CN1809636B - 耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法 - Google Patents

耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法 Download PDF

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Abstract

通过修饰天然α-葡聚糖磷酸化酶获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶；和制备所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的方法。所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物。与天然α-葡聚糖磷酸化酶比较，耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同的氨基酸残基：对应基序序列1L或1H的4-位的位置、对应基序序列2的4-位的位置和对应基序序列3L或3H的7-位的位置，并且在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中在60℃加热10分钟以后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性的20％或更多。

Description

耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
技术领域
本发明涉及热稳定的α-葡聚糖磷酸化酶和编码所述热稳定α-葡聚糖磷酸化酶的基因。另外，本发明还涉及生产热稳定α-葡聚糖磷酸化酶的方法。
背景技术
α-葡聚糖磷酸化酶(以下也称GP)是例如用于合成葡萄糖-1-磷酸(以下也称G-1-P)和合成葡聚糖的一种酶。G-1-P例如用作医用抗菌药、抗肿瘤药(作为铂络合物)、治疗心脏病的药物(作为胺盐)或葡聚糖合成的底物。GP广泛分布于植物，例如分布在马铃薯的块茎；动物，例如兔肌肉；和微生物如酵母中。
其中，植物来源的GP是有用的，因为它通常具有合成高分子量葡聚糖的能力。
多种GP可用于生产G-1-P或葡聚糖，其中，马铃薯来源的GP用于很多情况中，因为容易获得较大量的该酶。
在使用GP工业生产G-1-P或葡聚糖中，有必要基本去除缘于GP污染的其它酶活性，尤其是磷酸酶活性和淀粉酶活性。当大量生产GP时，大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)是表达GP基因的理想宿主。然而，如图4和图5所示，大肠杆菌具有淀粉酶活性和磷酸酶活性，而枯草杆菌具有淀粉酶活性。然而，如图4和图5所示，由这些宿主表达的酶不能被55℃热处理灭活，但几乎能被60℃热处理完全灭活。因此，希望得到具有抗热性的植物来源GP，其活性甚至在60℃热处理后也不丧失。
作为参考，热处理前后多种细菌(大肠杆菌TG-1株、大肠杆菌BL21株和枯草杆菌ANA-1株)的细胞提取物中淀粉酶和磷酸酶活性的具体数值在下表1中给出。
(表1)
Figure G200480017157XD00021
然而，能合成高分子量葡聚糖并具有耐热性的植物来源GP，尤其是在高温(如60℃-75℃)下能维持足够活性的GP仍然未知。对于来源于植物以外生物的GP，已经报道由极度嗜热细菌(水生栖热菌、Thermococcus litoralis、Aquifex aeolicus等)表达的、具有高度耐热性的GP。然而，因为以上这些GP来源于植物以外的生物，它们不能合成高分子量葡聚糖，因此有用性较差。
根据氨基酸序列的同源性(见非专利文献1)GP被分成两类。与马铃薯来源GP具有30％或更高一致性的GP归为A类GP，而与马铃薯来源GP具有低于30％一致性并与水生栖热菌的GP具有30％或更高一致性的GP归为B类GP。
与使用属于A类GP的马铃薯来源GP生产的葡聚糖相比，使用属于B类的Thermus来源的GP生产的葡聚糖具有较低的分子量。因此，存在不能使用Thermus来源的GP获得高分子量葡聚糖的问题。
为了解决这些问题，需要对工业应用有利且具有高度耐热性的植物来源GP。
已经尝试使一般酶具有更高耐热性的理论方法，如脯氨酸理论和基于酶立体结构信息的氨基酸替换，但并非都是成功的。因此，当前使用基于随机突变的方法，或使用随机突变和理论方法组合的方法。然而，在任何这些方法中，每种蛋白必须通过试错法来表征。
对于GP以外的其它酶，已经报道一旦确定参与提高酶耐热性的具体氨基酸位置，通过用其它氨基酸替换具体氨基酸残基，可以使酶具有耐热性(例如见非专利文献3-5)。
已经报道具有更高耐热性GP的实例，如大肠杆菌麦芽糊精磷酸化酶(见非专利文献2)。在此文献中，公开了热稳定大肠杆菌麦芽糊精磷酸化酶。麦芽糊精磷酸化酶是一种GP。在这种耐热化GP中，第133位天冬酰胺被丙氨酸替换。133位的这个天冬酰胺位于活性位点，并且是吡哆醛-5’-磷酸的结合位点，吡哆醛-5’-磷酸是所述酶反应必需的辅酶。在这种耐热化GP中，与天然GP比较，耐热性提高了约15℃，且最适反应温度从约45℃提高到约60℃，而所述GP在约67℃变性。然而，与Thermus来源的GP相似，这种大肠杆菌GP没有合成高分子量葡聚糖的能力。另外，在此文献中描述的耐热化GP在最适温度下的酶活性低于在最适温度下天然GP的酶活性。也就是说，由于突变，其合成葡聚糖的能力降低。因此，该文献教导133位替换不是优选的，至少从葡聚糖合成能力的观点看如此。
通常酶蛋白不稳定，并且对物理因素如pH、温度等以及蛋白酶敏感，因此容易降解。其中，也有酶在高度纯化时变得更不稳定，并因此容易降解。因此，酶必须在尽可能低的温度下制备，并且必须现用现制备。通过冷冻保存可以抑制酶降解。然而有些情况下蛋白质在融化过程中降解，因此当冷冻保存并随后融化酶时很难操作。一般来说，酶降解时立体结构改变，并且酶的性质如最适pH、pH稳定性、反应速率、底物亲和力等也相似的改变。偶尔所述酶活性被降低或灭活。这样，酶蛋白降解大大影响酶反应。因此，对于使用酶的工业，希望使用具有尽可能出色稳定性的酶。
已经知道天然马铃薯L型GP也容易降解，甚至当纯化GP冷藏保存时，也从纯化点逐渐降解。当可以抑制GP蛋白降解时，就可以制备大量GP并长期保存，从而增加生产效率，这对酶的保存和使用都是显著的优点。因此，也优选提供能长期保存而不降解的GP。
(非专利文献1)
Takeshi Takaha，et el.，″Structure and Properties ofThermus aqaticus α-Glucan Phosphorylase Expressed inEscherichia coli″，J.Appl.Glycosi.，2001，Vol.48，No.1，pp.71-78
(非专利文献2)
Richard Grieβler，et al.，″Mechanism of thermaldenaturation of maltodextrin phosphorylase from Escherichiacoli″，Biochem.J.，2000，346，pp.255-263
(非专利文献3)
Martin Lehmann and Markus Wyss，″Engineering proteinsfor thermostability：the use of sequence alignments versusrational design and directed evolution″，Current Opinionin Biotechnology，2001，12，pp.371-375
(非专利文献4)
M.Lehmann，et al.，″The consensus concept forthermostability engineering of proteins″，BiochemicaBiophysica Acta，2000，1543，pp.408-415
(非专利文献5)
Junichi Miyazaki，et al.，″Ancestral ResiduesStabilizing 3-Isopropylmalate Dehydrogenase of an ExtremeThermophile：Experimental Evidence Supporting theThermophilic Common Ancestor Hypothesis″，J.Biochem，2001，129，pp.777-782
发明内容
本发明待解决问题
本发明意图解决前述问题，并且本发明的目的是提供比常规α-葡聚糖磷酸化酶具有更好耐热性的植物来源α-葡聚糖磷酸化酶。更具体的，本发明的目的是提供除了具有耐热性以外还具有出色保存稳定性的植物来源α-葡聚糖磷酸化酶。
解决问题的方式
作为解决上述问题的勤奋研究结果，本发明人发现，通过在植物来源GP的氨基酸序列中的特定位置替换氨基酸残基，可以获得耐热化植物来源GP。基于这些发现，发明人完成了本发明。
为了解决前述问题，发明人继续深入研究，结果最终发现通过在植物来源GP的氨基酸序列中的特定位置替换氨基酸残基，作出了前述发现，并在此基础上完成了本发明。
根据本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶是通过修饰天然α-葡聚糖磷酸化酶而获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，
其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，并且
耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基：
对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；
对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和
对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中
在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置；或对应所述基序序列1H中第4位的位置；或对应所述基序序列3L中第7位的位置；或对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与选自下组的氨基酸序列具有至少50％一致性：SEQ ID NO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ ID NO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ IDNO：14的第1位到第983位；SEQ ID NO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ ID NO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ ID NO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ ID NO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ IDNO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ ID NO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化-->酶，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3L中第7位的位置。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1H中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以选自：SEQ IDNO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ ID NO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ IDNO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ ID NO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以来源于马铃薯或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
在一个实施方案中，根据本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以在选自下组的至少两个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置或对应所述基序序列1H中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3L中第7位的位置或对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，根据本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置或对应所述基序序列1H中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3L中第7位的位置或对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，对应所述基序序列1L中第4位的位置或对应所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸残基可以选自I、L和V。
在一个实施方案中，对应所述基序序列1L中第4位的位置或对应所述基序序列1H中第4位的位置上的氨基酸残基可以选自I和L。
在一个实施方案中，对应所述基序序列2中第4位位置上的氨基酸残基可以选自A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V和Y。
在一个实施方案中，对应所述基序序列2中第4位位置上的氨基酸残基可以选自C、G、S和V。
在一个实施方案中，对应所述基序序列3L中第7位的位置或对应所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸残基可以选自C、I、L、V和W。
在一个实施方案中，对应所述基序序列3L中第7位的位置或对应所述基序序列3H中第7位的位置上的氨基酸残基可以选自C、I、L和V。
在一个实施方案中，在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性可以是加热前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。
在一个实施方案中，在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中65℃加热2分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
在一个实施方案中，与天然α-葡聚糖磷酸化酶相比较，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以具有更高的保存稳定性。
本发明的方法是生产耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的方法，包括：
修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的第一种核酸分子，以获得含修饰碱基序列的第二种核酸分子；
制备含所述第二种核酸分子的表达载体；
将所述表达载体导入细胞中，以表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶；和
回收所表达的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，
其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，
所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同于所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：
对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；
对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和
对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；并且其中
在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以在以下位置具有与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置或对应所述基序序列1H中第4位的位置；或对应所述基序序列3L中第7位的位置或对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可在选自下组的至少一个位置具有与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1L中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3L中第7位的位置。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可在选自下组的至少一个位置具有与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1H中第4位的位置；对应所述基序序列2中第4位的位置；和对应所述基序序列3H中第7位的位置。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶可以来源于马铃薯或拟南芥。
本发明的核酸分子包含编码所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列。
本发明的载体包含所述核酸分子。
本发明的细胞包含所述核酸分子。
本发明合成葡聚糖的方法包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂，和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
本发明合成葡聚糖的另一种方法包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、引发剂和葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使反应液发生反应以产生葡萄糖-1-磷酸，所述反应液中含有根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶是通过修饰植物来源的天然α-葡聚糖磷酸化酶而获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，
其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：
对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；
对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和
对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置；
其中在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且
所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量为600kDa或更高的直链淀粉。
根据本发明另一种耐热化α-葡聚糖磷酸化酶是通过修饰天然α-葡聚糖磷酸化酶而获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，
其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，
所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应第706位苏氨酸(T706)的位置；并且
其中在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；或对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与选自下组的氨基酸序列具有至少50％一致性：SEQ ID NO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ ID NO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ ID NO：16的第1位到第928位；SEQ IDNO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ ID NO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以由一种核酸分子编码，所述核酸分子在严谨条件下与由编码选自下组的氨基酸序列的碱基序列组成的核酸分子杂交：SEQ ID NO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ IDNO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ ID NO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ IDNO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，所述碱基序列选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQIDNO：27和SEQ ID NO：29
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是L型α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶可以是H型α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列选自：SEQ IDNO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ ID NO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ IDNO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ ID NO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在一个实施方案中，所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于马铃薯或拟南芥。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少两个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在以下位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
在一个实施方案中，对应所述F39位置的氨基酸残基选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸。
在一个实施方案中，对应所述F39位置的氨基酸残基是异亮氨酸或亮氨酸。
在一个实施方案中，对应所述N135位置的氨基酸残基选自丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸。
在一个实施方案中，对应所述N135位置的氨基酸残基是半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。
在一个实施方案中，对应所述T706位置的氨基酸残基选自半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和色氨酸。
在一个实施方案中，对应所述T706位置的氨基酸残基是半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
在一个实施方案中，在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。
在一个实施方案中，在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中65℃加热2分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
根据本发明生产耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的方法包括修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶碱基序列的第一种核酸分子，以获得含修饰碱基序列的第二种核酸分子；制备含所述第二种核酸分子的表达载体；将所述表达载体导入细胞中，以表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，和回收所表达的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ IDNO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、对应第135位天冬酰胺(N135)的位置和对应第706位苏氨酸(T706)的位置，并且其中在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
在一个实施方案中，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基在以下位置与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶不同：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；或对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶。
在一个实施方案中，所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶来源于马铃薯或拟南芥。
本发明的核酸分子包含编码所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列。
本发明的载体包含所述核酸分子。
本发明的细胞包含所述核酸分子。
本发明合成葡聚糖的方法包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂，无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
本发明合成葡聚糖的一种方法包括使反应液发生反应，所述反应液中含有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、引发剂和葡萄糖-1-磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使反应液发生反应以产生葡萄糖-1-磷酸，所述反应液中含有所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸。
在一个实施方案中，所述反应可以在60℃-75℃的温度下进行。
根据本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶是通过修饰植物来源天然α-葡聚糖磷酸化酶而获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、对应第135位天冬酰胺(N135)的位置、和对应第706位苏氨酸(T706)的位置，其中在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量为600kDa或更高的直链淀粉。
本发明的效果
根据本发明，获得了在高温(如60℃或更高)下具有极佳耐热性的植物来源GP酶。
根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，合成葡聚糖的反应可以在高温条件(如60℃或更高)下进行，在此条件下天然GP酶不能反应。
要求保护的本发明获得这样的优点，当编码本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的基因(如通过提高马铃薯来源GP的耐热性而获得的、编码具有更高耐热性GP的基因，)在嗜中温性细菌宿主如大肠杆菌中高度表达时，来源于所述宿主细菌的污染酶根据本发明可通过加热所述细菌细胞提取物而简便除去，所述细胞提取物中含有在60℃具有更高耐热性的酶。具体的，在工业应用GP酶时淀粉酶活性和磷酸酶活性引起很大问题，通过热处理可以大大降低这些酶活性。因此，本发明的所述方法在酶纯化方面具有优势。
本发明的方法不仅在马铃薯来源GP和拟南芥来源GP上有效，而且也能适用于提高与马铃薯来源GP或拟南芥来源GP的氨基酸序列表现出高度同源的其它A类GP的耐热性。
因此，可以获得耐热化的其它生物来源的GP，所述GP在选自下组的至少一个位置具有与天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：
对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；
对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和
对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。
可以获得耐热化的其它生物来源GP，所述GP在选自下组的至少一个位置具有与天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
根据本发明，也提供同时具有更高保存稳定性和更高耐热性的GP。
附图说明
图1A：图1A表示来源于多种植物的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列，使用GENETYX-Win Ver.4.0的多重匹配对它们进行匹配。
图1B：图1B是图1A的续图。标出了基序序列1和2的位置。
图1C：图1C是图1B的续图。
图1D：图1D是图1C的续图。
图1E：图1E是图1D的续图。
图1F：图1F是图1E的续图。
图1G：图1G是图1F的续图。
图1H：图1H是图1G的续图。
图1I：图1I是图1H的续图。
图2：图2是质粒中α-葡聚糖磷酸化酶基因插入位点的示意图。
图3：图3表示当多种耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在60℃下30分钟或在65℃下2分钟时剩余的酶活性(％)。
图4：图4表示多种细菌(大肠杆菌TG-1和大肠杆菌BL21)在50℃、55℃、60℃或65℃加热30分钟后磷酸酶的剩余酶活性(％)。
图5：图5表示多种细菌(大肠杆菌TG-1、大肠杆菌BL21和枯草杆菌ANA-1)在50℃、55℃、60℃或65℃加热30分钟后淀粉酶的剩余酶活性(％)。
图6：图6表示耐热化GP酶(三重突变体(F39L+N135S+T706I))和天然马铃薯L型GP酶的比活性随时间的变化。
图7：图7表示耐热化GP酶(三重突变体(F39L+N135S+T706I))和天然马铃薯L型GP酶在37℃、50℃、55℃或60℃保温18小时时合成的直链淀粉量。
图8：图8表示60℃保温10分钟或65℃保温2分钟后，天然马铃薯L型GP和在F39处具有多种替换的GP的剩余活性。
图9：图9表示60℃保温10分钟或65℃保温2分钟后，天然马铃薯L型GP和在N135处具有多种替换的GP的剩余活性。
图10：图10表示60℃保温10分钟或65℃保温2分钟后，天然马铃薯L型GP和在T706处具有多种替换的GP的剩余活性。
图11：图11表示58℃保温10分钟、60℃保温10分钟或65℃保温2分钟后，天然马铃薯H型GP和三重突变(Y36L+N133S+T628I)型马铃薯H型GP的剩余活性。
图12：图12表示58℃保温10分钟、60℃保温10分钟或65℃保温2分钟后，天然拟南芥H型GP和三重突变(Y40L+N136S+N631I)型拟南芥H型GP的剩余酶活性。
图13：图13是聚丙烯酰胺凝胶电泳照片，表示天然马铃薯L型GP和7种耐热化GP在纯化后即时的分子量和在4℃保存5个月后的分子量。泳道1表示天然马铃薯L型(野生型)GP，泳道2表示F39L GP，泳道3表示N135S GP，泳道4表示T706I GP，泳道5表示F39L+N135S GP，泳道6表示F39L+T706I GP，泳道7表示N135S+T706I GP，泳道8表示F39L+N135S+T706I GP。
本发明最佳实施方式
本发明将在下面解释。应该理解，在整篇本说明书，用于本说明书中的术语具有本领域正常使用的意思，除非另外具体说明。
(1.α-葡聚糖磷酸化酶)
本说明书中，除非另外具体说明，“α-葡聚糖磷酸化酶”和“GP”可互换使用，表示具有α-葡聚糖磷酸化酶活性的酶。α-葡聚糖磷酸化酶归类于EC2.4.1.1。α-葡聚糖磷酸化酶活性表示催化从无机磷酸和α-1，4-葡聚糖制备葡萄糖-1-磷酸和α-1，4-葡聚糖部分降解产物的反应或其逆反应的活性。α-葡聚糖磷酸化酶在有些情况下称为磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、糖原磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶等。α-葡聚糖磷酸化酶也可催化α-1，4-葡聚糖的合成反应，它是磷酸解的逆反应。任意特定反应的方向依赖于底物的量。在体内，由于无机磷酸的量大，葡聚糖磷酸化酶反应向磷酸解方向进行。当无机磷酸量少时，反应向合成α-1，4-葡聚糖方向进行。
好像所有已知α-葡聚糖磷酸化酶的活化都需要吡哆醛-5’-磷酸，并具有相似的催化机理。尽管不同来源酶的底物偏向性和调节形式不同，所有α-葡聚糖磷酸化酶都属于包括很多α-葡聚糖磷酸化酶的大组。这个大组包括来源于细菌、酵母和动物的糖原磷酸化酶、来源于植物的淀粉磷酸化酶和来源于细菌的麦芽糊精磷酸化酶。
已经报道，α-葡聚糖磷酸化酶的葡聚糖合成反应的最小引发分子是麦芽四糖。也已经报道葡聚糖降解反应的最小有效底物是麦芽戊糖。通常，认为这些是α-葡聚糖磷酸化酶的共同特征。然而，近些年，已经报道来自嗜热栖热菌的α-葡聚糖磷酸化酶和来自Thermococcus litoralis的α-葡聚糖磷酸化酶具有不同于其它α-葡聚糖磷酸化酶的底物特异性。对于这些α-葡聚糖磷酸化酶，葡聚糖合成的最小引发剂是麦芽三糖，而葡聚糖降解的最小底物是麦芽四糖。
α-葡聚糖磷酸化酶被认为广泛存在于能储存淀粉或糖原的多种植物、动物和细菌中。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的植物的实例包括根和块茎作物如马铃薯(也称爱尔兰马铃薯)、甘薯、薯蓣、芋和木薯；蔬菜如甘蓝和菠菜；谷物如玉米、水稻、小麦、大麦、黑麦和粟；豆类如蚕豆、豌豆、大豆、赤豆和杂色菜豆(mottled kidney bean)；实验植物如拟南芥；柑桔杂交栽培种，藻类等。
产生α-葡聚糖磷酸化酶的植物不限于以上实例。
用于本发明方法的第一种α-葡聚糖磷酸化酶优选是天然α-葡聚糖磷酸化酶并来源于植物。通常，来源于植物的天然α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成高分子量的直链淀粉。然而，这些α-葡聚糖磷酸化酶的耐热性较低。因此它们不能在高温下(如约60℃或更高)催化反应。因此，当在植物(如马铃薯)来源GP的最适反应温度，即约30℃到约40℃进行反应时，出现多种微生物污染或所述葡聚糖老化的问题，并且葡聚糖或G-1-P不能被有效产生。
根据对糖原的亲和力，植物α-葡聚糖磷酸化酶分成L型和H型。L型α-葡聚糖磷酸化酶表示对糖原具有低亲和力的α-葡聚糖磷酸化酶。通常，L型α-葡聚糖磷酸化酶优先选择麦芽糊精、直链淀粉和支链淀粉而不是糖原作为底物(Hiroyuki Mori，et al.，“A Chimeric α-glucan phosphorylase of Plant Type L and H Isozyme”，The Journal ofBiological Chemistry，1993，vol.268，No.8，pp.5574-5581)。H型α-葡聚糖磷酸化酶表示对糖原具有高亲和力的α-葡聚糖磷酸化酶。通常，H型α-葡聚糖磷酸化酶对多种葡聚糖包括糖原具有极高亲和力。
例如，根据Toshio Fukui，et al.，Biochemistry of Vitamin B6，1987，pp.267-276，马铃薯叶来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶对糖原的Km(米氏常数)是1.4×10-3(M)，而马铃薯叶来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶产生糖原的Km是4×10-6(M)。此外，马铃薯块茎来源α-葡聚糖磷酸化酶的主要组分产生糖原的Km是2.4×10-3(M)，被分类为L型。次要组分α-葡聚糖磷酸化酶产生糖原的Km是1×10-6(M)，被分类为H型。
本领域已知，米氏常数是由酶促反应初始速率对底物浓度依赖性确定的动力学参数之一。米氏常数是当初始速率是最大速率Vmax的1/2时的底物浓度。米氏常数具有浓度单位。米氏常数随酶的具体测定条件而改变。该常数是表示酶对底物亲和力的量度。当米氏常数变小时，对底物的亲和力变大。
例如，L型α-葡聚糖磷酸化酶和H型α-葡聚糖磷酸化酶在特征方面具有以下不同。
(表2)
  L型GP   H型GP
  抗体与马铃薯块茎来源GP的主要组分的交叉反应   有   无
  抗体与马铃薯块茎来源GP的次要组分的交叉反应   无   有
  蛋白水解敏感性   高   低
  定位   质体(造粉体或叶绿体)   胞浆
在一个具体实施方案中，进一步优选的是，用于本发明方法的α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶。马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶比马铃薯H型α-葡聚糖磷酸化酶更长，并包含H型中没有的78个残基的氨基酸序列，该序列插入所述多肽链的中心区。因此，举例来说，马铃薯叶来源L型α-葡聚糖磷酸化酶亚基的分子量约为104,000Da，而马铃薯叶来源H型α-葡聚糖磷酸化酶亚基的分子量约是94,000Da。马铃薯块茎来源α-葡聚糖磷酸化酶主要组分亚基的分子量约是104,000Da，而马铃薯块茎来源α-葡聚糖磷酸化酶次要组分亚基的分子量约是94,000Da。特定α-葡聚糖磷酸化酶是L型还是H型可通过是否存在与78残基的该氨基酸序列的同源区域来确定，而不需实际测定亲和力。
一般来说，L型和H型的确定是通过综合考虑多种特性如酶活性、分子量、底物特异性、酶定位、一级序列同源性和插入序列的存在性。因此，一般来说，有些情况下L型和H型的边界是不清楚的，但为了方便，在本发明中，α-葡聚糖磷酸化酶是L型还是H型可通过α-葡聚糖磷酸化酶中是否存在转运肽来确定。转运肽序列的特征在本领域已知。编码转运肽的序列是L型，而不编码转运肽的序列是H型。
产生L型α-葡聚糖磷酸化酶的植物的实例包括马铃薯(也称爱尔兰马铃薯)、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米和水稻。
在另一个实施方案中，用于本发明方法的第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶优选是H型α-葡聚糖磷酸化酶。产生H型α-葡聚糖磷酸化酶的植物的实例包括马铃薯、小麦、柑桔杂交栽培种、水稻、蚕豆、拟南芥和甘薯。
来自马铃薯的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：1，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：2的第1位到第916位。
来自甘薯的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：3，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ IDNO：4的第1位到第912位。
来自马铃薯的另一种天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ IDNO：5，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：6的第1位到第893位。
来自蚕豆的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：7，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：8的第1位到第939位。
来自拟南芥的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：9，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：10的第1位到第962位。
来自菠菜的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：11，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：12的第1位到第971位。
来自玉米的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：13，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：14的第1位到第983位。
来自水稻的天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：15，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：16的第1位到第928位。
来自水稻的另一种天然L型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ IDNO：17，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：18的第1位到第951位。
来自小麦的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：19，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：20的第1位到第832位。
来自柑桔杂交栽培种的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ IDNO：21，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ IDNO：22的第1位到第840位。
来自水稻的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：23，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：24的第1位到第841位。
来自蚕豆的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：25，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：26的第1位到第842位。
来自拟南芥的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：27，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：28的第1位到第841位。
来自马铃薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶的cDNA序列表示于SEQ ID NO：29，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
来自甘薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶cDNA的部分序列表示于SEQ IDNO：31，由其编码的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：32。来自甘薯的天然H型α-葡聚糖磷酸化酶cDNA的全序列可通过常规方法使用这个部分序列而获得。
用于本发明方法的第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶优选来源于植物，并优选来源于马铃薯、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米、水稻、小麦或柑桔杂交栽培种，更优选来源于马铃薯、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米或水稻，最优选来源于马铃薯。用于本发明方法的所述第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶优选是L型α-葡聚糖磷酸化酶。用于本发明方法的所述第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶优选是来源于马铃薯的L、L2或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于甘薯的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于蚕豆的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于拟南芥的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于水稻的L或H型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于小麦的H型α-葡聚糖磷酸化酶，或来源于柑桔杂交栽培种的H型α-葡聚糖磷酸化酶；更优选是来源于马铃薯的L或L2型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于甘薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于蚕豆的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于拟南芥的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于菠菜的L型α-葡聚糖磷酸化酶，来源于玉米的L型α-葡聚糖磷酸化酶，或来源于水稻的L型α-葡聚糖磷酸化酶；最优选是来源于马铃薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶。
在本说明书中，“来源于”一种生物的酶不仅表示所述酶直接从所述生物分离，而且表示通过使用任意形式的所述生物而获得的酶。例如，当编码从一种生物获得的酶的基因引入大肠杆菌，并且随后从大肠杆菌分离所表达酶时，所述酶被称为是“来源于”所述生物。
例如，可用以下程序制备编码来源于马铃薯的L型GP的基因。
首先，如Takaha et al.(Journal of Biological Chemistry，Vol.268，pp.1391-1396，1993)所述，使用公知的方法从马铃薯块茎制备mRNA，并用商品试剂盒制备cDNA文库等。
然后，基于已知的GP基因序列(数据库GenBank登记号D00520)制备PCR引物，并用前述cDNA文库作模板进行PCR。例如，当：
PCR引物1：5′AAATCGATAGGAGGAAAACAT ATG ACC TTG AGT GAG AAA AT 3’(SEQ ID NO：38)
和
PCR引物2：5′GAAGGTACCTTTTCATTCACTTCCCCCTC3′(SEQ ID NO：39)用作PCR引物时，在以下条件下可扩增一种基因。
进行30个循环PCR反应，一个循环是94℃30秒、50℃1分钟和72℃3分钟。
所述PCR引物1的下划线部分对应L型GP成熟蛋白N端区的结构基因序列，而所述PCR引物2的下划线部分对应L型GP结构基因终止密码子即下游的碱基序列。
作为替代方案，也可基于所述已知基因序列信息而直接经化学合成制备GP基因，而不需制备cDNA文库。例如，合成基因的方法描述于Te’o，et al.，(FEMSMicrological Letters，vol.190，pp.13-19，2000)。
可通过本领域技术人员熟知的方法将所得GP基因插入合适的载体。例如可以使用pMW118(Nippon Gene Co.，Ltd.制造)、pUC18(TAKARA BIO制造)、pKK233-2(Amersham-Pharmacia-Biotech制造)、pET3d(STRATAGENE制造)等作为用于大肠杆菌的载体，使用pUB110(可以从American Type Culture Collection购买)和pHY300PLK(TAKARABIO制造)等作为用于枯草杆菌的载体。
例如，当用PCR引物1和2扩增基因时，可以通过将所扩增基因插入预先用SmaI切割的质粒pMW118选择具有图2所示序列的质粒。这用于转化，例如，大肠杆菌TG-1，然后选择氨苄青霉素抗性株，并培养携带所得重组质粒的菌株，通过提取质粒可以获得GP基因。
(2.提高α-葡聚糖磷酸化酶的耐热性)
根据本发明的方法包括修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的第一种核酸分子，以获得含修饰碱基序列的第二种核酸分子；制备含所述第二种核酸分子的表达载体；将所述表达载体导入细胞中，以表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，和回收所表达的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶.
(2.1分离含编码第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子)
根据本发明含编码耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子也在本发明范围内。基于本说明书的公开内容，这样的核酸分子可用本领域已知方法获得。
如上所述，含编码天然α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子可以直接从产生天然存在α-葡聚糖磷酸化酶的植物中分离。
例如，首先从马铃薯、拟南芥、菠菜等中分离天然α-葡聚糖磷酸化酶。为举例说明马铃薯来源的α-葡聚糖磷酸化酶的程序，首先，1.4kg商品马铃薯块茎去皮。所述已经去皮的块茎在榨汁机中捣碎得到糊状流体。然后用仪器过滤此糊状流体得到滤液。向滤液中加入Tris缓冲液(pH7.0)到终浓度100mM，得到酶溶液。此酶溶液进而在55℃水浴加热10分钟，之后液体温度达到50℃。加热后此酶溶液用离心机(BECKMAN制造的AVANTI J-25I)在8,500rpm离心20分钟，以除去不溶性蛋白，并得到上清液。
向上清液中加入硫酸铵至终浓度100g/L，4℃静置2小时以沉淀蛋白。然后用离心机(BECKMAN制造的AVANTI J-25I)在8,500rpm离心溶液20分钟，以除去不溶性蛋白。再加入硫酸铵到所得上清液中至终浓度250g/L，并在4℃静置2小时以沉淀蛋白。然后用离心机(BECKMAN制造的AVANTI J-25I)在8,500rpm离心溶液20分钟，以回收不溶性蛋白。
回收的不溶性蛋白悬于150ml 25mM Tris缓冲液(pH7.0)。重悬的酶溶液对相同缓冲液透析过夜。透析后样品吸附到已经预先平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose(Pharmacia制造)上，然后用含200mM氯化钠的缓冲液洗涤。随后用含400mM氯化钠的缓冲液洗脱蛋白，并回收洗脱液，得到含部分纯化的马铃薯块茎来源葡聚糖磷酸化酶的溶液。
取决于所购买马铃薯，此阶段获得的含α-葡聚糖磷酸化酶溶液可用于胰酶处理，但在有些情况下需要进一步纯化。在这些情况下，如果必要，通过组合来自使用例如Sephacryl S-200HR(Pharmacia制造)的凝胶过滤层析的组分和来自使用例如Phenyl-TOYOPEARL650M(Tosoh Corporation制造)的疏水层析的组分，可以获得所述含纯化马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶的溶液。可相似的从其它植物物种中纯化α-葡聚糖磷酸化酶。
用胰酶处理由此获得的纯化α-葡聚糖磷酸化酶，所得胰酶处理片段通过HPLC分离，用肽测序仪确定每个分离肽片段的N端氨基酸序列。然后用基于鉴定氨基酸序列而制备的合成寡核苷酸探针，筛选合适的基因组文库或cDNA文库，从而获得含编码天然α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子(也称基因)。制备寡核苷酸探针和cDNA文库以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域技术人员公知。例如，见Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A laboratory Manual(1989)；DNA Cloning，vol.Iand II(edited by D.N.Glover，1985)；Oligonucleotide Synthesis(edited by M.J.Gait，1984)；Nucleic Acid Hybridization(edited by B.D.Hames & S.J.Higgins，1984)。
作为替代方案，基于与编码α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列已知的某些α-葡聚糖磷酸化酶碱基序列的同源性，例如，用含至少部分该碱基序列的核酸探针通过杂交而筛选cDNA文库或基因组文库，从而获得含另一种α-葡聚糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子。这些方法在本领域已知。
作为替代方案，制备简并引物，它们对应于多种α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中的保守区域，并使用例如目标物种的cDNA文库或基因组文库作模板进行PCR，获得来源于所述物种的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列。这些方法在本领域已知。
筛选基因组文库或cDNA文库时，可以使用本领域技术人员熟知的方法亚克隆所得核酸分子。例如通过混合含目标基因的λ噬菌体、合适的大肠杆菌和合适的辅助噬菌体，可以容易的获得含目标基因的质粒。而后，可以通过用含质粒的溶液转化合适的大肠杆菌来亚克隆目标基因。可以通过培养所得转化体，例如经碱SDS方法获得质粒DNA，并确定目标基因的碱基序列。确定碱基序列的方法对本领域技术人员公知。进而，通过使用基于DNA片段碱基序列合成的PCR引物，并使用马铃薯的基因组DNA或cDNA作模板的聚合酶链式反应(PCR)，可以直接扩增α-葡聚糖磷酸化酶基因。
在本说明书中，所述“核酸分子”可只由天然核苷酸组成，可以含有非天然核苷酸，或可以只由非天然核苷酸组成。非天然核苷酸的实例包括衍生核苷酸(也称核苷酸类似物)。所述“衍生核苷酸”和所述“核苷酸类似物”表示那些不同于天然存在核苷酸但与起源核苷酸具有相似功能的核苷酸。这些衍生核苷酸和核苷酸类似物在本领域公知。这些衍生核苷酸和核苷酸类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。
(2.2修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的所述第一种核酸分子)
修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的第一种核酸分子，获得含修饰碱基序列的第二种核酸分子。第一种核酸分子可以是如上(2.1)获得的含编码天然α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子。所述第一种核酸分子也可以是含编码α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，其中所述α-葡聚糖磷酸化酶具有与天然α-葡聚糖磷酸化酶基本相同的酶活性，并且其中1个或几个或更多氨基酸被替换、缺失或添加到编码天然α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列中。“具有基本相同酶活性”表示，在与修饰前α-葡聚糖磷酸化酶相同条件下测定修饰后α-葡聚糖磷酸化酶时，酶活性范围是修饰前α-葡聚糖磷酸化酶酶活性在±20％、优选±10％、更优选±5％的范围内。
可通过定点突变、用诱变剂突变(用致突变剂如亚硝酸盐、紫外线处理受研究基因)或易错PCR进行修饰。从容易获得目标突变的角度来看优选使用定点突变，因为当使用定点突变时可在目标位点引入目标修饰。作为替代方案，可直接合成含目标序列的核酸分子。这些化学合成方法在本领域公知。
本发明人发现，通过在来源于植物的α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中特定位置用另一个氨基酸残基替换氨基酸残基，可提高所得α-葡聚糖磷酸化酶的耐热性。这种特定位置可通过比对以下任意基序序列或SEQ ID NO：2的氨基酸序列、并比较受研究氨基酸序列而确定：
基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S(SEQ ID NO：44)
或基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S(SEQ ID NO：45)，
基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G(SEQ ID NO：46)，和
基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V(SEQ ID NO：47)
或基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V(SEQ ID NO：48)。
基序序列1L、2和3L存在于马铃薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中。这些基序序列存在于马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的以下位置：基序序列1L：SEQ ID NO：2中氨基酸序列的第36位到第44位；基序序列2：SEQ IDNO：2中氨基酸序列的第132位到第139位；基序序列3L：SEQ ID NO：2中氨基酸序列的第700位到第708位。基序序列1H、2和3H存在于水稻来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中。这些基序序列存在于水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的以下位置：基序序列1H：SEQ ID NO：24中氨基酸序列的第36位到第44位；基序序列2：SEQ IDNO：24中氨基酸序列的第132位到第139位；基序序列3H：SEQ ID NO：2中氨基酸序列的第625位到第633位。一般的，天然α-葡聚糖磷酸化酶具有这些基序序列或与它们高度同源的序列。本领域技术人员可以容易的确定这些基序序列在其它植物来源的α-葡聚糖磷酸化酶中的位置。
在根据本发明的方法中，修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应第706位苏氨酸(T706)的位置。优选的，修饰含编码所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子，以得到由修饰核酸分子编码的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列，与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶相比，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列在以下位置不同：对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中对应第39位苯丙氨酸(F39)的位置或对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
如本说明书所用，“对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置”表示，当受研究氨基酸序列和SEQ ID NO：2氨基酸序列进行比对以使两序列之间同源性最大时，如果必要可以在一个序列中插入间隙，与SEQ ID NO：2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)匹配的位置。当在SEQ ID NO：2中插入间隙时，当计算氨基酸残基数目时不计间隙。更优选，以上短语表示当SEQ ID NO：2氨基酸序列与受研究氨基酸序列在间隙罚分(GAP Penalty)(Peptide)条件下进行比对时，与SEQ ID NO：2中第39位苯丙氨酸(F39)匹配的位置，其中所述比对条件是：在GENETYX-WINVer.4.0的多重比对中，Insert＝-10，Extend＝-3，gap Extend on top position：setted(checked)，Match Mode：Local Match using a score table of default。关于氨基酸的默认记分表示于下表3。
(表3)
C    12，
S    0，2，
T    -2，1，3，
P    -3，1，0，6，
A    -2，1，1，1，2，
G    -3，1，0，-1，1，5，
N    -4，1，0，-1，0，0，2，
D    -5，0，0，-1，0，1，2，4，
E    -5，0，0，-1，0，0，1，3，4，
Q    -5，-1，-1，0，0，-1，1，2，2，4，
H    -3，-1，-1，0，-1，-2，2，1，1，3，6，
R    -4，0，-1，0，-2，-3，0，-1，-1，1，2，6，
K    -5，0，0，-1，-1，-2，1，0，0，1，0，3，5，
M    -5，-2，-1，-2，-1，-3，-2，-3，-2，-1，-2，0，0，6，
I    -2，-1，0，-2，-1，-3，-2，-2，-2，-2，-2，-2，-2，2，5，
L    -6，-3，-2，-3，-2，-4，-3，-4，-3，-2，-2，-3，-3，4，2，6，
V    -2，-1，0，-1，0，-1，-2，-2，-2，-2，-2，-2，-2，2，4，2，4，
F    -4，-3，-3，-5，-4，-5，-4，-6，-5，-5，-2，-4，-5，0，1，2，-1，9，
Y    0，-3，-3，-5，-3，-5，-2，-4，-4，-4，0，-4，-4，-2，-1，-1，-2，7，10，
W    -8，-2，-5，-6，-6，-7，-4，-7，-7，-5，-3，2，-3，-4，-5，-2，-6，0，0，17，
B    -4，0，0，-1，0，0，2，3，2，1，1，-1，1，-2，-2，-3，-2，-5，-3，-5，2，
Z    -5，0，-1，0，0，-1，1，3，3，3，2，0，0，-2，-2，-3，-2，-5，-4，-6，2，3，
X    0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0
     C  S  T  P  A  G  N  D  E  Q  H  R  K  M  I  L  V  F  Y  W  B  Z  X
GENETYX-WIN Ver.4.0的多重比对基于以下算法。在这个比对程序中，所有可能的序列配对被比对，两序列比对循环进行(成对比对)，并且其中具有高保守比例(成对比对中的评分)组合的序列被确定为共有序列，从共有序列产生假想序列(共有部分保持不变，同时对于非共有部分选择所述序列的任意一个)。用相同程序产生除了组成假想序列的序列以外的所有序列与假想序列之间的循环比较，直到产生最终的假想序列。此后，通过将有关用于产生所述假想序列的GAP插入和移位信息应用到所述起始序列，以组成整体，从而完成多重比对。用于这种成对比对的计算公式如下。
当序列a和b每个分别具有序列长度m或n时，各自序列表达为：
a＝a1 a2 a3...am
b＝b1 b2 b3...bm，
间隙罚分(GAP penalty)g用以下方程表示：
-g＝s(ai，φ)＝a(φ，bj).
