WO1993012815A1 - Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it - Google Patents

Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it Download PDF

Info

Publication number
WO1993012815A1
WO1993012815A1 PCT/RU1992/000258 RU9200258W WO9312815A1 WO 1993012815 A1 WO1993012815 A1 WO 1993012815A1 RU 9200258 W RU9200258 W RU 9200258W WO 9312815 A1 WO9312815 A1 WO 9312815A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
anτigena
food
glucose
biosynthesis
Prior art date
Application number
PCT/RU1992/000258
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mikhail Alekseevich Novikov
Lidiya Anatolievna Mikhailova
Vera Nilolaevna Borisova
Mikhail Valentinovich Budanov
Andrei Gennadievich Amosov
Igor Viktorovich Krasilnikov
Original Assignee
Gensci Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SU5025798/14A external-priority patent/RU2045073C1/ru
Priority claimed from SU5025861/14A external-priority patent/RU2045760C1/ru
Application filed by Gensci Limited filed Critical Gensci Limited
Publication of WO1993012815A1 publication Critical patent/WO1993012815A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the field of technology The invention of the Internet for medical immunobiological drugs for the prevention of viruses, and the name of the patient is the patient.
  • the more recent invention is not available for the combination of antigens ⁇ ( ⁇ ) and the vaccine based on it.
  • the invention is also obtained by the receipt of such anti-micro methods, in particular, the healthy women used in the process of the production of In one of the realizations of the implementation, the invention is also available in the form of a healthy medium.
  • vaccines are available on the basis of the genotype ⁇ on the basis of the Antigas from the series of donors (see, for example, Mar. Heb., Oct. 6, 1982, 10. With two - three stages of inactivation in the process of receipt of the output, the output of a positive antigene is about 10 percent.
  • Such vaccines require a remover of the device and the corresponding calculation of the availability of the optional contents of the Hepatitis Virus and Particle Virus keys. - 2 - ⁇ ueami, na ⁇ ime ⁇ , ⁇ e ⁇ vi ⁇ usami, na ⁇ dyaschimisya in syv ⁇ e.
  • Vaccines received by way of the biological synthesis of the z-antigen cage were obtained, and the patient received a vaccine.
  • ⁇ beaut ⁇ Chinese Canal pier borough - - - - - - - - - - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . sow, a cell of mammals and yeast cells.
  • the name of the Holy Father is the name of the sacred cell for the purpose of writing, for example, in the work of the Holy Father. eb a ⁇ . , LaBeighe, 1982, ⁇ . 298, ⁇ . 347-350.
  • ⁇ as ⁇ y ⁇ ie iz ⁇ b ⁇ e ⁇ eniya best va ⁇ ian ⁇ y eg ⁇ ⁇ susches ⁇ vleniya purpose of nae ⁇ yascheg ⁇ iz ⁇ b ⁇ e ⁇ eniya yavlyae ⁇ sya s ⁇ zdanie ⁇ s ⁇ g nadezhn ⁇ g ⁇ s ⁇ s ⁇ ba ⁇ lucheniya ⁇ e ⁇ mbinan ⁇ n ⁇ g ⁇ ⁇ ve ⁇ n ⁇ s ⁇ n ⁇ g ⁇ igena ge ⁇ a ⁇ i ⁇ a ⁇ with d ⁇ s ⁇ a ⁇ chnym in ⁇ myshlenn ⁇ m ⁇ n ⁇ shenii you d ⁇ m, is ⁇ lzuyuscheg ⁇ ⁇ azlichnye kinds sy ⁇ ya for ⁇ i ⁇ a ⁇ eln ⁇ y e ⁇ ed
  • Another object of the invention is to obtain a vaccine of a genetics ⁇ on a basic recombinant antigen.
  • the set and other goals are achieved in the process.
  • Theme supports the inorganic activity in the center of shared interest. 0 It was . It is found that there is a risk of increased concentration in the range of 40–200 mg / l at the stage of cultivation of the strain and in the case of an increase of no Bytes ⁇ same v ⁇ emya is ⁇ lz ⁇ vanie ⁇ i ⁇ a ⁇ eln ⁇ y s ⁇ edy ⁇ a ⁇ 5 s ⁇ ad ⁇ i vgoaschivan ⁇ ya bi ⁇ masey, ⁇ a ⁇ and s ⁇ adii bi ⁇ sin ⁇ eza an ⁇ i on with s ⁇ de ⁇ zhaniem ne ⁇ ganiches ⁇ g ⁇ ⁇ e ⁇ a in ⁇ liches ⁇ ve, vy ⁇ present for ⁇ edely values s ⁇ glasn ⁇ iz ⁇ b ⁇ e ⁇ eniyu, ⁇ ez ⁇ snizhae ⁇ ⁇ d an ⁇ igena, and ne ⁇ y ⁇ sluchaya ⁇ ⁇ iv ⁇ di ⁇ ⁇ ⁇
  • This culture in the amount of 10 liters, is transported in a biological product of 100 liters, containing 90 liters of a solid medium, it is free from the consumption of 5% of the product;
  • Example 2 The process leads to a similar process in Example 2, at the stage of cultivating biomasses, use a healthy medium with a dose of 300 mg / l.
  • Medium of 2.0 mass percent of the product is reactive with the original content of inorganic phosphate mg / g and 1.0% of the non-combustible product ⁇ a s ⁇ adii b ⁇ sin ⁇ eza an ⁇ igena is ⁇ lzuyu ⁇ ⁇ i ⁇ a ⁇ elnuyu s ⁇ edu s ⁇ de ⁇ zhan ne ⁇ ganiches ⁇ g ⁇ ⁇ s ⁇ a with 100 mg / L, from 1.0 s ⁇ s ⁇ avlennuyu mass ⁇ v ⁇ ⁇ tsen ⁇ a ⁇ e ⁇ na and 0.1 mase ⁇ v ⁇ g ⁇ ⁇ tsen ⁇ a d ⁇ zhzhev ⁇ g ⁇ e ⁇ s ⁇ a ⁇ e vysheu ⁇ azannym s ⁇ de ⁇ zhaniem is ⁇ dn ⁇ g
  • This culture in the amount of 10 liters, is transported to a biological product, containing 90 liters of a healthy and healthy medium, which contains a total weight of 25 (30) - 11 - sulfuric acid hydrolysis of casein (purely) with the original content of inorganic phosphorus 2.0 - 2.5 mg / g - 1,
  • the weight of raw biomass is 1.35 kg. It produces a flax homogenisate with an antigen level of 21 mcg / ml.
  • the yield of a single culture liquid is 3.15 mg.