获得比对记分的方程如下：
G(0，0)＝0
G(i，0)＝i(-g)
G(0，j)＝j(-g)
-gk＝-[α+β(k-1)]
E(i，j)＝{G(i-1，j)-α，E(i-1，j)-β}
F(i，j)＝max{G(i，j-1)-α，F(i，j-1)-β}
G(i，j)＝max{E(i，j)，G(i-1，j-1)+s(ai，bj)，F(i，j)}
α是间隙插入罚分(GAP insertion penalty)，β是间隙延长罚分(GAP extensionpenalty)。E、F和G是记分矩阵(score matrix)，基于此，产生pass matrix。
类似的分析对应第135位天冬酰胺(N135)的位置和对应第706位苏氨酸(T706)的位置。
在GENETYX-WIN Ver.4.0的多重比对中，在前述条件下，SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28和SEQ ID NO：30与SEQ ID NO：2进行比对。作为结果，苯丙氨酸或酪氨酸在对应SEQ ID NO：2氨基酸序列的第39位苯丙氨酸(F39)的位置进行比对，天冬酰胺在对应SEQ ID NO：2氨基酸序列的第135位天冬酰胺(N135)的位置进行比对，苏氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸在对应SEQ ID NO：2氨基酸序列的第706位苏氨酸(T706)的位置进行比对。这种比对结果表示于图1A到图1I。在图1A到图1I中，“马铃薯L型”代表马铃薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。“马铃薯L2型”代表马铃薯来源的第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。“甘薯L型”代表甘薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。“蚕豆L型”代表蚕豆来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。“拟南芥L型”代表拟南芥来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。“菠菜L型”代表菠菜来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。“水稻L型”代表水稻来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。“水稻L2型”代表水稻来源的第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。“玉米L型”代表玉米来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。“马铃薯H型”代表马铃薯来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。“蚕豆H型”代表蚕豆来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。“拟南芥H型”代表拟南芥来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。“水稻H型”代表水稻来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。“小麦”代表小麦来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。“柑桔H型”代表柑桔杂交栽培种来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。“E.coliMalQ”代表大肠杆菌来源的麦芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。麦芽糊精磷酸化酶是α-葡聚糖磷酸化酶的一种类型。
例如，在甘薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置是SEQ ID NO：4的氨基酸序列中第39位，对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置是SEQ ID NO：4的氨基酸序列中第135位，对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置是SEQ ID NO：4的氨基酸序列中第702位。
例如，在马铃薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第11位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第107位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：6氨基酸序列中第683位。
例如，在蚕豆来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第43位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第139位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：8氨基酸序列中第729位。
例如，在拟南芥来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第106位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第202位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：10氨基酸序列中第752位。
例如，在菠菜来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第112位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第208位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：12氨基酸序列中第761位。
例如，在玉米来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第95位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第191位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：14氨基酸序列中第773位。
例如，在水稻来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第41位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第137位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：16氨基酸序列中第718位。
例如，在另一种水稻来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第91位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第187位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：18氨基酸序列中第741位。
例如，在小麦来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第31位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第127位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：20氨基酸序列中第622位。
例如，在柑桔杂交栽培种来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：22氨基酸序列中第42位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：22氨基酸序列中第138位，对应SEQ IDNO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：22氨基酸序列中第630位。
例如，在水稻来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：24氨基酸序列中第39位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：24氨基酸序列中第135位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：24氨基酸序列中第631位。
例如，在蚕豆来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：26氨基酸序列中第43位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：26氨基酸序列中第139位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：26氨基酸序列中第632位。
例如，在拟南芥来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：28氨基酸序列中第40位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：28氨基酸序列中第136位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：28氨基酸序列中第631位。
例如，在马铃薯来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶中，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中F39的位置是SEQ ID NO：30氨基酸序列中第36位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中N135的位置是SEQ ID NO：30氨基酸序列中第133位，对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中T706的位置是SEQ ID NO：30氨基酸序列中第628位。
提高耐热性的氨基酸残基位置不仅可以通过与SEQ ID NO：2的916个氨基酸残基序列比对来确定，而且可以通过与选自前述基序序列1L或1H、2、和3L或3H的一个或多个序列比对来确定。就目前已知的植物来源的α-葡聚糖磷酸化酶进行比对，不论是使用SEQ ID NO：2的情况下，还是使用基序序列1L或1H、2、和3L或3H的情况下，所确定的位置都是相同的。
基序序列1L在L型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守，而基序序列1H在H型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守。可以说对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置是对应基序序列1L或1H中第4位的位置。
基序序列2在L型和H型α-葡聚糖磷酸化酶中通常保守。可以说对应SEQ IDNO：2氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置是对应基序序列2中第4位的位置。
基序序列3L在L型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守，而基序序列3H在H型α-葡聚糖磷酸化酶中很保守。可以说对应SEQ ID NO：2氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置是对应基序序列3L或3H中第7位的位置。
这样，也可用所述基序序列指定提高耐热性的氨基酸残基位置。提高耐热性的氨基酸残基位置可以是选自下组的至少一个位置：对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。
因此，在根据本发明的方法中，可以说含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的核酸分子被这样修饰，使得由修饰核酸编码的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。
本说明书中，所述“基序序列”表示在多种蛋白的氨基酸序列之间见到的、共有或高度保守的部分序列。一般的，所述基序序列在很多情况下具有特定功能，但在本说明书中，甚至当未确定具体功能时，只要所述序列在多种氨基酸序列之间保守，就称为基序序列。
“基序序列1L中第4位”氨基酸残基表示当将所述基序序列1L的N端(左端)的氨基酸残基当作第1位时依次计数的第4位氨基酸残基。“基序序列1H中第4位”、“基序序列2中第4位”、“基序序列3L中第7位”、“基序序列3H中第7位”等都与前相似。
这些基序序列在植物α-葡聚糖磷酸化酶中通常非常保守。所述基序序列1L或1H和3L或3H在α-葡聚糖植物磷酸化酶中非常保守，但在来源于动物、微生物等的α-葡聚糖磷酸化酶中不保守。基序序列2在几乎所有生物如植物、动物和微生物的α-葡聚糖磷酸化酶中非常保守。所述基序序列2含有被认为参与结合底物和结合吡哆醛-5’-磷酸的氨基酸残基、并是活性必需区域的一部分，其中吡哆醛-5’-磷酸是辅酶。基序序列1L和1H的位置和基序序列2的位置在图1B中示出。基序序列3L和3H的位置在图1G中示出。
如此处所用，“对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置”表示：当在不插入间隙以使序列间同源性最大条件下，将受研究氨基酸序列和所述基序序列1L或所述基序序列1H进行比对时，与所述基序序列1L或所述基序序列1H中第4位氨基酸残基匹配的位置。更优选的，它表示当在无间隙条件下进行GENETYX-WIN Ver.4.0(GeneticsCo.，Ltd.)的最大匹配时，与所述基序序列1L或所述基序序列1H中第4位氨基酸残基匹配的位置。
以相似方式来解释对应基序序列2中第4位的位置，和对应基序序列3L中第7位的位置或对应基序序列3H中第7位的位置。
GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配如下：考虑替换和缺失，待分析的序列数据和待比较的序列数据进行比对，使得这些序列之间的氨基酸配对匹配最大，并因此分别对匹配(Matches)、错配(Mismatches)和间隙(Gaps)进行评分，计算总和，并输出最低总和的比对结果(参考文献：Takashi，K.，and Gotoh，O.1984.SequenceRelationships among Various 4.5 S RNA Species J.Biochem.92：1173-1177)。优选在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝None、*N+＝2的条件下进行比对。
使用GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配，马铃薯L型(SEQ ID NO：2)、甘薯L型(SEQ ID NO：4)、马铃薯第二种L型(SEQ ID NO：6)、蚕豆L型(SEQ ID NO：8)、拟南芥L型(SEQ ID NO：10)、菠菜L型(SEQ ID NO：12)、玉米L型(SEQ ID NO：14)、水稻L型(SEQ ID NO：16)、水稻第二种L型(SEQ ID NO：18)、小麦H型(SEQ IDNO：20)、柑桔杂交栽培种H型(SEQ ID NO：22)、水稻H型(SEQ ID NO：24)、蚕豆H型(SEQ ID NO：26)、拟南芥H型(SEQ ID NO：28)和马铃薯H型(SEQ ID NO：30)与基序序列1L或基序序列1H进行比对。在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝0、*N+＝2的条件下分析最大匹配。
在GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配中，在前述条件下，SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28和SEQ ID NO：30与每一种基序序列(基序序列1L、1H、2、3L或3H)进行比对。结果，苯丙氨酸或酪氨酸与对应基序序列1L中第4位的位置或对应基序序列1H中第4位的位置匹配，天冬酰胺与对应基序序列2中第4位的位置匹配，而苏氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸与对应基序序列3L中第7位的位置或对应基序序列3H中第7位的位置匹配。所述基序序列1L、2和3L是SEQ IDNO：2的部分序列，而所述基序序列1H、2和3H是SEQ ID NO：24的部分序列。
对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30中的每一种，将使用SEQID NO：2全长的比对结果和使用基序序列1L、1H、2、3L和3H的比对结果进行比较。结果，在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30中的每一种中，对应SEQID NO：2中第39位的位置和对应所述基序序列1L或1H中第4位的位置相同；对应SEQ ID NO：2中第135位的位置和对应所述基序序列2中第4位的位置相同；对应SEQID NO：2中第706位的位置和对应所述基序序列3L或3H中第7位的位置相同。这样就证实：甚至当用基序序列进行比对时，所指定位置与使用SEQ ID NO：2氨基酸序列时指定的位置相同。
含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内，所述核酸分子通过修饰含编码下面所示氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而获得：序列表中的SEQ ID NO：2的第1位到第916位，SEQ ID NO：4的第1位到第912位，SEQ ID NO：6的第1位到第893位，SEQ ID NO：8的第1位到第939位，SEQ ID NO：10的第1位到第962位，SEQ IDNO：12的第1位到第971位，SEQ ID NO：14的第1位到第983位，SEQ ID NO：16的第1位到第928位，SEQ ID NO：18的第1位到第951位，SEQ ID NO：20的第1位到第832位，SEQ ID NO：22的第1位到第840位，SEQ ID NO：24的第1位到第841位，SEQ ID NO：26的第1位到第842位，SEQ ID NO：28的第1位到第841位，和SEQ IDNO：30的第1位到第838位。
含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内，所述核酸分子通过修饰含下面给出的碱基序列的核酸分子而获得：序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQID NO：27或SEQ ID NO：29。
含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内，所述核酸分子通过修饰含编码一定氨基酸序列的碱基序列的核酸分子而获得，所述氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有至少50％一致性：序列表中的SEQ ID NO：2的第1位到第916位，SEQ IDNO：4的第1位到第912位，SEQ ID NO：6的第1位到第893位，SEQ ID NO：8的第1位到第939位，SEQ ID NO：10的第1位到第962位，SEQ ID NO：12的第1位到第971位，SEQ ID NO：14的第1位到第983位，SEQ ID NO：16的第1位到第928位，SEQ IDNO：18的第1位到第951位，SEQ ID NO：20的第1位到第832位，SEQ ID NO：22的第1位到第840位，SEQ ID NO：24的第1位到第841位，SEQ ID NO：26的第1位到第842位，SEQ ID NO：28的第1位到第841位，和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
在本发明中，序列如氨基酸序列和碱基序列的“一致性”表示两序列之间出现相同氨基酸(当比较碱基序列时为碱基)的程度。一致性的确定通常是通过比较两种氨基酸序列或两种碱基序列，并比较以最佳方式匹配的这两种序列，其中可以含有插入或缺失。一致性百分率的计算是通过确定这两种序列之间相同氨基酸(当比较碱基序列时为碱基)位置的数目、将相同位置的数目除以比较位置的总数、并将所得结果乘以100而得到这两种序列之间的一致性百分率。
作为实例，用于获得本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与选自下组的氨基酸序列(即对照氨基酸序列)相同，也即100％一致：SEQ ID NO：2的第1位到第916位，SEQ ID NO：4的第1位到第912位，SEQ IDNO：6的第1位到第893位，SEQ ID NO：8的第1位到第939位，SEQ ID NO：10的第1位到第962位，SEQ ID NO：12的第1位到第971位，SEQ ID NO：14的第1位到第983位，SEQ ID NO：16的第1位到第928位，SEQ ID NO：18的第1位到第951位，SEQ ID NO：20的第1位到第832位，SEQ ID NO：22的第1位到第840位，SEQ IDNO：24的第1位到第841位，SEQ ID NO：26的第1位到第842位，SEQ ID NO：28的第1位到第841位，和SEQ ID NO：30的第1位到第838位，或与对照氨基酸序列相比该氨基酸序列含有一个或多个改变氨基酸残基。这些改变可以选自至少一个氨基酸的缺失、包括保守和非保守替换的替换、或插入。这种改变可以发生在对照氨基酸序列的氨基端或羧基端，或发生在这些末端以外的其它任意位置。氨基酸残基改变可以与一个残基分散分布，或几个残基可以连续。
在本说明书中，使用GENETYX-WIN Ver.4.0(Genetics Co.，Ltd.)的最大匹配计算序列的一致性百分率。该程序比对待分析序列数据和待比较序列数据，使得序列间匹配的氨基酸对最多，同时还考虑替换和缺失，并因此得到匹配(Matches)、错配(Mismatches)和间隙(Gaps)的评分，计算总和，并输出最小总和的比对结果，从而计算一致性百分率(参考文献：Takashi，K.，and Gotoh，O.1984.SequenceRelationships among Various 4.5 S RNA Species J.Biochem.92：1173-1177)。
使用GENETYX-WIN Ver.4.0的最大匹配，计算马铃薯L型(SEQ ID NO：2)、甘薯L型(SEQ ID NO：4)、马铃薯另一种L型(SEQ ID NO：6)、蚕豆L型(SEQ ID NO：8)、拟南芥L型(SEQ ID NO：10)、菠菜L型(SEQ ID NO：12)、玉米L型(SEQ ID NO：14)、水稻L型(SEQ IDNO：16)、水稻第二种L型(SEQ IDNO：18)、小麦H型(SEQ IDNO：20)、柑桔杂交栽培种H型(SEQ ID NO：22)、水稻H型(SEQ ID NO：24)、蚕豆H型(SEQ ID NO：26)、拟南芥H型(SEQ ID NO：28)和马铃薯H型(SEQ ID NO：30)与马铃薯L型(SEQ ID NO：2)之间的一致性百分率，结果示于表4。在Matches＝-1、Mismatches＝1、Gaps＝1、*N+＝2的条件下分析最大匹配。
表4
 目标序列   一致性
 马铃薯L型   100
 马铃薯第二种L型   70.3
 拟南芥L型   72.1
 菠菜L型   72.7
 水稻L型   73.8
 水稻第二种L型   67.7
 玉米L型   70.2
 甘薯L型   78.6
 蚕豆L型   72.5
 马铃薯H型   57.5
 拟南芥H型   57.8
 水稻H型   57.0
 蚕豆H型   58.6
 柑桔杂交栽培种H型   57.5
 小麦H型   57.6
含修饰碱基序列的核酸分子位于本发明范围内，所述核酸分子通过修饰在严谨条件下与由选自下组的碱基序列组成的核酸分子而获得：序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：29。本领域技术人员可容易的选择期望的α-葡聚糖磷酸化酶基因。
如此处所用，术语“严谨条件”表示这样的条件，在此条件下序列与特异性序列杂交但不与非特异性序列杂交。适当严谨条件的选择对本领域技术人员公知，并描述于例如Molecular Cloning(Sambrook，et al.，同上)。具体的，所述条件意味着使用所述条件可以鉴定多核苷酸，在此条件下，在一种溶液中用固定有来源于菌落或噬斑的DNA的滤膜在65℃进行杂交，所述溶液含50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhart’s溶液(0.2％ BSA、0.2％ Ficoll 400和0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA，并用0.1-2倍浓度的SSC(盐水-柠檬酸钠)溶液(一倍浓度的SSC溶液组成是150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)在65℃条件下洗涤滤膜。
用于本发明方法的修饰核酸分子可以是相对于含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子而被保守性修饰的核酸分子。所述“相对于含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶碱基序列的核酸分子而被保守性修饰的核酸分子”表示含编码一定氨基酸序列的碱基序列的核酸分子，所述氨基酸序列与由编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列编码的氨基酸序列相同或基本相同。所述“与由编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列编码的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列”表示与第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有基本相同酶活性的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，很多功能等价的碱基序列编码指定的氨基酸序列。例如密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码丙氨酸。因此，在所有由GCA密码子指定的丙氨酸位置上，密码子可以换成GCC、GCG或GCT，不改变所编码的丙氨酸。相似的，对于由多个密码子编码的氨基酸，在所有由一个密码子指定的氨基酸位置，所述密码子可以换成编码所述氨基酸的任意另一个密码子，而不改变所编码具体氨基酸。碱基序列的这种变化是“沉默突变”，这是一种保守性改变的突变。本说明书中的编码多肽的所有碱基序列也包括所述核酸的所有可能的沉默改变。沉默突变包括其中编码核酸(nuclear acid)不改变的“沉默替换”，和核酸原本不编码氨基酸的情况。当某种核酸编码氨基酸时，沉默突变与沉默替换有相同含义。在本说明书中，“沉默替换”表示在碱基序列中用编码相同氨基酸的另一个碱基序列替换编码一种氨基酸的碱基序列。基于遗传密码简并性的现象，在多种碱基序列编码某种氨基酸(如甘氨酸)的情况下，这种沉默替换是可能的。因此，含由沉默替换产生的碱基序列编码的氨基酸序列的多肽具有与原始多肽相同的氨基酸序列。因此，除了本发明针对的修饰(进行替换使得所述α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应所述基序序列1L或1H中第4位的位置、对应所述基序序列2中第4位的位置、对应所述基序序列3L或3H中第7位的位置、或对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置、对应第135位天冬酰胺(N135)的位置和对应第706位苏氨酸(T706)的位置)以外，本发明所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以包括在碱基序列水平的沉默替换。在本领域中，可以理解核酸中的每个密码子(不包括ATG和TGG，其中ATG是通常编码甲硫氨酸的唯一一个密码子，TGG是通常编码色氨酸的唯一一个密码子)可以修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默突变也隐含在每种所述序列中。优选的，可以进行这些改变使得避免替换半胱氨酸，半胱氨酸是大大影响多肽构象的氨基酸。
可以改变编码本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列，使得与将要导入序列供表达的生物体的密码子使用偏好相一致。密码子使用偏好反映所述生物中高表达基因的使用偏好。例如，当意图在大肠杆菌中表达时，可根据公开的密码子使用偏好表(如Sharp，et al.，Nucleic Acids Research 16，No.17，p.8207(1988))对所述序列进行大肠杆菌表达的优化。
(2.3制备表达载体)
使用含上述修饰的碱基序列的核酸分子制备表达载体。使用特定核酸序列制备表达载体的方法对本领域技术人员是公知的。
当在本说明书中提及核酸分子时，“载体”表示可转移目标碱基序列到目标细胞中的核酸分子。这些载体的实例包括可在目标细胞中自主复制或可整合到目标细胞染色体中、并在适于转录修饰碱基序列的位置有启动子的载体。在本说明书中，所述载体可以是质粒。
如此处所用，所述“表达载体”表示可在目标细胞中表达修饰碱基序列(即编码修饰的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列)的载体。除了修饰碱基序列以外，表达载体还含有多种调节元件如调节表达的启动子，如果必要，还含有在目标细胞中复制和选择重组体所必需的因子(如复制起点(ori)和诸如药物抗性基因的选择标记)。在表达载体中，修饰的碱基序列可操作的连接，使得它可以被转录和翻译。调节元件包括启动子、终止子和增强子。此外，当意图将表达酶分泌到细胞外时，编码分泌信号肽的碱基序列以正确的读码框连接到修饰的碱基序列上游。本领域技术人员公知，用于导入特定生物(如细菌)中的表达载体类型和用于所述表达载体的调节元件和其它因子的种类都可以根据目标细胞而改变。
如此处所用，所述“终止子”是位于蛋白质编码区域下游的序列，参与将碱基序列转录成mRNA的转录过程的终止，参与添加多聚A序列。已知所述终止子在mRNA稳定性方面影响基因表达水平。
如此处所用，所述“启动子”表示DNA上确定基因的转录起始位点并直接调节转录频率的区域，同时还是结合RNA聚合酶并因此启动转录的碱基序列。因为在用DNA分析软件预测基因组碱基序列中的蛋白质编码区域时，在很多情况下启动子区域通常是推断的蛋白质编码区域上游约2kbp或更近的区域，启动子区域是可以推断的。推断性启动子区域随每个结构基因而变化，并通常非限制性的位于结构基因上游，还可以在结构基因下游。推断性启动子区域优选位于第一个外显子翻译起始位点上游约2kbp或更近。
如此处所用，所述“增强子”可用于增强目标基因的表达效率。这样的增强子在本领域公知。可以使用多种增强子，但只可以使用一种，或可以完全不用。
如此处所用，“可操作的连接”表示将期望碱基序列放置于转录和翻译调节序列(如启动子、增强子等)或实现表达的翻译调节序列(即操作)的控制之下。为了使启动子与基因可操作的连接，通常将启动子置于所述基因的即上游，但不必要将启动子置于与所述基因临近的位置。
为了将修饰核酸序列与前述调节元件可操作的连接，在有些情况下要加工目标α-葡聚糖磷酸化酶基因。实例包括启动子和编码区之间距离太长而预计转录效率降低的情况、核糖体结合位点和翻译起始密码子之间距离不合适的情况等。所述加工含义的实例包括用限制酶消化、用核酸外切酶如Bal31和ExoIII消化或用单链DNA如M13或PCR引入定点突变。
(2.4耐热性α-葡聚糖磷酸化酶的表达)
然后，将如上述制备的表达载体导入细胞，因而表达耐热性α-葡聚糖磷酸化酶。
在本说明书中，酶的“表达”指编码所述酶的碱基序列在体内或体外的转录和翻译，以及所编码酶的生成。
导入表达载体的细胞(也称为宿主)包括原核和真核细胞。考虑多种条件如表达α-葡聚糖磷酸化酶的难易、培养的难易、生长速率和安全性，可以容易的选择导入表达载体的细胞。例如当使用α-葡聚糖磷酸化酶来合成高分子量直链淀粉时，因为优选α-葡聚糖磷酸化酶不含淀粉酶污染，优选使用不产生淀粉酶或仅产生低水平淀粉酶的细胞。这样的细胞的实例包括微生物，如细菌和真菌。更优选的细胞的实例包括中温性微生物(例如大肠杆菌、枯草杆菌)。在本说明书中，所述“中温性微生物”是具有正常温度环境生长温度的微生物，具体指最佳生长温度20℃-40℃的微生物。细胞可以是如微生物细胞，或可以是植物或动物细胞。依赖于待用细胞，本发明的酶可以是经历翻译后加工的酶。植物包括但不限于双子叶植物，和单子叶植物如水稻、小麦、大麦和玉米。谷类如水稻具有在种子中积累储藏蛋白的性质，使用储藏蛋白系统，可以表达所述谷类使得本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在种子中积累(见日本特开平公开No.2002-58492的说明书)。
在本发明方法中，将表达载体导入细胞中的技术可以是本领域已知的任一种技术。这种技术的实例例如包括转化、转导和转染。这种导入核酸分子的技术在本领域公知，并且是常规技术，例如描述于Ausubel F.A.，et al.ed.(1988)，Current Protocols inMolecular Biology，Wiley，New York，NY；Sambrook J，et al.(1987)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，和Bessatsu Jikkenkagaku“Idenshidounyu & Hatsugen kaiseki jikkenhou”，Yodosha，1997。
当使用植物细胞作为细胞时，使转化体重新分化成组织或植物的方法在本领域公知。这种方法的实例描述如下：Rogers，et al.，Methods in Enzymology 118：627-640(1986)；Tabata，et al.，Plant Cell Physiol.，28：73-82(1987)；Shaw，Plant Molecular Biology：A Practical Approach.IRL press(1988)；Shimamoto，et al.，Nature 338：274(1989)；和Maliga，et al.，Methods in Plant Molecular Biology：A Laboratory course.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1995)。转化木本植物的方法描述于Molecular Biology ofWoody Plants(Vol.I，II)(ed.S.Mohan Jain，Subhash C.Minocha)，Kluwer AcademicPublishers，(2000)。此外，转化木本植物的方法例如详细描述于Plant Cell Reports(1999)19：106-110。因此，根据目标转基因植物，本领域技术人员可以适当的使用前述公知方法使转化体重新分化。目标基因导入如此所得转基因植物，并且可以用已知方法如Northern印迹和Western印迹分析或其它公知常规技术确认基因的导入。
通过培养已导入表达载体并获得表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶能力的细胞(也称转化细胞)，可以在细胞中表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。培养转化细胞的条件可根据待使用宿主细胞种类和表达载体中表达调节因子的种类适当选择。例如，通常使用振荡培养方法。
不具有限定用于培养转化细胞的培养基，只要所使用细胞生长并能表达目标耐热化α-葡聚糖磷酸化酶即可。除了碳源和氮源以外，如果必要可在培养基中单独或适当混合使用无机盐如磷酸盐、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Na+、K+等。此外，如果必要，可以添加培养转化细胞或表达目标耐热化α-葡聚糖磷酸化酶所必需的多种无机物或有机物。
可以选择转化细胞的培养温度使得适于生长待使用转化细胞。通常，温度在15℃-60℃之间。使连续培养转化细胞的时间足以表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
当使用带诱导型启动子的表达载体时，可通过加入诱导剂、改变培养温度和调节培养基成分来控制表达。例如，当使用带乳糖诱导型启动子的表达载体时，可通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
(2.5回收耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
然后可以回收所表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。例如，当在转化细胞中生成所表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶时，通过离心或过滤培养物从转化细胞培养物中回收细胞。所回收细胞悬于合适缓冲液中，并用常规方法(超声、French press、溶菌酶处理)破碎而获得粗酶液。进而，通过用适当组合的常规酶纯化方法如离心、层析、膜分离、电泳和盐析来纯化所述粗酶液，从而获得粗酶液或具有更高比活性的纯化酶。当不含水解葡聚糖的酶如α-淀粉酶时，可以直接使用粗酶，例如用于制备高分子量葡聚糖。
通过如上述生产耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，可以相当大的提高天然α-葡聚糖磷酸化酶的耐热性。此外，所表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以利用这种耐热性简单纯化。简单的说，通过在约60℃热处理含耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的细胞提取物，使污染酶不再溶解。通过离心所述不溶物而除去它们，并进行透析处理，从而获得纯化的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
(3.耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
通过前述方法获得的本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应基序序列1L：H-A-E-F-T-P-V-F-S中第4位的位置或对应基序序列1H：H-A-Q-Y-S-P-H-F-S中第4位的位置；对应基序序列2：A-L-G-N-G-G-L-G中第4位的位置；和对应基序序列3L：R-I-V-K-F-I-T-D-V中第7位的位置或对应基序序列3H：R-I-V-K-L-V-N-D-V中第7位的位置。
本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置。，除了这些位置上的氨基酸替换以外，本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶还可以含有相对于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方案中，，本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶含有下述氨基酸序列，其中相对于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸，并在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ IDNO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置。
本发明的所述酶是通过修饰植物来源的天然α-葡聚糖磷酸化酶而获得的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，含有下述氨基酸序列，其中相对于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸，并在选自下组的至少一个位置具有不同于所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置。
优选本发明的酶在选自下组的至少两个位置具有不同于天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ IDNO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置。最优选本发明的酶在以下所有位置具有不同于天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置。
天然α-葡聚糖磷酸化酶的前述三个位置被认为在α-葡聚糖磷酸化酶立体结构中与周围氨基酸相互作用形成立体的部分结构，使所述酶去稳定化。通过将这些位置的残基改变成另一个氨基酸残基，酶被稳定化，并且耐热性提高。此外，因为这些位置的残基在立体结构上与周围氨基酸残基相互作用，替换所述氨基酸残基具有意料之外重要的显著影响。例如，对于马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶，用其它残基替换F39位置的F具有意料之外重要的显著结果。此外，例如，对于马铃薯来源H型α-葡聚糖磷酸化酶，对应F39位置的氨基酸是Y，用其它氨基酸替换Y具有意料之外重要的显著影响。
根据本发明的所述酶中，对应所述基序序列1L或1H中第4位或F39位置的氨基酸残基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基以外的氨基酸。对应所述基序序列1L或1H中第4位或F39位置的氨基酸残基优选是脂肪族氨基酸或杂环氨基酸，更优选是脂肪族氨基酸，特别优选支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，尤其优选异亮氨酸或亮氨酸，最优选亮氨酸。
根据本发明的所述酶中，对应所述基序序列2中第4位或N135位置的氨基酸残基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基以外的氨基酸。对应所述基序序列2中第4位或N135位置的氨基酸残基优选是脂肪族氨基酸或杂环氨基酸，更优选是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸，特别优选半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。
根据本发明的所述酶中，对应所述基序序列3L或3H中第7位或T706位置的氨基酸残基可以是天然α-葡聚糖磷酸化酶中所发现氨基酸残基以外的氨基酸。对应所述基序序列3L或3H中第7位或T706位置的氨基酸残基优选是脂肪族氨基酸，更优选是支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)或含硫氨基酸(即半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸)，特别优选半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸，特别优选半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，最优选异亮氨酸。
在根据本发明的方法中，为制备耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，除了本发明目的的改变以外(这种替换使得α-葡聚糖磷酸化酶在选自下组的至少一个位置具有与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸残基不同的氨基酸残基：对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第39位苯丙氨酸(F39)的位置；对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第135位天冬酰胺(N135)的位置；和对应SEQ ID NO：2的氨基酸序列中第706位苏氨酸(T706)的位置)还可以进行氨基酸替换、添加、缺失或修饰。氨基酸替换表示用一种氨基酸替换另一种氨基酸。氨基酸添加表示在原氨基酸序列的任意位置插入一个或更多，例如1-10个、优选1-5个、更优选1-3个氨基酸。氨基酸缺失表示从原氨基酸序列的任意位置去除一个或更多，例如1-10个、优选1-5个、更优选1-3个氨基酸。氨基酸修饰的实例包括但不限于酰胺化、羧化、硫酸化、卤化、烷基化、糖基化、磷酸化、羟化和酰化(如乙酰化)。本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以通过肽合成方法合成，在这种情况下待替换或添加的氨基酸可以是天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸类似物。优选天然氨基酸。
本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以是具有α-葡聚糖磷酸化酶相同酶活性的酶类似物。如此处所用，术语“酶类似物”表示一种实体，它是与天然酶不同的化合物(compound)，但在至少一种化学功能或生物学功能上与天然酶等价。因此，所述酶类似物包括相对于起始天然酶添加或替换一个或更多个氨基酸类似物的实体。所述酶类似物具有这样的添加或替换，使得它的功能(如α-酸化酶活性或耐热性)与起始天然酶的功能基本相同或更好。这样的酶类似物可以用本领域公知的技术制备。因此，所述酶类似物可以是含氨基酸类似物的聚合物。在本说明书中，除非另外说明，所述“酶”包括这种酶类似物。
在本说明书中，所述“氨基酸”可以是天然氨基酸、非天然氨基酸、衍生氨基酸或氨基酸类似物。优选天然氨基酸。
术语“天然氨基酸”指天然氨基酸的L-异构体。天然氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、γ-羧基谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。除非另外说明，本说明书提及的氨基酸是L-构型，同时使用D-构型氨基酸的实施方案也在本发明范围内。
术语“非天然氨基酸”表示通常在天然蛋白中不被发现的氨基酸。非天然氨基酸的实例包括正亮氨酸、对-硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、对-氟苯丙氨酸、3-氨基-2-苯甲基丙酸、D-构型或N构型高精氨酸，以及D-苯丙氨酸。
术语“衍生氨基酸”表示通过衍生化氨基酸而获得的氨基酸。
术语“氨基酸类似物”表示不是氨基酸、但在物理性质和/或功能上与氨基酸相似的分子。氨基酸类似物的实例例如包括乙硫氨酸、刀豆氨酸和2-甲基谷氨酰胺。
在本说明书中，氨基酸可以用IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的任意公知三字母符号和单字母符号表示。与之相似，核苷酸可以用一般接受的单字母代码表示。
除了所述目的性修饰以外，耐热化α-葡聚糖磷酸化酶还可以包括相对于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言一个或几个或更多个氨基酸替换、添加或缺失引起的修饰，这样的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶也在本发明范围内。包括一个或几个或更多个氨基酸替换、添加或缺失的这种耐热化α-葡聚糖磷酸化酶例如可以根据描述于下文的方法制备：Molecualr Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，JohnWiley & Sons(1987-1997)，Nucleic Acids Research，10，6487(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)，Gene，34，315(1985)，Nucleic Acids Research 13，443(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，5662(1984)，Science，224，1431(1984)，PCT WO85/00817(1985)，Nature，316，601(1985)。
根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可用本领域公知的方法制备。例如，根据本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶中氨基酸的缺失、替换或添加可以通过本领域公知的定点突变技术进行。定点突变程序在本领域公知。例如，见Nucl.Acid Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)。
在本说明书中，当用于耐热化α-葡聚糖磷酸化酶时，所述“一个或几个或更多个氨基酸的替换、添加或缺失”或所述“至少一个氨基酸的替换、添加或缺失”表示一定数目的替换、添加或缺失，这种改变程度使α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性不丧失，优选所述酶活性与标准品(如天然α-葡聚糖磷酸化酶)等价或超过标准品。本领域技术人员可以容易的选择具有期望性质的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。另外，目标性耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以直接化学合成。这种化学合成方法在本领域公知。
由此制备的本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶优选与第一种(天然)α-葡聚糖磷酸化酶(优选马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶)的氨基酸序列具有约40％、更优选约45％、更优选约50％、更优选约55％、更优选约60％、更优选约65％、更优选约70％、更优选约75％、更优选约80％、更优选约85％、更优选约90％、更优选约95％和最更优选约99％一致性。
设计前述改变时，可以考虑氨基酸的疏水性指数。赋予蛋白质相互作用性生物功能的疏水性氨基酸指数显著性在本领域公知(Kyte.J and Doolittle，R.F.J.Mol.Biol.157(1)：105-132，1982)。氨基酸的疏水性对所产生蛋白的二级结构有贡献，并限定所述蛋白质和其它分子(如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)之间的相互作用。基于疏水性和带电性质，氨基酸被指定一个疏水性指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本领域公知用具有相似疏水性指数的另一种氨基酸替换某种氨基酸，从而可以产生仍然具有相似生物功能的蛋白质(如酶活性等价的蛋白质)。在这种氨基酸替换中，疏水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，进一步优选在±0.5以内。本领域中可以理解基于疏水性的这种氨基酸替换是有效率的。如USP No.4,554,101中描述，给氨基酸残基指定以下亲水性指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解，氨基酸可以用具有相似亲水性指数的另一种氨基酸替换，且仍然能是生物学等价的。在这种氨基酸替换中，所述亲水性指数优选在±2以内，更优选在±1以内，进一步优选在±0.5以内。
本发明中，“保守性替换”表示在氨基酸替换中起始氨基酸和待替换氨基酸之间如上述的亲水性指数或/和疏水性指数相似的替换。保守性替换的实例对本领域技术人员公知，并包括但不限于以下每组中间的替换，例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
(3.2评价耐热性的方法)
本发明所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶有一种特性，在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟以后，耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟以后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的优选约20％或更多，更优选约25％或更多，更优选约30％或更多，更优选约40％或更多，更优选约50％或更多，更优选约55％或更多，更优选约60％或更多，进一步优选约65％或更多，进一步优选约70％或更多，特别优选约80％或更多，最优选约90％或更多。
在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中65℃加热2分钟以后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的优选约40％或更多，更优选约45％或更多，进一步优选约50％或更多，进一步优选约55％或更多，特别优选约60％或更多，最优选约65％或更多。
(3.2.1测定α-葡聚糖磷酸化酶(GP)活性的方法)
这种测定GP酶活性的方法定量由G-1-P产生的游离无机磷酸(Pi)。
(i)200μl反应液(含12.5mM G-1-P、1％糊精和酶溶液的100mM乙酸盐缓冲液(pH6.0))在37℃保温15分钟。
(ii)加入800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM乙酸锌)，搅拌以终止反应。
(iii)加入200μl 568mM抗坏血酸(pH5.8)，然后混合。
(iv)37℃保温15分钟后，用分光光度计测定850nm吸光度。
(v)相似的用已知浓度的无机磷酸测定吸光度，并制作标准曲线。
(vi)由样品获得的吸光度值拟合到此标准曲线上，并由此确定样品中无机磷酸量。无机磷酸作为磷酸离子定量。未定量葡萄糖-1-磷酸的量。在本说明书中，当用这种测定方法测定时，1单位α-葡聚糖磷酸化酶活性定义如下：1分钟产生1μmol无机磷酸(Pi)的活性定义作1单位(U)。
(3.2.2测定耐热性的方法)
根据以下程序测定耐热性。
(i)0.2U/ml酶溶液(在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中)在55℃、60℃或65℃保温0到60分钟。
(ii)在多个时间点取酶溶液样品，并保持在冰上。
(iii)步骤(ii)中的酶溶液样品稀释10倍，根据GP活性测定方法测定酶活性。使用(Aafter)/(Abefore)×100％，计算在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃加热10分钟后所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性Aafter与加热前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性Abefore的比值。加热后耐热化α-葡聚糖磷酸化酶酶活性Aafter相对于加热前耐热化α-葡聚糖磷酸化酶酶活性Abefore的比值也称为剩余活性。
(3.3评价合成直链淀粉能力的方法)
本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有一种特性，它具有合成葡聚糖(尤其是直链淀粉)的能力，所述葡聚糖的重均分子量优选是约60kDa或更高，更优选约100kDa或更高，进一步优选约150kDa或更高，进一步优选约200kDa或更高，进一步优选约250kDa或更高，进一步优选约300kDa或更高，进一步优选约350kDa或更高，进一步优选约400kDa或更高，进一步优选约450kDa或更高，进一步优选约500kDa或更高，进一步优选约550kDa或更高，进一步优选约600kDa或更高，最优选约650kDa或更高。重均分子量约5kDa到约599kDa的葡聚糖几乎不溶于水，而重均分子量约600kDa或更高的葡聚糖有可溶于水的特别优点。通过本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡聚糖的重均分子量没有具体上限，但可以极高生产率合成最高为1000kDa、最高为10000kDa、最高为100000kDa的葡聚糖。
所述“合成重均分子量为60kDa或更高的直链淀粉的能力”表示当通过使用40μM麦芽四糖、250mM葡萄糖-1-磷酸、200mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)和4U/ml耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(纯化酶)反应液在37保温18小时合成直链淀粉时，其重均分子量是60kDa或更高。类似的定义合成具有其它重均分子量直链淀粉的能力，例如，“合成重均分子量为600kDa或更高的直链淀粉的能力”表示当在此条件下合成直链淀粉时，其重均分子量是600kDa或更高。
例如可以通过以下方法测定直链淀粉的重均分子量。
首先，将所合成直链淀粉完全溶解于1N氢氧化钠，用适量盐酸中和，使用差示折光计和多角光散射检测器将一小份约30-300μg的直链淀粉进行凝胶过滤层析，从而获得平均分子量。
更具体的，使用Shodex SB806M-HQ(SHOWA DENKO K.K.制造)作为柱子，使用依次连接的多角光散射检测器(DAWN-DSP，Wyatt Technology制造)和差示折光计(Shodex RI-71，SHOWA DENKO K.K.制造)作为检测器。柱子保持在40℃，并使用0.1M硝酸钠溶液以1mL/min流速作为洗脱剂。用数据分析软件(商品名ASTRA，Wyatt Technology制造)收集所得信号，并用相同软件分析，从而得到重均分子量。
(3.4评价保存稳定性的方法)
与天然α-葡聚糖磷酸化酶比较，根据本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶优选具有更高保存稳定性。在本说明书中，所述“保存稳定性更高”表示与天然α-葡聚糖磷酸化酶比较所述酶几乎不被降解的情况。
在一个实施方案中，保存稳定性表示当保存在4℃时的稳定性。在此情况下，当根据本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶纯化后在4℃保存一段时间时，所述酶蛋白的分子量几乎等于纯化后即刻的分子量。一般来说，当天然α-葡聚糖磷酸化酶在4℃长期保存时会降解，与纯化后即刻比较酶蛋白的分子量降低。本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶优选在4℃保存1个月、更优选在4℃保存3个月、最优选在4℃保存5个月后，它具有与纯化后即刻大致相等的分子量。
另一方面，保存稳定性表示保存在37℃时的稳定性。在此情况下，当根据本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶纯化后在37℃保存一段时间时，所述酶蛋白的分子量与纯化后即刻的分子量大致相等。一般来说，当天然α-葡聚糖磷酸化酶在37℃长期保存时会降解，并且与纯化后即刻比较酶蛋白的分子量降低。另一方面，本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶优选在37℃保存4天、更优选在37℃保存7天、最优选在37℃保存10天后，它具有与纯化后即刻大致相等的分子量。
当然，本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以保存在正常用于保存的任意温度。用于保存的温度可以是约4℃到约37℃之间的任意温度(如约4℃、约5℃、约10℃、约20℃、约25℃、约37℃等)。
可以用本领域已知的任意方法评价保存稳定性。例如，纯化后即刻的酶蛋白和已在预定温度保存一段时间的酶蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，并通过比较这些酶蛋白的分子量评价稳定性。
(4.用本发明的酶制备葡聚糖的方法)
本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可有利地用于合成葡聚糖的方法。用本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡聚糖的方法可以是本领域已知的合成葡聚糖的任意方法。但本发明的α-葡聚糖磷酸化酶优选用于同时用蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶使蔗糖和引发剂反应的方法(也称SP-GP方法)中。所述SP-GP方法具有可使用廉价底物生产线性葡聚糖的优点。
本发明合成葡聚糖的方法包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂，和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
本发明合成葡聚糖的方法可以是不基于SP-GP方法的方法。在这种方法的情况下，本发明合成葡聚糖的方法包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有本发明的所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、引发剂和葡萄糖-1-磷酸。
在本说明书中，所述“葡聚糖”表示一种糖，其中含D-葡萄糖作为组成单元，并具有以α-1，4-糖苷键连接的至少两个糖单元或更多个糖单元。葡聚糖可以是线性、支链或环状分子。线性葡聚糖与α-1，4-葡聚糖有相同含义。在线性葡聚糖中，糖单元之间只用α-1，4-糖苷键连接。含有一个或更多α-1，6-糖苷键的葡聚糖是支链葡聚糖。某种程度上葡聚糖优选含有线性节段。无分支的线性葡聚糖较为优选。
某些情况下葡聚糖优选具有小数目的(即α-1，6-糖苷键的数目)分支。这种情况下，分支数目代表性的是0-10000，优选0-1000，更优选0-500，进一步优选0-100，进一步优选0-50，进一步优选0-25，进一步优选0。
本发明的葡聚糖中，将α-1，6-糖苷键当作1，α-1，4-糖苷键数目相对于α-1，6-糖苷键数目的比值优选是1-10000，更优选2-5000，进一步优选5-1000，进一步优选10-500。
α-1，6-糖苷键可以随机分布于葡聚糖中，也可以均匀分布。分布程度使得在葡聚糖中优选形成5个或更多糖单元的线性部分。
葡聚糖可以只由D-葡聚糖构成，或可以是一定程度修饰的衍生物，这种修饰程度使这种葡聚糖的性质不变差。所述葡聚糖优选不修饰。
葡聚糖的代表性分子量是约8×103或更高，优选约1×104或更高，更优选约5×104或更高，进一步优选约1×105或更高，进一步优选约6×105或更高。葡聚糖的代表性分子量是约1×108或更低，优选约3×107或更低，更优选约1×107或更低，进一步优选约5×106或更低，进一步优选约1×106或更低。在本发明中，除非另外说明，葡聚糖的分子量指重均分子量。
本领域技术人员容易理解，通过适当选择用于本发明生产方法的底物量、酶量、反应时间等可以获得具有期望分子量的葡聚糖。
具有极佳生产率的SP-GP法描述于国际公开WO 02/097107小册子。
在本发明生产方法中，例如，耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸、缓冲剂和溶解它的溶剂被用作主要材料。通常这些材料在反应开始时全部加入，其中的任何材料还可以在反应过程中加入。在本发明的生产方法中，如果必要，可以使用选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖基转移酶和糖原脱支酶的酶。根据葡聚糖的期望结构，可以在本发明生产方法开始时或在反应中途将选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖基转移酶和糖原脱支酶的酶加入反应溶液中。
在本说明书中，所述“蔗糖磷酸化酶”表示将蔗糖的α-糖苷基转移到磷酸基上以进行磷酸解作用的任何酶。由蔗糖磷酸化酶催化的反应由以下方程式表示：
Figure G200480017157XD00531
自然界中多种生物含有蔗糖磷酸化酶。产生蔗糖磷酸化酶的实例包括但不限于链球菌属的细菌(如嗜热链球菌、转糖链球菌、肺炎链球菌和缓症链球菌)、肠膜明串珠菌、假单胞菌属、梭菌属、Pullularia pullulans、木醋杆菌、农杆菌属、Synecococcussp.、大肠杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌、青春双歧杆菌、黑曲霉、链孢霉、Sclerotineaescerotiorum和衣藻。
蔗糖磷酸化酶可以来源于产生蔗糖磷酸化酶的任何生物。蔗糖磷酸化酶优选具有一定程度的耐热性。更优选当蔗糖磷酸化酶单独存在时具有更高耐热性。例如在存在4％蔗糖下在55℃加热蔗糖磷酸化酶30分钟时，优选保留加热前蔗糖磷酸化酶活性的20％或更多。蔗糖磷酸化酶优选来源于选自转糖链球菌、肺炎链球菌、肠膜明串珠菌、酒类酒球菌、长双岐杆菌、葡萄土壤杆菌、嗜糖假单胞杆菌、大肠杆菌和无害利斯特氏菌的细菌，更优选可以来源于选自转糖链球菌、肺炎链球菌、肠膜明串珠菌和酒类酒球菌的细菌，进一步优选可以来源于转糖链球菌或肺炎链球菌。
蔗糖是分子量约342的二糖，用C12H22O11表示。蔗糖存在于具有光合作用能力的所有植物中。蔗糖可以从植物中分离，或可以化学合成。从成本观点来看，优选从植物分离蔗糖。含大量蔗糖的植物的实例包括甘蔗和甜菜。甘蔗汁含约20％蔗糖。甜菜汁含约10-15％蔗糖。可以在从含蔗糖的植物液或汁到纯化蔗糖的任意纯化阶段提供蔗糖。
用于本发明生产方法的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶和蔗糖磷酸化酶可分别用于反应，甚至当固定化时也是如此，而无论是纯化酶还是粗酶，并且反应形式可以是批次形式或连续形式。作为固定化方法，可以使用载体结合方法(如共价结合方法、离子结合方法或物理吸附方法)、交联方法或包合方法(格形式或微胶囊形式)。
引发剂的实例包括低聚麦芽糖、直链淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、普鲁分支葡聚糖、偶联糖、淀粉，及其衍生物。
在本说明书中，无机磷酸指SP反应中能提供磷酸根底物的物质。在本说明书中，磷酸根底物表示用作葡萄糖-1-磷酸的磷酸部分原材料的物质。人们认为，在由蔗糖磷酸化酶催化的蔗糖磷酸解中，无机磷酸以磷酸根离子形式起底物作用。因为这种底物一般在本领域称为无机磷酸，在本说明书中这种底物也被称为无机磷酸。无计磷酸包括磷酸和磷酸的无机盐。通常，无机磷酸在含阳离子如碱金属离子的水中使用。在此情况下，因为磷酸、磷酸盐和磷酸根离子处于平衡状态，不可能区分磷酸和磷酸盐。因此，为了方便，磷酸和磷酸盐通称无机磷酸。在本发明中，无机磷酸优选是磷酸的的任意金属盐，更优选是磷酸的碱金属盐。无机磷酸的优选具体实例包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸(H3PO4)、磷酸二氢铵和磷酸氢二铵。
SP-GP反应体系中在反应起始时可以含有仅一种或多种无机磷酸。
例如可以通过物理、化学或酶促反应降解磷酸缩合物如多磷酸(如焦磷酸、三磷酸和四磷酸)或其盐、并将此加入反应液中来提供无机磷酸。
在本说明书中，葡萄糖-1-磷酸指葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐。葡萄糖-1-磷酸优选是狭义葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意金属盐，更优选是葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)的任意碱金属盐。葡萄糖-1-磷酸的优选具体实例包括葡萄糖-1-磷酸二钠、葡萄糖-1-磷酸二钾和葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)。在本说明书中，没有在括号内标出化学式的葡萄糖-1-磷酸表示广义的葡萄糖-1-磷酸，即狭义葡萄糖-1-磷酸(C6H13O9P)及其盐。
SP-GP反应体系中在反应起始时可以含有仅一种或多种葡萄糖-1-磷酸。
根据本发明生产葡聚糖的方法中，当在产物中产生分支时，如当使用含α-1，6-糖苷键的起始材料时，如果必要可使用脱支酶。
可用于本发明的脱支酶是能切割α-1，6-糖苷键的酶。脱支酶分成两类，良好作用于支链淀粉和糖原的异淀粉酶(EC3.2.1.68)，和作用于支链淀粉、糖原和普鲁分支葡聚糖的α-糊精内-1，-α-糖苷酶(也称支链淀粉酶(pullulanase))(EC3.2.1.41)。
脱支酶存在于微生物、细菌和植物中。产生脱支酶的微生物实例包括酿酒酵母菌和衣藻属物种。产生脱支酶的细菌实例包括短芽孢杆菌、Bacillus acidopullulyticus、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、环状芽孢杆菌、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、肺炎克雷伯氏菌、嗜温高温放线菌(Thermoactinomyces thalpophilus)、Thermoanaerobacter ethanolicus和Pseudomonasamyloderamosa。产生脱支酶的植物实例包括马铃薯、甘薯、玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦和甜菜。产生脱支酶的生物不限于以上实例。
根据本发明的方法中，当希望在产物中产生分支时，如果必要可使用分支酶。
可用于本发明的分支酶是可转移一部分α-1，4-葡聚糖链到该α-1，4-葡聚糖链的某个葡萄糖残基上的第6位从而形成分支的酶。分支酶也称1，4-α-葡聚糖分支酶、分支产生酶或Q酶。
分支酶存在于微生物、动物和植物中。产生分支酶的微生物实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、热容芽孢杆菌(Bacillus caldolyticus)、Bacillus lichecniformis、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、Bacillus caldovelox、Bacillus thermocatenulatus、Bacillus smithii、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短芽孢杆菌、Alkalophilic Bacillus sp.、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、Aquifex aeolicus、蓝藻物种(Synechosystis sp.)、大肠杆菌、根癌土壤杆菌、水生栖热菌、Rhodothermus obamensis、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和酵母。产生分支酶的动物的实例包括诸如人、兔、大鼠和猪的哺乳动物。产生分支酶的植物实例包括藻类；块茎和根作物如马铃薯、甘薯、薯蓣和木薯；蔬菜如菠菜；谷类如玉米、水稻、小麦、大麦、黑麦和粟；与豆类如豌豆、大豆、赤豆和杂色菜豆。产生分支酶的生物不限于以上实例。
在根据本发明的方法中，当在产物中产生环状结构时，如果必要可以使用4-α-葡聚糖转移酶。
可用于本发明的4-α-葡聚糖转移酶也称歧化酶、D-酶或淀粉麦芽糖酶，是可催化低聚麦芽糖的糖转移反应(歧化反应)的酶。4-α-葡聚糖转移酶是将葡萄糖基团或麦芽糖基或低聚麦芽糖基单元从供体分子的非还原端转移到受体分子的非还原端的酶。因此酶反应导致最初给定的低聚麦芽糖的聚合程度歧化。当供体分子和受体分子相同时，引起分子内转移，并因而得到有环状结构的产物。
4-α-葡聚糖转移酶存在于微生物和植物中。产生4-α-葡聚糖转移酶的微生物实例包括Aquifex aeolicus、肺炎链球菌、丁酸杆菌(Clostridium butylicum)、耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、Thermococcus litralis、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Thermotoga neapolitana、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、热球菌属物种(Pyrococcus sp.)、嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、蓝藻、大肠杆菌和水生栖热菌。产生4-α-葡聚糖转移酶的植物实例包括块茎和根作物如马铃薯、甘薯、薯蓣和木薯；谷类如玉米、水稻和小麦；与豆类如豌豆和大豆。产生4-α-葡聚糖转移酶的生物不限于以上实例。
在根据本发明的方法中，当在产物中产生环状结构时，如果必要可以使用糖原脱支酶。
可用于本发明的糖原脱支酶是具有两种活性的酶，即α-1，6-糖苷酶活性和4-α-葡聚糖转移酶活性。由于糖原脱支酶具有4-α-葡聚糖转移酶活性，而获得具有环状结构的产物。
糖原脱支酶存在于微生物和动物。产生糖原脱支酶的微生物实例包括酵母。产生糖原脱支酶的动物实例包括哺乳动物如人、兔、大鼠和猪。产生糖原脱支酶的生物不限于以上实例。
用于本发明生产方法的溶剂可以是任何溶剂，只要它不破坏蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性。
只要产生葡聚糖的反应可以发生，溶剂就不必要完全溶解用于根据本发明生产方法的物质。例如，当酶由固相载体携带时，酶不必要溶于溶剂。进而，不必所有反应物质如蔗糖都溶解，只要部分物质的溶解程度可使反应进行就足够了。
代表性的溶剂是水。溶剂可以是细胞裂解液中的水，在制备蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶时同时伴随蔗糖磷酸化酶或α-葡聚糖磷酸化酶。
在含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液中，还可以含有任何其它物质，只要不阻碍所述蔗糖磷酸化酶和蔗糖之间相互作用以及所述α-葡聚糖磷酸化酶与所述引发剂之间相互作用即可。这种物质的实例包括缓冲剂、产生α-葡聚糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌)成分、产生蔗糖磷酸化酶的微生物(如细菌、真菌)成分、盐和培养基成分。
待使用的这些物质的量是已知的，并且可由本领域技术人员适当选择。
在根据本发明的生产方法中，首先制备反应溶液。例如，可通过向合适溶剂中加入α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、固体蔗糖、引发剂、和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸来制备反应溶液。另外，可通过混合分别含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、或无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸的溶液来制备反应溶液。作为替代方案，可通过将其它固体成分与含有α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂、和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸中一些成分的溶液混合来制备反应溶液。如果必要，为调节pH的目的，可以向此反应溶液中加入任何缓冲剂，只要它不抑制酶反应即可。如果必要，可以向此反应溶液中加入选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶。
如果必要，然后通过本领域已知的方法加热反应溶液以使之反应。只要得到本发明的效果，反应温度可以是任何温度。当反应起始时反应溶液中的蔗糖浓度是约5％到约100％时，代表性的反应温度可以是约30℃到约75℃。优选的是，在此反应步骤中的溶液温度应使得预定反应时间后此反应溶液中所含蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶中至少一种、优选两种酶活性保持反应前活性的约20％或更高，更优选约30％或更高。这种温度优选是约55℃到约75℃，更优选约60℃到约75℃，进一步优选约60℃到约70℃，特别优选约60℃到约65℃。
考虑到反应温度、反应产生葡聚糖的分子量和剩余酶活性，反应时间可以设定为任何时间。代表性反应时间是约1小时到约100小时，更优选约1小时到约72小时，进一步更优选约2小时到约36小时，最优选约2小时到约24小时。
以此方式，生产含葡聚糖的溶液。
(5.用根据本发明的酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法)
本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶也可以优选用于合成葡萄糖-1-磷酸的方法。使用根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶合成葡萄糖-1-磷酸的方法可以是本领域已知合成葡萄糖-1-磷酸的任何方法。
本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法包括使含有本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸的反应液发生反应，以产生葡萄糖-1-磷酸。
用于根据本发明合成葡萄糖-1-磷酸的方法中葡聚糖和无机磷酸的定义与前述4中的相同。
待用于合成葡萄糖-1-磷酸方法中的物质的量已知，并可以由本领域技术人员适当选择。
在根据本发明合成葡萄糖-1-磷酸方法中首先制备反应溶液。例如，可通过向合适溶剂中加入α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸来制备反应溶液。作为替代方案，可通过混合分别含有α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖或无机磷酸的溶液来制备反应溶液。作为替代方案，可通过将其它固体成分与含α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸中一些成分的溶液混合来制备反应溶液。如果必要，为调节pH的目的，可以向此反应溶液中加入任何缓冲剂，只要它不抑制酶反应即可。如果必要，可以向此反应溶液中加入脱支酶。
然后，如果必要，通过本领域已知的方法加热反应溶液以使之反应。只要得到本发明的效果，反应温度可以是任何温度。代表性的反应温度可以是约30℃到约75℃。优选的是，此反应步骤中的溶液温度应使得预定反应时间后此反应溶液中所含α-葡聚糖磷酸化酶活性保持反应前活性的约20％或更高，更优选约30％或更高。这种温度优选是约55℃到约75℃，更优选约60℃到约75℃，进一步优选约60℃到约70℃，特别优选约60℃到约65℃。
考虑到反应温度和剩余酶活性，反应时间可以设定为任何时间。代表性反应时间是约1小时到约100小时，更优选约1小时到约72小时，进一步更优选约2小时到约36小时，最优选约2小时到约24小时。
以此方式，生产含葡萄糖-1-磷酸的溶液。
(6.使用根据本发明酶的其它生产方法)
除了前述生产方法以外，本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可用于使用α-葡聚糖磷酸化酶的本领域已知的任何生产方法。在这些生产方法中使用本发明耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可容易的由本领域技术人员实施。
(7.通过本发明生产方法获得的葡聚糖的用途)
通过本发明生产方法获得的葡聚糖可用于本领域已知的葡聚糖用途。葡聚糖中，尤其是不溶性直链淀粉中，预测具有与膳食纤维相同的功能，并预计可用于健康食品。另外，因为直链淀粉具有例如能在分子中包合碘或脂肪酸的特性，可以预计在药物、化妆品或卫生产品领域的用途。直链淀粉能用作生产具有与直链淀粉相同包合能力的环糊精和环状淀粉(cycloamylose)的原材料。另外，含直链淀粉的膜具有与通用塑料相当的抗张强度，因而是非常有前景的生物降解塑料的材料。以此方式，可以预计直链淀粉的很多用途。
(8.通过本发明合成方法获得的葡萄糖-1-磷酸的用途)
根据本发明合成方法获得的葡萄糖-1-磷酸可用于本领域已知的葡萄糖-1-磷酸用途。葡萄糖-1-磷酸用作医用抗菌药、抗肿瘤药(作为铂络合物)、治疗心脏病的药物(作为胺盐)或合成葡聚糖的底物。
将基于实施例在下面解释本发明，但提供实施例的目的只是为了举例说明。因此，本发明的范围不受前述本发明详细解释和以下实施例的限制，而仅受权利要求书限制。
实施例
(1.测定方法和计算方法)
根据以下测定方法测定本发明中的各种物质。
(1.1定量葡萄糖)
用商品化测定试剂盒定量葡萄糖。用葡萄糖AR-II显色试剂(由Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)测定葡萄糖。
(1.2定量果糖)
用商品化测定试剂盒定量果糖。用F-kit，D-glucose/D-fructose(Roche制造)测定果糖。
(1.3定量葡萄糖-1-磷酸)
用以下方法定量葡萄糖-1-磷酸。向300μl测定试剂(200mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM NAD P，15mM氯化镁，3mM EDTA，15μM葡萄糖-1，6-二磷酸，6μg/ml葡萄糖磷酸变位酶，6μg/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)中加入600μl含适当稀释葡萄糖-1-磷酸的溶液，搅拌，所得反应混合物在37℃反应30分钟。此后，用分光光度计测定340nm吸光度。相似的测定已知浓度的葡萄糖-1-磷酸钠盐的吸光度，以制作标准曲线。将由样品获得的吸光度值拟合到此标准曲线上，并由此确定样品中葡萄糖-1-磷酸浓度。通常，在1分钟内产生1μmol葡萄糖-1-磷酸的活性定义为1单位。在此定量方法中，只定量葡萄糖-1-磷酸，而不定量无机磷酸的量。
(1.4定量无机磷酸)
用以下方法获得磷酸根离子形式的无机磷酸。向含无机磷酸的溶液(200μl)中混合800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM乙酸锌)，随后加入200μl 568mM抗坏血酸(pH5.0)，搅拌，所得反应混合物在37℃反应30分钟。此后，用分光光度计测定850nm吸光度。相似的测定已知浓度的无机磷酸的吸光度，以制作标准曲线。将由样品获得的吸光度值拟合到此标准曲线上，并由此确定样品中无机磷酸的测定值。在此定量方法中，定量无机磷酸的量，而不定量葡萄糖-1-磷酸的量。
(1.5由葡萄糖-1-磷酸产生葡聚糖产率的计算方法)
通过以下公式，从反应终止后溶液中无机磷酸和葡萄糖的量得到不用蔗糖磷酸化酶、用α-葡聚糖磷酸化酶和作为起始材料的葡萄糖-1-磷酸产生葡聚糖(如直链淀粉)的产率。
(葡聚糖产率(％))
＝(用于葡聚糖合成的葡萄糖(mM))÷(初始葡萄糖-1-磷酸(mM))×100
＝{(反应产生的无机磷酸(mM))-(反应后葡萄糖(mM))}÷(初始葡萄糖-1-磷酸(mM))×100
(1.6由蔗糖产生葡聚糖产量的计算方法)
用以下公式，从反应终止后溶液中葡萄糖、果糖和葡萄糖-1-磷酸的量得到SP-GP方法中用无机磷酸作为起始物产生葡聚糖(如直链淀粉)的产量。
葡聚糖(mM葡萄糖当量)
＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))
此公式基于以下原理。
在本发明生产方法中，首先可以发生根据以下方程式的反应(A)。
(A)蔗糖+无机磷酸→葡萄糖-1-磷酸+果糖
此反应由蔗糖磷酸化酶催化。在此反应中，蔗糖和无机磷酸反应生成等摩尔量的葡萄糖-1-磷酸和果糖。因为所得果糖不再与其它物质反应，通过测定果糖的摩尔量可知所生成葡萄糖-1-磷酸的摩尔量。
除了前述反应(A)以外，作为副反应，蔗糖磷酸化酶可以催化以下反应(B)中蔗糖水解。
(B)蔗糖→葡萄糖+果糖
掺入葡聚糖中的葡萄糖量可如下计算。
掺入葡聚糖中的葡萄糖量
＝(反应(A)生成的葡萄糖-1-磷酸量)-(未反应葡萄糖-1-磷酸量)
＝(反应(A)生成的果糖量)-(未反应葡萄糖-1-磷酸量)
考虑到反应(B)生成的果糖，如下计算反应(A)生成的果糖量：
反应(A)生成的果糖量
＝(反应终止后的果糖量)-(反应终止后的葡萄糖量)
因此，由以下公式得到葡聚糖的产量。
(葡聚糖(mM葡萄糖当量))
＝(果糖(mM)-(葡萄糖-1-磷酸(mM))-(葡萄糖(mM))
由以下公式，从起始葡萄糖-1-磷酸量以及反应终止后溶液中葡萄糖、果糖和葡萄糖-1-磷酸量得到用葡萄糖-1-磷酸作为起始材料生成的葡聚糖产量。
(葡聚糖(mM葡萄糖当量))
＝(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM)-(葡萄糖(mM))-(反应后葡萄糖-1-磷酸(mM))
此公式基于以下原理。
在反应溶液中，除了起始葡萄糖-1-磷酸，还由反应(A)产生葡萄糖-1-磷酸。也就是说，起始葡萄糖-1-磷酸和生成的葡萄糖-1-磷酸可用于葡聚糖合成。通过从可用于葡聚糖合成的葡萄糖-1-磷酸量中减去反应终止后反应溶液中剩余的葡萄糖-1-磷酸量，可以计算用于反应的葡萄糖-1-磷酸量，即掺入葡聚糖中的葡萄糖量。因此，可用前述公式得到掺入葡聚糖中的葡萄糖量。当在SP-GP反应体系中一起使用无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时也可应用此公式。
(1.7由蔗糖产生的葡聚糖产率的计算方法)
当用无机磷酸作为起始材料时生成的葡聚糖产率可用以下公式得到。
(葡聚糖产率(％))
＝(葡聚糖(mM葡萄糖当量))/(起始蔗糖(mM))×100
当用葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时生成的葡聚糖产率可用以下公式得到。
(葡聚糖产率(％))
＝{(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))+(果糖(mM))-(葡萄糖(mM))-(反应后葡萄糖-1-磷酸(mM))}÷{(起始蔗糖(mM))+(起始葡萄糖-1-磷酸(mM))}×100
当在SP-GP反应体系中一起使用无机磷酸和葡萄糖-1-磷酸作为起始材料时此公式也适用。
(实施例1：马铃薯耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的制备、筛选和测序)
简单概括的说，向马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因中引入随机突变，将带有随机突变的基因导入大肠杆菌，表达带随机突变的α-葡聚糖磷酸化酶，并从表达α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌中，选择所表达的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在60℃加热10分钟后能够合成葡聚糖的大肠杆菌，从该大肠杆菌中分离耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的基因，并确定其序列。
细节如下。
首先，制备马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶(GP)基因。根据Takaha等人(Journal of Biological Chemistry，vol.268，pp.1391-1396，1993)所述，用公知方法从马铃薯块茎制备mRNA，并用商品试剂盒制备cDNA文库。
然后，基于已知GP基因序列(数据库GenBank登记号D00520)，设计PCR引物1和PCR引物2。利用前述cDNA文库作模板，并用如下PCR引物1和2，PCR引物1：5′AAATCGATAGGAGGAAAACAT ATG ACC TTG AGT GAG AAA AT 3’(SEQ ID NO：38)
和
PCR引物2：5′GAAGGTACCTTTTCATTCACTTCCCCCTC3′(SEQ ID NO：39)，进行PCR反应以扩增马铃薯来源GP的基因。PCR条件是30个循环的PCR反应，一个循环是94℃30秒、50℃1分钟和72℃3分钟。PCR引物1的下划线部分对应L型GP成熟蛋白N端区的结构基因序列，而PCR引物2的下划线部分对应L型GP结构基因终止密码子即下游的碱基序列。
扩增的GP基因插入预先用SmaI切割的质粒pMW118(由Nippon Gene Co.Ltd.制造)中，并选择具有如图2序列的质粒。用磷酸钙沉淀方法将此质粒导入大肠杆菌TG-1，选择氨苄青霉素抗性菌株，培养此氨苄青霉素抗性菌株，并从此氨苄青霉素抗性菌株回收质粒，从而得到马铃薯来源L型GP的基因。
用本领域技术人员已知的易错PCR方法(参考文献：Leung，et al.(Technique 1，11-15，1989)和Cadwell and Joyce(PCR Methods Applic.2，28-33，1992))，用PCR引物3和PCR引物4进行PCR反应，扩增所得马铃薯来源L型GP的基因，
PCR引物3：5′TTCGGATCCTCACCTTGAGTGAGAAAATTCAC-3′(SEQ ID NO：40)
和
PCR引物4：5′TTCGGATCCTTTTCATTCACTTCCCCCTC-3′(SEQ ID NO：41)，PCR反应条件为90℃30秒，随后25个循环，一个循环是94℃30秒和68℃3分钟，随后68℃1分钟。所扩增DNA片段的平均2到3个位置引入碱基替换。PCR引物3的下划线部分对应L型GP成熟蛋白N端区的结构基因序列，而PCR引物4的下划线部分对应L型GP结构基因终止密码子即下游的碱基序列。
将带随机突变的GP基因扩增片段引入预先用BamHI切割的质粒pET3d(STRATAGENE制造)中，制备带随机突变的质粒文库供筛选耐热化GP。用此质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，稀释转化子以获得独立菌落，并铺板于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基(50μg/ml氨苄青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，1.5％琼脂糖，pH 7.3)上，随后在30℃培养24小时。将所得平板上的菌落转移到尼龙滤膜上。充分干燥粘附菌落的滤膜表面，并将滤膜在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中60℃保温10分钟。转移后，剩余平板接着在37℃培养数小时，然后保存于4℃作为母板。将热处理的滤膜施加到含葡聚糖合成底物的凝胶(含0.05％糊精，50mM G-1-P，100mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)，0.7％琼脂糖)上，使得粘附菌落的表面与凝胶表面粘附，并在50℃保温2小时。从凝胶上剥离滤膜，浸入碘溶液(0.1％碘化钾，0.01％碘)中，利用碘淀粉反应检测滤膜上合成的葡聚糖。从母板上分离对应染成蓝色的菌落。
从由此所得每种大肠杆菌中，根据本领域已知方法回收质粒，并用DNA测序仪(ABI制造)确定此质粒上耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因的碱基序列。
当将由这种耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因编码的氨基酸序列与天然马铃薯L型(即突变前)α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列进行比较时，突变被引入天然马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的第39位、第135位或第706位氨基酸，并分别发生氨基酸替换F39→L、N135→S或T706→I。此外，F39突变成非L氨基酸、N135突变成非S氨基酸或T706突变成非I氨基酸的GP中也发现耐热性提高。
(实施例2-1A：通过定点突变制备马铃薯L型耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
在本实施例中，制备只在实施例1中发现有助于提高耐热性的一个位置发生替换的耐热化GP、具有任意两个替换组合的耐热化GP、和具有所有三个替换的耐热化GP。作为实例，具有所有三种突变(F39L+N135S+T706I)的耐热化GP的氨基酸序列表示于SEQ ID NO：34，编码它的碱基序列表示于SEQ ID NO：33。为了比较，制备在第39位、第135位和第706位没有氨基酸替换、而在与这些氨基酸位置无关位置的氨基酸被替换(仅467位赖氨酸被替换成天冬氨酸的GP，和仅711位苏氨酸被替换成丙氨酸的GP)的GP。已公开很多替换氨基酸的方法(参考文献：Kinkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488(1995)，Vandeyar，M.，et al.，Gene，65：129-133(1988)，Sugimoto，M.，et al.，Anal.Biochem.，179：309-311(1989)，Taylor，J.W.and Eckstein，F.，Nucl.Acids Res.，13：8764(1985)，Nelson，M.and McClelland，M.，Methods Enzymol.，216：279-303(1992))。
在本发明中，使用Quick change XL Site-Directed Mutagenesis试剂盒(STRATAGENE制造)。使用实施例1中所示的含插入pMW-118质粒中的马铃薯来源L型GP基因的质粒作为模板，并且每个突变使用一组引入突变的引物，进行PCR反应，以实现定点突变，其中每组引物相对于中心引入突变位置有约35bp互补，并设计引入突变F39L、N135S、T706I、K467D或T711A。制备含由此获得的耐热化GP编码基因的质粒pMW-PGP。用该质粒转化大肠杆菌TG-1，稀释转化子以获得独立菌落，并铺板到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基(50μg/ml氨苄青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，1.5％琼脂糖，pH 7.3)上，随后在37℃培养过夜。在这种含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的大肠杆菌携带导入的质粒。以此方式，制备表达耐热化GP的大肠杆菌。从所得大肠杆菌中提取质粒，并测序编码GP的基因，确认本实施例获得的大肠杆菌中含有的质粒具有编码带目标突变的耐热化GP的突变型GP基因。
按如下验证本实施例所得大肠杆菌表达的GP是耐热化GP。携带导入质粒的大肠杆菌TG-1接种在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基(50μg/ml氨苄青霉素，Difco制造的胰蛋白胨1％，Difco制造的酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，1.5％琼脂糖，pH7.3)上，随后在37℃生长到对数中期，温度降低到约22℃，加入基因表达诱导剂异丙基β-D-硫代半乳糖苷到终浓度0.1mM，加入吡哆醇到终浓度1mM，随后在22℃培养约20小时。离心培养物以回收细菌细胞，将细菌细胞悬于缓冲液中，并超声处理悬液以得到细菌细胞提取物。将此细菌提取物在60℃处理30分钟，以获得确证的GP制备物。
当通过使蔗糖磷酸化酶和α-葡聚糖磷酸化酶对蔗糖和引发剂进行反应的方法(描述于国际公开WO 02/097107小册子中的方法)，用所得确证GP制备物生产葡聚糖时，对于所有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可以高产率获得高分子量葡聚糖。
另一方面，在与提高耐热性无关位置氨基酸被替换的GP经60℃处理30分钟被灭活，而不能产生葡聚糖。
(实施例2-1B：制备多种氨基酸替换的修饰型马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶)
除了使用设计的引物使得在F39、N135和T706的一个位置用另一个氨基酸残基替换以外，根据与实施例2-1A相同的方式，制备含修饰型α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒，并得到多种修饰型GP的确证制备物。
这些修饰型GP确证制备物的耐热性在以下实施例3-1(3-1)中详细研究。
(实施例2-2A：通过定点突变制备马铃薯H型耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
除了用马铃薯来源H型α-葡聚糖磷酸化酶基因代替马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因以外，根据与实施例2-1A相同的方式，制备含耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒，并获得GP的确证制备物。在本实施例中，制备下述耐热化GP，在实施例1中发现有助于提高耐热性的替换位置中，其仅在对应马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列中N135S或T706I的位置(分别是马铃薯H型α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列的第133位和第628位)具有一个替换。
当如实施例2-1A所述将这些GP确证制备物用于60℃处理30分钟并制备葡聚糖时，所有耐热化α-葡聚糖磷酸化酶都可获得高分子量葡聚糖，这与天然马铃薯H型α-葡聚糖磷酸化酶相似。
(实施例2-2B：用定点突变制备马铃薯H型耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
除了用马铃薯来源H型α-葡聚糖磷酸化酶基因代替马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶基因、并使用引入突变的引物使得在对应F39的位置(Y36)、对应N135的位置(N133)和对应T706的位置(T628)分别用亮氨酸(L)、丝氨酸(S)和异亮氨酸(I)替换以外，根据与实施例2-1A相同的方式，制备含耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒，并获得三重突变型(Y36L+N133S+T628I)GP的确证制备物。在本实施例中，制备在实施例1中发现有助于提高耐热性的所有三个位置进行替换的耐热化GP。
这些修饰型GP的确证制备物的耐热性在以下实施例3-2(2)中详细研究。
(实施例2-2C：用定点突变制备拟南芥H型耐热化α-葡聚糖磷酸化酶)
首先，用商品化拟南芥来源的cDNA(PCR Ready First Strand cDNA，Wako PureChemical Industries，Ltd.制造)制备拟南芥来源的H型α-葡聚糖磷酸化酶基因。
更具体的，基于已知拟南芥GP基因序列(数据库GenBank登记号AL133292；CAB61943.1)，设计PCR引物5和6。用前述拟南芥来源的cDNA作模板，并用：
PCR引物5：5’AAATCGATAGGAGGAAAACAT ATG GCA AAC GCC AAT GGA AAA GCT GCG ACT AGT TTA CCG GAG AAA ATC TC 3′(SEQ ID NO：42)
和
PCR引物6：5′GAAGGTACC TTA GGG AAC AGG ACA AGC CTC AAT GTT CCA AAT CTC TTT GGC ATA CTG AG 3′(SEQ ID NO：43)，进行PCR，以扩增拟南芥来源的H型GP基因。PCR反应条件是30个循环，一个循环是94℃30秒、60℃1分钟和72℃3分钟。PCR引物5的下划线部分对应拟南芥来源H型GP基因成熟蛋白N端区的结构基因，而PCR引物6的下划线部分对应拟南芥来源H型GP基因成熟蛋白C端区的结构基因。
将扩增的拟南芥来源H型GP基因插入预先用SmaI切割的pMW118质粒(由Nippon Gene Co.，Ltd.制造)，用感受态细胞方法将质粒导入大肠杆菌TG-1，选择氨苄青霉素抗性菌株，培养此氨苄青霉素抗性菌株，并从此氨苄青霉素抗性菌株中回收质粒，从而获得拟南芥来源的H型GP基因。
除了用所得拟南芥来源的H型GP基因代替马铃薯来源的L型GP基因、并使用引入突变的引物使得在对应F39的位置(Y40)、对应N135的位置(N136)和对应T706的位置(N631)分别用亮氨酸(L)、丝氨酸(S)和异亮氨酸(I)替换以外，根据与实施例2-1A相同的方式，制备含耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒，并获得三重突变型(Y40L+N136S+N631I)GP的确证制备物。在本实施例中，制备在实施例1中发现有助于提高耐热性的所有三个位置进行替换的耐热化GP。
这些修饰型GP的确证制备物的耐热性在以下实施例3-2(2)中详细研究。
(实施例3-1：大规模制备多种耐热化α-葡聚糖磷酸化酶并比较耐热性)
(1)大规模制备酶
实施例2-1A或2-1B中制备的表达耐热化GP的各种大肠杆菌在TB培养基(含Terrific broth(GIBCO)47g/L，甘油4ml/L和50μg/ml氨苄青霉素)中37℃培养5小时。向此培养液中加入IPTG和盐酸吡哆醇至终浓度0.1mM IPTG和1mM盐酸吡哆醇，继续在22℃培养24小时。然后离心培养物回收细菌细胞，用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)洗涤除去培养基成分。洗涤后细菌细胞悬于20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)，用超声仪裂解细菌细胞，离心，取上清液用作细菌细胞提取物。所得细菌细胞提取物加载到预平衡的Q-Sepharose FF柱上，回收用含0.1M到0.3M NaCl浓度梯度的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)洗脱的含耐热化GP的组分。所回收酶组分加载到预平衡的Phenyl-TOYOPEARL 650M柱上，并回收用含17.5％到7.5％饱和度的硫酸铵浓度梯度的20mM柠檬酸盐缓冲液洗脱的含耐热化GP组分的组分。所回收酶组分加载到预平衡的HiTrap HQP柱，并回收用含0.1M到0.4M NaCl浓度梯度的20mM柠檬酸盐缓冲液洗脱的活性组分。所得活性组分进一步加载到预平衡的Resource Q柱上，用含0.1M到0.4M NaCl浓度梯度的20mM柠檬酸盐缓冲液洗脱，以回收含纯化酶的活性组分。
取约1μg所得含纯化酶活性组分进行非变性PAGE(Native聚丙烯酰胺凝胶电泳)。结果，对于所有表达耐热化GP的大肠杆菌，在分子量约210kDa处见到单一条带，并且在任意其它位置未发现条带。因为从氨基酸序列预测GP的分子量为约104kDa，认为GP具有二聚体结构。这样就表明耐热化GP得到了均质纯化。
(2)测定纯化的耐热化GP的活性
测定(1)中纯化的耐热化GP的活性。按如下测定。首先，200μl反应液(含12.5mM G-1-P、1％糊精和酶溶液的100mM乙酸盐缓冲液(pH6.0))在37℃保温15分钟。然后，加入800μl钼试剂(15mM钼酸铵，100mM乙酸锌)，并搅拌以终止反应。然后，加入200μl 568mM抗坏血酸(pH5.8)，混合，并在37℃保温15分钟，用分光光度计测定850nm吸光度。在本实施例中，通过定量由G-1P生成的游离无机磷酸来测定GP酶活性。1分钟内生成1μmol无机磷酸的酶量被定义为1个单位(U)。
(3-1)比较实施例2-1A制备的耐热化GP在60℃和65℃的耐热性
比较实施例2-1A制备并在(1)中大规模制备和纯化的各种耐热化GP在60℃和65℃的耐热性。使用通过相同方法纯化的天然(非突变)马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶作为对照。
首先，0.2U/ml纯化酶溶液(在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中)在60℃或65℃保温0到30分钟。在特定时间点如0、2、10、20和30分钟取酶溶液的小份，并保持于冰上。用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)将保持于冰上的酶溶液样品稀释10倍，并根据(2)中描述的活性测定方法测定酶活性。将60℃或65℃保温前的酶在37℃的酶活性当作100％，用保温后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判断酶的耐热性。60℃保温的结果表示于下表5。65℃保温的结果表示于下表6。
表5            60℃保温时剩余活性(％)
  时间(分钟)   天然马铃薯L型   F39L   N135S   T706I   F39L+N135S   F39L+T706I   N135S+T706I   F39L+N135S+T706I
  0   100   100   100   100   100   100   100   100
  时间(分钟)   天然马铃薯L型   F39L   N135S   T706I   F39L+N135S   F39L+T706I   N135S+T706I   F39L+N135S+T706I
  10   8.4   61.2   65.4   70.5   101   100   101   98.8
  20   1.2   58.3   55.2   50.8   99.6   100   100   96.3
  30   0.7   34.7   52.1   36.6   98.3   101   98.5   94.6
表6
                          65℃保温时剩余活性(％)
  时间(分钟)   天然马铃薯L型   F39L   N135S   T706I   F39L+N135S   F39L+T706I   N135S+T706I   F39L+N135S+T706I
  0   100   100   100   100   100   100   100   100
  2   1.3   40.2   86.5   22.9   86.8   50.8   61.9   90.3
  10   0   0.5   1.4   0.3   18.2   9.3   16.9   61.1
  20   0   0.4   0.6   0.3   2.9   0.9   2.8   47.7
  30   0   0.4   0.2   0.3   0.2   0.2   0.7   31.4
在上表5和表6中，天然马铃薯L型指天然马铃薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L指第39位苯丙氨酸替换成亮氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。T706I指第706位苏氨酸替换成异亮氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。N135S指第135位天冬酰胺替换成丝氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+T706I指第39位苯丙氨酸替换成亮氨酸并且第706位苏氨酸替换成异亮氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。N135S+T706I指第135位天冬酰胺替换成丝氨酸并且第706位苏氨酸替换成异亮氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+N135S指第39位苯丙氨酸替换成亮氨酸并且第135位天冬酰胺替换成丝氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。F39L+N135S+T706I指第39位苯丙氨酸替换成亮氨酸、第135位天冬酰胺替换成丝氨酸并且第706位苏氨酸替换成异亮氨酸的天然马铃薯来源L型α-葡聚糖磷酸化酶。在表5和表6给出的结果中，60℃加热30分钟的结果和65℃加热2分钟的结果作为图示于图3。
发现：与天然马铃薯L型GP比较，本发明耐热化GP具有非常高的耐热性。从耐热性较差GP到耐热性极佳GP的顺序如下：天然马铃薯L型GP＜F39L＜T706I＜N135S＜F39L+T706I＜N135S+T706I＜F39L+N135S＜F39L+N135S+T706I。通过在有助于耐热性的三个位置氨基酸残基中仅替换一个位置提高了耐热性。进而，可以看到，通过替换多个这些氨基酸残基，耐热性急剧提高。
(3-2)比较实施例2-1B制备的修饰型GP在60℃和65℃的耐热性
比较实施例2-1B制备并在实施例3-1(1)中大规模制备和纯化的各种修饰型GP在60℃和65℃的耐热性。使用通过相同方法纯化的天然(非突变)马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶作为对照。
首先，0.2U/ml纯化酶溶液(在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)中)在60℃保温10分钟或65℃保温2分钟。在预定时间点(10分钟或2分钟)取酶溶液的小份，并保持于冰上。用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)将保持于冰上的酶溶液样品稀释10倍，并根据(2)中描述的活性测定方法测定酶活性。将60℃保温10分钟或65℃保温2分钟前的酶在37℃的酶活性当作100％，用保温后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判断酶的耐热性。结果表示于下表7和图8-10中。
表7
Figure G200480017157XD00711
在上表7中，WT指天然马铃薯来源的L型α-葡聚糖磷酸化酶。每一行中，单字母缩写代表的氨基酸表示修饰型GP中的氨基酸替换。例如左端有记F39的行中用I表达的实体是指第39位苯丙氨酸替换成异亮氨酸的修饰型GP。对于其它行中的修饰型GP也是如此。
氨基酸的单字母缩写对本领域技术人员公知，并如下列出：A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸。
结果可以看出，当上述实施例2-1A中替换的特定氨基酸以外的氨基酸用来替换第39位、第135位和第706位氨基酸时，天然马铃薯来源L型GP的耐热性提高。
当第39位苯丙氨酸替换成异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸时，从60℃保温10分钟后的剩余活性来看，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第39位的替换，替换成亮氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是61.2％)对耐热性最佳。当第135位天冬酰胺替换成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸时，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第135位的替换，替换成丙氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是76.2％)、半胱氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是85.0％)、甘氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是85.2％)、异亮氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是60.0％)、丝氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是65.4％)、苏氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是73.4％)或缬氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是82.8％)对耐热性特别好。当第706位苏氨酸替换成半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸时，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第706位的替换，替换成半胱氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是65.4％)、异亮氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是70.5％)或缬氨酸(60℃保温10分钟后的剩余活性是68.7％)对耐热性特别好。
当第39位苯丙氨酸替换成异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸时，从65℃保温2分钟后的剩余活性来看，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第39位的替换，替换成亮氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是61.2％)对耐热性最佳。当第135位天冬酰胺替换成丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸时，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第135位的替换，替换成丙氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是79.0％)、半胱氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是76.9％)、甘氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是58.4％)、甲硫氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是52.6％)、丝氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是86.5％)、苏氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是62.4％)或缬氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是79.3％)对耐热性特别好。当第706位苏氨酸替换成半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸时，修饰型GP的耐热性高于天然马铃薯来源L型GP的耐热性。对于第706位的替换，替换成亮氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是57.8％)或缬氨酸(65℃保温2分钟后的剩余活性是59.2％)对耐热性特别好。
结果发现，与天然马铃薯L型GP比较，本发明修饰型GP的耐热性有很大提高。
(实施例3-2：制备H型耐热化GP酶)
(1)大规模制备酶
实施例2-2B和2-2C中制备的表达马铃薯H型耐热化GP的每种大肠杆菌和表达拟南芥H型耐热化GP的每种大肠杆菌分别在TB培养基(含Terrific broth(GIBCO)47g/L，甘油4ml/L和50μg/ml氨苄青霉素)中37℃培养5小时，向此培养液中加入IPTG和盐酸吡哆醇至终浓度0.1mM IPTG和1mM盐酸吡哆醇，继续在22℃培养24小时。然后离心培养物回收细菌细胞，用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)洗涤除去培养基成分。洗涤后细菌细胞悬于20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)，用超声仪裂解细菌细胞，离心，取上清液用作细菌细胞提取物。所得细菌细胞提取物用离子交换层析和疏水层析纯化，以回收含纯化酶的活性组分，所述组分在非变性PAGE(Native聚丙烯酰胺凝胶电泳)中显示为单一条带。
(2)比较耐热化H型GP酶的耐热性
比较(1)中纯化的各种耐热化GP在60℃和65℃的耐热性。使用通过相同方法纯化的天然(非突变)马铃薯H型GP和拟南芥H型GP作为对照。
0.2U/ml纯化酶溶液(20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7))在60℃保温10分钟或65℃保温2分钟，并保持于冰上。用20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.7)将保持于冰上的酶溶液稀释10倍，并根据实施例3-1(2)中描述的活性测定方法测定酶活性。将58℃保温10分钟、60℃保温10分钟或65℃保温2分钟前的酶在37℃的酶活性当作100％，用保温后酶在37℃的酶活性比率(即剩余活性)判断酶的耐热性。耐热化马铃薯H型GP和天然马铃薯H型GP的结果示于下表8和图11。耐热化拟南芥H型GP和天然拟南芥H型GP的结果示于下表9和图12。
表8
保温温度和时间   天然马铃薯H型GP的剩余活性(％)   耐热化马铃薯H型GP的剩余活性(％)(Y36L+N133S+T628I)
  58℃10分钟   0   75.8
  60℃10分钟   0   48.8
  65℃2分钟   0   34.5
表9
保温温度和时间   天然拟南芥H型GP的剩余活性(％)   耐热化拟南芥H型GP的剩余活性(％)(Y40L+N136S+T631I)
  58℃10分钟   1.5   48.8
  60℃10分钟   0.5   29.3
  65℃2分钟   0.5   29.2
从这些结果来看，甚至在65℃加热2分钟以后，本发明的耐热化马铃薯H型GP仍保留34.5％活性。另一方面，65℃加热2分钟以后天然马铃薯H型GP保留0％活性。由此发现，与天然马铃薯H型GP比较，本发明的耐热化马铃薯H型GP具有高度耐热性。
此外，甚至在65℃加热2分钟以后，本发明的耐热化拟南芥H型GP仍保留29.2％活性。另一方面，65℃加热2分钟以后天然拟南芥H型GP保留0.5％活性。由此发现，与天然拟南芥H型GP比较，本发明的耐热化拟南芥H型GP具有高度耐热性。
(实施例4：用耐热化α-葡聚糖磷酸化酶合成重均分子量600kDa或更高的直链淀粉)
使用根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，研究是否可以合成重均分子量600kDa或更高的直链淀粉。使用以上实施例3-1(1)制备的多种耐热化GP的任何一种(单突变F39L、单突变N135S、单突变T706I、双突变(F39L+N135S)、双突变(F39L+T706I)、双突变(N135S+T706I)和三突变(F39L+N135S+T706I))作为耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
使用嗜热脂肪芽孢杆菌来源的α-葡聚糖磷酸化酶(也称作嗜热脂肪芽孢杆菌)和水生栖热菌来源的α-葡聚糖磷酸化酶(也称作水生栖热菌)作为对照。
使用具有下表10所述组成的反应溶液在50℃进行直链淀粉合成反应18小时。
表10
使用描述于前述“1.测定方法和计算方法”的1.5中的计算方法计算该反应合成的直链淀粉产率。
用以下方法测定该反应合成直链淀粉的重均分子量。该反应合成的直链淀粉完全溶解于1N氢氧化钠中，用适量盐酸中和，取约30-300μg等份直链淀粉用于同时使用差示折光计和多角光散射检测器的凝胶过滤层析，以获得重均分子量。
更具体的，使用Shodex SB806M-HQ(SHOWA DENKO K.K.制造)作为柱子，使用多角光散射检测器(DAWN-DSP，Wyatt Technology制造)作为检测器，并通过以这种顺序将它们连接而使用差示折光计(Shodex RI-71，SHOWA DENKO K.K.制造)。柱子保持在40℃，并使用0.1M硝酸钠溶液以1mL/min流速作为洗脱剂。用数据分析软件(商品名ASTRA，Wyatt Technology制造)收集所得信号，并用相同软件分析，从而得到重均分子量。这种方法也称为MALLS分析法。
以此方式获得的合成直链淀粉的产率和分子量示于下表11。
表11
合成直链淀粉的产率和分子量
Figure G200480017157XD00761
如上所述，发现本发明的耐热化GP可以合成重均分子量约600kDa或更高的高分子直链淀粉。此外，还发现本发明的耐热化GP合成直链淀粉的产率约40％或更高。用作比较实施例的嗜热脂肪芽孢杆菌GP和水生栖热菌GP是耐热性酶，但不能合成高分子直链淀粉。
(实施例5：用耐热化α-葡聚糖磷酸化酶从蔗糖合成直链淀粉)
使用根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用蔗糖作为原材料，来合成直链淀粉。使用以上实施例3-1(1)制备的所述多种耐热化GP的任何一种(单突变F39L、单突变N135S、单突变T706I、双突变(F39L+N135S)、双突变(F39L+T706I)、双突变(N135S+T706I)和三突变(F39L+N135S+T706I))作为耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
使用具有下表12所述组成的反应溶液在50℃进行直链淀粉合成反应18小时。
表12
使用描述于前述“1.测定方法和计算方法”的1.7中的计算公式计算该反应合成的直链淀粉产率(％)。
用与以上实施例4中相同的方法测定该反应合成直链淀粉的重均分子量。以此方式获得的合成直链淀粉的产率和分子量示于下表13。
表13
合成直链淀粉的产率和重均分子量
Figure G200480017157XD00772
如上所述，发现当用蔗糖作为合成直链淀粉的原材料时，像天然GP一样，本发明的耐热化GP可以合成重均分子量约600kDa的高分子直链淀粉。此外，还发现与天然GP相似，直链淀粉的产率高，如约40％或更高。
(实施例6：在高温条件下(50℃、55℃和60℃)用耐热化GP由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖)
使用根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用葡萄糖-1-磷酸作为原材料，在高温条件下来合成直链淀粉。使用实施例3-1(1)制备的耐热化GP(三突变(F39L+N135S+T706I))，同时使用由相同方法纯化的天然马铃薯L型GP作为对照。
通过在37℃、50℃、55℃或60℃将含G-1-P 6.1g/L、麦芽四糖(G4)0.3g/L和GP 20U/L的反应溶液保温18小时进行直链淀粉合成反应。时间过去后测定反应产物中的合成直链淀粉的量。基于以下公式计算合成直链淀粉的量(g/L)。
(合成直链淀粉的量(g/L))
＝(用于直链淀粉合成的葡萄糖(mM))×180(葡萄糖分子量)
＝[(反应生成的无机磷酸(mM))-(反应后葡萄糖(mM))]×180(葡萄糖分子量)
反应18小时后合成直链淀粉的量示于下表14和图17。
表14
合成直链淀粉的量(g/L)
  反应温度   天然马铃薯L型GP   耐热化GP
  37℃   2.8   3.1
  50℃   3.2   3.3
  55℃   2.5   2.7
60℃ 0 1.5
当使用耐热化GP时，在37℃、50℃和55℃合成约3g/L直链淀粉，甚至在60℃也合成约1.5g/L直链淀粉。另一方面，当使用天然马铃薯L型GP时，在37℃、50℃和55℃有直链淀粉合成，但在60℃根本不合成直链淀粉。认为对于天然马铃薯L型GP，60℃时在反应的起始阶段GP即被灭活。另一方面，认为因为耐热化GP在60℃也稳定保留酶活性，足以使直链淀粉合成反应进行。此外，当在37℃、50℃、55℃和60℃的每个温度使用耐热化GP时，所合成直链淀粉量大于使用天然马铃薯L型GP时的量。可以认为，使用耐热化GP合成直链淀粉的量将随着反应时间延长进一步增加。如上所述，发现根据本发明的耐热化GP可以在60℃合成葡聚糖，而天然马铃薯L型GP不能在此温度反应。
(实施例7：用耐热化GP在65℃和70℃由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖)
如实施例6，使用实施例3-1(1)制备的耐热化GP(三突变(F39L+N135S+T706I))，在更高温度条件下由葡萄糖-1-磷酸合成葡聚糖。使用天然马铃薯L型GP作为对照。
通过在37℃、65℃或70℃将含G-1-P 15.2g/L、麦芽四糖(G4)2.7g/L和GP 200U/L的反应溶液保温4小时进行直链淀粉合成反应。如实施例6计算合成直链淀粉的量。反应4小时后，当使用马铃薯L型GP时，在65℃或70℃根本不合成直链淀粉，而当使用耐热化GP时，在65℃由15.2g G-1-P合成约5.6g/L直链淀粉，而在70℃由15.2g G-1-P合成约0.3g/L直链淀粉。结果发现，天然马铃薯L型GP不能在65℃到70℃合成直链淀粉，但耐热化GP在高温如70℃保持GP活性，并具有合成直链淀粉能力。
基于实施例6和7的结果，发现根据本发明的耐热化GP在高温条件下具有合成直链淀粉的能力，而天然马铃薯L型GP在如此条件下根本不反应。
(实施例8：确认经热处理去除污染蛋白质)
确认：使用热处理，以下方法可用于容易地纯化耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
如实施例2-1A所述，将实施例2-1A中制备的表达耐热化GP(三重突变体(F39L+N135S+T706I))基因的大肠杆菌(TG-1)培养于LB培养基中。如实施例2-1A所述，将表达天然马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌(TG-1)培养于LB培养基中作为对照。离心培养液回收细菌细胞，细菌细胞悬于缓冲液中，并进行超声以获得细菌细胞提取物。在60℃水浴中加热该细菌细胞提取物0到60分钟，离心去除不溶性蛋白以获得上清液。测定该上清液的GP活性和蛋白质含量，从而得到GP酶的比活性。用实施例3-1(2)所述活性测定方法测定GP活性，用Bradford方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.，72，248-254(1976))测定蛋白质含量。Bradford方法是一种比色方法，其中显色物质与溶液中含有的所有蛋白质结合。在本说明书中，用蛋白质测定试剂盒(Nippon Bio-Rad Laboratories，Inc.)和牛球蛋白作为标准品进行测定。
由以下方法计算GP酶比活性。
比活性(U/ml)
＝(α-葡聚糖磷酸化酶活性)/(上清液中所含蛋白质的质量mg)
图6表示耐热化GP酶(称作耐热化GP(F39L+N135S+T706I))和天然马铃薯L型GP酶比活性随时间的变化。
如图6所示，耐热化GP的比活性经60℃加热增加约10倍。污染蛋白几乎完全热变性并被除去。相反，天然马铃薯L型GP的比活性随时间降低。可以认为这是因为不仅污染蛋白而且所述GP蛋白也被变性。以此方式，发现经热处理可以简单的纯化耐热化GP。
(实施例9：确认经热处理去除污染蛋白质)
如实施例8，培养表达耐热化GP(F39L+N135S+T706I)基因的大肠杆菌(TG-1)，并制备细菌细胞提取物。使用该细菌细胞提取物，确认经过60℃热处理可以使淀粉酶活性和磷酸酶活性降低到可用于工业生产直链淀粉或G-1-P的水平。
如实施例8，在60℃水浴中加热细菌细胞提取物30分钟，离心去除不溶性蛋白以获得上清液。测定该上清液的磷酸酶活性和淀粉酶活性。
通过将含100μl该上清液和100μl 50mM葡萄糖-1-磷酸的反应溶液在37℃保温60分钟，并用(1.测定方法和计算方法)所述的方法定量由反应溶液中葡萄糖-1-磷酸生成的游离无机磷酸，从而测定磷酸酶活性。在1分钟内生成1μmol无机磷酸的酶量定义为1个单位(U)。通过将含25μl该上清液和25μl 0.5％直链淀粉(重均分子量约50kDa)的反应溶液在37℃保温60分钟，加入1ml碘溶液(0.1％碘化钾，0.01)，并测定伴随反应溶液中直链淀粉转化成低分子直链淀粉时碘显色的降低速率，获得酶活性。在1分钟内能降低A660吸光度约10％的活性定义为1U。
淀粉酶活性(U/分钟)
＝(反应前A660nm吸光度-反应后A660nm吸光度)÷(反应前A660nm吸光度)×100÷10÷(时间(分钟))
下表15表示细菌细胞提取物中磷酸酶活性和淀粉酶活性的剩余比例。
如表15所示，将加热前细菌细胞提取物的活性当作100％，经60℃加热后，磷酸酶活性和淀粉酶活性分别是磷酸酶活性约3％，淀粉酶活性约0.3％，这两种污染蛋白质几乎被灭活。
表15
  磷酸酶活性(％)   淀粉酶活性(％)
  加热前   100   100
  60℃加热30分钟后   3.1   0.3
以此方式，根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶是即使经60℃热处理也不丧失活性的植物GP酶，并发现，经过60℃热处理可以容易的生产含很少淀粉酶活性和磷酸酶活性的极好GP。
(实施例10：GP蛋白质的稳定性)
已经报道天然马铃薯来源L型GP容易降解。这些GP，甚至纯化后低温保存，在保存期间也逐渐降解。一般来说，酶降解时，结构发生变化，酶的性质发生变化，同时活性降低等。如果能增强GP蛋白质稳定性，则可以降低以上因素的影响，这有利于酶的保存和使用。
将实施例3-1(1)制备的天然马铃薯来源L型GP和7种耐热化GP(单突变F39L、单突变N135S、单突变T706I、双突变(F39L+N135S)、双突变(F39L+T706I)、双突变(N135S+T706I)和三突变(F39L+N135S+T706I))保存于4℃，并经过5个月检测所述GP蛋白质的分子量。此外，相似的检测37℃保存10天后的GP蛋白质分子量。纯化后即刻和4℃保存5个月后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，结果示于图13。加到凝胶上的蛋白量对所有GP蛋白相同。
结果，纯化后即刻，天然马铃薯L型GP和7种耐热化GP都在分子量约210kDa位置(GP单体分子量约104kDa，形成二聚体)显示条带。另一方面，天然马铃薯L型GP和N135S突变体在4℃保存5个月后具有约140kDa的分子量，这比纯化后即刻要小。这表明在保存期间天然马铃薯L型GP和N135S单突变体被降解。天然马铃薯L型GP和N135S突变体在37℃保存10天后也被降解。另外6种耐热化GP(单突变F39L、单突变T706I、双突变F39L+N135S、双突变F39L+T706I、双突变N135S+T706I和三突变F39L+N135S+T706I)在4℃保存5个月后的分子量约为210kDa，这与纯化后即刻相同，未发现蛋白质降解。此外，这六种耐热化GP在37℃保存10天后分子量也没有改变，未发现这些GP蛋白降解。这表明这些耐热化GP在4℃到37℃具有出色的抗降解能力，并且比天然马铃薯L型GP具有更高稳定性。由此发现，F39位替换和T706位替换不仅提供提高耐热性的作用，而且提供抑制GP蛋白质降解的作用。
(实施例11：合成葡萄糖-1-磷酸)
(1)用耐热化GP在65℃合成G-1-P
使用根据本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，并使用葡聚糖和无机磷酸作为原材料，在65℃合成葡萄糖-1-磷酸。使用实施例3-1(1)中制备的耐热化GP(三突变(F39L+N135S+T706I))，并使用由同样方法纯化的天然马铃薯L型GP作为对照。通过在37℃或65℃将反应溶液保温18小时，进行G-1-P合成反应，其中所述反应溶液含300mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)、10g/L糊精和1000U/L任一种GP。用以上“1.测定方法和计算方法”的1.3中所述的定量葡萄糖-1-磷酸方法获得的G-1-P浓度(mM)乘以G-1-P的分子量260，计算合成G-1-P的量。反应后合成G-1-P的量示于下表16。
表16
合成葡萄糖-1-磷酸的量(g/L)
  反应温度   天然马铃薯L型GP   耐热化GP
  37℃   3.5   4.2
  65℃   0.0   3.7
当使用天然马铃薯L型GP时在65℃不合成G-1-P。然而当使用耐热化GP时，即使在65℃也可以生成G-1-P。
(2)用耐热化GP在70℃合成G-1-P
如以上实施例11(1)，使用根据本发明的耐热化GP和天然马铃薯L型GP，并使用葡聚糖和无机磷酸作为原材料，在70℃合成G-1-P。将含300mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)、10g/L糊精和10,000U/L任一种GP的反应溶液在70℃保温4小时，合成G-1-P。如前述实施例计算合成G-1-P的量。
当使用天然马铃薯L型GP时在70℃根本不合成G-1-P。然而当使用耐热化GP时，合成约1g G-1-P。
如上述，本发明用本发明的优选实施方案举例说明，但不应理解为将本发明限制到这些实施方案内。可以理解，本发明的范围只由权利要求书解释。可以理解，基于本发明的描述和常规技术知识，从本发明优选实施方案的具体描述，本领域技术人员可在等价的范围实施。可以理解，专利、专利申请和本说明书引用的参考文献内容本身应引入作为参考，就像其内容在本说明书中具体描述一样。
工业实用性
根据本发明得到在高温下(如60℃或更高)具有极佳耐热性的植物来源GP酶。本发明的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶可用于高温条件(如60℃或更高)下的葡聚糖合成反应，天然GP酶在此条件下不能反应。
当使用中温性细菌如大肠杆菌作为宿主，高度表达根据本发明的编码耐热化α-葡聚糖磷酸化酶基因(如通过提高马铃薯来源GP耐热性获得的编码耐热化GP的基因)时，通过在60℃加热含耐热化酶的细菌细胞提取物，可以简单的除去来源于宿主细菌的污染酶。具体来说，淀粉酶活性和磷酸酶活性是大问题，尤其是在GP酶的工业应用中如此，经热处理可以大大降低这两种酶活性。因此，本发明的酶尤其在酶纯化中有用。
本发明方法不仅对马铃薯来源GP和拟南芥来源GP有效，而且可优选应用于提高与马铃薯来源GP和拟南芥来源GP的氨基酸序列高度同源的其它A类GP的耐热性。通过使用本发明方法，可以制备来源于马铃薯和拟南芥以外其它生物物种的耐热化GP。
根据本发明，提供耐热化GP，其中酶蛋白降解被抑制并且保存稳定性提高。
(序列表解释)
SEQ ID NO：1：编码马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：2：马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3：编码甘薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：4：甘薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5：编码马铃薯第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：6：马铃薯第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7：编码蚕豆L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：8：蚕豆L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：9：编码拟南芥L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：10：拟南芥L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：11：编码菠菜L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：12：菠菜L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：13：编码玉米L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：14：玉米L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：15：编码水稻L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：16：水稻L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：17：编码水稻第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：18：水稻第二种L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：19：编码小麦H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：20：小麦H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：21：编码柑桔杂交栽培种H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：22：柑桔杂交栽培种H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：23：编码水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：24：水稻H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：25：编码蚕豆H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：26：蚕豆H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：27：编码拟南芥H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：28：拟南芥H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：29：编码马铃薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：30：马铃薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：31：编码甘薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的部分序列；
SEQ ID NO：32：甘薯H型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：33：编码耐热化马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列；
SEQ ID NO：34：耐热化马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NO：35：大肠杆菌麦芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列；
SEQ ID NOs：36和37：图2中所示的质粒pMW118连接位点附近的碱基序列；
SEQ ID NO：38：PCR引物1的碱基序列；
SEQ ID NO：39：PCR引物2的碱基序列；
SEQ ID NO：40：PCR引物3的碱基序列；
SEQ ID NO：41：PCR引物4的碱基序列；
SEQ ID NO：42：PCR引物5的碱基序列；
SEQ ID NO：43：PCR引物6的碱基序列；
SEQ ID NO：44：基序序列1L的氨基酸序列；
SEQ ID NO：45：基序序列1H的氨基酸序列；
SEQ ID NO：46：基序序列2的氨基酸序列；
SEQ ID NO：47：基序序列3L的氨基酸序列；
SEQ ID NO：48：基序序列3H的氨基酸序列。
序列表
<110>江崎格力高株式会社
<120>耐热化α-葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
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<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<220>
<221>CDS
<222>(44)..(2941)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(194)..(2941)
<400>1
atcactctca ttcgaaaagc tagatttgca tagagagcac aaa atg gcg act gca     55
                                   Met Ala Thr Ala
                                   -50
aat gga gca cac ttg ttc aac cat tac agc tcc aat tcc aga ttc atc    103
Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Phe Ile
  -45             -40           -35
cat ttc act tct aga aac aca agc tcc aaa ttg ttc ctt acc aaa acc    151
His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe Leu Thr Lys Thr
-30            -25            -20            -15
tcc cat ttt cgg aga ccc aaa cgc tgt ttc cat gtc aac aat acc ttg    199
Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val Asn Asn Thr Leu
           -10            -5          -1 1
agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt gag agc gac    247
Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp
      5              10              15
ctg agt tct ttt gct cct gat gcc gca tct att acc tca agt atc aaa    295
Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys
   20              25              30
tac cat gca gaa ttc aca cct gta ttc tct cct gaa agg ttt gag ctc    343
Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu
35             40            45             50
cct aag gca ttc ttt gca aca gct caa agt gtt cgt gat tcg ctc ctt    391
Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu
           55            60              65
att aat tgg aat gct acg tat gat att tat gaa aag ctg aac atg aag    439
Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys
         70            75             80
caa gcg tac tat cta tcc atg gaa ttt ctg cag ggt aga gca ttg tta    487
Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu
     85             90            95
aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gca ttt gcg gaa gct ttg    535
Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu
  100             105            110
aaa aac ctt ggc cac aat cta gaa aat gtg gct tct cag gaa cca gat    583
Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp
115           120            125             130
gct gct ctt gga aat ggg ggt ttg gga cgg ctt gct tcc tgt ttt ctg    631
Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu
           135            140            145
gac tct ttg gca aca cta aac tac cca gca tgg ggc tat gga ctt agg    679
Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg
        150            155            160
tac aag tat ggt tta ttt aag caa cgg att aca aaa gat ggt cag gag    727
Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu
     165            170            175
gag gtg gct gaa gat tgg ctt gaa att ggc agt cca tgg gaa gtt gtg    775
Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val
   180            185            190
agg aat gat gtt tca tat cct atc aaa ttc tat gga aaa gtc tct aca    823
Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr
195           200              205            210
gga tca gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat ata aag gca    871
Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala
           215           220              225
gtt gcg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga acc aca atc    919
Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile
        230             235             240
agc ctt cga ctg tgg tct aca cag gtt cca tca gcg gat ttt gat tta    967
Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu
     245            250             255
tct gct ttc aat gct gga gag cac acc aaa gca tgt gaa gcc caa gca   1015
Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala
   260              265              270
aac gct gag aag ata tgt tac ata ctc tac cct ggg gat gaa tca gag   1063
Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu
275            280              285           290
gag gga aag atc ctt cgg ttg aag caa caa tat acc tta tgc tcg gct   1111
Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala
           295            300            305
tct ctc caa gat att att tct cga ttt gag agg aga tca ggt gat cgt   1159
Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg
        310              315            320
att aag tgg gaa gag ttt cct gaa aaa gtt gct gtg cag atg aat gac   1207
Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp
      325            330            335
act cac cct aca ctt tgt atc cct gag ctg atg aga ata ttg ata gat   1255
Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp
  340            345             350
ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa gct tgg aat att act caa aga act   1303
Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr
355           360            365            370
gtg gcc tac aca aac cat act gtt ttg cct gag gca ctg gag aaa tgg   1351
Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp
           375            380            385
agt tat gaa ttg atg cag aaa ctc ctt ccc aga cat gtc gaa atc att   1399
Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile
        390            395           400
gag gcg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta aaa tat ggt   1447
Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly
      405            410            415
tca atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca atg aga atc   1495
Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile
   420           425            430
tta gaa aat ttt gat ctt ccc agt tct gtt gct gaa tta ttt att aag   1543
Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys
435           440            445             450
cct gaa atc tca gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa gtc cat gac   1591
Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp
            455            460           465
aaa gtt gaa gct tcc gat aaa gtt gtg act aat gat gaa gat gac act   1639
Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr
        470             475             480
ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gca gct gca gaa aaa gac att   1687
Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile
     485            490              495
gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca gct gtt ata cca cct aag   1735
Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys
   500              505              510
gag gta cgc atg gcc aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat gct gtt aat   1783
Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn
515            520           525            530
gga gtt gct gag atc cat agt gaa att gtg aag gag gag gtt ttc aat   1831
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn
            535             540             545
gac ttc tat gag ctc tgg ccg gaa aag ttc caa aac aaa aca aat gga   1879
Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly
        550           555            560
gtg act cca aga aga tgg att cgt ttc tgc aat cct cct ctt agt gcc   1927
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala
     565            570             575
atc ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg aaa act gaa   1975
Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu
    580             585           590
aag ttg gca gaa ttg cag aag ttt gct gat aat gaa gat ctt caa aat   2023
Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn
595                600       605            610
gag tgg agg gaa gca aaa agg agc aac aag att aaa gtt gtc tcc ttt   2071
Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe
          615             620             625
ctc aaa gaa aag aca ggg tat tct gtt gtc cca gat gca atg ttt gat   2119
Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp
        630           635             640
att cag gta aaa cgc att cat gag tac aag cga caa ctg tta aat atc   2167
Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile
      645              650           655
ttc ggc atc gtt tat cgg tat aag aag atg aaa gaa atg aca gct gca   2215
Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala
  660              665           670
gaa aga aag act aac ttc gtt cct cga gta tgc ata ttt ggg gga aaa   2263
Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys
675            680           685             690
gct ttt gcc aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa ttt atc aca   2311
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr
           695            700             705
gat gtt ggt gct act ata aat cat gat cca gaa atc ggt gat ctg ttg   2359
Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu
        710             715            720
aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt gct gaa ttg cta   2407
Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu
     725             730            735
att cct gct agc gat cta tca gaa cat atc agt acg gct gga atg gag   2455
Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu
   740             745              750
gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gca atg aat ggt tgt atc caa   2503
Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gln
755             760           765            770
att ggt aca ttg gat ggc gct aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt gga   2551
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly
            775           780             785
gaa gaa aac ttc ttt ctc ttt ggt gct caa gct cat gaa att gca ggg   2599
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly
        790           795            800
ctt aga aaa gaa aga gct gac gga aag ttt gta cct gat gaa cgt ttt   2647
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe
     805            810            815
gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga agc ggt gct ttt ggc tct tat aac   2695
Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn
  820             825            830
tat gat gac cta att gga tcg ttg gaa gga aat gaa ggt ttt ggc cgt   2743
Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg
835           840             845            850
gct gac tat ttc ctt gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac ata gaa tgc   2791
Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys
          855            860            865
caa gag aaa gtt gat gag gca tat cgc gac cag aaa agg tgg aca acg   2839
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Thr
        870             875           880
atg tca atc ttg aat aca gcg gga tcg tac aag ttc agc agt gac aga   2887
Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg
     885             890            895
aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa gct gtg gaa   2935
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu
  900             905             910
ata gca taagaggggg aagtgaatga aaaataacaa aggcacagta agtagtttct    2991
Ile Ala
915
ctttttatca tgtgatgaag gtatataatg tatgtgtaag aggatgatgt tattaccaca 3051
taataagaga tgaagagtct cattttgctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa            3101
<210>2
<211>966
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>2
Met Ala Thr Ala Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn
-50            -45            -40            -35
Ser Arg Phe Ile His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe
           -30             -25           -20
Leu Thr Lys Thr Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val
        -15             -10          -5
Asn Asn Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly
  -1  1          5              10
Gly Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr
15            20             25             30
Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu
            35              40           45
Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg
        50            55             60
Asp Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys
     65              70           75
Leu Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly
  80            85             90
Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe
95            100             105            110
Ala Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser
            115           120            125
Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala
        130             135           140
Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly
     145            150            155
Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys
  160            165            170
Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro
175           180             185            190
Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly
       195                200            205
Lys Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu
        210             215           220
Asp Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr
      225             230            235
Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala
  240             245            250
Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys
255           260            265            270
Glu Ala Gln Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly
           275            280             285
Asp Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr
        290             295            300
Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg
     305            310             315
Ser Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val
  320             325            330
Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg
335           340            345             350
Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile
            355            360           365
Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
        370            375            380
Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His
     38             390           395
Val Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val
   400              405             410
Leu Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr
415           420            425            430
Thr Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu
          435             440           445
Leu Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val
        450             455             460
Glu Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp
     465            470             475
Glu Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala
   480           485            490
Glu Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val
495             500           505             510
Ile Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly
            515            520           525
His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu
        530             535             540
Glu Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn
     545            550           555
Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro
  560            565            570
Pro Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val
575            580              585            590
Leu Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu
          595            600            605
Asp Leu Gln Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys
        610           615            620
Val Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp
     625             630            635
Ala Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln
   640            645            650
Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu
655            660             665            670
Met Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile
          675            680            685
Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val
        690             695           700
Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile
     705             710            715
Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val
   720           725            730
Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr
735            740             745            750
Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn
           755            760            765
Gly Cys Ile Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg
        770              775            780
Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His
     785             790           795
Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro
   800             805            810
Asp Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe
815           820            825             830
Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu
           835           840             845
Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser
        850            855           860
Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys
      865            870            875
Arg Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe
  880            885             890
Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile
895            900             905            910
Glu Ala Val Glu Ile Ala
            915
<210>3
<211>3292
<212>DNA
<213>甘薯(Ipomoea batatas)
<220>
<221>CDS
<222>(86)..(2950)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(215)..(2950)
<400>3
gaattccgct tagctaatat cgcaccgata gagagagacc gacagagagc aatggcagct   60
tcaccgtact ccgtttctcg gagca atg tcg agg ctt tcc ggc att acg cct    112
                    Met Ser Arg Leu Ser Gly Ile Thr Pro
                            -40             -35
cga gct cga gat gat cga tct caa ttc cag aat ccg agg ctc gaa att    160
Arg Ala Arg Asp Asp Arg Ser Gln Phe Gln Asn Pro Arg Leu Glu Ile
           -30           -25            -20
gcg gtt cct gac cga acg gcc ggc tta cag aga acg aaa cgg act ctc    208
Ala Val Pro Asp Arg Thr Ala Gly Leu Gln Arg Thr Lys Arg Thr Leu
         -15            -10           -5
ctt gtc aag tgc gtg ttg gat gag acg aaa caa acg att cag cat gtg    256
Leu Val Lys Cys Val Leu Asp Glu Thr Lys Gln Thr Ile Gln His Val
  -1  1          5             10
gtt act gaa aaa aat gaa ggt acc tta ctt gat gct gca tct att gct    304
Val Thr Glu Lys Asn Glu Gly Thr Leu Leu Asp Ala Ala Ser Ile Ala
15            20             25            30
tca agc atc aaa tac cat gca gaa ttc tca cca gca ttt tct ccc gag    352
Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Ser Pro Ala Phe Ser Pro Glu
             35             40            45
agg ttt gag ctt cca aag gct tac ttt gca aca gca caa agt gtt cgt    400
Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg
        50            55             60
gat gca ctg att gtc aat tgg aat gca aca tac gat tac tat gag aag    448
Asp Ala Leu Ile Val Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Glu Lys
     65              70            75
ttg aat atg aag cag gca tac tat ctc tct atg gag ttt cta cag ggt    496
Leu Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly
  80            85             90
aga gca ttg tta aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gaa tat    544
Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Glu Tyr
95            100             105            110
gct gaa gca ctg aac aag ctt ggc cac aat cta gaa aat gtt gct tct    592
Ala Glu Ala Leu Asn Lys Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser
            115          120            125
aag gag cca gat gct gct ctt gga aat gga ggt ttg ggg cgg ctt gct    640
Lys Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala
        130             135           140
tcc tgt ttt ctt gac tct ttg gca aca ttg aat tat cca gca tgg ggg    688
Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly
     145            150            155
tat gga ctc agg tac aag tat gga tta ttt aag caa cgc att aca aaa    736
Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys
   160           165            170
gat gga cag gag gag gtg gct gaa gat tgg ctt gaa ctt ggc aat cct    784
Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Gly Asn Pro
175            180            185            190
tgg gag ata atc aga atg gat gtt tca tac cct gtg aag ttc ttt ggc    832
Trp Glu Ile Ile Arg Met Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Phe Gly
            195            200             205
aaa gtg atc aca ggg tca gat gga aag aag cac tgg att ggt ggg gag    880
Lys Val Ile Thr Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Ile Gly Gly Glu
        210             215             220
gac att ctg gca gtt gca tac gat gtt cca att cca gga tat aag act    928
Asp Ile Leu Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr
      225            230             235
aga acc aca att agc ctt cgc cta tgg tct act aag gtt cca tcc gag    976
Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Val Pro Ser Glu
  240             245            250
gat ttt gat cta tat tct ttc aat gca gga gag cac acc aaa gcg tgt   1024
Asp Phe Asp Leu Tyr Ser Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys
255           260            265            270
gag gcc caa gca aat gct gaa aaa ata tgt tac ata ctc tac cct ggg   1072
Glu Ala Gln Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly
           275             280            285
gat gaa tca att gaa gga aaa att tta cga ctg aag caa caa tac acc   1120
Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr
        290             295             300
ttg tgc tct gct tct cta caa gat ata att gcc cga ttt gag agg aga   1168
Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg
     305            310             315
tct ggt gaa tat gtt aaa tgg gag gag ttt cct gaa aaa gtt gct gtc   1216
Ser Gly Glu Tyr Val Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val
   320            325            330
cag atg aat gac acc cac cca act cta tgt atc cct gaa ctg att aga   1264
Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Ile Arg
335           340            345             350
ata ttg ata gat ttg aag ggc ttg agt tgg aag gaa gct tgg aat atc   1312
Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile
            355            360            365
act caa agg act gtg gct tac aca aat cat act gtt ctg cct gag gca   1360
Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
        370            375            380
ctg gag aaa tgg agt tat gag ctg atg gag aag ctg ctc cct aga cat   1408
Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg His
     385            390           395
ata gag att ata gag atg ata gac gag cag ctg ata aat gaa ata gta   1456
Ile Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Gln Leu Ile Asn Glu Ile Val
    400              405            410
tca gaa tat ggc acg tca gat ctt gac atg tta gaa aaa aag ttg aat   1504
Ser Glu Tyr Gly Thr Ser Asp Leu Asp Met Leu Glu Lys Lys Leu Asn
415             420           425           430
gat atg aga att ttg gag aat ttt gat att ccc agc tct att gcc aac   1552
Asp Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Ile Pro Ser Ser Ile Ala Asn
          435             440            445
ttg ttt acc aaa cca aag gaa act tct att gtt gat cct agt gaa gaa   1600
Leu Phe Thr Lys Pro Lys Glu Thr Ser Ile Val Asp Pro Ser Glu Glu
        450            455             460
gtt gaa gtt tct ggt aaa gtg gtg act gag agt gtt gaa gtt tct gat   1648
Val Glu Val Ser Gly Lys Val Val Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Asp
     465             470            475
aaa gtg gtg act gag agt gaa aaa gat gaa ctt gaa gaa aaa gac aca   1696
Lys Val Val Thr Glu Ser Glu Lys Asp Glu Leu Glu Glu Lys Asp Thr
   480            485            490
gaa ctg gag aaa gat gag gac cca gta cca gct cct ata cca ccc aag   1744
Glu Leu Glu Lys Asp Glu Asp Pro Val Pro Ala Pro Ile Pro Pro Lys
495            500           505             510
atg gtc cgc atg gct aat ctc tgc gtt gtt ggt ggt cat gct gta aat   1792
Met Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn
          515            520            525
gga gtt gcc gag att cat agt gat ata gtg aag gaa gat gtt ttt aat   1840
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Asp Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn
        530             535              540
gac ttt tac cag ctt tgg cct gag aaa ttt caa aac aaa aca aat ggt   1888
Asp Phe Tyr Gln Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly
     545            550           555
gtg aca cca aga aga tgg atc cga ttt tgt aat cct gct cta agt aat   1936
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Ala Leu Ser Asn
  560             565            570
atc att act aag tgg att ggt aca gag gac tgg gtc cta aac aca gaa   1984
Ile Ile Thr Lys Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu
575             580              585            590
aag ttg gca gaa ctg cgc aag ttt gca gat aat gaa gat ctt caa ata   2032
Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Ile
          595            600            605
gag tgg agg gct gca aaa aga agc aac aaa gtt aag gtt gcc tca ttc   2080
Glu Trp Arg Ala Ala Lys Arg Ser Asn Lys Val Lys Val Ala Ser Phe
        610             615           620
cta aaa gaa agg aca ggg tat tcg gtc agc ccc aat gca atg ttt gat   2128
Leu Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Ser Val Ser Pro Asn Ala Met Phe Asp
     625            630            635
atc cag gta aaa cga att cat gaa tac aag cgc caa ctc ttg aat atc   2176
Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile
    640            645             650
ttg gga att gtt tat cgc tac aag cag atg aaa gaa atg agc gca cga   2224
Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Gln Met Lys Glu Met Ser Ala Arg
655             660            665           670
gaa aga gaa gct aag ttt gtt cct cga gta tgc ata ttt gga gga aaa   2272
Glu Arg Glu Ala Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys
           675            680            685
gct ttt gct aca tat gtt caa gct aaa agg atc gca aaa ttc ata aca   2320
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Ala Lys Phe Ile Thr
        690             695           700
gat gtt gga gcc acc ata aac cat gat cct gag ata ggt gat ttg ttg   2368
Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu
     705             710            715
aag gtt att ttt gtc cca gat tac aat gtc agt gct gca gaa ctg ctg   2416
Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Ala Ala Glu Leu Leu
  720              725           730
att cca gct agt gga ctt tca caa cat atc agt act gcc gga atg gag   2464
Ile Pro Ala Ser Gly Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu
735             740             745             750
gcc agt gga caa agc aat atg aaa ttt gcc atg aat ggt tgc atc tta   2512
Ala Ser Gly Gln Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu
           755            760            765
att ggg acc ttg gat gga gcc aat gtt gag ata agg caa gag gtt gga   2560
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Gln Glu Val Gly
         770            775            780
gag gaa aac ttc ttt ctc ttt ggg gct gaa gct cat gag att gca ggg   2608
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly
     785            790            795
ctt cgg aaa gaa aga gct gag gga aag ttt gta cca gat gaa cgt ttt   2656
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe
  800            805             810
gag gaa gtc aag gaa ttc ata aag cgt ggt gtt ttt ggc tcc aat acc   2704
Glu Glu Val Lys Glu Phe Ile Lys Arg Gly Val Phe Gly Ser Asn Thr
815            820             825            830
tat gat gag ctt ctt gga tct ttg gag gga aat gaa ggc ttt ggt cgt   2752
Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg
          835            840            845
gga gac tat ttc ctt gtg ggc aag gac ttc cct agt tac ata gaa tgc    2800
Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys
        850            855           860
caa gag aag gtt gat gag gca tat cga gac caa aag ata tgg act aga    2848
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Ile Trp Thr Arg
     865            870            875
atg tca atc ttg aac aca gcc gga agt tac aaa ttc agc agt gat aga    2896
Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg
  880             885            890
aca att cat gaa tat gcc aag gac ata tgg aac atc cag cca gtt gtg    2944
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Gln Pro Val Val
895             900            905              910
ttt ccc tagaaattaa agaatgaacc aattttctga gcagcagtaa taaaatgtcg     3000
Phe Pro
tcttaggtcc tatgttcttg tttatgtaca tgtaggtgca agatcctgtg atgatctaat  3060
aaatcttgct tccttctatt atgcagatcc ttttataagg gtcatgtact tctgatcatc  3120
cttaataatc aatattttag tttcacatcg gacataagaa gttgattgca gtaagaaatc  3180
atgagttttt actactgtaa attctacaac ttggaataca aggatgacta ttccagaggc  3240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa          3292
<210>4
<211>955
<212>PRT
<213>甘薯(Ipomoea batatas)
<400>4
Met Ser Arg Leu Ser Gly Ile Thr Pro Arg Ala Arg Asp Asp Arg Ser
        -40             -35            -30
Gln Phe Gln Asn Pro Arg Leu Glu Ile Ala Val Pro Asp Arg Thr Ala
     -25            -20             -15
Gly Leu Gln Arg Thr Lys Arg Thr Leu Leu Val Lys Cys Val Leu Asp
  -10            -5          -1  1          5
Glu Thr Lys Gln Thr Ile Gln His Val Val Thr Glu Lys Asn Glu Gly
          10              15             20
Thr Leu Leu Asp Ala Ala Ser Ile Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala
        25            30              35
Glu Phe Ser Pro Ala Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala
     40              45            50
Tyr Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ala Leu Ile Val Asn Trp
  55             60             65
Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys Gln Ala Tyr
70            75            80            85
Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile
           90            95            100
Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Asn Lys Leu
        105           110            115
Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Lys Glu Pro Asp Ala Ala Leu
     120            125             130
Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu
  135            140            145
Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr
150           155             160            165
Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala
          170             175            180
Glu Asp Trp Leu Glu Leu Gly Asn Pro Trp Glu Ile Ile Arg Met Asp
        185           190            195
Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Phe Gly Lys Val Ile Thr Gly Ser Asp
      200            205            210
Gly Lys Lys His Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Leu Ala Val Ala Tyr
  215             220             225
Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg
230             235            240           245
Leu Trp Ser Thr Lys Val Pro Ser Glu Asp Phe Asp Leu Tyr Ser Phe
          250             255            260
Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala Asn Ala Glu
        265            270            275
Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys
      280             285            290
Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln
    295           300            305
Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu Tyr Val Lys Trp
310              315            320            325
Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro
          330             335            340
Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Ile Arg Ile Leu lle Asp Leu Lys Gly
        345             350             355
Leu Ser Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr
     360            365             370
Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu
   375           380            385
Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg His Ile Glu Ile Ile Glu Met Ile
390           395            400              405
Asp Glu Gln Leu Ile Asn Glu Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Ser Asp
          410             415              420
Leu Asp Met Leu Glu Lys Lys Leu Asn Asp Met Arg Ile Leu Glu Asn
        425           430           435
Phe Asp Ile Pro Ser Ser Ile Ala Asn Leu Phe Thr Lys Pro Lys Glu
     440             445             450
Thr Ser Ile Val Asp Pro Ser Glu Glu Val Glu Val Ser Gly Lys Val
  455             460             465
Val Thr Glu Ser Val Glu Val Ser Asp Lys Val Val Thr Glu Ser Glu
470             475             480           485
Lys Asp Glu Leu Glu Glu Lys Asp Thr Glu Leu Glu Lys Asp Glu Asp
          490            495            500
Pro Val Pro Ala Pro Ile Pro Pro Lys Met Val Arg Met Ala Asn Leu
        505              510            515
Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser
     520             525             530
Asp Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn Asp Phe Tyr Gln Leu Trp Pro
  535             540             545
Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile
550             555             560             565
Arg Phe Cys Asn Pro Ala Leu Ser Asn Ile Ile Thr Lys Trp Ile Gly
          570             575             580
Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys
        585             590             595
Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Ile Glu Trp Arg Ala Ala Lys Arg
     600             605             610
Ser Asn Lys Val Lys Val Ala Ser Phe Leu Lys Glu Arg Thr Gly Tyr
    615             620             625
Ser Val Ser Pro Asn Ala Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His
630             635             640             645
Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr
           650             655             660
Lys Gln Met Lys Glu Met Ser Ala Arg Glu Arg Glu Ala Lys Phe Val
        665             670             675
Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln
     680             685             690
Ala Lys Arg Ile Ala Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn
   695             700             705
His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Ile Phe Val Pro Asp
710             715             720             725
Tyr Asn Val Ser Ala Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Gly Leu Ser
           730             735             740
Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Gln Ser Asn Met
        745             750             755
Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala
     760             765             770
Asn Val Glu Ile Arg Gln Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe
  775             780             785
Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu
790             795             800             805
Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Ile
          810             815             820
Lys Arg Gly Val Phe Gly Ser Asn Thr Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser
        825             830             835
Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly
     840             845             850
Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala
  855             860             865
Tyr Arg Asp Gln Lys Ile Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala
870             875             880             885
Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys
           890             895             900
Asp Ile Trp Asn Ile Gln Pro Val Val Phe Pro
        905             910
<210>5
<211>3171
<212>DNA
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<220>
<221>CDS
<222>(87)..(3008)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(330)..(3008)
<400>5
tttttttttt caacatgcac aacaattatt ttgattaaat tttgtatcta aaaatttagc   60
attttgaaat tcagttcaga gacatc atg gca act ttt gct gtc tct gga ttg   113
                      Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu
                          -80             -75
aac tca att tca agt att tct agt ttt aat aac aat ttc aga agc aaa   161
Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys
     -70             -65             -60
aac tca aac att ttg ttg agt aga agg agg att tta ttg ttc agt ttt   209
Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe
  -55             -50             -45
aga aga aga aga aga agt ttc tct gtt agc agt gtt gct agt gat caa   257
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln
-40           -35            -30             -25
aag cag aag aca aag gat tct tcc tct gat gaa gga ttt aca tta gat   305
Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp
          -20             -15             -10
gtt ttt cag ccg gac tcc acg tct gtt tta tca agt ata aag tat cac   353
Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His
        -5          -1  1           5
gct gag ttc aca cca tca ttt tct cct gag aag ttt gaa ctt ccc aag   401
Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys
  10             15             20
gca tac tat gca act gca gag agt gtt cga gat acg ctc att ata aat   449
Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn
25             30             35             40
tgg aat gcc aca tac gaa ttc tat gaa aag atg aat gta aag cag gca   497
Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala
          45             50             55
tat tac ttg tct atg gaa ttt ctt cag gga aga gct tta ctc aat gct   545
Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala
        60             65             70
att ggt aac ttg ggg cta acc gga cct tat gca gat gct tta act aag   593
Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys
      75             80             85
ctc gga tac agt tta gag gat gta gcc agg cag gaa ccg gat gca gct   641
Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala
  90             95             100
tta ggt aat gga ggt tta gga aga ctt gct tct tgc ttt ctg gac tca   689
Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser
105           110            115            120
atg gcg aca cta aac tac cct gca tgg ggc tat gga ctt aga tac caa   737
Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln
          125            130            135
tat ggc ctt ttc aaa cag ctt att aca aaa gat gga cag gag gaa gtt   785
Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val
        140            145            150
gct gaa aat tgg ctc gag atg gga aat cca tgg gaa att gtg agg aat   833
Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn
      155            160            165
gat att tcg tat ccc gta aaa ttc tat ggg aag gtc att gaa gga gct    881
Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala
  170            175            180
gat ggg agg aag gaa tgg gct ggc gga gaa gat ata act gct gtt gcc    929
Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala
185            190            195            200
tat gat gtc cca ata cca gga tat aaa aca aaa aca acg att aac ctt    977
Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu
          205            210            215
cga ttg tgg aca aca aag cta gct gca gaa gct ttt gat tta tat gct   1025
Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala
        220            225            230
ttt aac aat gga gac cat gcc aaa gca tat gag gcc cag aaa aag gct   1073
Phe Asn Asn Gly Asp His Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala
     235            240            245
gaa aag att tgc tat gtc tta tat cca ggt gac gaa tcg ctt gaa gga   1121
Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly
   250            255            260