  • ⁇ bioreactivation with a working volume of 10 liters comprising 9 liters with a large medium composition as in 1 ⁇ and ⁇ ⁇ 5.0 - 5.5 made 15 quantities of 1.0 liter 3. 3. ⁇ 746 / ⁇ * ⁇ -46, and a total cell of 4.2 x 10 ⁇ 7 in a cubic centimeter of culture of a new fluid grown in a minimum environment of at least one.
  • ⁇ ⁇ 304 ⁇ 7 ⁇ 20 - 0.350 components for microelements components, for example 1 - 1.75 ml / l, for vitamins (for 1 ml, for example)
  • the resulting culture fluid with a 6 x 10 ⁇ 8 plug in the cell for the centric meter, as well as in unit 1, is connected to the mains supply
  • Example 2 there is a discharge of biomass cells with the help of a homogenizer type of pressure at a pressure of 600 - 700 atmospheres in. Homogenizes light • 2 with the help of the factory price type without the need for liquid and the speed of 60 l / h. Received 70 l of homogenis - 15 - ⁇ a. at the same time the antigen content is shared.
  • the antigen content is 28 ⁇ g / ml.
  • the end of the antigen is -19 mg with one liter of culture fluid.
  • the content of the antigenic activity determines the same as in Example 1.
  • Example 7 (i.e., 0.12: 0.1: 1.0, respectively), as well as salts, trace elements and vitamins, as in Example 7.
  • the resulting culture fluid containing 8.8 x 10 "8 cells in a cubic meter, is similar to that described in the previous paragraph.
  • the process leads to an analogous example of 8;, at the stage of growing biomass, they use a healthy environment with a content of 300 mg / l of garlic powder.
  • the product is prepared from 2 mass percent reactants with a concentration of 8 mg / g of non-urban and non-combustible products.
  • they use nutritional food with the feed of unclean garlic phosphorus 100 mg / l, made from a single bulk - 16 - the centrifugal and 0.1 mass percent of the interest in the above extract of the above-mentioned non-commercial phase.
  • the food source for additional delivery is prepared from the above mentioned extracts and burnt extract, as well as glucose taken from 0.20: 0.20: Received 8 > 0 kg of raw biomass. There is no bios without the antigen.
  • the cultivation leads to a temperature of 30 grams of Celjeus units for 44 hours. There is an additional supply of food, starting at 8 o'clock, 20 liters of fresh and healthy food (there is a non-continuous consumption). - 17 - the extract of aromatic with the original content of inorganic phosphorus 10 - 11 mg / g - 4.2 glucose - 42.0,
  • example 7 means that at the stage of the synthesis of the an- - 18 - tachy ;: direct contact with non-hazardous substances - 0.6 mg / l - 6.90; a ferrous extract with the original source of organic matter 2.0 - 2.5 mg / l - 6.90; glucose 4 5 (i.e., at a ratio of 0.15: 0.15: 1.0, respectively), and in the case of salt, minerals and vitamins, such as in example 7.
  • a commercially available antigen received at 12 clears the message that is written in the car license plate, ⁇ , 1389060 29 6190.
  • the cleaned product provides a vaccine containing 20 mg (one dose) of 20 mg of antigen, 0.17 - 0.25 mg of aluminum hydroxide (at a rate of 0.12 mg).
  • the vaccine s immunogenicity in the test on mouse mouse line 12–14 g in the ⁇ 50 line is 0.3–0.4 ⁇ g (where 2550 is vaccine-induced, it causes a decrease in the incidence of infection) It is noteworthy.
  • An advantageous embodiment of the implementation of the invention is that the proposed method will cost 80 times more to increase the output of the recombinant

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

- 1 -
-г СПΟСΟБ ПΟЛУЧΕΗИЯ ΡΕΚΟΜБЙΗΑΗΤΗΟГΟ ПΟΒΕΡΧΗΟСΤΗΟГΟ ΑΗΤИГΕΗΑ ГΕПΑΤИΤΑ Β И ΑΗΤИГΕΗ И ΒΑΚЦИΗΑ ΗΑ ΕГΟ ΟСΗΟΒΕ
Οбласτь τеχниκи Изοбρеτение οτнοеиτея κ медицинеκим иммунοбиοлοгичес0 πρеπаρаτам для πρедуπρеждения виρуснοгο геπаτиτа Β, а именн πρеπаρаτам, сοдеρжащим анτигены виρуеа геπаτиτа Β. Бοлее κ ρеτнο изοбρеτение οτнοсиτся κ ρеκοмбинанτнοму ποвеρχнοсτ анτигену геπаτиτа Β (ΗΒзΑ ) и ваκцине на егο οснοве.
Изοбρеτение οτнοсиτся τаκже κ ποлучению τаκοгο анτиг миκροбиοлοгичесκими меτοдами, в.часτнοсτи, κ πиτаτельным е дам, исποльзуемым в προцеесе κульτивиροвания ρеκοмбинанτ дροжжей, эκсπρесеиρующиχ ρеκοмбинанτный анτиген. Β οднοм из ρианτοв ρеализации изοбρеτение οτнοсиτея τаκже κ πρиемам ποд πиτаτельнοй сρеды.
Уροвень τеχниκи Пροблема эφφеκτивнοгο ποлучения ваκцины προτив геπаτиτа являеτся аκτуальнοй в связи с ρасπροсτρаненнοсτью даннοгο за левания и выеοκим ποκазаτелем χροнизации эτοй инφеκции. Β ρамκаχ эτοй προблемы οснοвнοй задачей являеτся ποлуче ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β, являющегοся οснο ι дейсτвующим началοм) τаκοй ваκцины, κοτορая мοжеτ сοдеρж дοποлниτельнο, κаκ эτο извесτнο из уροвня τеχниκи, адьюв ( наπρимеρ, гель гидροοκиси алюминия), κοнсеρванτ и φизиοлο чесκи πρиемлемый ρазбавиτель ( наπρимеρ, φοсφаτный буφеρ или зиοлοгичесκий ρасτвορ) . йзвесτны ваκцины προτив геπаτиτа Β на οснοве ΗΒз-анτиг из сывοροτκи κροви дοнοροв (см. , наπρимеρ, ΤаЬοг Ε. еЬ аϊ. , Μеά. Уϊгοϊ. , 1982, νοϊ.10, ρρ.65 - 74). Пρи двуχ - τρеχ сτад инаκτивации в προцессе ποлучения выχοд ποвеρχнοсτнοгο анτиг сοсτавляеτ οκοлο 10 προценτοв. Τаκие ваκцины τρебуюτ τщаτель προвеρκи и еοοτвеτсτΕующей οчисτκи οτ вοзмοжнοгο сοдеρжания φеκциοнныχ часτиц виρуса геπаτиτа Β и κοнτаминации дρугими - 2 - ρуеами, наπρимеρ, ρеτροвиρусами, наχοдящимися в сывοροτκе.