aag acg ctt agg tta aag cag caa tac aca cta tgt tct gct tct ctt   1169
Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu
265            270            275            280
cag gac att att gca cgg ttc gag aag aga tca ggg aat gca gta aac   1217
Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn
            285             290            295
tgg gat cag ttc ccc gaa aag gtt gca gta cag atg aat gac act cat   1265
Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His
        300            305            310
cca aca ctt tgt ata cca gaa ctt tta agg ata ttg atg gat gtt aaa   1313
Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys
     315            320             325
ggt ttg agc tgg aag cag gca tgg gaa att act caa aga acg gtc gca   1361
Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala
   330           335            340
tac act aac cac act gtt cta cct gag gct ctt gag aaa tgg agc ttc   1409
Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe
345           350            355            360
aca ctt ctt ggt gaa ctg ctt cct cgg cac gtg gag atc ata gca atg   1457
Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met
          365            370            375
ata gat gag gag ctc ttg cat act ata ctt gct gaa tat ggt act gaa   1505
Ile Asp Glu Glu Leu Leu His Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu
        380             385             390
gat ctt gac ttg ttg caa gaa aag cta aac caa atg agg att ctg gat   1553
Asp Leu Asp Leu Leu Gln Glu Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp
      395              400              405
aat gtt gaa ata cca agt tct gtt ttg gag ttg ctt ata aaa gcc gaa   1601
Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu
  410             415             420
gaa agt gct gct gat gtc gaa aag gca gca gat gaa gaa caa gaa gaa   1649
Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu
425             430            435            440
gaa ggt aag gat gac agt aaa gat gag gaa act gag gct gta aag gca   1697
Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala
           445            450            455
gaa act acg aac gaa gag gag gaa act gag gtt aag aag gtt gag gtg   1745
Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val
        460            465            470
gag gat agt caa gca aaa ata aaa cgt ata ttc ggg cca cat cca aat   1793
Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn
     475            480            485
aaa cca cag gtg gtt cac atg gca aat cta tgt gta gtt agc ggg cat   1841
Lys Pro Gln Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His
  490            495            500
gca gtt aac ggt gtt gct gag att cat agt gaa ata gtt aag gat gaa   1889
Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu
505            510             515             520
gtt ttc aat gaa ttt tac aag tta tgg cca gag aaa ttc caa aac aag   1937
Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys
           525           530            535
aca aat ggt gtg aca cca aga aga tgg cta agt ttc tgt aat cca gag   1985
Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu
        540           545            550
ttg agt gaa att ata acc aag tgg aca gga tct gat gat tgg tta gta   2033
Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val
     555              560            565
aac act gaa aaa ttg gca gag ctt cga aag ttt gct gat aac gaa gaa   2081
Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu
  570            575            580
ctc cag tct gag tgg agg aag gca aaa gga aat aac aaa atg aag att   2129
Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile
585            590            595            600
gtc tct ctc att aaa gaa aaa aca gga tac gtg gtc agt ccc gat gca   2177
Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala
            605            610            615
atg ttt gat gtt cag atc aag cgc atc cat gag tat aaa agg cag cta   2225
Met Phe Asp Val Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu
        620             625             630
tta aat ata ttt gga atc gtt tat cgc tat aag aag atg aaa gaa atg   2273
Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met
  635            640            645
agc cct gaa gaa cga aaa gaa aag ttt gtc cct cga gtt tgc ata ttt   2321
Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe
650            655            660
gga gga aaa gca ttt gct aca tat gtt cag gcc aag aga att gta aaa   2369
Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys
665            670            675            680
ttt atc act gat gta ggg gaa aca gtc aac cat gat ccc gag att ggt   2417
Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly
         685            690            695
gat ctt ttg aag gtt gta ttt gtt cct gat tac aat gtc agt gta gca   2465
Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala
     700            705            710
gaa gtg cta att cct ggt agt gag ttg tcc cag cat att agt act gct   2513
Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala
715            720            725
ggt atg gag gct agt gga acc agc aac atg aaa ttt tca atg aat ggc   2561
Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly
730            735            740
tgc ctc ctc atc ggg aca tta gat ggt gcc aat gtt gag ata aga gag   2609
Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu
745            750            755            760
gaa gtt gga gag gac aat ttc ttt ctt ttc gga gct cag gct cat gaa   2657
Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu
         765            770            775
att gct ggc cta cga aag gaa aga gcc gag gga aag ttt gtc ccg gac   2705
Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp
     780            785            790
cca aga ttt gaa gaa gta aag gcg ttc att agg aca ggc gtc ttt ggc   2753
Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly
795            800            805
acc tac aac tat gaa gaa ctc atg gga tcc ttg gaa gga aac gaa ggc   2801
Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly
810            815            820
tat ggt cgt gct gac tat ttt ctt gta gga aag gat ttc ccc gat tat   2849
Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr
825            830            835            840
ata gag tgc caa gat aaa gtt gat gaa gca tat cga gac cag aag aaa   2897
Ile Glu Cys Gln Asp Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Lys
         845            850            855
tgg acc aaa atg tcg atc tta aac aca gct gga tcg ttc aaa ttt agc   2945
Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser
     860            865            870
agt gat cga aca att cat caa tat gca aga gat ata tgg aga att gaa   2993
Ser Asp Arg Thr Ile His Gln Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu
      875              880             885
cct gtt gaa tta cct taaaagttag ccagttaaag gatgaaagcc aattttttcc    3048
Pro Val Glu Leu Pro
   890
ccctgaggtt ctcccatact gtttattagt acatatattg tcaattgttg ctactgaaat  3108
gatagaagtt ttgaatattt actgtcaata aaatacagtt gattccattt gaaaaaaaaa  3168
aaa                                                                3171
<210>6
<211>974
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>6
Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser
  -80            -75             -70
Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser
-65           -60            -55            -50
Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe
          -45             -40            -35
Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser
         -30             -25             -20
Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr
     -15             -10           -5
Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe
-1  1           5              10             15
Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu
           20            25             30
Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe
         35             40             45
Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe
     50             55             60
Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr
  65             70             75
Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp
80             85             90             95
Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly
           100            105            110
Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro
        115            120            125
Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu
      130            135            140
Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met
    145            150            155
Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys
160            165            170            175
Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala
           180            185            190
Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly
        195            200            205
Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu
     210            215            220
Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala Phe Asn Asn Gly Asp His Ala
   225            230            235
Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu
240            245            250            255
Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln
           260            265            270
Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe
        275            280            285
Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys
     290            295            300
Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu
  305            310            315
Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala
320            325            330            335
Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu
            340            345            350
Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu
        355            360            365
Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met Ile Asp Glu Glu Leu Leu His
     370            375            380
Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu Asp Leu Asp Leu Leu Gln Glu
   385            390            395
Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser
400            405            410            415
Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu
           420            425            430
Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys
        435            440            445
Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu
     450            455            460
Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile
   465            470            475
Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn Lys Pro Gln Val Val His Met
480            485            490            495
Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu
           500            505            510
Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys
         515            520            525
Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg
     530            535            540
Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys
  545            550            555
Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu
560            565            570            575
Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys
          580            585            590
Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys
        595            600            605
Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Ile Lys
     610            615            620
Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val
  625            630            635
Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu
640            645            650            655
Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr
           660            665            670
Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu
        675            680            685
Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe
     690            695            700
Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser
   705            710            715
Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr
720            725            730            735
Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu
          740            745            750
Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe
        755            760            765
Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu
     770            775            780
Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys
  785            790            795
Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu
800            805            810            815
Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe
           820            825            830
Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr Ile Glu Cys Gln Asp Lys Val
        835            840            845
Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Lys Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu
     850            855            860
Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gln
  865            870            875
Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu Pro Val Glu Leu Pro
880            885            890
<210>7
<211>3283
<212>DNA
<213>蚕豆(Vicia faba)
<220>
<221>CDS
<222>(58)..(3066)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(250)..(3066)
<400>7
acaatacaaa caatcaaagc tctgtgagtg tgtgagtgag tgagagaaat tccaatt     57
atg gct tcc atg aca atg cgg ttt cat cca aat tcc acc gcc gta acc   105
Met Ala Ser Met Thr Met Arg Phe His Pro Asn Ser Thr Ala Val Thr
           -60           -55            -50
gaa tcc gtt cct cgc cgt ggc tcc gtt tac gga ttc atc ggt tac aga   153
Glu Ser Val Pro Arg Arg Gly Ser Val Tyr Gly Phe Ile Gly Tyr Arg
        -45            -40            -35
tcc tcg tcg ttg ttc gtc cga acg aac gtt atc aag tat cgt tct gtt   201
Ser Ser Ser Leu Phe Val Arg Thr Asn Val Ile Lys Tyr Arg Ser Val
      -30            -25            -20
aag cgt aat ctg gaa ttt agg agg aga agc gct ttc tct gtg aag tgt   249
Lys Arg Asn Leu Glu Phe Arg Arg Arg Ser Ala Phe Ser Val Lys Cys
  -15            -10            -5          -1
ggt tct ggt aat gaa gcg aaa cag aaa gtc aag gat cag gaa gtt caa   297
Gly Ser Gly Asn Glu Ala Lys Gln Lys Val Lys Asp Gln Glu Val Gln
1           5            10             15
caa gaa gct aaa act tct ccg agc tca ttt gca cca gat act act tcc   345
Gln Glu Ala Lys Thr Ser Pro Ser Ser Phe Ala Pro Asp Thr Thr Ser
        20             25             30
att gtg tca agt att aag tac cat gca gag ttc aca cca ctg ttt tct   393
Ile Val Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser
      35             40             45
ccg gaa aaa ttt gag ctt cca caa gct ttc att gca act gca cag agt   441
Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Gln Ala Phe Ile Ala Thr Ala Gln Ser
  50             55             60
gtt cgt gat gct ctc ata ata aac tgg aat gct act tat gat tac tat   489
Val Arg Asp Ala Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr
65             70             75             80
gag aag ctg aat gtt aag cag gca tat tac ctt tca atg gaa ttt tta   537
Glu Lys Leu Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu
          85             90             95
cag gga aga gca tta ttg aat gca att ggc aat tta gag cta act ggt   585
Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly
        100            105             110
ccc tat gca gag gct ttg agc cag ctt agt tat aaa tta gaa gac gtg   633
Pro Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Gln Leu Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Val
     115             120            125
gca cac cag gag ccg gat gct gca ctt gga aat ggg ggt ctt gga cga   681
Ala His Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg
   130            135            140
ctt gct tca tgt ttc ttg gac tct ttg gct acc ttg aat tat ccg gca   729
Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala
145            150            155            160
tgg ggt tat gga ctg aga tac aag tat ggc tta ttc aaa caa cga atc   777
Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile
           165            170            175
acc aaa gat ggg caa gag gaa gtt gct gaa gat tgg ctc gag atg ggc   825
Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Met Gly
        180            185            190
aat cct tgg gag atc gtt aga aat gac gtc tca tac cct gta agg ttc   873
Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Val Arg Phe
     195            200            205
tat ggc aaa gtt gtt tca ggc tca gat ggt aaa aaa cat tgg gtt gga   921
Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Val Gly
  210             215             220
gga gaa gat atc aaa gct gtt gca cac gat gtc ccc ata ccc gga tat   969
Gly Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr
225             230             235            240
aag acc aga agc aca att aac ctg aga ctt tgg tct aca aaa gct gca  1017
Lys Thr Arg Ser Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Ala
          245            250            255
tcc gaa gaa ttt gat tta aat gct ttt aat tct gga agg cac acc gaa   1065
Ser Glu Glu Phe Asp Leu Asn Ala Phe Asn Ser Gly Arg His Thr Glu
        260            265            270
gca tct gag gct cta gca aat gct gaa aag att tgc tat ata ctt tac   1113
Ala Ser Glu Ala Leu Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr
      275            280            285
ccc ggg gat gaa tct ata gag gga aaa acc ctt cgc ctc aag caa caa   1161
Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln Gln
   290            295            300
tat act tta tgt tcg gct tct ctt caa gat atc att gct cgt ttt gag   1209
Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu
305            310            315            320
aga aga tca ggg gca agt gtg aat tgg gaa gac ttt cct gaa aag gtt   1257
Arg Arg Ser Gly Ala Ser Val Asn Trp Glu Asp Phe Pro Glu Lys Val
           325            330            335
gca gtg cag atg aat gat act cac cca act ttg tgc atc cca gag ctg   1305
Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu
         340            345            350
atg aga atc ctg ata gat ata aag ggt tta agc tgg aag gat gct tgg   1353
Met Arg Ile Leu Ile Asp Ile Lys Gly Leu Ser Trp Lys Asp Ala Trp
     355            360            365
aat atc acc caa cgg act gta gca tac aca aac cat act gtt ctt ccg   1401
Asn Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro
  370            375            380
gag gca tta gag aaa tgg agc atg gac ctt atg gag aaa ttg ctt cca   1449
Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Met Asp Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro
385            390            395            400
cgc cat gtt gag att ata gaa atg att gat gag gag ctg att cgg acc   1497
Arg His Val Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Glu Leu Ile Arg Thr
           405              410             415
ata atc gca gaa tat ggc aca gca gat tca gac tta ctt gat aag aaa   1545
Ile Ile Ala Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Ser Asp Leu Leu Asp Lys Lys
          420            425            430
ttg aag gaa atg aga ata cta gaa aat gtt gaa ttg cct gca gaa ttt   1593
Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ala Glu Phe
     435            440            445
gca gat ata cta gtt aaa acc aag gag gcc act gat att tct agt gag   1641
Ala Asp Ile Leu Val Lys Thr Lys Glu Ala Thr Asp Ile Ser Ser Glu
   450            455            460
gaa gtg caa att tct aaa gaa ggg gga gaa gaa gaa gaa act tct aaa   1689
Glu Val Gln Ile Ser Lys Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Thr Ser Lys
465            470            475            480
gaa ggg gga gaa gaa gaa gaa gaa aaa gaa gta gga gga gga aga gaa   1737
Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Val Gly Gly Gly Arg Glu
           485            490            495
gaa ggc gat gat ggt aag gaa gat gaa gtg gaa aaa gca att gct gaa   1785
Glu Gly Asp Asp Gly Lys Glu Asp Glu Val Glu Lys Ala Ile Ala Glu
        500            505            510
aag gat gga acg gtt aaa agc tcc att ggg gat aag aaa aag aag ttg   1833
Lys Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Ile Gly Asp Lys Lys Lys Lys Leu
     515            520            525
cct gag cca gta cca gta ccg cca aaa ttg gtt cgt atg gcc aat ctt   1881
Pro Glu Pro Val Pro Val Pro Pro Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu
   530            535            540
tgt gtt gtg ggt ggt cat gca gtg aat ggg gtt gca gag ata cat agt   1929
Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser
545            550            555            560
gaa att gtc aag gat gac gtg ttc aat gca ttt tat aag ttg tgg cct   1977
Glu Ile Val Lys Asp Asp Val Phe Asn Ala Phe Tyr Lys Leu Trp Pro
            565            570            575
gag aaa ttc cag aac aaa aca aat ggc gtg acg cct agg aga tgg att   2025
Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile
        580            585            590
agg ttc tgc aat cca gat ttg agt aaa ata ata act cag tgg ata ggc   2073
Arg Phe Cys Asn Pro Asp Leu Ser Lys Ile Ile Thr Gln Trp Ile Gly
     595            600            605
aca gaa gac tgg atc cta aat act gag aaa ctg gct gaa ctg cgg aag   2121
Thr Glu Asp Trp Ile Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys
  610            615            620
ttt gca gat aat gag gat ctg caa aca caa tgg agg gaa gca aaa agg   2169
Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Thr Gln Trp Arg Glu Ala Lys Arg
625            630            635            640
aat aac aag gtg aaa gtt gca gca ttc ctc aga gaa aga aca gga tat   2217
Asn Asn Lys Val Lys Val Ala Ala Phe Leu Arg Glu Arg Thr Gly Tyr
          645            650            655
tct gtc agt cct gat tca atg ttt gac atc cag gtg aaa aga atc cat   2265
Ser Val Ser Pro Asp Ser Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His
         660            665            670
gaa tat aaa cga caa tta tta aat ata ttt gga att gtt tat cgc tac   2313
Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr
     675            680            685
aag aag atg aaa gaa atg aat gct gct gaa aga aaa gaa aat ttt gtt   2361
Lys Lys Met Lys Glu Met Asn Ala Ala Glu Arg Lys Glu Asn Phe Val
  690            695            700
cca aga gtt tgt ata ttt ggg gga aaa gca ttt gct act tat gtg caa   2409
Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln
705            710            715            720
gcc aaa aga att gtg aaa ttt att aca gat gtt gga gct act gta aat   2457
Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Val Asn
            725            730             735
cat gat cca gaa ata gga gat ctt ctt aag gtt att ttt gtc cct gac    2505
His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Ile Phe Val Pro Asp
        740            745            750
tac aat gtt agt gtt gcg gag atg ctt att cct gct agt gaa ttg tca    2553
Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser
     755            760            765
caa cat atc agt act gct gga atg gag gca agt gga act agc aac atg    2601
Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met
   770            775            780
aaa ttt gca atg aat gga tgc tta cag att gga act ttg gat ggg gcc    2649
Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Leu Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala
785            790            795            800
aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt ggt gct gac aac ttc ttc ctt ttt    2697
Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Ala Asp Asn Phe Phe Leu Phe
           805            810            815
ggt gct aag gct cgt gaa att gtt ggg ctc agg aaa gaa aga gca aga    2745
Gly Ala Lys Ala Arg Glu Ile Val Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Arg
        820            825            830
ggg aag ttt gtc cct gat cca cga ttc gaa gaa gtt aaa aaa ttt gtc    2793
Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Lys Phe Val
     835            840            845
aga agt ggt gtc ttt ggg tct tac aac tat gat gaa ctg att gga tcc    2841
Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser
  850            855            860
tta gaa gga aat gaa ggt ttt ggt cga gca gat tat ttt ctt gtg ggc    2889
Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly
865            870            875            880
cag gac ttc cct agc tat tta gaa tgc cag gag gag gtc gac aaa gct    2937
Gln Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Glu Cys Gln Glu Glu Val Asp Lys Ala
          885            890            895
tat cgc gac caa aaa aaa tgg aca aga atg tca ata ttg aac aca gca    2985
Tyr Arg Asp Gln Lys Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala
        900            905            910
ggc tca tcc aaa ttc agc agt gac cgt acc att cat gaa tat gca cga    3033
Gly Ser Ser Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Arg
     915            920            925
gaa ata tgg aac att gag cca gtc aaa ttg gag tagaggggta atctatacta  3086
Glu Ile Trp Asn Ile Glu Pro Val Lys Leu Glu
   930            935
tacccttggt aatagcagag aatcggtgcc acgtcgtaat atgatcacta ctttaccaag  3146
tacccattag tgaaaaataa actaagtttt gtaaaattaa aataagggtc tggttttaca  3206
tactgaaata aacagaagtt ttgtaaaatt aaaataaggg tctggctgtt gtcctccaaa  3266
acaagcctac attcctg                                                 3283
<210>8
<211>1003
<212>PRT
<213>蚕豆(Vicia faa)
<400>8
Met Ala Ser Met Thr Met Arg Phe His Pro Asn Ser Thr Ala Val Thr
           -60           -55            -50
Glu Ser Val Pro Arg Arg Gly Ser Val Tyr Gly Phe Ile Gly Tyr Arg
        -45             -40             -35
Ser Ser Ser Leu Phe Val Arg Thr Asn Val Ile Lys Tyr Arg Ser Val
      -30            -25            -20
Lys Arg Asn Leu Glu Phe Arg Arg Arg Ser Ala Phe Ser Val Lys Cys
  -15            -10            -5           -1
Gly Ser Gly Asn Glu Ala Lys Gln Lys Val Lys Asp Gln Glu Val Gln
1           5            10             15
Gln Glu Ala Lys Thr Ser Pro Ser Ser Phe Ala Pro Asp Thr Thr Ser
        20             25             30
Ile Val Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser
      35             40             45
Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Gln Ala Phe Ile Ala Thr Ala Gln Ser
  50             55             60
Val Arg Asp Ala Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr
65             70             75             80
Glu Lys Leu Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu
          85             90             95
Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly
        100            105             110
Pro Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Gln Leu Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Val
     115             120            125
Ala His Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg
   130            135            140
Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala
145            150            155            160
Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile
           165            170            175
Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Met Gly
        180            185            190
Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Val Arg Phe
     195            200            205
Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Lys Lys His Trp Val Gly
  210            215            220
Gly Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr
225             230             235            240
Lys Thr Arg Ser Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Ala
          245            250            255
Ser Glu Glu Phe Asp Leu Asn Ala Phe Asn Ser Gly Arg His Thr Glu
        260            265            270
Ala Ser Glu Ala Leu Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr
      275            280            285
Pro Gly Asp Glu Ser Ile Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln Gln
   290            295            300
Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu
305            310            315            320
Arg Arg Ser Gly Ala Ser Val Asn Trp Glu Asp Phe Pro Glu Lys Val
           325            330            335
Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu
        340            345            350
Met Arg Ile Leu Ile Asp Ile Lys Gly Leu Ser Trp Lys Asp Ala Trp
     355            360            365
Asn Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro
  370             375            380
Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Met Asp Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro
385            390            395            400
Arg His Val Glu Ile Ile Glu Met Ile Asp Glu Glu Leu Ile Arg Thr
           405             410          415
Ile Ile Ala Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Ser Asp Leu Leu Asp Lys Lys
          420            425            430
Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ala Glu Phe
     435            440            445
Ala Asp Ile Leu Val Lys Thr Lys Glu Ala Thr Asp Ile Ser Ser Glu
   450            455            460
Glu Val Gln Ile Ser Lys Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Thr Ser Lys
465             470             475            480
Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Val Gly Gly Gly Arg Glu
           485            490            495
Glu Gly Asp Asp Gly Lys Glu Asp Glu Val Glu Lys Ala Ile Ala Glu
        500            505            510
Lys Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Ile Gly Asp Lys Lys Lys Lys Leu
     515            520            525
Pro Glu Pro Val Pro Val Pro Pro Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu
   530            535            540
Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser
545            550            555            560
Glu Ile Val Lys Asp Asp Val Phe Asn Ala Phe Tyr Lys Leu Trp Pro
            565            570            575
Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile
        580            585            590
Arg Phe Cys Asn Pro Asp Leu Ser Lys Ile Ile Thr Gln Trp Ile Gly
     595            600            605
Thr Glu Asp Trp Ile Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys
  610            615            620
Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Thr Gln Trp Arg Glu Ala Lys Arg
625            630            635            640
Asn Asn Lys Val Lys Val Ala Ala Phe Leu Arg Glu Arg Thr Gly Tyr
          645            650            655
Ser Val Ser Pro Asp Ser Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His
         660            665            670
Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr
     675            680            685
Lys Lys Met Lys Glu Met Asn Ala Ala Glu Arg Lys Glu Asn Phe Val
  690            695            700
Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln
705            710            715            720
Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Val Asn
           725            730            735
His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Ile Phe Val Pro Asp
        740            745            750
Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser
     755            760            765
Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met
   770            775            780
Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Leu Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala
785            790            795            800
Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Ala Asp Asn Phe Phe Leu Phe
           805             810            815
Gly Ala Lys Ala Arg Glu Ile Val Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Arg
        820            825            830
Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Lys Phe Val
     835            840            845
Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser
  850             855            860
Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly
865            870            875            880
Gln Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Glu Cys Gln Glu Glu Val Asp Lys Ala
          885            890            895
Tyr Arg Asp Gln Lys Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala
        900            905           910
Gly Ser Ser Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Arg
     915             920            925
Glu Ile Trp Asn Ile Glu Pro Val Lys Leu Glu
   930             935
<210>9
<211>2889
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2889)
<400>9
atg gat acg atg cga atc tcc ggt gta tca acc gga gct gag gtt tta     48
Met Asp Thr Met Arg Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Glu Val Leu
1         5              10             15
ata caa tgc aat tcc tta tca agc ctc gtt tct cgt cgt tgc gac gac     96
Ile Gln Cys Asn Ser Leu Ser Ser Leu Val Ser Arg Arg Cys Asp Asp
         20            25            30
gga aaa tgg cga acg aga atg ttt ccg gcg aga aac aga gac ttg cgt    144
Gly Lys Trp Arg Thr Arg Met Phe Pro Ala Arg Asn Arg Asp Leu Arg
     35            40            45
cca tcg ccg acg aga aga tcc ttt ttg tcg gtg aaa tct atc tct agc    192
Pro Ser Pro Thr Arg Arg Ser Phe Leu Ser Val Lys Ser Ile Ser Ser
   50            55            60
gaa ccg aaa gcc aaa gta acc gac gca gtt ctc gat tcc gaa caa gaa    240
Glu Pro Lys Ala Lys Val Thr Asp Ala Val Leu Asp Ser Glu Gln Glu
65            70            75            80
gtg ttt att agc tcg atg aat ccg ttt gcg cca gat gct gct tcg gta    288
Val Phe Ile Ser Ser Met Asn Pro Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Val
            85            90            95
gct tcg agt atc aag tac cac gcg gag ttt acg cca ttg ttt tca ccg    336
Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser Pro
         100            105            110
gag aag ttt gag ttg cca aag gcg ttc ttt gcg act gcg caa agt gtt    384
Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val
     115            120            125
aga gat gct ttg atc atg aat tgg aat gca act tat gag tat tac aac    432
Arg Asp Ala Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Tyr Tyr Asn
  130            135            140
aga gtg aat gtg aaa caa gcg tat tat ttg tca atg gag ttt ttg cag    480
Arg Val Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln
145            150            155            160
ggt aga gcc tta tcg aat gcc gtg ggt aac ctt ggg ctt aat agc gct    528
Gly Arg Ala Leu Ser Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Leu Asn Ser Ala
           165            170            175
tat ggt gat gct ttg aag agg ctt ggt ttt gat ttg gaa agc gtg gct    576
Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Arg Leu Gly Phe Asp Leu Glu Ser Val Ala
        180            185            190
agt cag gag cca gat cct gca ctt ggg aat ggt gga ctc ggg aga ctt    624
Ser Gln Glu Pro Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu
     195            200            205
gcc tcg tgt ttt ttg gat tcc atg gca act ttg aat tat ccg gct tgg    672
Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp
   210            215            220
ggt tat gga ctt aga tac aag tat ggc ttg ttc aaa cag aga att aca    720
Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr
225            230            235            240
aaa gat gga cag gag gaa gct gca gaa gat tgg ctt gag cta agc aat    768
Lys Asp Gly Gln Glu Glu Ala Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Ser Asn
          245            250            255
cct tgg gaa ata gtc aga aat gat gtc tca tat cct att aag ttc tat    816
Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr
        260            265            270
ggg aaa gtg gtt ttt gga tca gat ggt aag aaa cgg tgg att ggt gga    864
Gly Lys Val Val Phe Gly Ser Asp Gly Lys Lys Arg Trp Ile Gly Gly
     275            280            285
gaa gac att gtt gct gtt gct tat gat gtt cct ata cct ggt tat aaa    912
Glu Asp Ile Val Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys
   290             295            300
act aag aca act atc aat ctg cgg ctc tgg tca aca aaa gct cct tcc    960
Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Pro Ser
305            310            315            320
gaa gat ttt gat tta tct tca tat aac tct ggg aag cat act gag gca   1008
Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Asn Ser Gly Lys His Thr Glu Ala
          325            330            335
gca gaa gct cta ttc aac gct gaa aag att tgc ttc gtg ctt tac ccc   1056
Ala Glu Ala Leu Phe Asn Ala Glu Lys Ile Cys Phe Val Leu Tyr Pro
        340            345            350
gga gat gag tca act gaa gga aag gct ctt cgt ctg aag caa caa tac   1104
Gly Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Ala Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr
     355            360            365
act ctg tgc tca gcc tcg cta caa gat atc gta gca cgt ttt gag aca   1152
Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Val Ala Arg Phe Glu Thr
   370            375            380
agg tct gga gga aac gtc aac tgg gaa gaa ttt cca gag aag gtt gca   1200
Arg Ser Gly Gly Asn Val Asn Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala
385            390            395            400
gtg cag atg aat gac act cac cct acc cta tgc att cct gag cta atg   1248
Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met
           405            410            415
agg att cta atg gat tta aaa gga cta agc tgg gaa gac gct tgg aaa   1296
Arg Ile Leu Met Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Glu Asp Ala Trp Lys
         420            425            430
atc aca caa agg act gtg gca tac aca aac cat aca gtc ttg cct gag   1344
Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu
      435            440            445
gca ctg gag aag tgg agt tta gaa ctc atg gag aaa ttg ctt cct cgt   1392
Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg
   450            455            460
cat gtg gag att atc gaa aag att gat gag gag cta gtt cgc aca att   1440
His ValGlu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu Leu Val Arg Thr Ile
465            470            475            480
gtt tca gag tat ggc acc gcg gat cct gac tta ctt gaa gaa aaa ctg   1488
ValSer Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Pro Asp Leu Leu Glu Glu Lys Leu
           485            490            495
aag gca atg agg atc ttg gaa aat gtc gag ttg cct tct gcc ttt gca   1536
Lys Ala Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ser Ala Phe Ala
        500            505            510
gat gtg atc gtg aag ccg gtg aac aaa cca gtt act gca aaa gat gct   1584
Asp Val Ile Val Lys Pro Val Asn Lys Pro Val Thr Ala Lys Asp Ala
     515            520            525
caa aat ggc gtg aaa acg gaa caa gaa gag gaa aaa act gct gga gag   1632
Gln Asn Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Glu Glu Lys Thr Ala Gly Glu
   530            535            540
gaa gag gaa gac gaa gtt atc cca gaa cca aca gta gaa ccc ccc aag   1680
Glu Glu Glu Asp Glu Val Ile Pro Glu Pro Thr Val Glu Pro Pro Lys
545            550            555            560
atg gtc cgt atg gcc aac ctt gct gtt gtg ggt ggt cat gct gta aat   1728
Met Val Arg Met Ala Asn Leu Ala Val Val Gly Gly His Ala Val Asn
           565            570            575
ggc gtt gca gag ata cac agt gaa ata gtg aag cag gac gtg ttt aat   1776
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Gln Asp Val Phe Asn
        580             585             590
gat ttc gta cag ttg tgg cca gaa aaa ttt cag aac aaa aca aat gga   1824
Asp Phe Val Gln Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly
     595            600            605
gta aca cca agg cga tgg att cgt ttt tgc aac cca tat tta agt gat   1872
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Tyr Leu Ser Asp
   610            615            620
att ata act aac tgg ata ggc aca gaa gac tgg gtc tta aat acc gaa   1920
Ile Ile Thr Asn Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu
625            630            635            640
aag gtt gcg gaa cta aga aag ttt gca gat aat gaa gat ctc caa tct   1968
Lys Val Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Ser
           645            650            655
gag tgg agg gca gca aag aag aag aac aag ttg aag gtt gta tca ctt   2016
Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Lys Asn Lys Leu Lys Val Val Ser Leu
        660            665            670
atc aag gaa aga act gga tat act gtc agc ccc gat gca atg ttc gac   2064
Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp
      675            680            685
att cag atc aag cgt ata cat gag tac aag cga caa ctg cta aat atc   2112
Ile Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile
    690            695            700
ttg gga att gtt tac cgc tac aaa aag atg aag gaa atg agt gct agt   2160
Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ser
705            710            715            720
gag aga gag aaa gca ttt gtt cca aga gtt tgc ata ttt ggg gga aaa   2208
Glu Arg Glu Lys Ala Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys
           725            730            735
gca ttt gcc aca tat gtg caa gct aag aga att gtt aaa ttt atc aca   2256
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr
        740            745            750
gat gtt gcg tct aca att aac cat gat cca gaa ata ggt gac ctc ctt   2304
Asp Val Ala Ser Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu
     755            760            765
aag gtt atc ttt gtt cct gat tac aat gtc agt gtt gct gaa ttg ctc   2352
Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu
   770             775            780
att cca gca agt gag ctt tct cag cac atc agt act gct ggg atg gaa   2400
Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu
785            790            795            800
gct agt ggg aca agc aac atg aaa ttt tcg atg aac ggt tgc gtt ttg   2448
Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Val Leu
           805            810            815
att gga acc ttg gat ggg gcg aat gtc gag att aga gaa gaa gtt gga   2496
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly
         820            825            830
gaa gaa aat ttc ttc ctc ttt ggt gcc aaa gct gat cag att gtg aac   2544
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gln Ile Val Asn
     835            840            845
ctc agg aag gag aga gca gag gga aag ttt gtt ccc gat cct act ttt   2592
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Phe
  850            855            860
gaa gaa gtc aag aag ttc gtt gga agc ggc gtc ttt ggc tca aat agc   2640
Glu Glu Val Lys Lys Phe Val Gly Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser
865            870            875            880
tat gat gaa cta atc ggc tct ttg gaa gga aac gaa ggc ttt gga cga   2688
Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg
          885            890            895
gcg gat tacttc cta gtt ggc aaa gac ttt cct agt tac atc gaa tgc    2736
Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys
        900            905            910
caa gaa aaa gtc gac gag gca tac cga gac cag aaa aga tgg acg aga   2784
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Arg
     915            920            925
atg tca ata atg aac aca gca ggt tca ttc aag ttt agc agt gac cgg   2832
Met Ser Ile Met Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg
  930            935            940
acg atc cac gaa tac gcc aaa gac ata tgg aat att aag caa gtg gaa   2880
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Lys Gln Val Glu
945            950            955            960
ctt cca tga                                                       2889
Leu Pro
<210>10
<211>962
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>10
Met Asp Thr Met Arg Ile Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Glu Val Leu
1         5              10              15
Ile Gln Cys Asn Ser Leu Ser Ser Leu Val Ser Arg Arg Cys Asp Asp
         20            25             30
Gly Lys Trp Arg Thr Arg Met Phe Pro Ala Arg Asn Arg Asp Leu Arg
     35             40            45
Pro Ser Pro Thr Arg Arg Ser Phe Leu Ser Val Lys Ser Ile Ser Ser
   50            55             60
Glu Pro Lys Ala Lys Val Thr Asp Ala Val Leu Asp Ser Glu Gln Glu
65            70            75            80
Val Phe Ile Ser Ser Met Asn Pro Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Val
            85             90            95
Ala Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Leu Phe Ser Pro
         100             105            110
Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val
     115            120            125
Arg Asp Ala Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Tyr Tyr Asn
   130            135            140
Arg Val Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln
145            150            155            160
Gly Arg Ala Leu Ser Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Leu Asn Ser Ala
            165           170            175
Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Arg Leu Gly Phe Asp Leu Glu Ser Val Ala
        180            185            190
Ser Gln Glu Pro Asp Pro Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu
     195            200            205
Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp
   210            215           220
Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr
225            230            235            240
Lys Asp Gly Gln Glu Glu Ala Ala Glu Asp Trp Leu Glu Leu Ser Asn
          245            250            255
Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr
        260            265            270
Gly Lys Val Val Phe Gly Ser Asp Gly Lys Lys Arg Trp Ile Gly Gly
     275            280             285
Glu Asp Ile Val Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys
   290            295            300
Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Lys Ala Pro Ser
305            310            315            320
Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Asn Ser Gly Lys His Thr Glu Ala
          325            330            335
Ala Glu Ala Leu Phe Asn Ala Glu Lys Ile Cys Phe Val Leu Tyr Pro
        340            345            350
Gly Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Ala Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr
     355            360            365
Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Val Ala Arg Phe Glu Thr
  370            375            380
Arg Ser Gly Gly Asn Val Asn Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala
385            390            395            400
Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met
           405            410            415
Arg Ile Leu Met Asp Leu Lys Gly Leu Ser Trp Glu Asp Ala Trp Lys
         420            425            430
Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu
      435            440            445
Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Glu Leu Met Glu Lys Leu Leu Pro Arg
   450            455            460
His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu Leu Val Arg Thr Ile
465            470            475            480
Val Ser Glu Tyr Gly Thr Ala Asp Pro Asp Leu Leu Glu Glu Lys Leu
           485            490            495
Lys Ala Met Arg Ile Leu Glu Asn Val Glu Leu Pro Ser Ala Phe Ala
        500            505            510
Asp Val Ile Val Lys Pro Val Asn Lys Pro Val Thr Ala Lys Asp Ala
     515             520            525
Gln Asn Gly Val Lys Thr Glu Gln Glu Glu Glu Lys Thr Ala Gly Glu
   530            535            540
Glu Glu Glu Asp Glu Val Ile Pro Glu Pro Thr Val Glu Pro Pro Lys
545            550            555            560
Met Val Arg Met Ala Asn Leu Ala Val Val Gly Gly His Ala Val Asn
           565            570            575
Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Gln Asp Val Phe Asn
        580            585            590
Asp Phe Val Gln Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly
     595            600           605
Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Tyr Leu Ser Asp
  610            615            620
Ile Ile Thr Asn Trp Ile Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu
625            630            635            640
Lys Val Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Ser
           645            650            655
Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Lys Asn Lys Leu Lys Val Val Ser Leu
        660            665            670
Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp
      675            680            685
Ile Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile
    690            695            700
Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ser
705            710            715            720
Glu Arg Glu Lys Ala Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys
           725            730            735
Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr
        740            745            750
Asp Val Ala Ser Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu
     755            760            765
Lys Val Ile Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu
  770            775            780
Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu
785            790            795            800
Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Val Leu
           805            810            815
Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly
         820            825            830
Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gln Ile Val Asn
     835            840            845
Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Thr Phe
  850            855            860
Glu Glu Val Lys Lys Phe Val Gly Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser
865            870            875            880
Tyr Asp Glu Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg
          885             890            895
Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys
        900            905            910
Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Arg
     915            920            925
Met Ser Ile Met Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg
  930            935            940
Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Lys Gln Val Glu
945            950            955            960
Leu Pro
<210>11
<211>3088
<212>DNA
<213>菠菜(Spinacia oleracea)
<220>
<221>CDS
<222>(57)..(2972)
<400>11
ggcacgaggt gtatcggagt cactcagagt cagagagatt attcaagaga tcaaca atg   59
                                               Met
                                               1
gcg aca ttg cca tta tca tca aca aca cct tca acc gga aga aca gag    107
Ala Thr Leu Pro Leu Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Gly Arg Thr Glu
        5             10             15
aat tgt ttc tct tcg tac tat tca tcg tca att tca cga gtt atg gaa    155
Asn Cys Phe Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Arg Val Met Glu
     20             25             30
ttt ggg tta aaa aac ggc tgt aat tcc aag ctg ttg ttt tct tct gtc    203
Phe Gly Leu Lys Asn Gly Cys Asn Ser Lys Leu Leu Phe Ser Ser Val
  35             40            45
aat tat aaa cct atg att atg aga ggt tca aga agg tgt atc gta att    251
Asn Tyr Lys Pro Met Ile Met Arg Gly Ser Arg Arg Cys Ile Val Ile