Ρаеπροсτρанение ποлучили ваκцины, ποлучаемые πуτем миκ биοлοгичесκοгο синτеза ΗΒ-з-анτигена κлеτκοй τρансφορмиροванн ρеκοмбинанτнοй ДΗΚ, в сοсτав κοτοροй вκлючен ген ΗΒзΑ^. Β κ чесτве κлеτκи - χοзяина извесτнο иеποльзοвание баκτеρиальн еиеτем Ε. сοϋ, κлеτοκ млеκοπиτающиχ и дροжжевыχ κлеτοκ. Иеποл зοвание τρанеφορмиροванныχ дροжжевыχ κлеτοκ ЗассЬагοιг-ус сегеνιзϊае для еинτеза ΗΒзΑд- οπисанο, наπρимеρ, в ρабοτ νаϊеηζиеϊа Ρ. еЬ аϊ. , ΝаЬиге, 1982, νοϊ.298, ρρ.347 -350.
Из ρабοτы ¥атρ1ег Б. ^ аϊ. , ΡΝΑ5, 1985, νοϊ.82, ρ.68 извесτен сποсοб ποлучения ΗΒз-анτигена из шτамма - προдуцен дροжжей ЗассЬагοтусез сегеνϊзϊае, заκлючающийея в κульτивиροв нии шτамма - προдуценτа в еρеде с бοгаτым сοдеρжанием φοсφορ πеρенοсе κлеτοκ в еρеду с низκим сοдеρжанием φοсφορа для ρеπρ дуκции ΗΒз-анτигена с ποследующим οτмыванием κлеτοκ на ценτρ φуге с προτοчным ροτοροм. Далее κлеτοчную πасτу, οсвοбοжденн οτ сρеды,- ρазвοдяτ дο исχοднοгο οбъема φοсφаτным буφеροм и ρа ρушаюτ κлеτκи с ποмοщью гοмοгенизаτορа выеοκοгο давления. Κ нечный προдуκτ ποлучаюτ с выχοдοм 29 προценτοв.
3 πаτенτнοм дοκуменτе ΕΡ 0135435 πο κлассу Α 61 Κ 39/2 οπублиκοваннοм 27 маρτа 1985 гοда, οπисан сποсοб ποлучения ва цины геπаτиτа Β πуτем κульτивиροвания κлеτοκ ΞассЬагοтусе еегеνϊзϊае, шτамм ΑΤСС 20665 Η52, в сρеде ΥΕЖ, сοдеρжаще дροжжевοй зκсτρаκτ и глюκοзу. Βыρащивание шτамма дροжжей - προ дуценτа ΗΒзΑ ведуτ в две сτадии с исποльзοванием οднοй и το же сρеды ΥΕШ, πρичем на πеρвοй и вτοροй сτадияχ в φеρменτе дοποлниτельнο ποдаюτ τу же сρеду ΥΕΗΟ сο сκοροсτью ποдачи 6 мл/час на πеρвοй сτадии и еο еκοροсτью οτ 2 дο 4,8 л/час н вτοροй. Β κοнце φеρменτации ποлучаюτ 3,1 κг влажнοй биοмасеы ποсле ρазρушения κοτοροй выделяюτ ΗΒзΑг в κοличесτве 50 мκг οднοгο лиτρа φеρменτеρа.
Β заявκе Ρ0Τ/Ϊ-Б86/01702 (нοмеρ междунаροднοй πубжκаци Ш87/0И29 οτ 26.02.87) οπисан меτοд κульτивиροвания дροжжей еποсοбныχ προдуциροваτь ΗΒзΑ^ πρи 25 гρадусаχ Цельсия на сρеде ебалансиροваннοй πο свοбοдным аминοκислοτам в κοнценτρации 20 160 г/л. Сρеда сοдеρжиτ τаκже глюκοзу в κοнценτρации 6 г/л, сο ли и виτамины. Пρи κульτивиροвании ποдаеτся дοποлниτельнο сρед с κοнценτρацией глюκοзы 400 г/л. Βыχοд биοмасеы сοсτавляеτ 17 - з - г πρи ρасχοде глюκοзы 1630 г.
Из авτορсκοгο свидеτельеτва зυ, Α, 1389060 πο κлассу Α 6 39/29 извесτен τаκже сποсοб ποлучения ρеκοмбинанτнοй ваκ геπаτиτа Β, вκлючающий на сτадии синτеза ΗΒз-анτигена κульτи ροвание шτамма - προдуценτа дροжжей в сρеде, не сοдеρжа φοсφаτ, и выделение анτигена с исποльзοванием адсορбциοн χροмаτοгρаφии на πορиеτыχ κρемнеземаχ с элюцией биκаρбοнаτ буφеροм с ρΗ 9,1 - 9,5 с ποследующим ценτρиφугиροванием в г диенτе πлοτнοсτи 50 προценτοв τаρτρаτ Κ(Νа) - 25 προценτοв г цеρин πρи сοοτнοшении κοмποненτοв 1 : 1. Слοжнοсτь выделе гοτοвοгο προдуκτа в эτοм сποсοбе οбесπечиваеτ егο чисτοτу, наκο выχοд ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β ποсле сτадии φ менτации и ρазρушеκия дροжжевыχ κлеτοκ сοсτавляеτ 200 - 300 анτигена с οднοгο лиτρа φеρменτеρа. Сποсοб πρедсτавляеτ инτе для лабορаτορнοгο исποльзοвания.
Τаκим οбρазοм из уροвня τеχниκи сτанοвиτся οчевидным, πρи ποлучении анτигена геπаτиτа Β προблемοй, τρебующей изοб τаτельеκοгο τвορчесτва, являеτся οτκρыτие τаκиχ πаρамеτροв π цесса и κοмποненτ πиτаτельныχ сρед, κοτορые бы οбесπечивали лучение προмышленныχ κοличесτв анτигена дοсτаτοчнοй чисτο πρичем οτсуτсτвуюτ меτοды οбычнοгο инженеρнοгο προеκτиροван κοτορые ποзвοляли бы οсущееτвляτь προсτοй ποдбορ τаκиχ πаρам ροв.
Ρасκρыτие изοбρеτения и лучшие ваρианτы егο οсущесτвления Целью наеτοящегο изοбρеτения являеτся сοздание προсτοг надежнοгο сποсοба ποлучения ρеκοмбинанτнοгο ποвеρχнοсτнοгο τигена геπаτиτа Β с дοсτаτοчным в προмышленнοм οτнοшении вы дοм, исποльзующегο ρазличные виды сыρья для πиτаτельнοй еρед
Целью изοбρеτения являеτся τаκже ποлучение ρеκοмбинанτн ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β с исποльзοванием ρазлич видοв сыρья для πиτаτельнοй сρеды, κοτορый ποсле οбычныχ πρ мοв гοмοгенизации, οсвеτления, φильτρации и οчисτκи был бы π меним для ποлучения ваκцины.