50             55             60             65
aga aat gtg ttc agt gaa tcg aag ccg aaa tcg gag gaa ccg atc att    299
Arg Asn Val Phe Ser Glu Ser Lys Pro Lys Ser Glu Glu Pro Ile Ile
           70             75            80
gaa caa gaa act cca agc att ttg aac ccg ttg agt aac ttg agt cca    347
Glu Gln Glu Thr Pro Ser Ile Leu Asn Pro Leu Ser Asn Leu Ser Pro
        85             90             95
gat tct gct tca agg caa tca agt att aaa tac cat gcg gag ttc act    395
Asp Ser Ala Ser Arg Gln Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr
     100             105             110
ccg ttg ttt gct cca aat gac ttt tct ctt ccc aag gct ttc ttc gcc    443
Pro Leu Phe Ala Pro Asn Asp Phe Ser Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala
   115            120           125
gct gca cag agt gtt aga gat tca ctt att att aac tgg aat gct act    491
Ala Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr
130             135            140              145
tat gcc cat tat gag aag atg aac atg aag caa gct tat tat ttg tcc    539
Tyr Ala His Tyr Glu Lys Met Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser
            150           155           160
atg gaa ttt ctc cag ggt aga gca ctg ttg aat gcg att ggg aat ttg    587
Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu
        165           170           175
gaa cta acc gat gct tat gga gat gct ttg aaa aag ctt gga cac aat    635
Glu Leu Thr Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Lys Leu Gly His Asn
     180            185           190
ctg gaa gct gta gct tgt cag gaa cga gat gct gca ctt gga aat ggg    683
Leu Glu Ala Val Ala Cys Gln Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly
   195           200           205
ggt ctc ggg agg ctc gct tcg tgc ttt ctt gac tct ctc gct aca ttg    731
Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu
210           215            220            225
aat tat cct gca tgg ggt tat gga cta aga tac aag tat ggg tta ttc    779
Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe
           230            235           240
aag caa atg att acc aag gat ggt caa gaa gaa gtt gct gag aat tgg    827
Lys Gln Met Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp
        245            250             255
ctt gag att gct aat cca tgg gaa ctt gtg aga aat gat gtt tcc tat    875
Leu Glu Ile Ala Asn Pro Trp Glu Leu Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr
     260            265            270
tca ata aaa ttt tat gga aag gtg gtt tct gga tcg gat ggc aga agt    923
Ser Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Arg Ser
   275            280            285
cat tgg act ggg gga gag gat atc agg gct gtt gcc tat gat gtt cct    971
His Trp Thr Gly Gly Glu Asp Ile Arg Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro
290            295            300            305
att cct ggg tat caa act aaa acc act att aat ctt cga ttg tgg tgt   1019
Ile Pro Gly Tyr Gln Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Cys
            310            315            320
act act gta tca tct gaa gac ttt gac tta tct gct ttt aat gcg ggg   1067
Thr Thr Val Ser Ser Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly
        325            330            335
gaa cac gcc aaa gca aat gag gct cgt gcg aat gcg gaa aag atc tgt   1115
Glu His Ala Lys Ala Asn Glu Ala Arg Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys
     340            345            350
agc gta cta tac ccc ggg gat gaa tct atg gaa gga aag atc ctc cgt   1163
Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Met Glu Gly Lys Ile Leu Arg
   355            360            365
ctg aag caa caa tac acc cta tgt tcg gct tct ttg caa gac atc att   1211
Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile
370            375            380            385
tca caa ttt gaa agg aga tca ggg gaa cat gta aat tgg gaa gaa ttt   1259
Ser Gln Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu His Val Asn Trp Glu Glu Phe
           390            395            400
cca gag aag gtg gct gtg cag atg aat gac act cat cca aca ttg tgt   1307
Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys
        405             410           415
ata cca gaa ctg atg agg ata cta ata gat gta aaa gga ctt gcc tgg   1355
Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ala Trp
      420            425            430
aag gaa gct tgg aat ata acc caa aga act gtt gcg tat aca aat cat   1403
Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His
   435            440            445
act gtt ttg ccg gag gca ttg gag aaa tgg agt ttt gaa ctt atg caa   1451
Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Glu Leu Met Gln
450            455            460            465
tcc ttg ctt cct cga cat gtt gag att ata gag aaa ata gac gag gag   1499
Ser Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu Glu
           470            475            480
cta gtt gat acc atc gtt tct gag tat ggt act gat gac ccc aaa ttg   1547
Leu Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Asp Asp Pro Lys Leu
        485            490            495
ctg atg gga aaa ctg aat gag ttg aga ata ctg gag aat ttt cat ctt   1595
Leu Met Gly Lys Leu Asn Glu Leu Arg Ile Leu Glu Asn Phe His Leu
     500            505           510
ccc agt tcg gtt gcc agt ata atc aag gat aaa att acc tgt caa gtc   1643
Pro Ser Ser Val Ala Ser Ile Ile Lys Asp Lys Ile Thr Cys Gln Val
  515            520            525
gac gag gat aaa aaa att gaa att tct gat gaa gta gat gga cta gtt   1691
Asp Glu Asp Lys Lys Ile Glu Ile Ser Asp Glu Val Asp Gly Leu Val
530            535            540            545
gtt gta gag gaa agt gaa gaa ggt gat ata gag aaa cag gca gtg gaa   1739
Val Val Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asp Ile Glu Lys Gln Ala Val Glu
           550            555            560
gag cca gtt cca aaa cca gca aag ttg gtt cgg atg gct aac ctt tgc   1787
Glu Pro Val Pro Lys Pro Ala Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu Cys
        565            570            575
ata gtt ggg ggt cat gca gta aat ggg gtt gcc gag att cat agc caa   1835
Ile Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Gln
       580            585            590
atc gtg aag gaa caa gtt ttc cgt gac ttc ttc gag ttg tgg cca gag   1883
Ile Val Lys Glu Gln Val Phe Arg Asp Phe Phe Glu Leu Trp Pro Glu
    595            600            605
aaa ttt cag aac aaa aca aat ggg gtg act cca aga aga tgg atc cgg   1931
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg
610            615            620            625
ttt tgc aat cca gaa cta agc agt atc tta aca aaa tgg att ggg tct   1979
Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Lys Trp Ile Gly Ser
          630            635            640
gac gac tgg gtt ctt aac acc gaa aaa ctt gca gaa ctg cga aag ttt   2027
Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe
        645            650            655
gca gat aat aaa gat ctt cac act gaa tgg atg gaa gca aaa cgg aac   2075
Ala Asp Asn Lys Asp Leu His Thr Glu Trp Met Glu Ala Lys Arg Asn
     660            665            670
aac aaa cag aag gtt gtt tcg tta atc aaa gag aga aca ggt tac acg   2123
Asn Lys Gln Lys Val Val Ser Leu Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr Thr
   675            680            685
gtc agc cca gat gca atg ttt gat att cag atc aag cgt att cat gaa   2171
Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Ile His Glu
690            695            700            705
tac aag cgg caa ctt atg aac ata ttg gga att gta tac cgc tac aaa   2219
Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys
           710            715            720
aaa atg aaa gaa atg agt gct gca gag agg aag gaa aaa tat gtt cca   2267
Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ala Glu Arg Lys Glu Lys Tyr Val Pro
        725            730            735
aga gtt tgt ata ttc gga gga aaa gct ttt gcc aca tat gtg cag gct   2315
Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala
     740            745            750
aaa aga ata gtg aaa ttt atc act gat gta gga gct aca att aat cac   2363
Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His
   755            760            765
gat cct gaa att ggt gat cta ctg aag gtt gtg ttc atc ccc gat tac   2411
Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr
770            775            780            785
aat gtt agt gtg gct gag tta ttg atc cct gca agt gaa ctt tca cag   2459
Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln
            790            795            800
cat ata agc act gct ggg atg gag gca agt gga aca agc aat atg aag   2507
His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys
         805            810            815
ttt tca atg aat gga tgt atc tta att ggg acc cta gat ggt gcc aat   2555
Phe Ser Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn
     820            825            830
gtt gag att aga gaa gaa gtc gga gaa gat aac ttc ttt ctg ttt ggc   2603
Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly
   835            840            845
gct cga gca cat gat att gct ggc tta agg aag gaa aga gct gag ggc   2651
Ala Arg Ala His Asp Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly
850            855            860            865
aag tat gtg ccg gac cca tgt ttt gaa gaa gta aag gag tat gtt aga   2699
Lys Tyr Val Pro Asp Pro Cys Phe Glu Glu Val Lys Glu Tyr Val Arg
           870            875            880
agt ggt gtc ttt ggt tca aac agt tat gat gaa ctg tta ggg tct tta   2747
Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser Leu
        885            890            895
gag gga aat gaa gga ttt gga cgt gct gat tat ttc ctt gtg ggc aaa   2795
Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys
     900            905            910
gac ttc cct agt tat gta gaa tgc caa gaa caa gtt gac caa gca tat   2843
Asp Phe Pro Ser Tyr Val Glu Cys Gln Glu Gln Val Asp Gln Ala Tyr
  915            920            925
aga gat caa cag aaa tgg aca aga atg tca atc cta aat aca gct ggt   2891
Arg Asp Gln Gln Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly
930            935            940            945
tca ttc aag ttt agc agc gac cga acg att cat caa tat gct aag gat   2939
Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gln Tyr Ala Lys Asp
           950            955            960
ata tgg aat atc cat cca gta aat ctg cca tga aattgaaaac aactggatgg  2992
Ile Trp Asn Ile His Pro Val Asn Leu Pro
         965            970
ctcgccagag taaccatcat gctagaactc ttaaaagcgc ctctctctat atttttttta  3052
atgaataatt ttggtcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                            3088
<210>12
<211>971
<212>PRT
<213>菠菜(Spinacia oleracea)
<400>12
Met Ala Thr Leu Pro Leu Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Gly Arg Thr
1          5            10              15
Glu Asn Cys Phe Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Ser Arg Val Met
        20            25             30
Glu Phe Gly Leu Lys Asn Gly Cys Asn Ser Lys Leu Leu Phe Ser Ser
     35             40           45
Val Asn Tyr Lys Pro Met Ile Met Arg Gly Ser Arg Arg Cys Ile Val
   50            55             60
Ile Arg Asn Val Phe Ser Glu Ser Lys Pro Lys Ser Glu Glu Pro Ile
65            70            75            80
Ile Glu Gln Glu Thr Pro Ser Ile Leu Asn Pro Leu Ser Asn Leu Ser
            85             90            95
Pro Asp Ser Ala Ser Arg Gln Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe
        100            105            110
Thr Pro Leu Phe Ala Pro Asn Asp Phe Ser Leu Pro Lys Ala Phe Phe
     115            120            125
Ala Ala Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala
   130            135            140
Thr Tyr Ala His Tyr Glu Lys Met Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu
145            150            155            160
Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn
           165            170            175
Leu Glu Leu Thr Asp Ala Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Lys Leu Gly His
        180            185            190
Asn Leu Glu Ala Val Ala Cys Gln Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn
     195            200            205
Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr
   210            215            220
Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu
225            230            235            240
Phe Lys Gln Met Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn
           245            250            255
Trp Leu Glu Ile Ala Asn Pro Trp Glu Leu Val Arg Asn Asp Val Ser
        260            265            270
Tyr Ser Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Asp Gly Arg
      275            280            285
Ser His Trp Thr Gly Gly Glu Asp Ile Arg Ala Val Ala Tyr Asp Val
   290            295            300
Pro Ile Pro Gly Tyr Gln Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp
305            310            315            320
Cys Thr Thr Val Ser Ser Glu Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala
          325            330            335
Gly Glu His Ala Lys Ala Asn Glu Ala Arg Ala Asn Ala Glu Lys Ile
        340            345            350
Cys Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Met Glu Gly Lys Ile Leu
     355            360            365
Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile
  370            375            380
Ile Ser Gln Phe Glu Arg Arg Ser Gly Glu His Val Asn Trp Glu Glu
385            390            395            400
Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu
            405            410            415
Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ala
         420            425            430
Trp Lys Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn
     435            440            445
His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe Glu Leu Met
   450            455            460
Gln Ser Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Glu
465            470            475            480
Glu Leu Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Tyr Gly Thr Asp Asp Pro Lys
           485            490            495
Leu Leu Met Gly Lys Leu Asn Glu Leu Arg Ile Leu Glu Asn Phe His
        500            505            510
Leu Pro Ser Ser Val Ala Ser Ile Ile Lys Asp Lys Ile Thr Cys Gln
     515            520            525
Val Asp Glu Asp Lys Lys Ile Glu Ile Ser Asp Glu Val Asp Gly Leu
   530            535            540
Val Val Val Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asp Ile Glu Lys Gln Ala Val
545             550            555            560
Glu Glu Pro Val Pro Lys Pro Ala Lys Leu Val Arg Met Ala Asn Leu
           565            570            575
Cys Ile Val Gly Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser
         580            585            590
Gln Ile Val Lys Glu Gln Val Phe Arg Asp Phe Phe Glu Leu Trp Pro
      595            600            605
Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile
   610            615            620
Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Lys Trp Ile Gly
625            630            635            640
Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys
           645            650            655
Phe Ala Asp Asn Lys Asp Leu His Thr Glu Trp Met Glu Ala Lys Arg
        660            665            670
Asn Asn Lys Gln Lys Val Val Ser Leu Ile Lys Glu Arg Thr Gly Tyr
     675            680            685
Thr Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Ile His
   690            695            700
Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr
705            710            715            720
Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Ala Glu Arg Lys Glu Lys Tyr Val
           725            730            735
Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln
        740             745            750
Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn
     755             760             765
His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp
   770            775            780
Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser
785            790            795            800
Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met
            805            810            815
Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala
        820            825            830
Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe
     835             840             845
Gly Ala Arg Ala His Asp Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu
   850            855            860
Gly Lys Tyr Val Pro Asp Pro Cys Phe Glu Glu Val Lys Glu Tyr Val
865            870            875            880
Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Asn Ser Tyr Asp Glu Leu Leu Gly Ser
           885            890            895
Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly
        900            905            910
Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Val Glu Cys Gln Glu Gln Val Asp Gln Ala
     915            920            925
Tyr Arg Asp Gln Gln Lys Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala
   930            935            940
Gly Ser Phe Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Gln Tyr Ala Lys
945            950            955            960
Asp Ile Trp Asn Ile His Pro Val Asn Leu Pro
            965            970
<210>13
<211>2952
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2952)
<400>13
ggc gac gac cac ctc gcc gcc gct gca gct cgc cac cgc ctc ccg ccc     48
Gly Asp Asp His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg His Arg Leu Pro Pro
1         5             10              15
gca cgc ctc ctc ctc cgg cgg tgg cgg ggt tct cct ccg cgg gcg gtt     96
Ala Arg Leu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Gly Ser Pro Pro Arg Ala Val
        20            25            30
ccg gag gtg ggg tcg cgc cgg gtc ggg gtc ggg gtc gag ggg cga ttg    144
Pro Glu Val Gly Ser Arg Arg Val Gly Val Gly Val Glu Gly Arg Leu
     35             40             45
cag cgg cgg gtg tcg gcg cgc agc gtg gcg agc gat cgg gac gtg caa    192
Gln Arg Arg Val Ser Ala Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Asp Val Gln
   50            55             60
ggc ccc gtc tcg ccc gcg gaa ggg ctt cca aat gtg cta aac tcc atc    240
Gly Pro Val Ser Pro Ala Glu Gly Leu Pro Asn Val Leu Asn Ser Ile
65             70             75            80
ggc tca tct gcc att gca tca aac atc aag cac cat gca gag ttc gct    288
Gly Ser Ser Ala Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Ala
            85              90              95
ccc ttg ttc tct cca gat cac ttt tct ccc ctg aaa gct tac cat gcg    336
Pro Leu Phe Ser Pro Asp His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala
         100            105            110
act gct aaa agt gtc ctt gat gcg ctg ctg ata aac tgg aat gcg aca   384
Thr Ala Lys Ser Val Leu Asp Ala Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr
     115            120            125
tat gat tat tac aac aaa atg aat gta aaa caa gca tat tac ctg tcc   432
Tyr Asp Tyr Tyr Asn Lys Met Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser
   130            135            140
atg gag ttt tta cag gga agg gct ctc aca aat gct att ggc aat cta   480
Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu
145            150            155            160
gag att act ggt gaa tat gca gaa gca tta aaa caa ctt gga caa aac   528
Glu Ile Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Gln Asn
            165            170            175
ctg gag gat gtc gct agc cag gaa cca gat gct gcc ctg ggc aat ggt   576
Leu Glu Asp Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly
        180            185            190
ggt tta ggc cgc ctg gct tct tgt ttt ttg gat tct ttg gca aca tta   624
Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu
     195            200            205
aat tat cca gca ttg gga tat gga ctt cgc tat gaa tat ggc ctc ttt   672
Asn Tyr Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Glu Tyr Gly Leu Phe
  210            215             220
aag cag atc ata aca aag gat ggt cag gag gag att gct gag aat tgg   720
Lys Gln Ile Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asn Trp
225             230             235             240
ctt gag atg gga tat cct tgg gag gtt gta aga aat gat gtc tct tat   768
Leu Glu Met Gly Tyr Pro Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr
          245            250             255
cct gtg aaa ttc tat ggt aaa gtg gtg gaa ggc act gat ggt agg aag   816
Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Lys
        260            265            270
cac tgg att gga gga gaa aat atc aag gct gtg gca cat gat gtc cct   864
His Trp Ile Gly Gly Glu Asn Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro
     275             280             285
att cct ggc tac aaa act aga act acc aat aat ctg cgt ctt tgg tca   912
Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser
    290            295            300
aca act gta cca gca caa gat ttt gac ttg gca gct ttt aat tct gga   960
Thr Thr Val Pro Ala Gln Asp Phe Asp Leu Ala Ala Phe Asn Ser Gly
305            310            315            220
gat cat acc aag gca tat gaa gct cat cta aac gct aaa aag ata tgc  1008
Asp His Thr Lys Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys Ile Cys
           325            330            335
cac ata ttg tat cct ggg gat gaa tca cta gag ggg aaa gtt ctc cgc  1056
His Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Val Leu Arg
         340              345              350
ttg aag caa caa tat aca ttg tgt tca gcc tca cta cag gac atc att   1104
Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile
     355            360            365
gct cgt ttt gag agt aga gct ggc gag tct ctc aac tgg gag gac ttc   1152
Ala Arg Phe Glu Ser Arg Ala Gly Glu Ser Leu Asn Trp Glu Asp Phe
   370            375            380
ccc tcc aaa gtt gca gtg cag atg aat gac act cat cca aca cta tgc   1200
Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys
385            390            395            400
att cct gag tta atg aga ata ctg atg gat gtt aag gga tta agc tgg   1248
Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp
            405            410            415
agt gag gca tgg agt att aca gaa aga acc gtg gca tac act aac cat   1296
Ser Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His
        420            425            430
aca gtg ctt cct gaa gct cta gag aag tgg agc ttg gac ata atg cag   1344
Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gln
     435            440            445
aaa ctt tta cct cga cat gtt gag ata ata gaa aca att gat gaa gag   1392
Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Thr Ile Asp Glu Glu
   450            455            460
ctg ata aac aac ata gtc tca aaa tat gga acc aca gat act gaa ctg   1440
Leu Ile Asn Asn Ile Val Ser Lys Tyr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Leu
465             470             475            480
ttg aaa aag aag ctg aaa gag atg aga att ctg gat aat gtt gac ctt   1488
Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Asp Leu
           485            490            495
cca gct tcc att tcc caa cta ttt gtt aaa ccc aaa gac aaa aag gaa   1536
Pro Ala Ser Ile Ser Gln Leu Phe Val Lys Pro Lys Asp Lys Lys Glu
        500             505             510
tct cct gct aaa tca aag caa aag tta ctt gtt aaa tct ttg gag act   1584
Ser Pro Ala Lys Ser Lys Gln Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Thr
      515            520            525
att gtt gag gtt gag gag aaa act gag ttg gaa gag gag gcg gag gtt   1632
Ile Val Glu Val Glu Glu Lys Thr Glu Leu Glu Glu Glu Ala Glu Val
    530            535            540
cta tct gag ata gag gag gaa aaa ctt gaa tct gaa gaa gta gag gca   1680
Leu Ser Glu Ile Glu Glu Glu Lys Leu Glu Ser Glu Glu Val Glu Ala
545             550            555            560
gaa gaa gcg agt tct gag gat gag tta gat cca ttt gta aag tct gat   1728
Glu Glu Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp
           565            570            575
cct aag tta cca aga gtt gtc cga atg gca aac ctc tgt gtt gtt ggt   1776
Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly
         580              585             590
ggg cat tca gta aat ggt gta gct gaa att cac agt gaa att gtg aaa   1824
Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys
     595             600            605
cag gat gtg ttc aac agc ttc tat gag atg tgg cca act aaa ttt cag   1872
Gln Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Thr Lys Phe Gln
   610           615            620
aat aaa aca aat gga gtg act ccc agg cgt tgg atc cgg ttt tgt aat   1920
Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn
625           630            635            640
cct gca tta agt gca tta att tca aag tgg att ggt tct gat gac tgg   1968
Pro Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp
           645            650            655
gtg ctt aat aca gac aaa ctg gca gaa ctg aag aag ttt gct gat aat   2016
Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asn
        660            665            670
gaa gat ctg cat tca gag tgg cgt gct gct aag aag gct aac aaa atg   2064
Glu Asp Leu His Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Met
     675            680            685
aag gtt att tct ctt ata agg gag aag aca gga tat att gtc agt cca   2112
Lys Val Ile Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro
   690            695            700
gat gca atg ttt gat gtg cag gtg aaa agg ata cat gaa tat aag cgg   2160
Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg
705            710            715            720
cag ctg cta aat atc ctt gga att gtc tac cgc tac aag aag atg aaa   2208
Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys
          725            730              735
gaa atg agc aca gaa gaa aga gca aag agc ttt gtt cca agg gta tgc   2256
Glu Met Ser Thr Glu Glu Arg Ala Lys Ser Phe Val Pro Arg Val Cys
        740            745            750
ata ttc ggt ggg aaa gca ttt gcc aca tat ata cag gca aaa agg atc   2304
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Ile Gln Ala Lys Arg Ile
      755            760             765
gtt aaa ttt att aca gat gtg gca gct acc gtg aac cat gat tca gac   2352
Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Ser Asp
   770            775             780
att gga gat ttg ttg aag gtc gta ttt gtt cca gac tat aat gtt agt   2400
Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser
785            790            795            800
gtt gcc gag gca cta att cct gcc agt gaa ttg tca cag cat atc agt   2448
Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser
           805             810             815
act gct gga atg gaa gct agt ggg acc agt aac atg aag ttt gca atg   2496
Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met
         820               825              830
aac ggt tgc att ctt att gga act tta gat ggt gca aat gtg gag atc   2544
Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile
     835            840            845
aga gag gag gtt gga gaa gaa aac ttt ttc ctt ttt ggt gca gag gca   2592
Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala
  850             855            860
cat gaa att gct ggt ttg cgg aaa gaa aga gcc gag gga aag ttt gtg   2640
His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val
865             870             875            880
cct gac cca aga ttt gag gag gtt aag gaa ttt gtc cgc agt ggt gtc   2688
Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Val
           885            890            895
ttt ggg act tac agc tat gat gaa ttg atg ggg tct ttg gaa gga aat   2736
Phe Gly Thr Tyr Ser Tyr Asp Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn
        900            905           910
gaa ggt tac gga cgt gca gat tat ttc ctt gtt ggc aag gac ttc ccc   2784
Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro
     915            920             925
agc tat att gaa tgc caa gaa aaa gtt gat gag gcg tac cga gat cag   2832
Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln
   930            935            940
aag tta tgg aca agg atg tct atc ctc aac acg gct ggc tca tcc aag   2880
Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Ser Lys
945           950             955            960
ttc agc agc gat agg acg att cat gag tac gcc aag gat atc tgg gat   2928
Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp
           965             970            975
atc agc cct gcc atc ctt ccc tag                                   2952
Ile Ser Pro Ala Ile Leu Pro
         980
<210>14
<211>983
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>14
Gly Asp Asp His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg His Arg Leu Pro Pro
1          5             10              15
Ala Arg Leu Leu Leu Arg Arg Trp Arg Gly Ser Pro Pro Arg Ala Val
        20            25            30
Pro Glu Val Gly Ser Arg Arg Val Gly Val Gly Val Glu Gly Arg Leu
     35              40             45
Gln Arg Arg Val Ser Ala Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Asp Val Gln
   50            55            60
Gly Pro Val Ser Pro Ala Glu Gly Leu Pro Asn Val Leu Asn Ser Ile
65            70            75            80
Gly Ser Ser Ala Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Ala
            85            90            95
Pro Leu Phe Ser Pro Asp His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala
        100            105            110
Thr Ala Lys Ser Val Leu Asp Ala Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr
      115            120            125
Tyr Asp Tyr Tyr Asn Lys Met Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser
   130            135            140
Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu
145            150            155            160
Glu Ile Thr Gly Glu Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Gln Leu Gly Gln Asn
            165            170            175
Leu Glu Asp Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly
        180            185            190
Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu
     195            200            205
Asn Tyr Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Glu Tyr Gly Leu Phe
  210            215            220
Lys Gln Ile Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asn Trp
225            230            235            240
Leu Glu Met Gly Tyr Pro Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr
          245            250            255
Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Lys
        260            265            270
His Trp Ile Gly Gly Glu Asn Ile Lys Ala Val Ala His Asp Val Pro
      275            280            285
Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser
    290            295            300
Thr Thr Val Pro Ala Gln Asp Phe Asp Leu Ala Ala Phe Asn Ser Gly
305            310            315            320
Asp His Thr Lys Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys Ile Cys
           325            330            335
His Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Val Leu Arg
         340            345            350
Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile
     355            360            365
Ala Arg Phe Glu Ser Arg Ala Gly Glu Ser Leu Asn Trp Glu Asp Phe
   370            375            380
Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys
385            390            395            400
Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp
            405            410            415
Ser Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His
        420            425            430
Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gln
     435            440            445
Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Thr Ile Asp Glu Glu
   450            455            460
Leu Ile Asn Asn Ile Val Ser Lys Tyr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Leu
465            470            475            480
Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Asp Leu
          485            490            495
Pro Ala Ser Ile Ser Gln Leu Phe Val Lys Pro Lys Asp Lys Lys Glu
        500            505            510
Ser Pro Ala Lys Ser Lys Gln Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Thr
      515            520            525
Ile Val Glu Val Glu Glu Lys Thr Glu Leu Glu Glu Glu Ala Glu Val
    530            535            540
Leu Ser Glu Ile Glu Glu Glu Lys Leu Glu Ser Glu Glu Val Glu Ala
545             550            555            560
Glu Glu Ala Ser Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp
           565            570            575
Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly
        580            585            590
Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys
     595             600            605
Gln Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Thr Lys Phe Gln
   610            615            620
Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn
625            630            635            640
Pro Ala Leu Ser Ala Leu Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp
           645             650             655
Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asn
        660           665             670
Glu Asp Leu His Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Met
     675            680            685
Lys Val Ile Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro
   690            695            700
Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg
705            710            715            720
Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys
          725            730            735
Glu Met Ser Thr Glu Glu Arg Ala Lys Ser Phe Val Pro Arg Val Cys
        740            745            750
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Ile Gln Ala Lys Arg Ile
      755            760             765
Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Ser Asp
   770            775            780
Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser
785            790            795            800
Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser
            805            810            815
Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met
        820            825            830
Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile
     835             840            845
Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala
  850             855            860
His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val
865            870             875            880
Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Val
           885           890             895
Phe Gly Thr Tyr Ser Tyr Asp Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn
        900            905           910
Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro
     915            920             925
Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln
   930             935           940
Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Ser Lys
945            950            955            960
Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp
           965            970            975
Ile Ser Pro Ala Ile Leu Pro
         980
<210>15
<211>3141
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(2788)
<400>15
g cgg agc gtg gcg agc gat cgg ggc gtg cag ggg tcg gtg tcg ccc gag  49
Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gln Gly Ser Val Ser Pro Glu
1           5             10             15
gaa gag att tca agt gtg cta aat tcc atc gat tcc tct acc att gca    97
Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr Ile Ala
        20              25             30
tca aac att aag cac cat gcg gag ttc aca cca gta ttc tct cca gag   145
Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu
     35              40             45
cac ttt tca cct ctg aag gct tac cat gca act gct aaa agt gtt ctt   193
His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser Val Leu
   50            55             60
gat act ctg ata atg aac tgg aat gca aca tat gac tat tac gac aga   241
Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Asp Arg
65             70            75            80
aca aat gtg aag caa gcg tat tac ctg tcc atg gag ttt tta cag gga   289
Thr Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly
          85             90             95
aga gct ctc act aat gcc gtt ggt aac ctt gag cta act gga caa tac   337
Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Gln Tyr
        100            105            110
gca gaa gca cta caa caa ctt gga cac agc cta gag gat gtt gct acc   385
Ala Glu Ala Leu Gln Gln Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val Ala Thr
      115            120            125
cag gag cca gat gct gcc ctt ggg aat ggt ggt cta ggc cgg tta gct   433
Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala
   130            135            140
tcc tgt ttc ttg gat tct ctg gca acc cta aat tat cca gca tgg gga   481
Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly
145            150            155            160
tat gga ctt cga tac aaa cat ggc ctc ttt aag caa atc ata acg aag   529
Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile Thr Lys
           165            170           175
gat ggt cag gag gag gta gct gaa aat tgg ctc gag atg gga aat cct   577
Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro
        180            185            190
tgg gag att gta aga acc gat gtc tcc tat cct gtg aag ttc tat ggt   625
Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly
     195             200            205
aaa gtg gtt gaa ggc act gat ggg agg atg cac tgg att gga gga gaa    673
Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly Gly Glu
  210            215            220
aat atc aag gtt gtt gct cat gat atc cct att cct ggc tac aag act    721
Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr
225             230             235            240
aaa act acc aac aat ctt cgt ctt tgg tca aca aca gtg cca tca caa    769
Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro Ser Gln
           245           250            255
gat ttc gat ttg gaa gct ttt aat gct gga gat cat gca agt gca tat    817
Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser Ala Tyr
        260           265            270
gaa gct cat cta aat gct gaa aag ata tgt cac gta ctg tat cct ggg    865
Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Ile Cys His Val Leu Tyr Pro Gly
     275            280             285
gac gaa tca cca gag ggg aaa gtt ctt cgc ctg aag caa caa tat aca    913
Asp Glu Ser Pro Glu Gly Lys Val Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr
  290            295            300
tta tgc tca gcc tca cta cag gat att att gct cgt ttc gag agg aga    961
Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg
305            310            315            320
gct ggt gat tct ctc agc tgg gag gac ttc ccc tct aaa gtt gca gtg   1009
Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp Phe Pro Ser Lys Val Ala Val
           325            330            335
cag atg aat gac act cac cca aca ctg tgc att cct gag ttg atg aga   1057
Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg
        340            345            350
ata ttg att gat gtt aaa ggg tta agc tgg aat gag gct tgg agt atc   1105
Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile
      355            360            365
aca gaa aga act gtg gca tac aca aac cac acg gtg ctt cct gaa gct   1153
Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
  370            375            380
ctg gag aag tgg agc ttg gac ata atg cag aaa ctt ctt cct cgg cat   1201
Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His
385            390            395            400
gtt gaa atc ata gaa aaa att gat ggg gag ctg atg aac atc att atc   1249
Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile
            405              410            415
tca aaa tac gga aca gaa gat act tca ctg tta aaa aag aag att aaa   1297
Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys
        420            425            430
gaa atg aga atc tta gac aac att gac cta cca gat tct att gcc aaa   1345
Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys
     435            440             445
cta ttt gtg aaa cca aaa gag aaa aaa gaa tct cct gct aaa ttg aaa   1393
Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys
  450            455            460
gag aaa ttg ctt gtc aaa tct ctg gag cct agt gtt gtg gtt gag gag   1441
Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Pro Ser Val Val Val Glu Glu
465            470            475            480
aaa act gtg tcc aaa gta gag ata aac gag gac tct gag gag gtg gag   1489
Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu
           485            490             495
gta gac tct gaa gaa gtt gtg gag gca gaa aac gag gac tct gag gat   1537
Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp
        500             505            510
gag tta gat cca ttt gta aaa tca gat cct aaa tta cct aga gtt gtc   1585
Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp Pro Lys Leu Pro Arg Val Val
     515            520            525
cga atg gct aac ctt tgt gtt gtt ggt ggg cat tcg gtt aat ggt gtg   1633
Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ser Val Asn Gly Val
  530            535            540
gct gcg att cac agc gag att gtg aaa gaa gat gta ttc aac agc ttt   1681
Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe
545             550              555            560
tat gag atg tgg ccc gct aaa ttt caa aat aaa aca aat gga gtg act   1729
Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr
          565            570            575
cct aga cgt tgg att cgg ttt tgt aat cct gaa tta agt gca atc att   1777
Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile
        580             585            590
tca aaa tgg ata gga tct gat gat tgg gtt ttg aac act gat aaa ctt   1825
Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu
     595             600            605
gct gaa tta aag aag ttt gct gat gat gag gat ctg caa tca gaa tgg   1873
Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp Glu Asp Leu Gln Ser Glu Trp
   610            615           620
cgt gct gct aaa aag gct aac aag gtg aag gtt gtt tct ctc ata aga   1921
Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val Lys Val Val Ser Leu Ile Arg
625            630            635            640
gaa aaa aca gga tat atc gtc agt cca gat gca atg ttt gac gtt cag   1969
Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gln
           645             650             655
gtg aaa agg atc cat gag tat aag cga cag ctg cta aat atc ctt gga   2017
Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly
        660             665            670
att gtc tac cgc tac aag aag atg aaa gaa atg agt gca aaa gac aga   2065
Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg
   675               680            685
ata aat agc ttt gtt cca agg gta tgc ata ttt ggt ggg aaa gca ttt   2113
Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe
    690            695            700
gcc act tac gta cag gca aag agg ata gtg aag ttt att aca gat gtt   2161
Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val
705            710            715            720
gca gct act gta aat cat gat cca gaa att gga gat cta ttg aag gtt   2209
Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val
           725            730            735
gta ttt att cca gat tat aat gtt agt gtt gct gag gcg cta atc cct   2257
Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro
        740            745            750
gcc agt gaa ttg tct cag cat atc agt act gct gga atg gaa gct agt   2305
Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser
      755            760            765
gga acc agc aac atg aag ttt gca atg aat gga tgt atc ctt att gga   2353
Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly
   770            775            780
act ttg gat ggt gct aat gtg gaa atc aga gag gag gtt gga gag gaa   2401
Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu
785            790            795            800
aac ttt ttc ctt ttt ggt gct gag gca cat gaa att gct ggt tta agg   2449
Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg
          805             810            815
aaa gag aga gcc cag gga aag ttt gtg cct gac cca aga ttc gaa gag   2497
Lys Glu Arg Ala Gln Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu
        820            825            830
gtt aag aga ttt gtc cgc agt ggg gtc ttt gga act tac aac tac gat   2545
Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp
     835             840            845
gac ttg atg ggt tct ctg gaa gga aat gaa ggt tat ggg cgt gca gac   2593
Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp
  850            855            860
tat ttt ctt gtt ggt aaa gat ttc ccc agc tac att gaa tgc cag gag   2641
Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu
865            870            875            880
aag gtt gat aaa gca tac cgc gat cag aaa cta tgg aca agg atg tca   2689
Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser
          885            890            895
atc ctc aac aca gcc agt tcc tcc aag ttc aac agc gac cgg acg att   2737
Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile
         900            905            910
cac gag tac gcc aag gac atc tgg gac atc aag cct gtc atc ctg ccc   2785
His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro
     915             920            925
tag acaggcaagg caagcactag ccactccctg ccagcgacct tcagagctaa         2838
ggtgcgcgca accggtgatg cgatgacagc atctgcctcc cagctctcct tggcaggaag  2898
gtttcgcttt gctcccagtt ttgagtagac agaagcaagt tcagttcagg cttcgataaa  2958
acgctggaac tatgcaaatt gtagccgtgt tgcctagcct ggaacaccct tgttttacct  3018
gtaatgtgta gcagcctctg ctgatcagct catgtgctat atggaattct gaagtgaaac  3078
catagttaaa agggatcggt tagtggcaaa aaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  3138
aaa                                                                3141
<210>16
<211>928
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>16
Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gln Gly Ser Val Ser Pro Glu
1           5             10             15
Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr Ile Ala
        20              25              30
Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu
     35              40             45
His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser Val Leu
   50            55             60
Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr Asp Arg
65             70            75            80
Thr Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly
           85            90             95
Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Gln Tyr
        100            105            110
Ala Glu Ala Leu Gln Gln Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val Ala Thr
      115            120            125
Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala
   130            135            140
Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly
145            150            155            160
Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile Thr Lys
           165            170            175
Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro
        180             185           190
Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly
     195             200             205
Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly Gly Glu
  210             215            220
Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr
225            230            235            240
Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro Ser Gln
          245            250            255
Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser Ala Tyr
        260            265            270
Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Ile Cys His Val Leu Tyr Pro Gly
      275            280            285
Asp Glu Ser Pro Glu Gly Lys Val Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr
  290             295            300
Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg
305            310            315            320
Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp Phe Pro Ser Lys Val Ala Val
           325            330            335
Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg
        340           345            350
Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile
       355            360            365
Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
  370            375            380
Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His
385            390            395            400
Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile
            405              410            415
Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys
        420            425             430
Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys
     435            440             445
Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys
  450            455            460
Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu Pro Ser Val Val Val Glu Glu
465            470            475            480
Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu
           485            490             495
Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp
        500             505            510
Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp Pro Lys Leu Pro Arg Val Val
     515            520            525
Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ser Val Asn Gly Val
   530           535            540
Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe
545             550              555            560
Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr
           565            570            575
Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile
        580            585            590
Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu
     595            600            605
Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp Glu Asp Leu Gln Ser Glu Trp
   610            615            620
Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val Lys Val Val Ser Leu Ile Arg
625            630            635            640
Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gln
           645             650             655
Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly
        660             665            670
Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg
       675            680            685
Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe
    690            695            700
Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val
705            710            715            720
Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val
           725            730            735
Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro
         740            745            750
Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser
      755            760            765
Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly
  770            775            780
Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu
785            790            795            800
Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala His Glu Ile Ala Gly Leu Arg
          805            810            815
Lys Glu Arg Ala Gln Gly Lys Phe Val Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu
        820            825            830
Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp
     835            840            845
Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp
  850            855            860
Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu
865            870            875            880
Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser
           885            890            895
Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile
         900            905            910
His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro
     915            920            925
<210>17
<211>2856
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2856)
<400>17
atg gcg acc gcc tcg gcg ccg ctg cag ctg gcc acc gcg tcc cgg ccg     48
Met Ala Thr Ala Ser Ala Pro Leu Gln Leu Ala Thr Ala Ser Arg Pro
1          5              10            15
ctc ccc gtc ggc gtc ggc tgc ggc gga gga gga ggc ggg ggg ctc cac     96
Leu Pro Val Gly Val Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu His
        20             25            30
gtg ggt ggt gcc cgc ggc ggg ggc gcg gca ccg gcg cgg cgg cgg ctg    144
Val Gly Gly Ala Arg Gly Gly Gly Ala Ala Pro Ala Arg Arg Arg Leu
     35              40             45
gcg gtg cgg agc gtg gcg agc gat cgg ggc gtg cag ggg tcg gtg tcg    192
Ala Val Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gln Gly Ser Val Ser
  50             55              60
ccc gag gaa gag att tca agt gtg cta aat tcc atc gat tcc tct acc    240
Pro Glu Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr
65             70              75             80
att gca tca aac att aag cac cat gcg gag ttc aca cca gta ttc tct    288
Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser
            85              90            95
cca gag cac ttt tca cct ctg aag gct tac cat gca act gct aaa agt    336
Pro Glu His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser
        100             105            110
gtt ctt gat act ctg ata atg aac tgg aat gca aca tat gac tat tac    384
Val Leu Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr
     115            120            125
gac aga aca aat gtg aag caa gcg tat tac ctg tcc atg gag ttt tta    432
Asp Arg Thr Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu
   130             135             140
cag gga aga gct ctc act aat gcc gtt ggt aac ctt gag cta act gga    480
Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly
145            150            155            160
caa tac gca gaa gca cta caa caa ctt gga cac agc cta gag gat gtt    528
Gln Tyr Ala Glu Ala Leu Gln Gln Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val
           165            170            175
gct acc cag gag cca gat gct gcc ctt ggg aat ggt ggt cta ggc cgg    576
Ala Thr Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg
        180            185            190
tta gct tcc tgt ttc ttg gat tct ctg gca acc cta aat tat cca gca    624
Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala
     195            200            205
tgg gga tat gga ctt cga tac aaa cat ggc ctc ttt aaa gca aat cat    672
Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Ala Asn His
  210            215            220
acg aag gat ggt cag gag gag gta gct gaa aat tgg ctc gag atg gga    720
Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly
225            230            235            240
aat cct tgg gag att gta aga acc gat gtc tcc tat cct gtg aag ttc    768
Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe
          245            250            255
tat ggt aaa gtg gtt gaa ggc act gat ggg agg atg cac tgg att gga    816
Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly
        260            265            270
gga gaa aat atc aag gtt gtt gct cat gat atc cct att cct ggc tac    864
Gly Glu Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr
     275            280            285
aag act aaa act acc aac aat ctt cgt ctt tgg tca aca aca gtg cca    912
Lys Thr Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro
  290            295            300
tca caa gat ttc gat ttg gaa gct ttt aat gct gga gat cat gca agt    960
Ser Gln Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser
305            310            315            320
gca tat gaa gct cat cta aat gct gaa aag cct cac tac agg gat att   1008
Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Pro His Tyr Arg Asp Ile
           325            330            335
att gct cgt ttc gag agg aga gct ggt gat tct ctc agc tgg gag gac   1056
Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp
         340            345            350
ttc ccc tct aaa gtt gca gtg cag atg aat gac act cac cca aca ctg   1104
Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu
     355            360            365
tgc att cct gag ttg atg aga ata ttg att gat gtt aaa ggg tta agc   1152
Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser
   370             375              380
tgg aat gag gct tgg agt atc aca gaa aga act gtg gca tac aca aac   1200
Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn
385            390            395            400
cac acg gtg ctt cct gaa gct ctg gag aag tgg agc ttg gac ata atg   1248
His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met
           405            410            415
cag aaa ctt ctt cct cgg cat gtt gaa atc ata gaa aaa att gat ggg   1296
Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly
        420            425            430
gag ctg atg aac atc att atc tca aaa tac gga aca gaa gat act tca   1344
Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser
     435            440            445
ctg tta aaa aag aag att aaa gaa atg aga atc tta gac aac att gac   1392
Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp
   450            455            460
cta cca gat tct att gcc aaa cta ttt gtg aaa cca aaa gag aaa aaa   1440
Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys
465            470            475            480
gaa tct cct gct aaa ttg aaa gag aaa ttg ctt gtc aaa tct ctg gag   1488
Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu
           485            490            495
cct agt gtt gtg gtt gag gag aaa act gtg tcc aaa gta gag ata aac   1536
Pro Ser Val Val Val Glu Glu Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn
        500            505            510
gag gac tct gag gag gtg gag gta gac tct gaa gaa gtt gtg gag gca   1584
Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala
     515            520            525
gaa aac gag gac tct gag gat gag tta gat cca ttt gta aaa tca gat   1632
Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp
   530            535            540
cct aaa tta cct aga gtt gtc cga atg gct aac ctt tgt gtt gtt ggt   1680
Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly
545            550            555            560
ggg cat tcg gtt aat ggt gtg gct gcg att cac agc gag att gtg aaa   1728
Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys
            565            570            575
gaa gat gta ttc aac agc ttt tat gag atg tgg ccc gct aaa ttt caa   1776
Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gln
        580            585            590
aat aaa aca aat gga gtg act cct aga cgt tgg att cgg ttt tgt aat   1824
Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn
     595            600            605
cct gaa tta agt gca atc att tca aaa tgg ata gga tct gat gat tgg   1872
Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp
   610              615              620
gtt ttg aac act gat aaa ctt gct gaa tta aag aag ttt gct gat gat   1920
Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp
625            630            635            640
gag gat ctg caa tca gaa tgg cgt gct gct aaa aag gct aac aag gtg   1968
Glu Asp Leu Gln Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val
          645            650             655
aag gtt gtt tct ctc ata aga gaa aaa aca gga tat atc gtc agt cca   2016
Lys Val Val Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro
        660             665             670
gat gca atg ttt gac gtt cag gtg aaa agg atc cat gag tat aag cga   2064
Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg
     675            680            685
cag ctg cta aat atc ctt gga att gtc tac cgc tac aag aag atg aaa   2112
Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys
   690            695             700
gaa atg agt gca aaa gac aga ata aat agc ttt gtt cca agg gta tgc   2160
Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys
705            710            715            720
ata ttt ggt ggg aaa gca ttt gcc act tac gta cag gca aag agg ata   2208
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile
            725            730            735
gtg aag ttt att aca gat gtt gca gct act gta aat cat gat cca gaa   2256
Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu
        740            745            750
att gga gat cta ttg aag gtt gta ttt att cca gat tat aat gtt agt   2304
Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser
       755           760            765
gtt gct gag gcg cta atc cct gcc agt gaa ttg tct cag cat atc agt   2352
Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser
   770            775             780
act gct gga atg gaa gct agt gga acc agc aac atg aag ttt gca atg   2400
Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met
785            790            795            800
aat gga tgt atc ctt att gga act ttg gat ggt gct aat gtg gaa atc   2448
Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile
          805              810            815
aga gag gag gtt gga gag gaa aac ttt ttc ctt ttt ggt gct gag gca   2496
Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala
        820            825            830
cat gaa att gct ggt tta agg aaa gag aga gcc cag gga aag ttt gtg   2544
His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Gln Gly Lys Phe Val
     835            840            845
cct gac cca aga ttc gaa gag gtt aag aga ttt gtc cgc agt ggg gtc   2592
Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val
    850             855             860
ttt gga act tac aac tac gat gac ttg atg ggt tct ctg gaa gga aat   2640
Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn
865            870            875           880
gaa ggt tat ggg cgt gca gac tat ttt ctt gtt ggt aaa gat ttc ccc   2688
Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro
           885            890           895
agc tac att gaa tgc cag gag aag gtt gat aaa gca tac cgc gat cag   2736
Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gln
         900             905            910
aaa cta tgg aca agg atg tca atc ctc aac aca gcc agt tcc tcc aag   2784
Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys
     915            920            925
ttc aac agc gac cgg acg att cac gag tac gcc aag gac atc tgg gac   2832
Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp
  930            935             940
atc aag cct gtc atc ctg ccc tag                                   2856
Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro
945              950
<210>18
<211>951
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>18
Met Ala Thr Ala Ser Ala Pro Leu Gln Leu Ala Thr Ala Ser Arg Pro
1          5              10            15
Leu Pro Val Gly Val Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu His
        20             25            30
Val Gly Gly Ala Arg Gly Gly Gly Ala Ala Pro Ala Arg Arg Arg Leu
     35             40              45
Ala Val Arg Ser Val Ala Ser Asp Arg Gly Val Gln Gly Ser Val Ser
   50            55              60
Pro Glu Glu Glu Ile Ser Ser Val Leu Asn Ser Ile Asp Ser Ser Thr
65             70              75             80
Ile Ala Ser Asn Ile Lys His His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser
            85              90             95
Pro Glu His Phe Ser Pro Leu Lys Ala Tyr His Ala Thr Ala Lys Ser
        100             105            110
Val Leu Asp Thr Leu Ile Met Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Tyr Tyr
     115            120            125
Asp Arg Thr Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu
  130            135            140
Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly
145            150            155            160
Gln Tyr Ala Glu Ala Leu Gln Gln Leu Gly His Ser Leu Glu Asp Val
           165            170            175
Ala Thr Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg
        180            185            190
Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala
     195            200            205
Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys Ala Asn His
  210            215            220
Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly
225            230            235            240
Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Thr Asp Val Ser Tyr Pro Val Lys Phe
          245            250             255
Tyr Gly Lys Val Val Glu Gly Thr Asp Gly Arg Met His Trp Ile Gly
        260             265           270
Gly Glu Asn Ile Lys Val Val Ala His Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr
     275             280             285
Lys Thr Lys Thr Thr Asn Asn Leu Arg Leu Trp Ser Thr Thr Val Pro
  290            295            300
Ser Gln Asp Phe Asp Leu Glu Ala Phe Asn Ala Gly Asp His Ala Ser
305            310            315            320
Ala Tyr Glu Ala His Leu Asn Ala Glu Lys Pro His Tyr Arg Asp Ile
           325            330            335
Ile Ala Arg Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Ser Leu Ser Trp Glu Asp
         340            345            350
Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu
     355            360            365
Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp Val Lys Gly Leu Ser
  370             375            380
Trp Asn Glu Ala Trp Ser Ile Thr Glu Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn
385            390            395            400
His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asp Ile Met
           405            410            415
Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Glu Lys Ile Asp Gly
        420            425             430
Glu Leu Met Asn Ile Ile Ile Ser Lys Tyr Gly Thr Glu Asp Thr Ser
     435            440              445
Leu Leu Lys Lys Lys Ile Lys Glu Met Arg Ile Leu Asp Asn Ile Asp
  450            455            460
Leu Pro Asp Ser Ile Ala Lys Leu Phe Val Lys Pro Lys Glu Lys Lys
465            470            475            480
Glu Ser Pro Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Leu Val Lys Ser Leu Glu
           485            490            495
Pro Ser Val Val Val Glu Glu Lys Thr Val Ser Lys Val Glu Ile Asn
        500             505             510
Glu Asp Ser Glu Glu Val Glu Val Asp Ser Glu Glu Val Val Glu Ala
     515            520             525
Glu Asn Glu Asp Ser Glu Asp Glu Leu Asp Pro Phe Val Lys Ser Asp
   530           535            540
Pro Lys Leu Pro Arg Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly
545            550            555            560
Gly His Ser Val Asn Gly Val Ala Ala Ile His Ser Glu Ile Val Lys
           565            570              575
Glu Asp Val Phe Asn Ser Phe Tyr Glu Met Trp Pro Ala Lys Phe Gln
        580            585           590
Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn
     595            600            605
Pro Glu Leu Ser Ala Ile Ile Ser Lys Trp Ile Gly Ser Asp Asp Trp
   610            615              620
Val Leu Asn Thr Asp Lys Leu Ala Glu Leu Lys Lys Phe Ala Asp Asp
625            630           635            640
Glu Asp Leu Gln Ser Glu Trp Arg Ala Ala Lys Lys Ala Asn Lys Val
          645            650            655
Lys Val Val Ser Leu Ile Arg Glu Lys Thr Gly Tyr Ile Val Ser Pro
        660            665            670
Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg
     675            680            685
Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys
  690             695            700
Glu Met Ser Ala Lys Asp Arg Ile Asn Ser Phe Val Pro Arg Val Cys
705            710             715            720
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile
            725            730            735
Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Ala Ala Thr Val Asn His Asp Pro Glu
        740             745            750
Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asp Tyr Asn Val Ser
      755           760             765
Val Ala Glu Ala Leu Ile Pro Ala Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser
  770              775             780
Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met
785            790            795            800
Asn Gly Cys Ile Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile
          805              810            815
Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Glu Ala
        820            825            830
His Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Gln Gly Lys Phe Val
     835             840            845
Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Arg Phe Val Arg Ser Gly Val
   850           855            860
Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn
865           870            875            880
Glu Gly Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro
         885            890            895
Ser Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Lys Ala Tyr Arg Asp Gln
        900            905             910
Lys Leu Trp Thr Arg Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Ser Ser Ser Lys
     915            920            925
Phe Asn Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asp
  930            935            940
Ile Lys Pro Val Ile Leu Pro
945             950
<210>19
<211>2856
<212>DNA
<213>小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>CDS
<222>(58)..(2556)
<400>19
cgccacctcc cccgcacaca ccgagtgctc gtgctcgacg caattcccca ccccgcg      57
atg agt gcg gcg gac aag gtg aag ccg gcg gcc agc ccc gcg tcg gag    105
Met Ser Ala Ala Asp Lys Val Lys Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu
1          5             10             15
gac ccc tcc gcc atc gcc ggc aac atc tcc tac cac gcg cag tac agc    153
Asp Pro Ser Ala Ile Ala Gly Asn Ile Ser Tyr His Ala Gln Tyr Ser
        20              25              30
ccc cac ttc tcg ccg ctc gcc ttc ggc ccc gag cag gcc ttc tac gcc    201
Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe Gly Pro Glu Gln Ala Phe Tyr Ala
     35             40             45
acc gcc gag agc gtc cgc gac cac ctc ctc cag aga tgg aac gac acc    249
Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His Leu Leu Gln Arg Trp Asn Asp Thr
  50             55             60
tac ctg cat ttc cac aag acg gat ccc aag cag acc tac tac ctc tcc    297
Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser
65            70             75            80
atg gag tac ctg cag ggc cgc gcg ctc acc aac gcc gtc ggc aac ctc    345
Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu
          85             90            95
gcc atc acc ggc gcc tac gct gac gcc ctg aag aag ttc ggc tac gag    393
Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Phe Gly Tyr Glu
         100             105            110
ctc gag gcc atc gct gga cag gag aga gat gcg gct ctg gga aat ggt    441
Leu Glu Ala Ile Ala Gly Gln Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly
     115             120             125
ggc ttg ggc agg ctt gca tct tgc ttt ttg gat tca atg gca acg ctg    489
Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu
   130            135            140
aac ttg cct tct tgg ggc tat ggc ctt cgt tac cgt tat ggc ctg ttc    537
Asn Leu Pro Ser Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe
145            150            155            160
aag cag cgc att gcc aag gaa gga caa gaa gaa atc gct gaa gat tgg    585
Lys Gln Arg Ile Ala Lys Glu Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp
           165            170            175
ctt gat aag ttt agc cca tgg gag att gtc agg cat gat gtt gta tac    633
Leu Asp Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Tyr
        180            185            190
cca atc aga ttt ttc ggc cat gtc gag att tcg cca gat gga aag cgg    681
Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Ile Ser Pro Asp Gly Lys Arg
       195            200            205
aaa tgg gcc ggt gga gaa gtt ctg aac gct tta gcc tat gat gtg cca    729
Lys Trp Ala Gly Gly Glu Val Leu Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro
   210            215            220
att cct ggg tac aag aca aaa aat gca atc agt ctt cgc ctt tgg gat    777
Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp
225             230           235              240
gca aca gct act gct gag gat ttc aac tta ttt cag ttc aat gat ggc    825
Ala Thr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly
           245            250            255
cag tat gag tca gct gct caa ctt cac tcg agg gca cag cag ata tgt    873
Gln Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys
        260             265            270
gct gtt ctc tat ccc ggt gat gct aca gaa gaa ggg aag ctt ctg aga    921
Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg
     275            280            285
tta aag cag cag tat ttc ctt tgc agc gca tca ctt cag gat att att    969
Leu Lys Gln Gln Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile
   290           295            300
ttc aga ttt aaa gaa aga aaa gct gac aga gtt tca ggg aag tgg agt   1017
Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser
305           310            315            320
gag ttc cct tcc aaa gtt gct gtt caa atg aat gac act cat cca act   1065
Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr
           325            330            335
ctt gcc att cct gag cta atg agg ttg ctt atg gac gtg gag gga ctt   1113
Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu
        340            345             350
ggt tgg gac gaa gcc tgg gct gtc aca aat aag acg gtt gct tac acc   1161
Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Asn Lys Thr Val Ala Tyr Thr
     355            360            365
aat cac acg gtt ctt cct gaa gct ctt gag aaa tgg tca cag gct gta   1209
Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val
  370            375            380
atg aag aaa ttg ctt cca cgt cac atg gaa atc att gag gaa att gac   1257
Met Lys Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp
385            390            395            400
aag cgg ttt aga gaa atg gta atc tcc acc cgg aag gat atg gag gga   1305
Lys Arg Phe Arg Glu Met Val Ile Ser Thr Arg Lys Asp Met Glu Gly
          405            410            415
aag atc gaa tcg atg agg gtt tta gat aac aat ccc gag aag cca gta   1353
Lys Ile Glu Ser Met Arg Val Leu Asp Asn Asn Pro Glu Lys Pro Val
         420            425            430
gtg cgg atg gcg aat ttg tgt gtt gtg gct ggg cat acg gtg aat gga   1401
Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ala Gly His Thr Val Asn Gly
      435           440             445
gtg gcc gag ttg cac agc aac atc ttg aaa caa gag ctg ttt gca gat   1449
Val Ala Glu Leu His Ser Asn Ile Leu Lys Gln Glu Leu Phe Ala Asp
   450            455             460
tat gtc tct att tgg cct aac aaa ttc cag aac aaa act aat gga att   1497
Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile
465             470            475            480
aca cca cgt aga tgg ctc cgt ttt tgc aac cct gag ttg agt gaa ata   1545
Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile
          485            490            495
gtc act aaa tgg cta aaa aca gat cag tgg aca agc aac ctt gat ctt   1593
Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu
        500            505            510
ctc acc ggg ctt cgg aaa ttc gca gat gat gaa aaa cta cat gct gag   1641
Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu
     515            520            525
tgg gca gca gcc aag ctg gcc agc aaa aag cgc cta gcc aag cat gta   1689
Trp Ala Ala Ala Lys Leu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val
  530             535            540
ttg gat gtg act ggt gtt aca att gac cca gat agc ctt ttt gat ata   1737
Leu Asp Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile
545            550            555             560
caa att aaa cgc atc cac gaa tac aag aga cag ctg atg aac att ttg   1785
Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu
            565            570            575
gga gct gtg tac aga tac aag aag tta aag gaa atg agc gca gca gac   1833
Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Ala Ala Asp
        580            585            590
agg cag aag gtt aca ccg cgc act gtc atg gta gga ggg aaa gca ttt   1881
Arg Gln Lys Val Thr Pro Arg Thr Val Met Val Gly Gly Lys Ala Phe
     595            600            605
gca aca tac acc aac gcc aaa aga ata gtg aaa ttg gta aat gat gtt   1929
Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val
   610            615            620
ggt gct gtg gtg aac aac gat gct gac gtc aac aaa tat ctg aag gtg   1977
Gly Ala Val Val Asn Asn Asp Ala Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val
625            630            635            640
gtg ttc att cca aac tac aat gta tca gtg gct gaa gtg ctc att cct   2025
Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro
            645           650             655
ggc agt gaa ctg tca cag cac atc agt act gca ggc atg gaa gca agt   2073
Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser
        660             665             670
gga aca agt aac atg aag ttc tct ctg aat ggc tgt gtt atc att gga   2121
Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly
     675            680            685
act ctc gat gga gcc aat gtt gaa atc aga gaa gaa gtg gga caa gac   2169
Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gln Asp
   690           695            700
aac ttc ttc ctt ttc ggt gcc aaa gca gat cag gtt gct ggt ctg agg   2217
Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gln Val Ala Gly Leu Arg
705           710            715            720
aag gat aga gaa aat ggc ttg ttc aag cca gac cca cgc ttc gaa gaa   2265
Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu
          725            730            735
gcc aag cag ttt atc agg agt ggt gct ttc ggc acc tac gac tac act   2313
Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Thr
        740             745             750
cct ctc ttg gat tcc ctt gaa ggg aac act gga ttt ggg cgt ggt gac   2361
Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr GlyPhe Gly Arg Gly Asp
     755            760           765
tac ttc ctt gtt ggc tat gac ttt cca agc tac att gat gca cag gcc   2409
Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gln Ala
   770            775           780
cgg gtt gat gaa gcc tac aag gac aag aag aaa tgg gtc aag atg tcc    2457
Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Lys Lys Lys Trp Val Lys Met Ser
785            790            795            800
atc ttg aac acg gct gga agc ggc aag ttc agc agc gac cgc acc atc    2505
Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile
            805            810            815
gac caa tat gcg aag gag atc tgg ggc att tcg gct tgc cct gtt cca    2553
Asp Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Gly Ile Ser Ala Cys Pro Val Pro
        820            825             830
tga agaggagacg tgatcaagag gtgatggatg atgatgcgtg gcagtaataa         2606
ggaccttata ctggtccatg gtgaataacc cctgcttccg ttgtagctga gaagaatgaa  2666
gcaacgtacg aagcctgttg tgttgtgtat tctgctgcac ttttgaagtg catagaggat  2726
gcgacttttc ttttgttctt tttctttttt ggtctgtaac catactattt tgatcctgaa  2786
ccggaatggc ggaatcatcc aggttctcaa taaaatagtt caagttttga ttaaaaaaaa  2846
aaaaaaaaaa                                                         2856
<210>20
<211>832
<212>PRT
<213>小麦(Triticum aestivum)
<400>20
Met Ser Ala Ala Asp Lys Val Lys Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu
1          5             10             15
Asp Pro Ser Ala Ile Ala Gly Asn Ile Ser Tyr His Ala Gln Tyr Ser
        20              25              30
Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe Gly Pro Glu Gln Ala Phe Tyr Ala
     35             40             45
Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His Leu Leu Gln Arg Trp Asn Asp Thr
   50            55             60
Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser
65            70             75            80
Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu
          85             90            95
Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Lys Lys Phe Gly Tyr Glu
        100            105             110
Leu Glu Ala Ile Ala Gly Gln Glu Arg Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly
     115             120            125
Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu
   130            135            140
Asn Leu Pro Ser Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe
145            150            155            160
Lys Gln Arg Ile Ala Lys Glu Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp
           165            170            175
Leu Asp Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Tyr
        180            185            190
Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Ile Ser Pro Asp Gly Lys Arg
       195            200            205
Lys Trp Ala Gly Gly Glu Val Leu Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro
   210            215            220
Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp
225            230            235            240
Ala Thr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly
           245            250            255
Gln Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys
        260             265            270
Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg
     275            280            285
Leu Lys Gln Gln Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile
  290            295            300
Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser
305            310            315            320
Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr
           325            330            335
Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu
        340            345            350
Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Asn Lys Thr Val Ala Tyr Thr
     355            360            365
Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val
  370            375             380
Met Lys Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp
385           390            395            400
Lys Arg Phe Arg Glu Met Val Ile Ser Thr Arg Lys Asp Met Glu Gly
           405           410             415
Lys Ile Glu Ser Met Arg Val Leu Asp Asn Asn Pro Glu Lys Pro Val
         420            425            430
Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ala Gly His Thr Val Asn Gly
      435           440             445
Val Ala Glu Leu His Ser Asn Ile Leu Lys Gln Glu Leu Phe Ala Asp
   450            455             460
Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile
465             470             475          480
Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile
           485           490            495
Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu
        500            505           510
Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu
     515            520           525
Trp Ala Ala Ala Lys Leu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val
  530             535            540
Leu Asp Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile
545           550             555            560
Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu
            565             570           575
Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Ala Ala Asp
        580             585           590
Arg Gln Lys Val Thr Pro Arg Thr Val Met Val Gly Gly Lys Ala Phe
     595            600             605
Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val
   610            615            620
Gly Ala Val Val Asn Asn Asp Ala Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val
625             630           635            640
Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro
            645            650            655
Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser
        660            665              670
Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly
     675            680            685
Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gln Asp
  690            695            700
Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Asp Gln Val Ala Gly Leu Arg
705           710            715            720
Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu
          725            730            735
Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Thr
        740             745             750
Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp
     755            760            765
Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gln Ala
   770            775           780
Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Lys Lys Lys Trp Val Lys Met Ser
785            790            795            800
Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile
            805            810            815
Asp Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Gly Ile Ser Ala Cys Pro Val Pro
820            825            830
<210>21
<211>2884
<212>DNA
<213>柑桔杂交栽培种
<220>
<221>CDS
<222>(48)..(2570)
<400>21
cggcacgagc tgaaacaagc aagtaattcg gtaatttgtg gaatcaa atg gcg gat     56
                                    Met Ala Asp
                                    1
gcg aaa gca aac gga aag aat gag gcg gcc aaa ctg gcg aaa att ccg    104
Ala Lys Ala Asn Gly Lys Asn Glu Ala Ala Lys Leu Ala Lys Ile Pro
   5             10             15
gcg gct gcg aat cca ttg gct aat gaa cca tcg gcg att gca tca aat    152
Ala Ala Ala Asn Pro Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ala Ile Ala Ser Asn
20             25            30             35
ata agt tac cac gtg cag tac agt cct cat ttc tcg ccg act aag ttc    200
Ile Ser Tyr His Val Gln Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Thr Lys Phe
            40             45            50
gag ccg gag caa gct ttc ttt gcc acg gcg gag gtt gtc cgc gat cgt    248
Glu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Ala Thr Ala Glu Val Val Arg Asp Arg
        55             60            65
ctt att caa caa tgg aat gag aca tac cac cat ttt aat aaa gtt gat    296
Leu Ile Gln Gln Trp Asn Glu Thr Tyr His His Phe Asn Lys Val Asp
      70             75            80
ccg aag caa aca tac tac cta tca atg gaa ttt ctt caa gga agg act    344
Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Thr
   85            90             95
ttg act aat gca att ggc agt ttg gac att cag aat gca tat gct gat    392
Leu Thr Asn Ala Ile Gly Ser Leu Asp Ile Gln Asn Ala Tyr Ala Asp
100            105            110             115
gct tta aat aat ttg ggg cat gtc ctt gag gag ata gct gaa cag gaa    440
Ala Leu Asn Asn Leu Gly His Val Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gln Glu
           120           125            130
aaa gat gct gca cta gga aat ggt ggg ctg ggc agg cta gct tca tgc    488
Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys
        135            140            145
ttc tta gac tcc atg gca aca ttg aat ttg cct gca tgg ggt tat ggt    536
Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly
     150            155           160
ttg aga tac cgg tat ggg ctg ttc aag cag aag atc acc aag cag ggt    584
Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Lys Ile Thr Lys Gln Gly
   165             170              175
caa gaa gaa gtt gct gaa gat tgg ctt gag aaa ttt agt cct tgg gaa    632
Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu
180            185            190            195
gtt gtc agg cat gat gtg gta ttt ccg gtc aga ttt ttt ggg agt gtt    680
Val Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Ser Val
           200            205            210
atg gtt aat cca aat gga acg aga aaa tgg gtt ggg ggt gaa gtt gtc    728
Met Val Asn Pro Asn Gly Thr Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Val
        215            220            225
caa gcc gta gct tat gat ata cca att cca ggg tac aaa acc aag aac    776
Gln Ala Val Ala Tyr Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn
     230             235              240
act atc agt ctt cgt ctc tgg gac gct aaa gct agc gct gag gat ttc    824
Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe
   245            250            255
aat tta ttt cag ttt aat gat gga caa tac gaa tct gct gca cag ctt    872
Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Leu
260           265            270            275
cat tct cga gct caa cag att tgt gct gtg ctc tac ccc ggg gat tct    920
His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ser
           280             285            290
act gaa gaa ggg aag ctt tta agg ctg aaa caa caa ttc ttt ctc tgc    968
Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu Cys
        295            300           305
agt gct tca ctt cag gat atg att ctt aga ttc aag gag agg aaa agt   1016
Ser Ala Ser Leu Gln Asp Met Ile Leu Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ser
      310            315            320
gga agg cag tgg tct gaa ttt ccc agc aag gta gct gta caa ctg aat   1064
Gly Arg Gln Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val Gln Leu Asn
   325            330            335
gat act cat cca aca ctt gca att cca gag ttg atg cga ttg cta atg   1112
Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met
340            345            350            355
gat gag gaa gga ctt gga tgg gat gaa gca tgg gat ata aca aca agg   1160
Asp Glu Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg
          360            365            370
act gtt gct tat acc aat cac aca gta ctt cct gaa gca ctt gag aag   1208
Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys
        375             380            385
tgg tca caa gca gta atg tgg aag ctt ctt cct cgc cat atg gaa ata   1256
Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile
     390            395            400
att gaa gag att gac aag agattc att gca atg gtc cgc tcc aca agg    1304
Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Ile Ala Met Val Arg Ser Thr Arg
   405              410             415
agt gac ctt gag agt aag att ccc agc atg tgc atc ttg gat aat aat   1352
Ser Asp Leu Glu Ser Lys Ile Pro Ser Met Cys Ile Leu Asp Asn Asn
420            425             430             435
ccc aaa aag ccg gtt gtt agg atg gca aac tta tgt gta gta tct gcg   1400
Pro Lys Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Ala
           440             445           450
cat acg gta aat ggt gtt gct cag ttg cac agt gat atc tta aag gcc   1448
His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Ala
        455             460            465
gac ttg ttc gct gac tat gtt tct cta tgg cca aac aaa ctc caa aat   1496
Asp Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Leu Trp Pro Asn Lys Leu Gln Asn
     470            475            480
aaa act aat ggc att act cct cgt cga tgg ctc cgg ttt tgc aat cct   1544
Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro
  485             490            495
gag ctc agc aaa att atc aca aaa tgg tta aaa acc gat cag tgg gtt   1592
Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp Val
500            505              510           515
acg aac ctt gac ctg ctt gta ggt ctt cgt cag ttt gct gac aac aca   1640
Thr Asn Leu Asp Leu Leu Val Gly Leu Arg Gln Phe Ala Asp Asn Thr
          520           525             530
gaa ctc caa gct gaa tgg gaa tct gct aag atg gcc agt aag aaa cat   1688
Glu Leu Gln Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Lys His
        535            540            545
ttg gca gac tac ata tgg cga gta acc ggt gta acg att gat cct aat   1736
Leu Ala Asp Tyr Ile Trp Arg Val Thr Gly Val Thr Ile Asp Pro Asn
     550             555            560
agc tta ttt gac ata caa gtc aag cgc att cat gaa tac aag aga caa   1784
Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln
   565            570            575
ctg cta aat att ttg ggc gca atc tac aga tac aag aag ttg aag gag   1832
Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu
580            585            590             595
atg agc cct cag gag cgg aag aaa act act cca cgc acc att atg ttt   1880
Met Ser Pro Gln Glu Arg Lys Lys Thr Thr Pro Arg Thr Ile Met Phe
           600            605            610
gga ggg aaa gca ttt gca aca tat aca aac gca aaa aga ata gta aag   1928
Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys
        615             620           625
ttg gtt aat gat gtt ggt gaa gtc gtc aac acc gat cct gag gtc aat   1976
Leu Val Asn Asp Val Gly Glu Val Val Asn Thr Asp Pro Glu Val Asn
     630            635            640
agt tat ttg aag gtg gta ttt gtt cca aat tac aat gtc tct gtt gcg   2024
Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala
   645              650              655
gag ttg ctt att cca gga agt gag cta tct cag cat att agc aca gca    2072
Glu Leu Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala
660             665            670            675
ggc atg gag gca agt ggc aca agc aac atg aaa ttt tct cta aat ggt    2120
Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Leu Asn Gly
           680            685            690
tgc ctc att ata gga aca ttg gat gga gct aat gtg gaa atc agg cag    2168
Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Gln
        695              700            705
gag ata gga gag gag aat ttc ttt ctc ttt ggt gca gga gca gac caa    2216
Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gly Ala Asp Gln
       710           715            720
gtc cct aag ctg cgg aag gaa aga gaa gat gga ttg ttc aaa cca gat    2264
Val Pro Lys Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu Phe Lys Pro Asp
   725            730           735
cct cgg ttt gaa gag gcc aag caa ttt ata aga agt gga gca ttt gga    2312
Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe Gly
740            745            750            755
agc tat gac tac aac ccg ctt ctt gat tcc ctg gag ggg aac act ggt    2360
Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Thr Gly
           760           765            770
tat ggt cgt ggt gat tat ttt cta gtt ggt tat gac ttc cca agt tac    2408
Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr
        775            780            785
tta gag gct cag gac aga gtt gac caa gct tac aag gac cgg aag aag    2456
Leu Glu Ala Gln Asp Arg Val Asp Gln Ala Tyr Lys Asp Arg Lys Lys
     790            795            800
tgg ctg aag atg tct ata tta agt aca gct ggc agt ggg aaa ttc agc    2504
Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser
  805            810             815
agt gat cgc aca att gca cag tat gct aag gaa atc tgg aac ata aca    2552
Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile Thr
820            825             830             835
gaa tgc cgt aca tca tga ttcaagtgca aaaaaatttc atgtgcaata           2600
Glu Cys Arg Thr Ser
          840
ggttatataa tttcttggaa ggatgtatta agatgggaag aaaatgaaag gaaatccaca  2660
atctgtgggg atcattaaat aaacctgtct ctccgtctta accatcattt gtttactcaa  2720
acatcgctct gtcagataag ttttaagttg taatttctta aacaattcta tctttataag  2780
aatttccagg ttttgaagaa ttacatcatt tgtcattact gataatagta cgaaggaatt  2840
atgatacacc attttttttt tgttttaaaa aaaaaaaaaa aaaa                   2884
<210>22
<211>840
<212>PRT
<213>柑桔杂交栽培种
<400>22
Met Ala Asp Ala Lys Ala Asn Gly Lys Asn Glu Ala Ala Lys Leu Ala
1          5             10             15
Lys Ile Pro Ala Ala Ala Asn Pro Leu Ala Asn Glu Pro Ser Ala Ile
         20              25            30
Ala Ser Asn Ile Ser Tyr His Val Gln Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro
     35              40             45
Thr Lys Phe Glu Pro Glu Gln Ala Phe Phe Ala Thr Ala Glu Val Val
   50            55             60
Arg Asp Arg Leu Ile Gln Gln Trp Asn Glu Thr Tyr His His Phe Asn
65            70             75             80
Lys Val Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln
           85            90            95
Gly Arg Thr Leu Thr Asn Ala Ile Gly Ser Leu Asp Ile Gln Asn Ala
        100            105             110
Tyr Ala Asp Ala Leu Asn Asn Leu Gly His Val Leu Glu Glu Ile Ala
     115            120            125
Glu Gln Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu
   130            135            140
Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp
145            150            155            160
Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Lys Ile Thr
           165            170            175
Lys Gln Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser
        180            185             190
Pro Trp Glu Val Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe
     195             200            205
Gly Ser Val Met Val Asn Pro Asn Gly Thr Arg Lys Trp Val Gly Gly
   210            215            220
Glu Val Val Gln Ala Val Ala Tyr Asp Ile Pro Ile Pro Gly Tyr Lys
225             230            235              240
Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala
          245             250            255
Glu Asp Phe Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Glu Ser Ala
        260           265            270
Ala Gln Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro
     275            280            285
Gly Asp Ser Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe
   290            295            300
Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Met Ile Leu Arg Phe Lys Glu
305            310            315            320
Arg Lys Ser Gly Arg Gln Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala Val
           325            330            335
Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg
        340            345            350
Leu Leu Met Asp Glu Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile
     355            360            365
Thr Thr Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
  370            375            380
Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His
385            390            395            400
Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Ile Ala Met Val Arg
            405            410             415
Ser Thr Arg Ser Asp Leu Glu Ser Lys Ile Pro Ser Met Cys Ile Leu
        420            425            430
Asp Asn Asn Pro Lys Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val
     435            440            445
Val Ser Ala His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp Ile
   450            455            460
Leu Lys Ala Asp Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Leu Trp Pro Asn Lys
465            470            475            480
Leu Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe
          485            490             495
Cys Asn Pro Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp
        500            505            510
Gln Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu Val Gly Leu Arg Gln Phe Ala
     515            520            525
Asp Asn Thr Glu Leu Gln Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser
   530            535            540
Lys Lys His Leu Ala Asp Tyr Ile Trp Arg Val Thr Gly Val Thr Ile
545            550            555            560
Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr
          565            570             575
Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys
        580            585            590
Leu Lys Glu Met Ser Pro Gln Glu Arg Lys Lys Thr Thr Pro Arg Thr
     595            600            605
Ile Met Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg
    610            615            620
Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Glu Val Val Asn Thr Asp Pro
625            630            635            640
Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val
           645            650            655
Ser Val Ala Glu Leu Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile
        660             665             670
Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser
     675            680             685
Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu
   690            695            700
Ile Arg Gln Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gly
705            710            715            720
Ala Asp Gln Val Pro Lys Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu Phe
           725            730            735
Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly
        740            745            750
Ala Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly
      755            760            765
Asn Thr Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe
   770            775            780
Pro Ser Tyr Leu Glu Ala Gln Asp Arg Val Asp Gln Ala Tyr Lys Asp
785            790            795            800
Arg Lys Lys Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly
          805            810            815
Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp
        820            825            830
Asn Ile Thr Glu Cys Arg Thr Ser
     835            840
<210>23
<211>2526
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2526)
<400>23
atg ccg gag agc aac ggc gcc gcg tgc ggc gcg gcg gag aag gtg aag     48
Met Pro Glu Ser Asn Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Glu Lys Val Lys
1          5             10             15
ccg gcg gcc agc ccc gcg tcg gag gag ccg gcc gcc atc gcc ggt aac     96
Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ala Ile Ala Gly Asn
        20              25            30
atc tcc ttc cac gcg cag tac agc ccc cac ttc tcg ccg ctc gcg ttc    144
Ile Ser Phe His Ala Gln Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe
       35            40             45
ggc ccc gag cag gcc ttc tac tcc acc gcc gag agc gtc cgc gat cac    192
Gly Pro Glu Gln Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His
   50            55             60
ctc gtc cag aga tgg aac gag acg tac ttg cat ttc cac aag acg gat    240
Leu Val Gln Arg Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp
65             70            75            80
ccg aag cag acg tac tac ctc tcc atg gag tac ctg cag ggc cgc gcg    288
Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala
           85            90            95
ctc acc aac gcc gtc ggc aac ctc ggc atc acc ggc gcc tac gcg gag    336
Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Glu
        100            105            110
gcc gtg aag aag ttc ggg tac gag ctc gag gcc ctc gtc ggg cag gaa    384