Дρугοй целью изοбρеτения являеτся ποлучение ваκцины προ геπаτиτа Β на οснοве ρеκοмбинанτнοгο ποвеρχнοсτнοгο анτигена. Пοсτавленные и дρугие цели дοсτигаюτея в προцессе ποлу -4- ния ρеκοмбинанτнοгο ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β, вκл чающем в себя κульτиΕиροванκе шτамма дροжжей προдуцеκ ΗΒз-анτигена и синτез ΗΒз-анτигена на πиτаτельнοй сρеде, с 5 деρжащей πеπτοн и дροжжевοй эκсτρаκτ, * ποследующее ρазρушен κлеτοκ дροжжей κ выделение анτигена, πρи κοτοροм в πиτаτельн сρеде κаκ на сτадии κульτκвиροванκя; τаκ и κа сτадиκ бκοси . τеза ποддеρживаюτ сοдеρжанне неορганκчесκοгο φόсφορа в сτρο οπρеделеннοй κοнценτρацκи. 0 Былο. σбнаρуженο, чτο ποддеρжание κοнценτρации неορган чесκοгο φοсφορа в πρеделаχ 40 - 200 мг/л на сτадии κульτив вания шτамма и в πρеделаχ 5 -50 мг/л на сτадии биοсинτе ποзвοляеτ ποлучаτь οπτимальный ΕЫΧΟД анτигена независимο οτ да сыρья. Б το же вρемя исποльзοвание πиτаτельнοй сρеды κаκ 5 сτадκи вьгоащиванκя биοмасеы, τаκ и на сτадии биοсинτеза анτи на, с сοдеρжанием неορганичесκοгο φσеφορа в κοличесτве, выχο щем за πρеделы значений сοгласнο изοбρеτению, ρезκο снижаеτ χοд анτигена, а в неκοτορыχ случаяχ πρивοдиτ κ πρеκρащению с τеза. 0 Β πρеимущесτвеннοм ваρианτе на сτадии биοсинτеза целесο ρазнο οеущееτвляτь дοπαлниτельную ποдачу сεежей πиτаτель еρеды, сοдеρжащей πеπτοн, дροжжевοй эκсτρаκτ и глюκοзу.
Дοποлниτельная ποдача на сτадиκ синτеза анτигена πиτаτе нοй сρеды, сοдеρжашэй πеπτοн, дροжжэвοй эκсτρаκτ κ глюκα5 οеοбеннο в οπτимальнοм весοвοм сοοτнοшениκ 0,05 - 0,15. 0,0
0,15 : 1,0, сοοτвеτсτвеннο, πρивοдиτ κ ποвышению наκοπления οмассы дροжжей с οднοвρеменным ποΕЫшенκем выχοда анτигена.
Пρи κульτивиροΕании мοжеτ быτь исποльзοван любοй извесτ шτамм дροжжей, сοдеρжащий ρеκοмбинанτную πлазмиду с ге ΗБзΑд, еπσсσбную προдуциροваτь иммунοгенный
Figure imgf000006_0001
Ηаπρим мοжеτ быτь исποльзοван шτамм БассЬагοтуеез сегеνϊзϊае Ο 74б/ρΝΜνб-45 (Гρанοвсκий Η. Ε. и дρ. , Μοлеκуляρная Генеτи миκροбиοлοгия κ виρусοлοгия, 1986, Νο.8, сτρ. 12-19), или шτ
ЗасοЬагοтусез сегеνιзϊае ДΑΗ-041/ρΒЖ-1, заρегисτρиροванный Βсесοюзнοй κοллеκции προмышленныχ миκροορганκзмοв СΒΚПΜ) π нοмеροм Υ-1875 ΒΗИИ генеτиκи и селеκцин, имеющей сτаτус Μежд наροднοгο ορгана деποниροвания в сοοτвеτсτвии с Εудаπешτсκ дοгοвοροм ο междунаροднοм πρизнании деποниροвания миκροορгани -5- мοв для целей πаτенτнοй προцедуρы ( Κиззιаη Ρеάегаϋοη Κезеаг' Ιηзϋи&е Гοг Εеηеϋсз аηй ΙηсΙизЪгϊаΙ Μϊсгοοгвамзт Βгеесϋ (ΥΝΙΙ6) Ш, 113545, Μοзσον, БοгοζЬηауа иϊ. ,8), или шτа ΞасσЬагοтуσез сегеνϊзϊае ΙВДΒΥ ΙΙ ρС0Α7, деποнκροванный в κ леκции νΝΙΙβ ποд Νο Υ-1232.
Ρеκοмбинанτный ποвеρχнοсτный анτиген геπаτиτа Β, ποлучаем сοгласнο πρедлагаемοму сιποсοбу, мοжеτ быτь исποльзοван для и гοτοвления ρеκοмбинанτнοй• ροжжевοй ваκцины геπаτиτа Β, а τаκ для сοздания диагнοсτичееκκχ набοροв.
Пρимеρы οсушэеτвления изοбρеτения Пρимеρ 1.
Биορеаκτορ с ρабοчим" οбъемοм 10 л заποлняюτ 9-ю л сτеρил нοй сρеды с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 40 - 42 мг/л имеюшей сοсτав (в массοвыχ προценτаχ): πеπτοн из κислοτнοгο гидροлизаτа κазеина с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 0,5 - 0,6 мг/г - .3,0 эκсτρаκτ дροжжеΕθй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφσρа 2,0 - глюκοза еοли:
ΚСΙ ΝаСΙ
СаС12 безΕθДный Μ^Ξ04.7Η20 (ΝΗ4)2Ξ04 ρасτвορ миκροзлеменτοв вκлючающκй (Ε ΜΓ%): ΚΙ
ΗЗΒΟЗ ΜηΞ04 Μο04( Η4) 2 ΡеΞ04 дисτиллиροванная вοда
Figure imgf000007_0001
ρасτвορ виτаминοв - 1,00 мл/л, вκлючающκй (в мгό): - 6 - τиамин χлορид - 20,00 πиρидοκсин - 20,00 ρибοφлавин (мοнοнуκлеοτид) - 20,00 5 πанτοτенаτ κальция - 20,00 ниκοτинοвая κислοτа - 20,00 η-аминοбензοйная κислοτа - 20,00 биοτин - 0,20 инοзиτοл - 1000,0
10 дисτилиροванная вοда - дο 100 мл. дисτилиροванная вοда - οсτальн
Β эτу сρеду πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ в κοличесτве 1, κульτуρу дροжжей Ξ. с. ΟΒΥ 746/ρΝΜνΘ-4б, имеющую τиτρ κлеτοκ χ 10"7 в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρальнοй жидκοеτи, выρащ 15 ную на минимальнοй еρеде сοсτава (в массοвыχ προценτаχ}:
Figure imgf000008_0001
- 7 - Пοсле κульτивиροвания в τечение 20 часοв πρи τемπеρа 29+1 гρадусοв Цельсия ποлучена наκοπиτельная κульτуρа с τи κлеτοκ 2,0 χ 108κлеτοκ в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρал 5 жидκοсτи.
Эτу κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτ ρабοчим οбъемοм 100 л, сοдеρжащий 90 л сτеρильнοй πиτаτел сρеды е еοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 5,0 б, 0 м имеющей сοсτав (в масеοвыχ προценτаχ :
мл/
мл/
Figure imgf000009_0001
инοзиτοл - 1000,0 Й - дисτилиροванная вοда - дο 100 мл. Κульτивиροвание πρи ρΗ 5,5 - 6,0 ведуτ в τечение 22 ча πρи τемπеρаτуρе 30 гρадусοв Цельсия. Пοлученную κульτуρальную жидκοеτь с сοдеρжанием κлеτοκ χ 10Λ8 κлеτοκ на κубичесκий санτимеτρ ποдаюτ на προτοчную це ρиφугу τиπа Уезϊ-Гаϋа сο сκοροсτью προτοκа 500 л/час. Εлеτοч πаеτу οсвοбοждаюτ οτ сρеды προмыванием 0,05 Μ κаρбοнаτным бу ροм с ρΗ 9,0 меτοдοм миκροφильτρации с исποльзοванием мембρ ныχ φильτροв с диамеτροм πορ 0,2 - 0,45 мκм либο τρеχκρаτ οτмывκοй в буφеρе τοгο же сοсτава е ποследующим οτделением б массы на προτοчнοй ценτρиφуге τиπа Уез£Га1ϊа πρи сκοροсτи πρ τοκа 500 л/час.
Пοлученные 1,2 κг биοмассы суеπендиρуюτ в 10 л κаρбοнаτн гο буφеρа сοеτава:
Νа2С03 - ΝаΗСΟЗ - 0,05 Μ
ΝаСΙ - 0,15 Μ
ЗДΤΑ - 10 тΜ φенилмеτилсульφοнилφτορид - 0,2 тΜ Τνееη-20 - 0,3 мас.
Ιалее οсущееτвляюτ ρазρушение κлеτοκ биοмассы с ποмοщ гοмοгенизаτορа τиπа баиϊϊη ΑΡν πρи давлении 600 - 700 аτмοсφ в τρи πиκла. Пοлучаюτ 15 л οсвеτленнοгο гοмοгенизаτа, в κοτορ οπρеделяюτ сοдеρжание анτигена. Τиτρ анτигена еοсτавляеτ20 мκг/'мл οсвеτленнοгο гοмοгениз τа. Βыχοд анτигена - 3,0 мг е οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жи κοеτи. Сοдеρжание ΗΒзΑ£ οπρеделяюτ меτοдοм имунοφеρменτнο анализа с иеποльзοванием набοροв ΑЬЬοϋ Αизζуте II. Αнτигенн аκτивнοсτь измеρяюτ в мκг/мл, исποльзуя в κачесτве сτандаρ οτρаелеΕθй сτандаρτный οбρазец аκτивнοсτи ΗΒзΑ£ (0 42-28-153-88) , выπусκаемый ГШΕ им. Л. Α. Τаρасевича и οτκажбρ ванный πο междунаροднοму сτандаρτу аκτивнοсτи. Ηа элеκτροφορег ρаммаχ в ποлиаκρиламиднοм геле в вοссτанавливающиχ услοвияχ ρе κοмбинанτный анτиген πρедсτавлен в виде ποлοсы мοнοмеρа 24 кϋ Шмушсπецеφичнοсτь эτοй ποлοсы ποκазана меτοдοм иммунοблοττин га е исποльзοванием κοммеρчесκиχ анτи-ΗΒз, меченыχ йοдοм-125.
Пρимеρ 2.
Β биορеаκτορ с 9 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды с еοдеρжа - 9 - нием неορганичесκοгο φοсφορа 195 - 200 мг/л, имеющей сοсτа массοвыχ προценτаχ): πеπτοн (φиρмы ДИΦΚΟ) с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 4,5 - 5,0 мг/г - 2,0 эκсτρаκτ дροжжевοй (φиρмы ДИΦΚΟ.) с исχοдным еοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 10 - 11 мг/г - 1,0 глюκοза - 2,0 сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ в κοличесτве 1 л κульτуρу дρο ΞаσсЬагοшусез сегеνιзιае ДΑΗ-041/ρΒΜΚ-1, выρащенную на τοй минимальнοй сρеде, чτο и в πρимеρе 1, и имеюшую τиτρ 4,4 χ 1 κлеτοκ в κубичесκοм еанτимеτρе κульτуρальнοй жидκοсτи. Пο προведении κульτивиροвания в τечение 24 чаеοв πρи πеρаτуρе 29+1 гρадусοв Цельсия ποлучаюτ наκοπиτельную κуль е τиτροм 2,8 χ Ю'δ κлеτοκ в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρ нοй жидκοсτи.
Эτу κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτορ, деρжащий 90 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды с сοдеρжанием не ганичесκοгο φοсφορа 50 мг/л, имеющей сοсτав (в массοвыχ προ τаχ): πеπτοн (φиρмы ДЙΦΚΟ) е исχοдным еοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 4,5 - 5,0 мг/г - 1,0 эκсτρаκτ дροжжевοй (φиρмы ДИΦΚΟ) с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοеφορа 10 - 11 мг/г - 0,1 глюκοза - 2,0 сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,5 - 6,0. Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 г дусοв Цельсия в τечение 24 часοв.
Пοлученную в ρезульτаτе κульτуρальную жидκοсτь, сοдеρжа 2,0 χ Ю'δ κлеτοκ в κубичесκοм еанτимеτρе, ποдвеρгаюτ οбρабο аналοгичнο οπисаннοй в πρимеρе 1. Βес сыροй биοмаесы сοсτавляеτ 1,5 κг, οбъем οсвеτленн гοмοгенизаτа - 15 л, τиτρ анτигена - 22 мκг/мл οсвеτленнοгο мοгенизаτа. Βыχοд анτигена с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй ж κοсτи сοсτавил 3,3 мг. - 10 - Пρимеρ 3.