Ala Val Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Ala Leu Val Gly Gln Glu
      115            120            125
aaa gat gca gct ctg gga aat ggt ggc ttg ggt agg ctc gca tct tgc    432
Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys
   130            135            140
ttt ttg gat tcg atg gca acacta aat ttg cct gct tgg gga tat ggt     480
Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly
145            150            155            160
ctg cgg tac cga tat ggt cta ttc aaa caa tgc atc acc aag gaa ggc    528
Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Cys Ile Thr Lys Glu Gly
           165            170            175
cag gaa gaa att gct gaa gat tgg ctt gag aag ttc agc cca tgg gaa    576
Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu
        180            185             190
att gtc agg cat gac att gta tac cca atc aga ttt ttt ggc cac gtt    624
Ile Val Arg His Asp Ile Val Tyr Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val
       195            200            205
gag att ttg cca gat gga tct cgt aaa tgg gtg ggg gga gaa gtt ctc    672
Glu Ile Leu Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu
   210            215            220
aat gct tta gca tat gat gtg cca att cct ggg tac aag aca aaa aat    720
Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn
225            230            235            240
gca atc agt ctt cgt ctt tgg gac gca aaa gct agt gcg gag gat ttt    768
Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe
            245            250            255
aac tta ttt caa ttc aat gat ggc cag tat gag tcc gct gct caa ctt    816
Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Leu
        260            265            270
cat gct agg gca caa cag ata tgt gcc gtt ctc tat ccc ggt gat gct    864
His Ala Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala
      275            280            285
aca gaa gaa gga aag ctt ctc aga ctg aag caa cag tat ttc ctt tgc    912
Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Phe Leu Cys
   290            295           300
agt gca tcg ctt cag gat att ttt ttc agg ttt aaa gaa agg aaa gct    960
Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Phe Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala
305            310            315            320
gac aga gtt tct ggg aaa tgg agt gag ttc cct gca aaa gtt gct gtt   1008
Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ala Lys Val Ala Val
           325            330            335
caa ttg aat gac act cac cca act ctt gcg att cct gag ctg atg agg   1056
Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg
        340            345            350
cta ctc atg gat gtg gag gga ctt ggt tgg gat gaa gca tgg gat atc   1104
Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile
     355            360            365
aca aat aaa aca att gcc tac acc aat cac act gtt ctt cct gaa gcc   1152
Thr Asn Lys Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
   370            375            380
ctt gag aaa tgg tcg cag att gta atg agg aaa tta ctt cca cga cac   1200
Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ile Val Met Arg Lys Leu Leu Pro Arg His
385            390            395            400
atg gaa att atc gag gaa att gac aag cgg ttc aag gaa atg gta atc   1248
Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Lys Glu Met Val Ile
            405            410            415
tcc acc cgg aag gaa atg gag gga aag att gac tcc atg aga atc tta   1296
Ser Thr Arg Lys Glu Met Glu Gly Lys Ile Asp Ser Met Arg Ile Leu
        420            425            430
gac aac tca aat cct cag aag cca gta gtg cgc atg gca aat ttg tgc   1344
Asp Asn Ser Asn Pro Gln Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys
     435            440            445
gta gtg tct gcc cat acg gtg aat gga gtg gct gag tta cac agc aac   1392
Val Val Ser Ala His Thr Val Asn Gly Val Ala Glu Leu His Ser Asn
   450            455             460
att ttg aag gaa gag ctt ttt gca gac tat ctc tct ata tgg ccc aac   1440
Ile Leu Lys Glu Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Leu Ser Ile Trp Pro Asn
465             470            475           480
aaa ttt cag aac aaa aca aat gga att aca cct cgt aga tgg ctc cgt   1488
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg
           485            490            495
ttc tgc aac cca gag ttg agt gaa ata gta aca aaa tgg cta aaa aca   1536
Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr
        500            505             510
gat cag tgg aca agc aac ctt gat ctt ctt acc gga ctt cgg aaa ttt   1584
Asp Gln Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe
     515            520            525
gca gat gat gaa aag ctt cat gct gag tgg gca tca gct aag ttg gct   1632
Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu Trp Ala Ser Ala Lys Leu Ala
   530            535            540
agc aaa aaa cgc cta gcc aag cat gtg ttg gat gtg aca ggt gtt aca   1680
Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val Leu Asp Val Thr Gly Val Thr
545            550            555            560
atc gac cca aat agc ctt ttt gat ata caa att aaa cgc att cat gag   1728
Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Ile His Glu
            565            570            575
tac aag aga cag ctg cta aac att ttg gga gct gtt tac aga tac aag   1776
Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys
        580            585            590
aag tta aag gga atg agt gca gag gag aga caa aaa gtt acg cca cgc   1824
Lys Leu Lys Gly Met Ser Ala Glu Glu Arg Gln Lys Val Thr Pro Arg
     595            600            605
act gtc atg ata ggg gga aaa gca ttc gcg act tac acc aat gcc aaa   1872
Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys
   610            615            620
aga ata gta aaa ttg gta aat gat gtt ggt gct gtg gtg aac aat gat   1920
Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Ala Val Val Asn Asn Asp
625            630            635            640
cct gat gtt aat aaa tac cta aag gtg gtg ttc att ccc aac tac aat   1968
Pro Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn
           645            650            655
gta tct gtg gcc gag gtg ctc att cct ggg agt gaa ctg tca cag cac   2016
Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His
         660            665            670
atc agt acc gca ggc atg gaa gca agt gga acg agt aat atg aaa ttc   2064
Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe
       675            680            685
tct ctg aat ggt tgt gtt atc att ggt act ctt gat gga gct aat gtt   2112
Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val
   690            695            700
gag ata aga gag gaa gtg gga caa gaa aat ttc ttc ctt ttt ggt gcc   2160
Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gln Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala
705            710            715            720
aag gca gat caa gtt gct ggg ctg agg aag gat aga gag aat ggc ttg   2208
Lys Ala Asp Gln Val Ala Gly Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu
           725            730            735
ttc aaa cca gac cca cgt ttt gaa gaa gcc aag cag ctt ata agg agt   2256
Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Leu Ile Arg Ser
        740            745            750
ggt gct ttt ggc acc tat gac tat gct ccc ctc ttg gat tct ctt gaa   2304
Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu
     755            760            765
gga aat tct gga ttt ggt cgt ggt gat tat ttc ctc gtt ggc tat gat   2352
Gly Asn Ser Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp
   770            775            780
ttc cca agc tat att gat gca cag gcc cag gtt gat gaa gcc tac aag   2400
Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gln Ala Gln Val Asp Glu Ala Tyr Lys
785            790            795            800
gat aag aaa aaa tgg atc aag atg tct ata ctg aac aca gct gga agt   2448
Asp Lys Lys Lys Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser
           805            810            815
ggc aaa ttc agc agc gac cgt act atc gct cag tat gca aag gaa ata   2496
Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile
        820            825            830
tgg ggc att act gct agc cct gtc tcc taa                           2526
Trp Gly Ile Thr Ala Ser Pro Val Ser
     835             840
<210>24
<211>841
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>24
Met Pro Glu Ser Asn Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Glu Lys Val Lys
1          5             10             15
Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ser Glu Glu Pro Ala Ala Ile Ala Gly Asn
         20             25            30
Ile Ser Phe His Ala Gln Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Ala Phe
       35            40             45
Gly Pro Glu Gln Ala Phe Tyr Ser Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp His
   50            55             60
Leu Val Gln Arg Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Thr Asp
65            70            75             80
Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala
           85            90             95
Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Gly Ile Thr Gly Ala Tyr Ala Glu
        100            105             110
Ala Val Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Leu Glu Ala Leu Val Gly Gln Glu
     115            120             125
Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys
   130            135            140
Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly
145           150            155            160
Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Cys Ile Thr Lys Glu Gly
          165            170            175
Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu
        180            185            190
Ile Val Arg His Asp Ile Val Tyr Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val
       195             200             205
Glu Ile Leu Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu
   210            215            220
Asn Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn
225            230             235            240
Ala Ile Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ala Lys Ala Ser Ala Glu Asp Phe
            245            250            255
Asn Leu Phe Gln Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Leu
        260            265            270
His Ala Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala
      275            280            285
Thr Glu Glu Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Phe Leu Cys
   290            295            300
Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Phe Phe Arg Phe Lys Glu Arg Lys Ala
305            310            315            320
Asp Arg Val Ser Gly Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ala Lys Val Ala Val
          325            330            335
Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg
        340            345            350
Leu Leu Met Asp Val Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile
     355            360            365
Thr Asn Lys Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala
   370            375            380
Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ile Val Met Arg Lys Leu Leu Pro Arg His
385            390            395            400
Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Lys Glu Met Val Ile
            405            410            415
Ser Thr Arg Lys Glu Met Glu Gly Lys Ile Asp Ser Met Arg Ile Leu
        420            425            430
Asp Asn Ser Asn Pro Gln Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys
     435            440            445
Val Val Ser Ala His Thr Val Asn Gly Val Ala Glu Leu His Ser Asn
   450            455            460
Ile Leu Lys Glu Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Leu Ser Ile Trp Pro Asn
465            470            475            480
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg
           485            490            495
Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Val Thr Lys Trp Leu Lys Thr
        500            505            510
Asp Gln Trp Thr Ser Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Lys Phe
     515            520            525
Ala Asp Asp Glu Lys Leu His Ala Glu Trp Ala Ser Ala Lys Leu Ala
   530            535            540
Ser Lys Lys Arg Leu Ala Lys His Val Leu Asp Val Thr Gly Val Thr
545            550            555            560
Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Ile His Glu
            565            570            575
Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Ala Val Tyr Arg Tyr Lys
        580            585            590
Lys Leu Lys Gly Met Ser Ala Glu Glu Arg Gln Lys Val Thr Pro Arg
      595            600            605
Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys
   610            615             620
Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Ala Val Val Asn Asn Asp
625             630           635             640
Pro Asp Val Asn Lys Tyr Leu Lys Val Val Phe Ile Pro Asn Tyr Asn
           645           650             655
Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His
        660             665             670
Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe
       675            680            685
Ser Leu Asn Gly Cys Val Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val
   690           695              700
Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Gln Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala
705             710            715            720
Lys Ala Asp Gln Val Ala Gly Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu
           725            730            735
Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Leu Ile Arg Ser
        740            745            750
Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Ala Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu
      755            760            765
Gly Asn Ser Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp
   770            775            780
Phe Pro Ser Tyr Ile Asp Ala Gln Ala Gln Val Asp Glu Ala Tyr Lys
785             790             795           800
Asp Lys Lys Lys Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser
          805             810             815
Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile
        820             825             830
Trp Gly Ile Thr Ala Ser Pro Val Ser
    835            840
<210>25
<211>2910
<212>DNA
<213>蚕豆(Vicia faba)
<220>
<221>CDS
<222>(155)..(2683)
<400>25
tcatctcaca ctcacatgag gtagcaattc cattccttca aatatcttca catatgcttc   60
caaatccaga ttctttttaa tctctttttt tttccatttc ttcaaacaac tcgtttcgtt  120
gctacctttc tttactctca taaggatttg aaaa atg ggt ttt aaa gta gaa act  175
                            Met Gly Phe Lys Val Glu Thr
                            1         5
aat ggt ggt gat ggt tct tta gtt tct gct aaa gtt cca cct ctg gct    223
Asn Gly Gly Asp Gly Ser Leu Val Ser Ala Lys Val Pro Pro Leu Ala
     10             15             20
aat cca ttg gct gaa aaa cct gat gag att gct tct aac atc agt tat    271
Asn Pro Leu Ala Glu Lys Pro Asp Glu Ile Ala Ser Asn Ile Ser Tyr
  25             30            35
cat gct cag tat act cct cat ttt tca cct ttc aaa ttt cag ctt caa    319
His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe Gln Leu Gln
40             45            50            55
caa gct tac tat gca act gca gag agt gtt cgt gat cgt ctc att cag    367
Gln Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Arg Leu Ile Gln
           60             65             70
caa tgg aat gaa aca tac tta cat ttt cac aaa gtt gat ccc aag caa    415
Gln Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe His Lys Val Asp Pro Lys Gln
        75            80            85
aca tac tac tta tca atg gag ttc ctt caa ggt cga gct ttg acc aat    463
Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn
     90             95           100
gcc att gga aat ctc aat atc caa gat gca tat gct gat gct ttg cgc    511
Ala Ile Gly Asn Leu Asn Ile Gln Asp Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Arg
    105            110            115
aaa ttt gga ctt gaa ctt gaa gaa ata aca gag cag gag aag gat gca    559
Lys Phe Gly Leu Glu Leu Glu Glu Ile Thr Glu Gln Glu Lys Asp Ala
120            125            130            135
gca cta gga aat ggt ggt ctt ggt agg ctt gct tct tgc ttt ctg gat    607
Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp
           140            145            150
tcc atg gca aca ctt aat ttg cct gct tgg ggg tac ggt ttg agg tat    655
Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr
         155             160             165
cgg tac gga cta ttt aag cag ata atc aca aaa gaa ggt cag gag gaa    703
Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile Thr Lys Glu Gly Gln Glu Glu
     170            175             180
gtt gct gag gac tgg ctt gag aag ttt agc cct tgg gaa att gtg agg    751
Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg
   185            190            195
cat gac gtt ttg tac ccg atc aga ttc ttt ggc cag gtt gag gtt aac    799
His Asp Val Leu Tyr Pro Ile Arg Phe Phe Gly Gln Val Glu Val Asn
200            205             210            215
cct gat gga agc cga caa tgg ata ggc gga gaa gtt att caa gca cta    847
Pro Asp Gly Ser Arg Gln Trp Ile Gly Gly Glu Val Ile Gln Ala Leu
           220            225            230
gct tat gat gtg ccg att cct gga tac cag acc aag aac acc atc agt    895
Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Gln Thr Lys Asn Thr Ile Ser
        235             240            245
ctt cgc ctc tgg gaa gcg aaa gca tgc gct gat gat ttc gat ttg ttt    943
Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Cys Ala Asp Asp Phe Asp Leu Phe
     250            255            260
tta ttc aac gat ggg caa ctt gaa tct gct tca gtt ctt cac tca cga    991
Leu Phe Asn Asp Gly Gln Leu Glu Ser Ala Ser Val Leu His Ser Arg
  265            270            275
gcg caa cag att tgc tcg gtt ttg tat cct ggt gat gcc aca gaa ggt   1039
Ala Gln Gln Ile Cys Ser Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Gly
280             285            290            295
ggg aaa ctc cta cgg ctg aag cag cag tac ttt ctc tgc agt gca tca   1087
Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser
          300            305            310
ctc caa gac ata att tcc cga ttc aag gag agg agg caa gga cct tgg   1135
Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Lys Glu Arg Arg Gln Gly Pro Trp
        315              320            325
aac tgg tct gag ttc cca aca aag gtt gct gta caa ttg aac gat acc   1183
Asn Trp Ser Glu Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gln Leu Asn Asp Thr
     330            335             340
cac cca acc ctt tca ata ccg gag ttg atg cga tta cta atg gat gat   1231
His Pro Thr Leu Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp
   345            350             355
gaa ggg ctt gga tgg gat gaa gca tgg gct gtg aca tca aag aca gtt   1279
Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Ala Val Thr Ser Lys Thr Val
360             365            370            375
gct tac act aat cac act gtc ctc cct gaa gcg ctg gag aaa tgg tct   1327
Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser
           380            385            390
caa cct gtt atg tgg aaa ctg ctt cct cgt cac atg gaa atc ata gag   1375
Gln Pro Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu
         395             400              405
gaa atc gac aga cga ttc gtt gca ttg ata agt aaa acc cgt ttg gac   1423
Glu Ile Asp Arg Arg Phe Val Ala Leu Ile Ser Lys Thr Arg Leu Asp
      410            415            420
ctt gag gac gaa gtt tcc aac atg cgc att tta gac aat aat ctt cag   1471
Leu Glu Asp Glu Val Ser Asn Met Arg Ile Leu Asp Asn Asn Leu Gln
  425            430            435
aaa cca gta gtt cgg atg gcg aat ttg tgt gtt gtt tct tct cat act   1519
Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Ser His Thr
440             445           450            455
gtg aat ggt gtt gcc cag tta cac agt gat ata ttg aag tca gaa tta   1567
Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Ser Glu Leu
           460            465            470
ttt gca agt tat gtt tca ata tgg cca aca aaa ttc caa aat aaa act   1615
Phe Ala Ser Tyr Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gln Asn Lys Thr
        475            480            485
aat ggc att acg cct cga aga tgg atc aat ttc tgc agt cct gag cta   1663
Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Asn Phe Cys Ser Pro Glu Leu
     490            495            500
agc agg ata atc aca aag tgg tta aaa act gat aaa tgg gta acc aat   1711
Ser Arg Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Lys Trp Val Thr Asn
   505            510            515
ctt gac cta tta aca ggt ctt cgt gag ttt gct gac aac gaa gat cta   1759
Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu
520            525            530            535
caa gca gag tgg ctg tct gca aag agg gct aat aag cag cgc tta gca   1807
Gln Ala Glu Trp Leu Ser Ala Lys Arg Ala Asn Lys Gln Arg Leu Ala
           540            545            550
cag tat gtt ctg caa gtg aca ggg gag aac att gac cct gat agt cta   1855
Gln Tyr Val Leu Gln Val Thr Gly Glu Asn Ile Asp Pro Asp Ser Leu
        555            560            565
ttt gac att caa gtc aag cgt atc cac gaa tac aag agg cag ctg cta   1903
Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu
     570             575             580
aac att ctt ggt gtg atc tat aga tat aaa aag tta aag gag atg agc   1951
Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser
   585            590             595
cct gaa gaa cgg aaa agt aca act gca cgc acg gtc atg att gga gga   1999
Pro Glu Glu Arg Lys Ser Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Ile Gly Gly
600             605           610            615
aag gca ttt gca acg tac aca aat gct aaa cgg ata gtc aag ctt gtc   2047
Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val Lys Leu Val
           620            625            630
gat gat gtt ggt tct gtt gta aac agt gat cct gaa gtc aat agc tac   2095
Asp Asp Val Gly Ser Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr
         635               640             645
ttg aag gtt gtg ttt gtg cca aat tac aac gta tca gtg gcg gag gtg    2143
Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val
     650            655            660
ctt atc cca ggg agc gag cta tcg cag cat atc agc act gca gga atg    2191
Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met
   665            670            675
gaa gca agt ggc acg agc aac atg aaa ttt gct ttg aac cgg gtg ctt    2239
Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn Arg Val Leu
680            685            690            695
ata ata ggt aca tta gat gga gct aat gtc gaa atc cgg gag gag att    2287
Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Ile
             700            705            710
ggt gag gag aat ttt ttc ctg ttt ggt gca aca gcg gat gaa gtc cct    2335
Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp Glu Val Pro
        715            720            725
cga ctc agg aag gaa aga gag aat gga ctg ttc aag ccg gat cct cga    2383
Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg
     730            735            740
ttc gaa gag gca aag aag ttt ata agg agt ggg gtg ttt gga agc tac    2431
Phe Glu Glu Ala Lys Lys Phe Ile Arg Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr
  745            750            755
gac tac aac cca ttg ctc gat tca ttg gaa gga aat tct ggt tat ggt    2479
Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu Gly Asn Ser Gly Tyr Gly
760            765            770            775
cgc gga gat tac ttt ctt gtt ggt tat gac ttc cca agc tac atg gat    2527
Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp Phe Pro Ser Tyr Met Asp
           780            785            790
gct cag gaa aaa gta gac gaa gca tat cgt gat aag aaa agg tgg cta    2575
Ala Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Lys Lys Arg Trp Leu
        795            800            805
aaa atg tct att tta agc act gct ggg agt ggg aag ttc agc agt gac    2623
Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp
     810            815            820
agg aca att gct cag tat gct aag gaa att tgg aac atc gaa gaa tgc    2671
Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn lle Glu Glu Cys
  825            830            835
cgg gta cca taa tttcaaggct ctgtatagta ctagagcatt gaaattaatg        2723
Arg Val Pro
840
acagtatata gtcatgaata aaaaagaaca taattttcta tatttgattt tagtatgcca  2783
tatcaggttt caactgtatt attattatag taagtgtcgt ttctctcgat gcatctgctt  2843
ctacattatg aaaatatatt tgtatcatga tattttttat attggtttaa tttcaattca  2903
atcttcc                                     2910
<210>26
<211>842
<212>PRT
<213>蚕豆(Vicia faba)
<400>26
Met Gly Phe Lys Val Glu Thr Asn Gly Gly Asp Gly Ser Leu Val Ser
1          5             10             15
Ala Lys Val Pro Pro Leu Ala Asn Pro Leu Ala Glu Lys Pro Asp Glu
        20              25           30
Ile Ala Ser Asn Ile Ser Tyr His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser
      35              40             45
Pro Phe Lys Phe Gln Leu Gln Gln Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser
  50             55             60
Val Arg Asp Arg Leu Ile Gln Gln Trp Asn Glu Thr Tyr Leu His Phe
65            70             75             80
His Lys Val Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu
           85            90             95
Gln Gly Arg Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Ile Gln Asp
        100            105            110
Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Arg Lys Phe Gly Leu Glu Leu Glu Glu Ile
     115            120            125
Thr Glu Gln Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg
  130            135            140
Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala
145            150            155            160
Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile
           165            170            175
Thr Lys Glu Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe
        180            185            190
Ser Pro Trp Glu Ile Val Arg His Asp Val Leu Tyr Pro Ile Arg Phe
      195            200            205
Phe Gly Gln Val Glu Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Gln Trp Ile Gly
  210            215            220
Gly Glu Val Ile Gln Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr
225             230             235           240
Gln Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Cys
           245            250            255
Ala Asp Asp Phe Asp Leu Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gln Leu Glu Ser
        260           265            270
Ala Ser Val Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ser Val Leu Tyr
      275            280            285
Pro Gly Asp Ala Thr Glu Gly Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln
  290            295            300
Tyr Phe Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Lys
305            310            315            320
Glu Arg Arg Gln Gly Pro Trp Asn Trp Ser Glu Phe Pro Thr Lys Val
          325            330            335
Ala Val Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ser Ile Pro Glu Leu
         340          345             350
Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp
     355            360            365
Ala Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro
  370            375            380
Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Pro Val Met Trp Lys Leu Leu Pro
385            390            395            400
Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Arg Arg Phe Val Ala Leu
           405              410            415
Ile Ser Lys Thr Arg Leu Asp Leu Glu Asp Glu Val Ser Asn Met Arg
         420            425           430
Ile Leu Asp Asn Asn Leu Gln Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu
      435            440            445
Cys Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser
  450             455             460
Asp Ile Leu Lys Ser Glu Leu Phe Ala Ser Tyr Val Ser Ile Trp Pro
465             470           475             480
Thr Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile
           485            490            495
Asn Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Arg Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys
        500            505             510
Thr Asp Lys Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Glu
     515            520           525
Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Ala Glu Trp Leu Ser Ala Lys Arg
  530            535            540
Ala Asn Lys Gln Arg Leu Ala Gln Tyr Val Leu Gln Val Thr Gly Glu
545            550            555           560
Asn Ile Asp Pro Asp Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His
            565           570             575
Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr
        580            585            590
Lys Lys Leu Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Ser Thr Thr Ala
     595            600            605
Arg Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala
  610             615             620
Lys Arg Ile Val Lys Leu Val Asp Asp Val Gly Ser Val Val Asn Ser
625             630            635            640
Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr
          645             650            655
Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln
        660             665             670
His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys
      675             680            685
Phe Ala Leu Asn Arg Val Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn
  690            695              700
Val Glu Ile Arg Glu Glu Ile Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly
705             710             715            720
Ala Thr Ala Asp Glu Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asn Gly
           725            730            735
Leu Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Lys Phe Ile Arg
        740            745            750
Ser Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Asp Ser Leu
      755            760            765
Glu Gly Asn Ser Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr
   770            775            780
Asp Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr
785            790           795            800
Arg Asp Lys Lys Arg Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly
          805            810            815
Ser Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu
        820             825             830
Ile Trp Asn Ile Glu Glu Cys Arg Val Pro
      835             840
<210>27
<211>2526
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2526)
<400>27
atg gca aac gcc aat gga aaa gct gcg act agt tta ccg gag aaa atc    48
Met Ala Asn Ala Asn Gly Lys Ala Ala Thr Ser Leu Pro Glu Lys Ile
1          5             10              15
tcg gct aag gcg aat ccg gag gcc gat gat gct acg gag atc gct ggg    96
Ser Ala Lys Ala Asn Pro Glu Ala Asp Asp Ala Thr Glu Ile Ala Gly
         20            25            30
aat atc gtc tac cac gcc aag tac agt cca cat ttc tct cca ttg aag    144
Asn Ile Val Tyr His Ala Lys Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Lys
      35             40             45
ttc ggg cct gag caa gct ctc tac gct acc gca gag agt ctt cgc gat    192
Phe Gly Pro Glu Gln Ala Leu Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Leu Arg Asp
  50             55             60
cgt ctc att cag ctg tgg aat gag act tat gtt cat ttt aac aaa gtt    240
Arg Leu Ile Gln Leu Trp Asn Glu Thr Tyr Val His Phe Asn Lys Val
65             70            75             80
gat cca aaa caa act tat tac ttg tca atg gag tat ctc caa ggt cgt    288
Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg
          85             90            95
gct ttg acc aat gcc att ggg aat ttg aac ctt caa ggt cca tat gct    336
Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Ala
        100             105           110
gat gca ctg cgt acg ctg ggt tat gag ctt gag gag ata gct gag cag    384
Asp Ala Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gln
     115            120            125
gag aaa gat gca gct cta gga aat ggt ggg tta ggg aga ctt gcc tcg    432
Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser
   130            135           140
tgt ttc ttg gat tcg atg gcc acc cta aat ctg cct gct tgg ggt tat    480
Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr
145           150            155            160
ggt ttg agg tac aga cat ggg ttg ttt aag caa ata atc aca aag aaa    528
Gly Leu Arg Tyr Arg His Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile Thr Lys Lys
          165            170            175
ggt caa gaa gag att cca gag gac tgg ctt gag aaa ttc agc cca tgg    576
Gly Gln Glu Glu Ile Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp
        180             185            190
gaa att gtg agg cac gac gtg gta ttc cct gtc aga ttt ttc ggc aag    624
Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Lys
       195            200            205
gtg caa gta aat ccg gat gga tca agg aaa tgg gta gat ggt gat gtt    672
Val Gln Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Asp Gly Asp Val
   210            215            220
gta caa gct ctt gct tat gac gtg cca atc ccg gga tat ggc aca aag    720
Val Gln Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Lys
225            230            235             240
aac aca atc agt ctc cgt ctc tgg gaa gca aaa gct aga gct gag gat    768
Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Arg Ala Glu Asp
            245           250            255
ctt gat ctt ttt cag ttc aac gaa gga gaa tat gaa ttg gct gca cag    816
Leu Asp Leu Phe Gln Phe Asn Glu Gly Glu Tyr Glu Leu Ala Ala Gln
        260           265            270
ctt cat tct cga gct caa cag att tgc act gtt tta tat cca gga gat    864
Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Thr Val Leu Tyr Pro Gly Asp
     275            280            285
gct acc gag aat ggg aag tta tta cgg tta aaa cag cag ttc ttt ctc    912
Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu
   290            295            300
tgc agt gct tcg ctt cag gat att ata tca aga ttt cac gag agg agc    960
Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe His Glu Arg Ser
305            310            315            320
acc act gaa ggc agc cgg aaa tgg tca gag ttt cca agt aaa gtt gct   1008
Thr Thr Glu Gly Ser Arg Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala
          325            330            335
gtt caa atg aat gac aca cac cca act ctt gca ata cct gag ctc atg   1056
Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met
        340            345            350
cga ttg cta atg gat gac aat gga ctt gga tgg gat gag gct tgg gat   1104
Arg Leu Leu Met Asp Asp Asn Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp
     355            360            365
gtg aca tca aag acc gtt gct tac acc aat cac act gtc ctt cct gaa   1152
Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu
   370            375            380
gcg ttg gag aaa tgg tca caa tct ttg atg tgg aag ctt ctt cct cgt   1200
Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ser Leu Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg
385            390            395            400
cat atg gaa ata ata gaa gag att gac aag agg ttt gtt caa acc att   1248
His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Gln Thr Ile
           405            410            415
cgc gat aca aga gtt gat ctg gag gat aag att tca agt ttg agc atc   1296
Arg Asp Thr Arg Val Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ser Ser Leu Ser Ile
        420            425            430
tta gat aac aat cca caa aag cct gtg gtg aga atg gct aac tta tgt   1344
Leu Asp Asn Asn Pro Gln Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys
     435            440            445
gtt gta tcc tcg cat acg gtg aat ggc gtt gct cag tta cac agt gat   1392
Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp
   450            455            460
atc ttg aag gct gag tta ttc gca gac tat gtc tct ata tgg cca aac   1440
Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn
465             470            475            480
aag ttt caa aac aag act aat ggc atc aca cct cga agg tgg tta cgt   1488
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg
           485           490             495
ttc tgc agc cct gag ctc agt gat ata atc aca aag tgg tta aag act   1536
Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr
        500            505             510
gac aaa tgg att acc gat ctt gac cta ctt acc ggt ctt cgc cag ttt   1584
Asp Lys Trp Ile Thr Asp Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Gln Phe
     515             520           525
gcg gac aat gaa gaa ctc caa tct gaa tgg gct tct gca aag aca gcc   1632
Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gln Ser Glu Trp Ala Ser Ala Lys Thr Ala
   530            535            540
aat aag aaa cgt ttg gct caa tat ata gag cgt gtg act ggt gtg agt   1680
Asn Lys Lys Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Arg Val Thr Gly Val Ser
545            550            555            560
atc gat cca aca agc tta ttt gac ata caa gtt aag cgt atc cac gaa   1728
Ile Asp Pro Thr Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu
            565            570            575
tac aag agg cag ctg atg aac att ctt gga gta gta tac aga ttc aag   1776
Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu Gly Val Val Tyr Arg Phe Lys
        580            585             590
aaa cta aag gag atg aag cct gag gag agg aag aaa aca gtt cct cgt   1824
Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg Lys Lys Thr Val Pro Arg
     595            600            605
act gtc atg att ggg ggt aaa gca ttt gcc acc tat aca aat gca aaa   1872
Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys
   610             615            620
cgg ata gtg aag ctg gtg aat gat gtt ggt gat gtt gtt aac agc gat   1920
Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp
625             630            635            640
cca gag gtc aac gaa tac cta aag gtg gta ttt gtt cca aac tac aat   1968
Pro Glu Val Asn Glu Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn
           645            650            655
gtc act gta gcg gag atg cta ata ccc gga agt gag cta tct caa cac   2016
Val Thr Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His
        660             665             670
atc agc aca gca ggc atg gag gca agt ggt acc agc aat atg aaa ttc   2064
Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe
       675            680            685
gct ctc aac ggt tgt ctt att ata gga acc ctt gat ggg gct aat gtt   2112
Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val
   690           695              700
gag ata aga gag gag gtt ggc gaa gaa aat ttc ttt ctt ttt ggt gca   2160
Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala
705             710             715            720
acg gcc gat cag gtc cct cga ctg cgt aaa gaa cga gaa gac gga ctg   2208
Thr Ala Asp Gln Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu
           725             730           735
ttc aaa ccc gat cct cgg ttc gaa gag gca aag cag ttt gtc aaa agt   2256
Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Val Lys Ser
        740            745            750
gga gtg ttt ggg agc tac gat tat ggt cca ctc ctt gat tct ctt gag   2304
Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Gly Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu
     755             760            765
ggt aac aca ggt ttt gga cgt ggt gat tac ttc ctg gtt ggg tat gac   2352
Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp
   770            775            780
ttc ccc agc tac atg gac gct cag gcc aaa gtt gac gaa gct tat aag   2400
Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gln Ala Lys Val Asp Glu Ala Tyr Lys
785            790            795            800
gac cgg aag ggg tgg ctg aaa atg tcg ata ttg agc aca gcc ggg tca   2448
Asp Arg Lys Gly Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser
          805            810             815
gga aag ttc agc agt gac cgt aca ata gct cag tat gcc aaa gag att   2496
Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile
        820            825             830
tgg aac att gag gct tgt cct gtt ccc taa                           2526
Trp Asn Ile Glu Ala Cys Pro Val Pro
     835             840
<210>28
<211>841
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>28
Met Ala Asn Ala Asn Gly Lys Ala Ala Thr Ser Leu Pro Glu Lys Ile
1          5             10             15
Ser Ala Lys Ala Asn Pro Glu Ala Asp Asp Ala Thr Glu Ile Ala Gly
         20            25            30
Asn Ile Val Tyr His Ala Lys Tyr Ser Pro His Phe Ser Pro Leu Lys
      35             40             45
Phe Gly Pro Glu Gln Ala Leu Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Leu Arg Asp
  50             55             60
Arg Leu Ile Gln Leu Trp Asn Glu Thr Tyr Val His Phe Asn Lys Val
65            70             75             80
Asp Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg
          85             90            95
Ala Leu Thr Asn Ala Ile Gly Asn Leu Asn Leu Gln Gly Pro Tyr Ala
        100             105            110
Asp Ala Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gln
     115            120            125
Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser
   130            135            140
Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr
145            150            155            160
Gly Leu Arg Tyr Arg His Gly Leu Phe Lys Gln Ile Ile Thr Lys Lys
           165            170            175
Gly Gln Glu Glu Ile Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp
        180            185            190
Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Val Arg Phe Phe Gly Lys
      195            200            205
Val Gln Val Asn Pro Asp Gly Ser Arg Lys Trp Val Asp Gly Asp Val
  210            215            220
Val Gln Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Lys
225            230            235            240
Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Arg Ala Glu Asp
            245            250            255
Leu Asp Leu Phe Gln Phe Asn Glu Gly Glu Tyr Glu Leu Ala Ala Gln
        260            265            270
Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Thr Val Leu Tyr Pro Gly Asp
     275            280            285
Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu
   290            295            300
Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe His Glu Arg Ser
305            310            315            320
Thr Thr Glu Gly Ser Arg Lys Trp Ser Glu Phe Pro Ser Lys Val Ala
           325            330            335
Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Ala Ile Pro Glu Leu Met
        340            345            350
Arg Leu Leu Met Asp Asp Asn Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ala Trp Asp
     355            360           365
Val Thr Ser Lys Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu
   370            375            380
Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ser Leu Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg
385            390            395            400
His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Gln Thr Ile
           405             410             415
Arg Asp Thr Arg Val Asp Leu Glu Asp Lys Ile Ser Ser Leu Ser Ile
        420            425            430
Leu Asp Asn Asn Pro Gln Lys Pro Val Val Arg Met Ala Asn Leu Cys
     435            440            445
Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp
   450            455            460
Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Ile Trp Pro Asn
465            470            475            480
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Leu Arg
           485            490            495
Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr
        500            505            510
Asp Lys Trp Ile Thr Asp Leu Asp Leu Leu Thr Gly Leu Arg Gln Phe
     515            520            525
Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gln Ser Glu Trp Ala Ser Ala Lys Thr Ala
   530            535            540
Asn Lys Lys Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Glu Arg Val Thr Gly Val Ser
545            550            555            560
Ile Asp Pro Thr Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu
            565           570             575
Tyr Lys Arg Gln Leu Met Asn Ile Leu Gly Val Val Tyr Arg Phe Lys
        580           585             590
Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg Lys Lys Thr Val Pro Arg
     595            600            605
Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys
  610            615             620
Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp
625            630            635            640
Pro Glu Val Asn Glu Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn
            645           650            655
Val Thr Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His
        660            665             670
Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe
      675            680            685
Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val
   690            695             700
Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala
705            710            715            720
Thr Ala Asp Gln Val Pro Arg Leu Arg Lys Glu Arg Glu Asp Gly Leu
           725            730            735
Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Val Lys Ser
        740            745            750
Gly Val Phe Gly Ser Tyr Asp Tyr Gly Pro Leu Leu Asp Ser Leu Glu
     755             760            765
Gly Asn Thr Gly Phe Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly Tyr Asp
  770            775            780
Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gln Ala Lys Val Asp Glu Ala Tyr Lys
785            790            795            800
Asp Arg Lys Gly Trp Leu Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ala Gly Ser
          805            810            815
Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Ile
        820            825             830
Trp Asn Ile Glu Ala Cys Pro Val Pro
     835             840
<210>29
<211>2655
<212>DNA
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<220>
<221>CDS
<222>(12)..(2528)
<400>29
gtttattttc c atg gaa ggt ggt gca aaa tcg aat gat gta tca gca gca    50
       Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala
       1          5             10
cct att gct caa cca ctt tct gaa gac cct act gac att gca tct aat     98
Pro Ile Ala Gln Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn
   15              20            25
atc aag tat cat gct caa tat act cct cat ttt tct cct ttc aag ttt    146
Ile Lys Tyr His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe
30              35            40             45
gag cca cta caa gca tac tat gct gct act gct gac agt gtt cgt gat    194
Glu Pro Leu Gln Ala Tyr Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp
          50             55             60
cgc ttg atc aaa caa tgg aat gac acc tat ctt cat tat gac aaa gtt    242
Arg Leu Ile Lys Gln Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val
        65            70            75
aat cca aag caa aca tac tac tta tca atg gag tat ctc cag ggg cga    290
Asn Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg
     80            85            90
gct ttg aca aat gca gtt gga aac tta gac atc cac aat gca tat gct    338
Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp Ile His Asn Ala Tyr Ala
   95            100            105
gat gct tta aac aaa ctg ggt cag cag ctt gag gag gtc gtt gag cag    386
Asp Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gln Gln Leu Glu Glu Val Val Glu Gln
110            115            120            125
gaa aaa gat gca gca tta gga aat ggt ggt tta gga agg ctc gct tca    434
Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser
           130            135            140
tgc ttt ctt gat tcc atg gcc aca ttg aac ctt cca gca tgg ggt tat    482
Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr
        145            150            155
ggc ttg agg tac aga tat gga ctt ttt aag cag ctt atc aca aag gct    530
Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Ala
     160            165            170
ggg caa gaa gaa gtt cct gaa gat tgg ttg gag aaa ttt agt ccc tgg    578
Gly Gln Glu Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp
   175            180            185
gaa att gta agg cat gat gtt gtc ttt cct atc agg ttt ttt ggt cat    626
Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His
190            195            200            205
gtt gaa gtc ctc cct tct ggc tcg cga aaa tgg gtt ggt gga gag gtc    674
Val Glu Val Leu Pro Ser Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val
            210           215            220
cta cag gct ctt gca tat gat gtg cca att cca gga tac aga act aaa    722
Leu Gln Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys
        225            230            235
aac act aat agt ctt cgt ctc tgg gaa gcc aaa gca agc tct gag gat    770
Asn Thr Asn Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp
     240            245            250
ttc aac ttg ttt ctg ttt aat gat gga cag tat gat gct gct gca cag    818
Phe Asn Leu Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln
  255            260            265
ctt cat tct agg gct cag cag att tgt gct gtt ctc tac cct ggg gat    866
Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp
270            275            280            285
gct aca gag aat gga aaa ctc tta cgg cta aag caa caa ttt ttt ctg    914
Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu
           290            295            300
tgc agt gca tcg ctt cag gat att att gcc aga ttc aaa gag aga gaa    962
Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu
        305             310             315
gat gga aag ggt tct cac cag tgg tct gaa ttc ccc aag aag gtt gcg   1010
Asp Gly Lys Gly Ser His Gln Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala
     320            325             330
ata caa cta aat gac aca cat cca act ctt acg att cca gag ctg atg   1058
Ile Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met
    335           340            345
cgg ttg cta atg gat gat gaa gga ctt ggg tgg gat gaa tct tgg aat   1106
Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn
350            355            360            365
atc act act agg aca att gcc tat acg aat cat aca gtc cta cct gaa   1154
Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu
            370             375           380
gca ctt gaa aaa tgg tct cag gca gtc atg tgg aag ctc ctt cct aga   1202
Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg
        385            390            395
cat atg gaa atc att gaa gaa att gac aaa cgg ttt gtt gct aca ata   1250
His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Ala Thr Ile
     400              405             410
atg tca gaa aga cct gat ctt gag aat aag atg cct agc atg cgc att   1298