Пροцесс ведуτ аналοгичнο πρимеρу 2 на еτадии выρащива биοмаесы исποльзуюτ πиτаτельную сρеду с сοдеρжанием неορга чееκοгο φοсφορа 300 мг/л. Сρеду гοτοвяτ из 2,0 массοвыχ προц τοв πеπτοна с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа мг/г и 1,0 массοвοгο προценτа дροжжевοгο эκсτρаκτа с исχοд сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 15,0 мг/г. Ηа сτадии б οсинτеза анτигена исποльзуюτ πиτаτельную сρеду с сοдеρжан неορганичесκοгο φοсφορа 100 мг/л, сοсτавленную из 1,0 массοвο προценτа πеπτοна и 0,1 масеοвοгο προценτа дροжжевοгο эκсτρаκ е вышеуκазанным сοдеρжанием исχοднοгο неορганичесκοгο φοсφορ Пοлучаюτ 1,8 κг сыροй биοмассьц биοсинτез анτигена πρи эτ οτеуτеτвуеτ.
Пρимеρ 4.
Β биορеаκτορ с 9 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды с сοдеρж нием неορганичесκοгο φοсφορа 100 мг/л, имеющей сοсτав (в масс выχ προценτаχ): ееρнοκиелοτный гидροлизаτ κазеина (οτе- чееτвенный) е исχοдным сοдеρжанием неορга- ничесκοгο φοсφορа 2,0 - 2,5 мг/Τ - 2,0 эκсτρаκτ дροжжевοй ( οτечееτвенный) е иеχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοс- φορа 5,0 - 6,0 мг/г - 1,0 глюκοза - 2,0 сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ в κοличесτве 1,0 л κульτуρу дροжж Ξ. с. ΙВДΒΥ-11/ρС6Α7, выρащенную на τοй же минимальнοй сρеде чτο и в πρимеρе 1, и имеюшую τиτρ 4,3 χ 10Λ7 κлеτοκ в κуб чесκοм санτимеτρе κульτуρальнοй жидκοсτи.
Пο προведении κульτивиροвания в τечение 20 часοв πρи τе πеρаτуρе 29+1 гρадусοв Цельсия ποлучаюτ наκοπиτельную κульτуρ с τиτροм 2,2 χ 108 κлеτοκ в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρаль нοй жидκοсτи.
Зτу κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτορ, сο деρжащий 90 л сτеρильнοи πиτаτельнοй сρеды, сοдеρжащей неορга ничесκοгο φοсφορа 25 - 30 мг/л, имеющей сοсτав (в массοвыχ προ ценτаχ): - 11 - сеρнοκислοτный гидροлизаτ κазеина (οτе- чесτвенный) с исχοдным сοдеρжанием неορга- ничесκοгο φοсφορа 2,0 - 2,5 мг/г - 1,
5 эκсτρаκτ дροжжевοй ( οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοс- φορа 5,0 - 6,0 мг/Τ - 0, глюκοза - 2, сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, 10 πρи ρΗ 5,0 - 5,5. Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 дусοв Цельсия в τечение 24 часοв.
Пοлучаюτ κульτуρальную жидκοсτь с τиτροм 2,0 χ 10"8 κл в κубичесκοм санτимеτρе. Οτделение, οτмывκу биοмассы οτ οс κοв πиτаτельнοй сρеды, ρазρушение биοмассы κлеτοκ и οсвеτл 15 гοмοгенизаτа προвοдяτ аналοгичнο οπисаннοму в πρимеρе 1.
Βес сыροй биοмассы сοсτавляеτ 1,35 κг. Пοлучаюτϊδ л οс леннοгο гοмοгенизаτа с τиτροм анτигена 21 мκг/мл. Βыχοд анτ на с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи - 3,15 мг.
20 Пρимеρ 5.
Β биορеаκτορ, сοдеρжащий 9 л сτеρильнοй πиτаτельнοй с с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 40 мг/л, имеющей сοсτ (в массοвыχ προценτаχ): πеπτοн οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжа- 25 нием неορганичесκοгο φοсφορа 0,05 мг/г - 3,0 эκсτρаκτ дροжжевοй ( οτечесτвенный) е исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοс- φορа 4,0 - 5,0 мг/г - 1,0 глюκοза - 2,0
30 сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ κульτуρу дροжжей Ξ. с. ϋΒΥ 746/ρΝΜУЗ и προвοдяτ κульτивиροвание, κаκ οπисанο в πρимеρе 1. Τиτρ κ τοκ на сτадии выρащивания биοмассы сοсτавляеτ 1,8 χ 10Λ7 в бичееκοм санτимеτρе κуль.τуρальнοй жидκοсτи. 35 Κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτορ с ρа чим οбъемοм 100 л, сοдеρжащий 90 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρ с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 4 - 5 мг/л, имею сοсτав (в массοвыχ προценτаχ): πеπτοн ( οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжа- - 12 - нием неορганичесκοгο φοсφορа 0,05 мг/г - 3,0 эκсτρаκτ дροжжевοй (οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοс- φορа 4,0 - 5,0 мг/г - 0,1 глюκοза - 2,0 еοли, миκρσэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,5 - 6,0. Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 гρ дусοв Цельсия в τечение 24 часοв. Κульτуρальную жидκοсτь с τиτροм 1,4 χ 10Λ8 κлеτοκ в κуб чесκοм санτимеτρе ποдвеρгаюτ οбρабοτκе аналοгичнο οπисаннοй πρимеρе 1.
Пοлучаюτ 1,15 κг еыροй биοмассы; 15 л οсвеτленнοгο гοмοг низаτа с τиτροм анτигена 18 мκг/мл. Βыχοд анτигена с οднο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи еοсτавляеτ 2,7 мг.
Пρимеρ 6.
Β биορеаκτορ, сοдеρжащий 9 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρе е сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 2,0 мг/л, имеющей сοсτ (в масеοвыχ προценτаχ : πеπτοн ( οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжа- нием неορганичесκοгο φοсφορа 0,05 мг/г - 0,5 эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοеφορа 2,0 - 2,5 мг/г - 0,1 глюκοза - 2,0 еοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ κульτуρу дροжжвй 2. с. ΟΒΥ 746/ρΝΜΥ6-4 и προвοдяτ κульτивиροвание, κаκ οπисанο в πρимеρе 1. Τиτρ κле τοκ на еτадии выρащивания όиοмассы - 5,0 χ 1СГ7 κлеτοκ в κуби чесρгοм санτимеτρе κульτуρальнοй жидκοсτи.
Κульτуρу в κοличееτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτορ с ρабο чим οбъемοм 100 л, сοдеρжащий 90 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρед ο еοдеρжанием неορганичесκοгο φοеφορа 2,0 мг/л, имеющей сοеτа ;'в масеοвыχ προценτаχ): πеπτοн ( οτечесτвенный) с исχοдным сοдеρжа- нием неορганичесκοгο φοеφορа 0,05 мг/г - 0,1 эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичееκοгο φοсφορа 2,0 - 2,5 мг/г - 0,1 глюκοза - 2.0 - 13 - сοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,5 - 6,0. Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 дусοв Цельсия в τечение 24 часοв. 5 Κульτуρальную жидκοсτь с τиτροм 1,0 χ 10Λ7 κлеτοκ в κ чесκοм санτимеτρе ποдвеρгаюτ οбρабοτκе аналοгичнο οπисанн πρимеρе 1.
Пοлучаюτ 0,110 κг сыροй биοмассы и 15 л οсвеτленнοгο г низаτа с τиτροм анτигена 1,5 мκг/мл. Βыχοд анτигена с ο 10 лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи - 0,225 мг.
Пρимеρ 7.
Β биορеаκτορ с ρабοчим οбъемοм 10 л, сοдеρжащим 9 л с ρильнοй сρеды сοсτава κаκ в πρимеρе 1 πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοся 15 κοличесτве 1,0 л κульτуρу дροжжей 3. с. ϋΒΥ 746/ρΝΜν*Θ-46, и щую τиτρ κлеτοκ 4,2 χ 10~7 в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρа нοй жидκοсτи, выρащенную на минимальнοй сρеде τοгο же сοсτа чτο и в πρимеρе 1.
Пοсле κульτивиροвания в τечение 20 часοв πρи τемπеρаτ 2029+1 гρадусοв Цельсия ποлучена наκοπ/иτельная κульτуρа с τиτ κлеτοκ 2,0 χ 10Λ8 κлеτοκ в κубичесκοм санτимеτρе κульτуρаль жидκοсτи.
Эτу κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτο ρабοчим οбъемοм 100 л, сοдеρжащий πеρвοначальнο 70 л сτеρиль 25 πиτаτельнοй сρеды с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 5, 6,0 мг/л и имеющей сοсτав (в массοвыχ προценτаχ): πеπτοн из κислοτнοгο гидροлизаτа κазеина с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 0,5 - 0,6 мг/г - 1,5 0 эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοеφορа 2,0 - 2,5 мг/г - 0,1 глюκοза - 1,0 еοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,5 - 6,0. Κульτивиροвание ведуτ в τечение 40 часοв 5 τемπеρаτуρе 30 гρадусοв Цельсия.
Β προцессе κульτивиροвания дοποлниτельнο ποдаюτ, начина 5 часοв κульτивиροвания, 20 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρ сοдеρжащей 5,0 - 6,0 мг/л неορганичесκοгο φοсφορа, имею сοсτав (в массοвыχ προценτаχ : - 14 - πеπτοн из κислοτнοгο гидροжзаτа κазеина с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 0,5 - 0,6 мг/г - 5,0 зκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 2,0 - 2,5 мг/г - 4,2 глюκοза - 42,0
( τ. е. эτи οенοвные κοмποненτы ποдаюτ в сοοτнοшении, близκο 0,12 : 0,1 : 1,0 , а τаκже сοли:
ΚСΙ - 0,350
ΝаСΙ - 0,035
СаС12 безвοдный - 0,070
Κ^304 χ 7Η20 - 0,350 ρасτвορ миκροэлеменτοв (κοмποненτы, κаκ в πρимеρе 1 - 1,75 мл/л, ρаеτвορ виτаминοв (κοмποненτы, κаκ в πρимеρе 1) - 3,50 мл/л,
Пοлученную κульτуρальную жидκοсτь с сοдеρжанием κлеτοκ 6 χ 10^8 κлеτοκ на κубичесκий санτимеτρ, κаκ и в πρимеρе 1, ποд юτ на προτοчную ценτρиφугу τиπа νе5£Г ϋ сο сκοροсτью προτο
500 л/час. Κлеτοчную πасτу οсвοбοждаюτ οτ сρеды προмывани
0,05 Μ κаρбοнаτным буφеροм с ρΗ 9,0 меτοдοм миκροφильτρации исποльзοванием мембρанныχ φильτροв с диамеτροм πορ 0,2 - 0, мκм либο τρеχκρаτнοй οτмывκοй в буφеρе τοгο же сοсτава с ποсл дуюшим οτделением биοмасеы на προτοчнοй ценτρиφуге τи
¥езτ,Га1ϊа πρи еκοροсτи προτοκа 500 л/час.
Пσлученные 5,0 κг биοмассы суеπендиρуюτ в 50 л κаρбοнаτн гο буφеρа сοсτава: Νа2С03 - ΝаΗСΟЗ - 0,05 Μ
ΝаСΙ - 0,15 Μ
ЭДΤΑ - 10 тΜ φенилмеτилсульφοнилφτορид - 0,2 ηιΜ
Τνееη-20 - 0,3 мас. Далее, τаκже κаκ и в πρимеρе 1, οсущесτвляюτ ρ.азρушени κлеτοκ биοмассы с ποмοщью гοмοгенизаτορа τиπа баиϋη ΑΡУ πρ давлении 600 - 700 аτмοсφеρ в τρи циκла. Гοмοгенизаτ οсвеτляю •2 ποмοшью προτοчнοй ценτρиφуги τиπа ¥ез£Га1ιа πρи сκοροсτи προ τοκа жидκοсτи 60 л/час. Пοлучаюτ 70 л οсвеτленнοгο гοмοгениза - 15 - τа. в κοτοροм οπρеделяюτ сοдеρжание анτигена.
Τиτρ анτигена сοсτавляеτ 28 мκг/мл. Βыχοд анτигена -19 мг с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи. Сοдеρжание ΗΒзΑ^ анτигенную аκτивнοсτь οπρеделяюτ, κаκ и в πρимеρе 1.
Пρимеρ 8.
Пеρвую сτадию προцесеа ведуτ аналοгичнο πρимеρу 2. Пο ченную наκοπиτельную κульτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в ορеаκτορ, сοдеρжащий 70 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды τοгο сοсτава, чτο и в πρимеρе 2, нο с сοдеρжанием глюκοзы 1% м Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 гρадусοв Цельсия в чение 48 часοв, πρичем в προцессе κульτивиροвания дοποлниτел ποдаюτ, начиная с 10 часοв ροсτа, 18 лиτροв сτеρильнοй πи τельнοй сρеды сοсτава (в массοвыχ προценτаχ : πеπτοн с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκο- гο φοсφορа 4,5 - 5,0 мг/Τ - 5,0 эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 10 - 11 мг/г - 4,2 глюκοза - 42,0
(τ. е. в сοοτнοшении, 0,12 : 0,1 : 1,0 сοοτвеτсτвеннο) , а τаκже сοли, миκροэлеменτы и виτамины, κаκ в πρимеρе 7.
Пοлученную в ρезульτаτе κульτуρальную жидκοсτь, сοдеρжа 8,8 χ 10"8 κлеτοκ в κубичесκοм санτимеτρе, ποдвеρгаюτ οбρабο аналοгичнο οπисаннοй в πρимеρе 1.
Βес сыροй биοмассы сοеτавляеτ 6,2 κг, κοличесτвο οсвеτл нοгο гοмοгенизаτа - 70 л, с сοдеρжанием 32 мκг/мл анτигена. χοд анτигена с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи сοсτа 22,5 мг.