Met Ser Glu Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile
  415            420            425
ttg gat cac aac gcc aca aaa cct gtt gtg cat atg gct aac ttg tgt   1346
Leu Asp His Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys
430            435            440            445
gtt gtc tct tca cat acg gta aat ggt gtt gcc cag ctg cat agt gac   1394
Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp
            450            455            460
atc ctg aag gct gag tta ttt gct gat tat gtc tct gta tgg ccc acc   1442
Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr
         465            470            475
aag ttc cag aat aag acc aat ggt ata act cct cgt agg tgg atc cga   1490
Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg
     480            485            490
ttt tgt agt cct gag ctg agt cat ata att acc aag tgg tta aaa aca   1538
Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr
  495            500            505
gat caa tgg gtg acg aac ctc gaa ctg ctt gct aat ctt cgg gag ttt   1586
Asp Gln Trp Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe
510            515            520            525
gct gat aat tcg gag ctc cat gct gaa tgg gaa tca gcc aag atg gcc   1634
Ala Asp Asn Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala
          530            535            540
aac aag cag cgt ttg gca cag tat ata ctg cat gtg aca ggt gtg agc   1682
Asn Lys Gln Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser
        545            550            555
atc gat cca aat tcc ctt ttt gac ata caa gtc aaa cgt atc cat gaa   1730
Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu
      560            565            570
tac aaa agg cag ctt cta aat att ctg ggc gtc atc tat aga tac aag   1778
Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys
  575            580            585
aag ctt aag gga atg agc cct gaa gaa agg aaa aat aca act cct cgc   1826
Lys Leu Lys Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg
590            595            600            605
aca gtc atg att gga gga aaa gca ttt gca aca tac aca aat gca aaa   1874
Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys
            610            615            620
cga att gtc aag ctc gtg act gat gtt ggc gac gtt gtc aat agt gac   1922
Arg Ile Val Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp
         625            630            635
cct gac gtc aat gac tat ttg aag gtg gtt ttt gtt ccc aac tac aat   1970
Pro Asp Val Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn
     640            645            650
gta tct gtg gca gag atg ctt att ccg gga agt gag cta tca caa cac   2018
Val Ser Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His
   655            660            665
atc agt act gca ggc atg gaa gca agt gga aca agc aac atg aaa ttt   2066
Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe
670            675            680            685
gcc ctt aat gga tgc ctt atc att ggg aca cta gat ggg gcc aat gtg   2114
Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val
           690            695            700
gaa att agg gag gaa att gga gaa gat aac ttc ttt ctt ttt ggt gca   2162
Glu Ile Arg Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala
         705            710            715
aca gct gat gaa gtt cct caa ctg cgc aaa gat cga gag aat gga ctg   2210
Thr Ala Asp Glu Val Pro Gln Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu
     720            725            730
ttc aaa cct gat cct cgg ttt gaa gag gca aaa caa ttt att agg tct   2258
Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser
   735            740            745
gga gca ttt ggg acg tat gat tat aat ccc ctc ctt gaa tca ctg gaa   2306
Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu
750            755            760            765
ggg aac tcg gga tat ggt cgt gga gac tat ttt ctt gtt ggt cat gat   2354
Gly Asn Ser Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp
           770            775            780
ttt ccg agc tac atg gat gct cag gca agg gtt gat gaa gct tac aag   2402
Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gln Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys
        785            790            795
gac agg aaa aga tgg ata aag atg tct ata ctg agc act agt ggg agt   2450
Asp Arg Lys Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser
     800            805            810
ggc aaa ttt agt agt gac cgt aca att tct caa tat gca aaa gag atc   2498
Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Lys Glu Ile
   815            820            825
tgg aac att gcc gag tgt cgc gtg cct tga gcacacttct gaacctggta     2548
Trp Asn Ile Ala Glu Cys Arg Val Pro
830             835
tctaataagg atctaatgtt cattgtttac tagcatatga ataatgtaag ttcaagcaca 2608
acatgctttc ttatttccta ctgctctcaa gaagcagtta tttgttg               2655
<210>30
<211>838
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>30
Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala Pro Ile Ala
1          5             10             15
Gln Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn Ile Lys Tyr
        20            25            30
His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe Glu Pro Leu
     35             40             45
Gln Ala Tyr Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp Arg Leu Ile
   50            55             60
Lys Gln Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val Asn Pro Lys
65            70            75            80
Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr
          85             90            95
Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp Ile His Asn Ala Tyr Ala Asp Ala Leu
        100            105             110
Asn Lys Leu Gly Gln Gln Leu Glu Glu Val Val Glu Gln Glu Lys Asp
     115            120            125
Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu
   130            135            140
Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg
145            150            155            160
Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Ala Gly Gln Glu
          165            170            175
Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val
        180            185            190
Arg His Asp Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val
     195            200            205
Leu Pro Ser Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu Gln Ala
   210            215            220
Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys Asn Thr Asn
225            230            235            240
Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp Phe Asn Leu
          245            250            255
Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Leu His Ser
        260           265            270
Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu
     275            280            285
Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu Cys Ser Ala
  290            295            300
Ser Leu Gln Asp Ile lle Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu Asp Gly Lys
305            310            315            320
Gly Ser His Gln Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala Ile Gln Leu
            325            330            335
Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu
        340            345            350
Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn Ile Thr Thr
     355            360           365
Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu
  370            375            380
Lys Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu
385            390            395            400
Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Ala Thr Ile Met Ser Glu
             405            410             415
Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile Leu Asp His
        420            425            430
Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser
     435            440            445
Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp Ile Leu Lys
   450            455            460
Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr Lys Phe Gln
465            470            475            480
Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Ser
          485            490            495
Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp
        500              505            510
Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn
     515            520            525
Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Asn Lys Gln
   530            535            540
Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser Ile Asp Pro
545            550            555            560
Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg
          565             570             575
Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys
        580            585              590
Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg Thr Val Met
     595            600            605
Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val
    610            615            620
Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Asp Val
625            630            635            640
Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val
          645            650            655
Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr
        660            665            670
Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn
      675            680            685
Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg
  690              695            700
Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp
705            710            715            720
Glu Val Pro Gln Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro
           725            730            735
Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe
        740            745            750
Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu Gly Asn Ser
     755            760           765
Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp Phe Pro Ser
   770            775            780
Tyr Met Asp Ala Gln Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Arg Lys
785           790            795            800
Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Phe
            805             810            815
Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile
        820             825             830
Ala Glu Cys Arg Val Pro
     835
<210>31
<211>1618
<212>DNA
<213>甘薯(Ipomoea batatas)
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(1618)
<400>31
c ttg gga agg ctt gct tct tgc ttt ctt gat tcc atg gca aca tta aac   49
  Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn
  1          5             10            15
ttg cca gcc tgg ggt tat gga ttg agg tac aaa cat gga ctg ttc aag     97
Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys
        20            25             30
caa cgt atc acc aaa gca gga caa gag gag att gct gaa gat tgg ctg    145
Gln Arg Ile Thr Lys Ala Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu
     35              40             45
gag aaa ttc agt ccc tgg gaa gtt gca agg cat gac att gtc ttc ccc    193
Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Val Ala Arg His Asp Ile Val Phe Pro
   50            55             60
atc aga ttt ttt ggt cac gtt gag gtt gat cct agt ggc tcc cgg aaa    241
Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val Asp Pro Ser Gly Ser Arg Lys
65             70             75             80
tgg gtt ggt ggt gag gtc ata cag gct gtt gca tat gat gtt cct att   289
Trp Val Gly Gly Glu Val Ile Gln Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile
           85              90             95
cct ggg tat aaa aca aag aat act att agt ctt cga cta tgg gaa gcc   337
Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala
        100            105             110
aaa gcc agt gca gag gac tta aac tta tct caa ttt aat gat ggg caa   385
Lys Ala Ser Ala Glu Asp Leu Asn Leu Ser Gln Phe Asn Asp Gly Gln
     115             120           125
tat gaa tct gct aca ctg ctt cat tct cgg gct cat cag att tgt gct   433
Tyr Glu Ser Ala Thr Leu Leu His Ser Arg Ala His Gln Ile Cys Ala
   130            135            140
gtc ctt tac cct ggg gat gca acg gaa agt gga aaa ctt tta cga ctt   481
Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Leu
145            150            155            160
aaa caa caa ttt ttg ctg tgt agt gca tct ctt cag gac atc ata ttc   529
Lys Gln Gln Phe Leu Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Phe
           165            170            175
aga ttt aag gag agg aat gat ggg aag ggc act ctt gat tgg tcc aca   577
Arg Phe Lys Glu Arg Asn Asp Gly Lys Gly Thr Leu Asp Trp Ser Thr
        180            185            190
ttc ccc aca aaa gtt gca gta caa ctg aat gac aca cat cct acg ctc   625
Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu
     195            200             205
tcg att ccg gag ctg atg cgg tta ttg atg gat gat gaa gga ctt gga   673
Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly
   210             215           220
tgg gat gaa gca tgg gat ata acc act agg aca atc gct tat aca aat   721
Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn
225            230            235            240
cat acc gtc cta cct gaa gca cta gaa aaa tgg tca caa gca gtc atg   769
His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val Met
           245            250            255
tgg aaa ctt ctt cca cgg cat atg gaa atc att gag gaa atc gac aag   817
Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys
        260            265            270
cgg ttt att gca atg ata caa tca aag ata cct aat ctt gag agt aag   865
Arg Phe Ile Ala Met Ile Gln Ser Lys Ile Pro Asn Leu Glu Ser Lys
     275             280              285
atc tct gcc ata tgc att ttg gat cac aat ccc cag aag cct gtt gtg   913
Ile Ser Ala Ile Cys Ile Leu Asp His Asn Pro Gln Lys Pro Val Val
    290             295             300
cgt atg gct aat ttg tgt gtc atc tct tcg cat acg gtg aat ggt gtt   961
Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Ile Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val
305            310            315            320
gcc cag cta cac agt gat atc ttg aag gat gaa tta ttc atc gac tat   1009
Ala Gln Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Asp Glu Leu Phe Ile Asp Tyr
           325             330            335
gtc tct atc tgg ccc acc aaa ttc cag aac aaa acc aac ggc ata aca   1057
Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr
         340            345            350
cca cgg cgg tgg ctt agg ttt tgc aat ccc gag ctg agt gat ata atc   1105
Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile
     355            360            365
acc aag tgg tta aaa act gat gaa tgg gtg act aat ctt gat ttg ctt   1153
Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Glu Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu
   370           375            380
act aat ctg cgg aag ttt gct gac gat gaa caa ctc cat gct caa tgg   1201
Thr Asn Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Gln Leu His Ala Gln Trp
385           390            395            400
gag tct gcc aag atg gca agc aag caa cga ttg gcg cag tac ata ctg   1249
Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Gln Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu
            405            410            415
cga gta acc ggt gtg cgt gtt gac cca aat aca cta ttt gac ata caa   1297
Arg Val Thr Gly Val Arg Val Asp Pro Asn Thr Leu Phe Asp Ile Gln
        420            425            430
gtc aag cgc att cac gaa tac aaa agg cag ctg cta aat gta ttg ggt   1345
Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Val Leu Gly
     435            440            445
gta gtc tac cgg tac aag aaa ctg aag gag atg aaa ccc gaa gag cgt   1393
Val Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg
   450            455            460
aag aat aca aca gca cgc act gtc atg ctc ggg gga aaa gca ttt gcg   1441
Lys Asn Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Leu Gly Gly Lys Ala Phe Ala
465            470            475            480
acc tat aca aat gca aaa agg atc atc aag ctt gtg acg gat gtt ggg   1489
Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Ile Lys Leu Val Thr Asp Val Gly
          485            490              495
gat gtt gtc aat agt gat cct gag gtc aat agc tat ttg aag gta gtc   1537
Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val
        500            505            510
ttt gta ccc aat tac aac gta tct gtg gca gaa gtg ctt att ccg gga   1585
Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly
     515            520            525
agt gag ctt tca cag cac atc agc aca gct ggc                       1618
Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly
   530            535
<210>32
<211>539
<212>PRT
<213>甘薯(Ipomoea batatas)
<400>32
Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn
1          5             10            15
Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys His Gly Leu Phe Lys
        20             25            30
Gln Arg Ile Thr Lys Ala Gly Gln Glu Glu Ile Ala Glu Asp Trp Leu
     35            40            45
Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Val Ala Arg His Asp Ile Val Phe Pro
   50            55            60
Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val Asp Pro Ser Gly Ser Arg Lys
65            70            75            80
Trp Val Gly Gly Glu Val Ile Gln Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile
           85              90             95
Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Asn Thr lle Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala
        100             105            110
Lys Ala Ser Ala Glu Asp Leu Asn Leu Ser Gln Phe Asn Asp Gly Gln
     115            120            125
Tyr Glu Ser Ala Thr Leu Leu His Ser Arg Ala His Gln Ile Cys Ala
  130            135            140
Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Leu
145            150            155            160
Lys Gln Gln Phe Leu Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Phe
          165            170            175
Arg Phe Lys Glu Arg Asn Asp Gly Lys Gly Thr Leu Asp Trp Ser Thr
        180            185            190
Phe Pro Thr Lys Val Ala Val Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu
     195            200             205
Ser Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly
   210            215            220
Trp Asp Glu Ala Trp Asp Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn
225            230            235             240
His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val Met
           245            250            255
Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys
        260            265            270
Arg Phe Ile Ala Met Ile Gln Ser Lys Ile Pro Asn Leu Glu Ser Lys
     275              280            285
Ile Ser Ala Ile Cys Ile Leu Asp His Asn Pro Gln Lys Pro Val Val
    290            295            300
Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Ile Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val
305            310            315            320
Ala Gln Leu His Ser Asp Ile Leu Lys Asp Glu Leu Phe Ile Asp Tyr
          325            330            335
Val Ser Ile Trp Pro Thr Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr
         340            345            350
Pro Arg Arg Trp Leu Arg Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ile Ile
     355            360            365
Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Glu Trp Val Thr Asn Leu Asp Leu Leu
  370            375            380
Thr Asn Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asp Glu Gln Leu His Ala Gln Trp
385            390            395            400
Glu Ser Ala Lys Met Ala Ser Lys Gln Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu
            405            410           415
Arg Val Thr Gly Val Arg Val Asp Pro Asn Thr Leu Phe Asp Ile Gln
        420            425            430
Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Val Leu Gly
     435             440            445
Val Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Met Lys Pro Glu Glu Arg
   450            455            460
Lys Asn Thr Thr Ala Arg Thr Val Met Leu Gly Gly Lys Ala Phe Ala
465            470            475            480
Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Ile Lys Leu Val Thr Asp Val Gly
           485            490             495
Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Glu Val Asn Ser Tyr Leu Lys Val Val
        500            505            510
Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly
     515            520            525
Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly
   530            535
<210>33
<211>2754
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>马铃薯L型α-葡聚糖磷酸化酶的突变体
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2751)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(4)..(2751)
<400>33
atg acc ttg agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt    48
Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly
-1  1         5              10              15
gag agc gac ctg agt tct ttt gct cct gat gcc gca tct att acc tca    96
Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser
           20            25             30
agt atc aaa tac cat gca gaa ctc aca cct gta ttc tct cct gaa agg   144
Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Leu Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg
         35             40            45
ttt gag ctc cct aag gca ttc ttt gca aca gct caa agt gtt cgt gat   192
Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp
     50             55            60
tcg ctc ctt att aat tgg aat gct acg tat gat att tat gaa aag ctg   240
Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu
   65             70            75
aac atg aag caa gcg tac tat cta tcc atg gaa ttt ctg cag ggt aga    288
Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg
80           85             90             95
gca ttg tta aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gca ttt gcg    336
Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala
           100            105            110
gaa gct ttg aaa aac ctt ggt cac aat cta gaa aat gtg gct tct cag    384
Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Ash Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln
        115            120            125
gaa cca gat gct gct ctt gga agt ggg ggt ttg gga cgg ctt gct tcc    432
Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser
     130            135            140
tgt ttt ctg gac tct ttg gca aca cta aac tac cca gca tgg ggc tat    480
Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr
   145            150            155
gga ctt agg tac aag tat ggt tta ttt aag caa cgg att aca aaa gat    528
Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp
160            165            170            175
ggt cag gag gag gtg gct gaa gat tgg ctt gaa att ggc agt cca tgg    576
Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp
           180            185            190
gaa gtt gtg agg aat gat gtt tca tat cct atc aaa ttc tat gga aaa    624
Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys
        195            200            205
gtc tct aca gga tca gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat    672
Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp
      210            215            220
ata aag gca gtt gcg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga    720
Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg
    225            230            235
acc aca atc agc ctt cga ctg tgg tct aca cag gtt cca tca gcg gat    768
Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp
240            245            250            255
ttt gat tta tct gct ttc aat gct gga gag cac acc aaa gca tgt gaa    816
Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu
          260            265            270
gcc caa gca aac gct gag aag ata tgt tac ata ctc tac cct ggg gat    864
Ala Gln Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp
        275             280             285
gaa tca gag gag gga aag atc ctt cgg ttg aag caa caa tat acc tta    912
Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu
     290            295            300
tgc tcg gct tct ctc caa gat att att tct cga ttt gag agg aga tca    960
Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser
  305            310            315
ggt gat cgt att aag tgg gaa gag ttt cct gaa aaa gtt gct gtg cag   1008
Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln
320            325            330            335
atg aat gac act cac cct aca ctt tgt atc cct gag ctg atg aga ata   1056
Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile
          340            345            350
ttg ata gat ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa gct tgg aat att act   1104
Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr
         355            360           365
caa aga act gtg gcc tac aca aac cat act gtt ttg cct gag gca ctg   1152
Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu
     370            375            380
gag aaa tgg agt tat gaa ttg atg cag aaa ctg ctt ccc aga cat gtc   1200
Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val
   385            390            395
gaa atc att gag gcg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta   1248
Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu
400              405             410            415
aaa tat ggt tca atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca   1296
Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr
           420            425            430
atg aga atc tta gaa aat ttt gat ctt ccc agt cct gtt gct gaa tta   1344
Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Pro Val Ala Glu Leu
        435            440            445
ttt att aag cct gaa atc tca gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa   1392
Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu
      450            455            460
gtc cat gac aaa gtt gaa gct tcc gat aaa gtt gtg act aat gat gaa   1440
Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu
   465            470             475
gat gac act ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gca gct gca gaa   1488
Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu
480            485            490            495
aaa gac att gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca gct gtt ata   1536
Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile
            500           505             510
cca cct aag aag gta cgc atg gcc aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat   1584
Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His
        515            520            525
gct gtt aat gga gtt gct gag atc cat agt gaa att gtg aag gag gag   1632
Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu
     530            535            540
gtt ttc aat gac ttc tat gag ctc tgg ccg gaa aag ttc caa aac aaa   1680
Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys
   545            550            555
aca aat gga gtg act cca aga aga tgg att cgt ttc tgc aat cct cct   1728
Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro
560            565            570            575
ctt agt gcc atc ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg   1776
Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu
            580             585            590
aaa act gaa aag ttg gca gaa ttg cag aag ttt gct gat aat gaa gat   1824
Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp
        595            600            605
ctt caa aat gag tgg agg gaa gca aaa agg agc aac aag att aaa gtt   1872
Leu Gln Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val
     610            615            620
gtc tcc ttt ctc aaa gaa aag aca ggg tat tct gtt gtc cca gat gca   1920
Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala
   625            630            635
atg ttt gat att cag gta aaa cgc att cat gag tac aag cga caa ctg   1968
Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu
640            645            650            655
tta aat atc ttc ggc atc gtt tat cgg tat aag aag atg aaa gaa atg   2016
Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met
            660            665             670
aca gct gca gaa aga aag act aac ttc gtt cct cga gta tgc ata ttt   2064
Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe
        675            680            685
ggg gga aaa gct ttt gcc aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa   2112
Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys
     690            695            700
ttt atc ata gat gtt ggt gct act ata aat cat gat cca gaa atc ggt   2160
Phe Ile Ile Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly
  705               710             715
gat ctg ttg aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt gct   2208
Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala
720            725            730            735
gaa ttg cta att cct gct agc gat cta tca gaa cat atc agt acg gct   2256
Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala
          740              745            750
gga atg gag gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gca atg aat ggt   2304
Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly
        755            760            765
tgt atc caa att ggt aca ttg gat ggc gct aat gtt gaa ata agg gaa   2352
Cys Ile Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu
      770             775            780
gag gtt gga gaa gaa aac ttc ttt ctc ttt ggt gct caa gct cat gaa   2400
Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu
   785            790            795
att gca ggg ctt aga aaa gaa aga gct gac gga aag ttt gta cct gat   2448
Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp
800            805            810            815
gaa cgt ttt gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga agc ggt gct ttt ggc   2496
Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly
           820            825            830
tct tat aac tat gat gac cta att gga tcg ttg gaa gga aat gaa ggt   2544
Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly
        835            840            845
ttt ggc cgt gct gac tat ttc ctt gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac   2592
Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr
     850            855            860
ata gaa tgc caa gag aaa gtt gat gag gca tat cgc gac cag aaa agg   2640
Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg
    865            870            875
tgg aca acg atg tca atc ttg aat aca gcg gga tcg tac aag ttc agc   2688
Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser
880            885            890            895
agt gac aga aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa   2736
Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu
           900            905            910
gct gtg gaa ata gca taa                                           2754
Ala Val Glu Ile Ala
        915
<210>34
<211>917
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>34
Met Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly
-1  1         5              10              15
Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser
           20            25             30
Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Leu Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg
         35             40             45
Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp
     50             55             60
Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu
   65             70            75
Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg
80            85            90            95
Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala
          100              105           110
Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln
        115            120           125
Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser
     130            135             140
Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr
  145            150            155
Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp
160           165           170           175
Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp
           180            185            190
Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys
        195            200            205
Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp
      210            215            220
Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg
    225            230            235
Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp
240            245            250            255
Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu
          260            265            270
Ala Gln Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp
        275            280            285
Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu
     290            295            300
Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser
  305            310            315
Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln
320            325            330            335
Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile
          340            345            350
Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr
         355            360           365
Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu
     370            375            380
Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val
   385           390            395
Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu
400            405            410            415
Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr
           420           425            430
Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Pro Val Ala Glu Leu
        435            440           445
Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu
      450            455            460
Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu
   465            470            475
Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu
480            485            490            495
Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile
            500            505            510
Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His
        515            520            525
Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu
      530            535            540
Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys
   545            550            555
Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro
560            565            570            575
Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu
           580            585            590
Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp
        595            600            605
Leu Gln Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val
     610            615            620
Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala
   625            630            635
Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu
640            645            650            655
Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met
           660            665            670
Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe
        675            680            685
Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys
     690             695            700
Phe Ile Ile Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly
  705            710            715
Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala
720            725            730            735
Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala
           740             745            750
Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly
        755            760            765
Cys Ile Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu
      770            775            780
Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu
   785            790            795
Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp
800            805            810            815
Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly
          820            825            830
Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly
        835            840            845
Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr
     850            855            860
Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg
    865            870            875
Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser
880            885            890            895
Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu
          900            905            910
Ala Val Glu Ile Ala
        915
<210>35
<211>797
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>35
Met Ser Gln Pro Ile Phe Asn Asp Lys Gln Phe Gln Glu Ala Leu Ser
1           5             10            15
Arg Gln Trp Gln Arg Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Ala Glu Met Thr Pro
        20            25            30
Arg Gln Trp Trp Leu Ala Val Ser Glu Ala Leu Ala Glu Met Leu Arg
     35             40             45
Ala Gln Pro Phe Ala Lys Pro Val Ala Asn Gln Arg His Val Asn Tyr
   50            55             60
Ile Ser Met Glu Phe Leu Ile Gly Arg Leu Thr Gly Asn Asn Leu Leu
65            70            75            80
Asn Leu Gly Trp Tyr Gln Asp Val Gln Asp Ser Leu Lys Ala Tyr Asp
          85             90            95
Ile Asn Leu Thr Asp Leu Leu Glu Glu Glu Ile Asp Pro Ala Leu Gly
         100           105            110
Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ala Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala
     115            120            125
Thr Val Gly Gln Ser Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Asn Tyr Gln Tyr Gly
   130            135            140
Leu Phe Arg Gln Ser Phe Val Asp Gly Lys Gln Val Glu Ala Pro Asp
145           150            155            160
Asp Trp His Arg Ser Asn Tyr Pro Trp Phe Arg His Asn Glu Ala Leu
         165            170            175
Asp Val Gln Val Gly Ile Gly Gly Lys Val Thr Lys Asp Gly Arg Trp
        180             185            190
Glu Pro Glu Phe Thr Ile Thr Gly Gln Ala Trp Asp Leu Pro Val Val
     195            200             205
Gly Tyr Arg Asn Gly Val Ala Gln Pro Leu Arg Leu Trp Gln Ala Thr
   210            215            220
His Ala His Pro Phe Asp Leu Thr Lys Phe Asn Asp Gly Asp Phe Leu
225            230            235            240
Arg Ala Glu Gln Gln Gly Ile Asn Ala Glu Lys Leu Thr Lys Val Leu
           245             250            255
Tyr Pro Asn Asp Asn His Thr Ala Gly Lys Lys Leu Arg Leu Met Gln
        260            265            270
Gln Tyr Phe Gln Cys Ala Cys Ser Val Ala Asp Ile Leu Arg Arg His
     275            280            285
His Leu Ala Gly Arg Glu Leu His Glu Leu Ala Asp Tyr Glu Val Ile
    290            295            300
Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Ile Ala Ile Pro Glu Leu Leu Arg
305            310            315            320
Val Leu Ile Asp Glu His Gln Met Ser Trp Asp Asp Ala Trp Ala Ile
            325            330            335
Thr Ser Lys Thr Phe Ala Tyr Thr Asn His Thr Leu Met Pro Glu Ala
        340            345            350
Leu Glu Arg Trp Asp Val Lys Leu Val Lys Gly Leu Leu Pro Arg His
     355            360            365
Met Gln Ile Ile Asn Glu Ile Asn Thr Arg Phe Lys Thr Leu Val Glu
  370            375            380
Lys Thr Trp Pro Gly Asp Glu Lys Val Trp Ala Lys Leu Ala Val Val
385            390            395            400
His Asp Lys Gln Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly Phe
           405            410            415
Ala Val Asn Gly Val Ala Ala Leu His Ser Asp Leu Val Val Lys Asp
        420            425            430
Leu Phe Pro Glu Tyr His Gln Leu Trp Pro Asn Lys Phe His Asn Val
     435            440            445
Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Lys Gln Cys Asn Pro Ala
   450            455            460
Leu Ala Ala Leu Leu Asp Lys Ser Leu Gln Lys Glu Trp Ala Asn Asp
465            470            475            480
Leu Asp Gln Leu Ile Asn Leu Val Lys Leu Ala Asp Asp Ala Lys Phe
          485            490            495
Arg Asp Leu Tyr Arg Val Ile Lys Gln Ala Asn Lys Val Arg Leu Ala
        500           505             510
Glu Phe Val Lys Val Arg Thr Gly Ile Asp Ile Asn Pro Gln Ala Ile
     515            520            525
Phe Asp Ile Gln Ile Lys Arg Leu His Glu Tyr Lys Arg Gln His Leu
  530              535             540
Asn Leu Leu His Ile Leu Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Arg Glu Asn Pro
545            550            555            560
Gln Ala Asp Arg Val Pro Arg Val Phe Leu Phe Gly Ala Lys Ala Ala
           565           570            575
Pro Gly Tyr Tyr Leu Ala Lys Asn Ile Ile Phe Ala Ile Asn Lys Val
        580            585              590
Ala Asp Val Ile Asn Asn Asp Pro Leu Val Gly Asp Lys Leu Lys Val
     595             600            605
Val Phe Leu Pro Asp Tyr Cys Val Ser Ala Ala Glu Lys Leu Ile Pro
   610           615            620
Ala Ala Asp Ile Ser Glu Gln Ile Ser Thr Ala Gly Lys Glu Ala Ser
625             630             635             640
Gly Thr Gly Asn Met Lys Leu Ala Leu Asn Gly Ala Leu Thr Val Gly
           645           650            655
Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Ala Glu Lys Val Gly Glu Glu
        660            665             670
Asn Ile Phe Ile Phe Gly His Thr Val Lys Gln Val Lys Ala Ile Leu
      675            680            685
Ala Lys Gly Tyr Asp Pro Val Lys Trp Arg Lys Lys Asp Lys Val Leu
   690            695            700
Asp Ala Val Leu Lys Glu Leu Glu Ser Gly Lys Tyr Ser Asp Gly Asp
705            710            715            720
Lys His Ala Phe Asp Gln Met Leu His Ser Ile Gly Lys Gln Gly Gly
           725            730            735
Asp Pro Tyr Leu Val Met Ala Asp Phe Ala Ala Tyr Val Glu Ala Gln
        740            745            750
Lys Gln Val Asp Val Leu Tyr Arg Asp Gln Glu Ala Trp Thr Arg Ala
     755            760            765
Ala Ile Leu Asn Thr Ala Arg Cys Gly Met Phe Ser Ser Asp Arg Ser
   770            775            780
Ile Arg Asp Tyr Gln Ala Arg Ile Trp Gln Ala Lys Arg
785           790           795
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒和基因连接部分的序列
<400>36
acccaaatcg ataggaggaa aacatatgac cttgagt       37
<210>37
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒和基因连接部分的序列
<400>37
gcataagagg gggaagtgaa tgaaaaggta ccttcggg      38
<210>38
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>38
aaatcgatag gaggaaaaca tatgaccttg agtgagaaaa t  41
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>39
gaaggtacct tttcattcac ttccccctc                29
<210>40
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>40
ttcggatcct caccttgagt gagaaaattc ac                                  32
<210>41
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>41
ttcggatcct tttcattcac ttccccctc                                      29
<210>42
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>42
aaatcgatag gaggaaaaca tatggcaaac gccaatggaa aagctgcgac tagtttaccg    60
gagaaaatct c                                                         71
<210>43
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>43
gaaggtacct tagggaacag gacaagcctc aatgttccaa atctctttgg catactgag     59
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>44
His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser
1           5
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>45
His Ala Gln Tyr Ser Pro His Phe Ser
1           5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>46
Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly
1           5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<400>47
Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val
1            5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>水稻(Oryza sativa)
<400>48
Arg Ile Val Lys Leu Val Asn Asp Val
1           5

Claims (32)

1.耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其通过修饰天然α-葡聚糖磷酸化酶获得，
其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，并且
其中
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：
Figure F200480017157XC00012
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I；
其中除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有与天然α-葡聚糖磷酸化酶相同的氨基酸序列；或者除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有相对于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性等于或超过所述天然α-葡聚糖磷酸化酶；并且
其中在pH6.7的20mM柠檬酸盐缓冲液中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
2.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：
Figure F200480017157XC00021
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I。
3.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并且
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：
Figure F200480017157XC00024
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；或
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：
Figure F200480017157XC00025
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W。
4.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并且
(2)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；
(6)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I。
5.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列选自：SEQ ID NO：2的第1位到第916位；SEQ ID NO：4的第1位到第912位；SEQ ID NO：6的第1位到第893位；SEQ ID NO：8的第1位到第939位；SEQ IDNO：10的第1位到第962位；SEQ ID NO：12的第1位到第971位；SEQ ID NO：14的第1位到第983位；SEQ ID NO：16的第1位到第928位；SEQ ID NO：18的第1位到第951位；SEQ ID NO：20的第1位到第832位；SEQ ID NO：22的第1位到第840位；SEQ ID NO：24的第1位到第841位；SEQ ID NO：26的第1位到第842位；SEQ IDNO：28的第1位到第841位；和SEQ ID NO：30的第1位到第838位。
6.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶来源于马铃薯或拟南芥。
7.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有选自序列1L、1Ha或1Hb三者之一；2；和3L、3Ha或3Hb三者之一的至少两个序列。
8.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L、1Ha或1Hb三者之一；2；和3L、3Ha或3Hb三者之一。
9.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；或
(3)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L。
10.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I或L。
11.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：
Figure F200480017157XC00043
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y。
12.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基C、G、S或V。
13.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I。
14.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：
Figure F200480017157XC00051
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L或V。
15.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中在pH6.7的20mM柠檬酸盐缓冲液中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的30％或更多。
16.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中在pH6.7的20mM柠檬酸盐缓冲液中65℃加热2分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的10％或更多。
17.根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其中与所述天然α-葡聚糖磷酸化酶比较其保存稳定性被提高。
18.制备耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的方法，包括：
修饰含编码第一种α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列的第一种核酸分子，以获得含修饰碱基序列的第二种核酸分子；
制备含所述第二种核酸分子的表达载体；
将所述表达载体导入细胞中，以表达耐热化α-葡聚糖磷酸化酶；和
回收所表达的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，
其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶来源于植物，
其中
(1)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：
Figure F200480017157XC00052
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述刷热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(4)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：
Figure F200480017157XC00061
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；
(5)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I；
其中除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有与所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶相同的氨基酸序列；或者除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有相对于所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性等于或超过所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶；并且
其中在pH6.7的20mM柠檬酸盐缓冲液中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多。
19.根据权利要求18的方法，其中
(1)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：
Figure F200480017157XC00063
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(5)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I。
20.根据权利要求18的方法，其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶是L型α-葡聚糖磷酸化酶，并且
(1)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(4)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：
Figure F200480017157XC00073
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；或
(5)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W。
21.根据权利要求18的方法，其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶是H型α-葡聚糖磷酸化酶，并且
(2)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(4)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；
(6)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I。
22.根据权利要求18的方法，其中所述第一种α-葡聚糖磷酸化酶来源于马铃薯或拟南芥。
23.核酸分子，其编码根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶。
24.载体，其包含根据权利要求23的核酸分子。
25.细胞，其包含根据权利要求23的核酸分子。
26.合成葡聚糖的方法，包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖、引发剂，和无机磷酸或葡萄糖-1-磷酸。
27.根据权利要求26的方法，其中所述反应在60℃-75℃的温度下进行。
28.合成葡聚糖的方法，包括使反应液发生反应以产生葡聚糖，所述反应液中含有根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、引发剂和葡萄糖-1-磷酸。
29.根据权利要求28的方法，其中所述反应在60℃-75℃的温度下进行。
30.合成葡萄糖-1-磷酸的方法，包括使反应液发生反应以产生葡萄糖-1-磷酸，所述反应液中含有根据权利要求1的耐热化α-葡聚糖磷酸化酶、葡聚糖和无机磷酸。
31.根据权利要求30的方法，其中所述反应在60℃-75℃的温度下进行。
32.耐热化α-葡聚糖磷酸化酶，其通过修饰植物来源的天然α-葡聚糖磷酸化酶获得，
其中
(1)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1L：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1L中第4位具有氨基酸残基I、L或V；
(2)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Ha：H-A-Q-Y-T-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Ha中第4位具有氨基酸残基L；
(3)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列1Hb：H-A-K-Y-S-P-H-F-S，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列1Hb中第4位具有氨基酸残基L；
(4)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列2：并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列2中第4位具有氨基酸残基A、C、D、E、G、H、I、L、M、F、S、T、V或Y；
(5)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3L：
Figure F200480017157XC00092
并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3L中第7位具有氨基酸残基C、I、L、V或W；
(6)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Ha：R-I-V-K-L-V-T-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Ha中第7位具有氨基酸残基I；或
(7)所述天然α-葡聚糖磷酸化酶具有序列3Hb：R-I-V-K-L-V-N-D-V，并且所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在序列3Hb中第7位具有氨基酸残基I；
其中除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有与天然α-葡聚糖磷酸化酶相同的氨基酸序列；或者除了(1)-(7)中定义的替换以外，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶具有相对于天然α-葡聚糖磷酸化酶氨基酸序列而言缺失、替换或添加了一个或几个氨基酸的氨基酸序列；
其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶的酶活性等于或超过所述天然α-葡聚糖磷酸化酶；
其中在pH6.7的20mM柠檬酸盐缓冲液中60℃加热10分钟后，所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃的酶活性是加热之前所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶在37℃酶活性的20％或更多，并且
其中所述耐热化α-葡聚糖磷酸化酶有能力合成重均分子量为600kDa或更高的直链淀粉。
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