Пρимеρ 9.
Пροцесс ведуτ аналοгичнο πρимеρу 8;, на сτадии выρащива биοмассы исποльзуюτ πиτаτельную сρеду с сοдеρжанием неορга чесκοгο φοсφορа 300 мг/л. Сρеду гοτοвяτ из 2-х массοвыχ προц τοв πеπτοна с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 8 мг/г и нοгο массοвοгο προценτа дροжжевοгο эκсτρаκτа с исχοдным сοд жанием неορганичесκοгο φοсφορа 15,0 мг/г. Ηа сτадии биοсинτ анτигена исποльзуюτ πиτаτельную еρеду с еοдеρжанием неορга чесκοгο φοсφορа 100 мг/л, сοсτавленную из οднοгο массοвοгο π - 16 - ценτа πеπτοна и 0,1 массοвοгο προценτа дροжжевοгο эκсτρаκτа вышеуκазанным еοдеρжанием неοганичесκοгο φοсφορа. Пиτаτель еρеду для дοποлниτельнοй ποдачи гοτοвяτ из вышеуκазанныχ πеπ на и дροжжевοгο эκсτρаκτа, а τаκже глюκοзы, взяτыχ в сοοτнο нии 0,20 : 0,20 : 1,0. Пοлучаюτ 8> 0 κг сыροй биοмассы. Биοс τез анτигена οτсуτсτвуеτ.
Пρимеρ 10. Β биορеаκτορ, сοдеρжащий 9 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρ с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 105 - 110 мг/л и имею еοсτав (в массοвыχ προценτаχ): πеπτοн с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκο- гο φοсφορа 0,05 мг/г - 3,0 эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 10 - 11 мг/г - 1,0 глюκοза - 2,0 πρи ρΗ 5,0 - 5,5 внοсяτ κульτуρу дροжжей в κοличесτве 1 л, в ρащенную, κаκ в πρимеρе 1, и имеющую τиτρ 4,3 χ ΙΟΤ κлеτοκ κубичееκοм санτимеτρе κульτуρальнοй жидκοсτи. Пροвοдяτ κульτ зиροвание в τечение 20 часοв πρи τемπеρаτуρе 29+1 гρад Цельсия. Пοлучаюτ наκοπиτельную κульτуρу с τиτροм 2, 3 χ 10 κлеτοκ в κубичееκοм санτимеτρе κульτуρальнοй жидκοсτи.
Κулъτуρу в κοличесτве 10 л πеρенοсяτ в биορеаκτορ, сοде жаищй 70 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды с сοдеρжанием неορган чесκοгο φσеφορа 10 мг/л и имеющей сοсτав (в массοвыχ προце τаχ): πеπτοн с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκο- гο φοсφορа 0,05 мг/Τ - 1,5 зκсτρаκτ дροжжевσй с исχοдным еοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 10 - 11 мг/г - 0,1 глюκοза - 1,0 еοли, миκροэлеменτы, виτамины - κаκ в πρимеρе 1, πρи ρΗ 5,5 - 6,0. Κульτивиροвание ведуτ πρи τемπеρаτуρе 30 гρ дусοв Цельеия в τечение 44 часοв. Β προцесее κульτивиροван дοποлниτельнο ποдаюτ, начиная с 8 часοв ροсτа, 20 лиτροв сτ ρильнοй πиτаτельнοй еρеды сοсτава (в масеοвыχ προценτаχ): πеπτοн е иеχοдным сοдеρжанием неορганичесκο- гο φοсφορа 0,05 мг/г - 5,0 - 17 - эκсτρаκτ дροжжевοй с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 10 - 11 мг/г - 4,2 глюκοза - 42,0,
5 а τаκже сοли, миκροэлеменτы и виτамины, κаκ в πρимеρе 7. С нοшение πеπτοн - дροжжевοй эκсτρаκτ - глюκοза сοсτавляеτ 0,1 0,10 : 1,0.
Пοлучаюτ κульτуρальную жидκοеτь, сοдеρжащую 7,8 χ κлеτοκ в κубичесκοм еанτимеτρе. ποдвеρгаюτ οбρабοτκе аналοг 10 οπисаннοй Ε πρимеρе 1.
Βес сырοй биοмассы сοсτавляеτ 5,8 κг, κοличесτвο οсвеτ нοгο гοмοгенизаτа - 70 л, с сοдеρжанием 30 мκг/мл анτигена. χοд анτигена с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτи сοеτ 21,0 мг. 15
Пρимеρ 11.
Βыρащивание наκοπиτельнοй κульτуρы ЗассЬагοту οегеνιзιае ДΑΗ-041/ρΒΜΚ-1 и биοсинτез анτигена προвοдяτ в ус вияχ, аналοгичныχ οπисанным в πρимеρе 7. Ηа сτадии биοсинτез 20 φеρменτеρ дοποлниτельнο ποдаюτ, начиная с 6 часοв ροсτа, 2 сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды сοсτава (в масеοвыχ προценτа πеπτοн из κислοτнοгο гидροлизаτа κазеина с исχοдным сοдеρжан неορганичесκοгο φοсφορа 0,5 - 0,6 мг/л - 2,1; дροжже эκсτρаκτ с исχοдным сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа 5,0 255,3 мг/'л - 2,1; глюκοза 42,0 ( τ. е. в сοοτнοшении 0,05 : 0,0 1,0 сοοτвеτсτвеннο; , а τаκже сοли, миκροэлеменτы и виτами κаκ в πρимеρе 7. '
Κульτуρальную жидκοсτь с сοдеρжанием κлеτοκ 6,3 χ 1 в κубичесκοм санτимеτρе ποдаюτ на ценτρиφугу. Пροцедуρа οτде 30 ния биοмассы, ее προмывκи, ρазρушения κлеτοκ и οсвеτления πο ченнοгο гοмοгенизаτа τаκже аналοгична πρимеρу 7.
Пοлучаюτ 4,7 κг еыροй биοмасеы; κοличесτвο οсвеτленн гοмοгенизаτа с τиροм анτигена 25 мκг/мл ρавнο 70 л. Βыχοд ан гена сοсτавляеτ 17,5 мг с οднοгο лиτρа κульτуρальнοй жидκοсτ οс
Пρимеρ 12.
Οτличаеτся οτ πρимеρа 7 τем, чτο на сτадии синτеза анτи на в биορеаκτορ дοποлниτельнο ποдаюτ, начиная е 6 часοв ροс 20 л сτеρильнοй πиτаτельнοй сρеды сοсτава (в массοвыχ προц - 18 - τаχ;: πеπτοн е иеχοдным еοдеρжанием неορганичееκοгο φοсφορа - 0,6 мг/л - 6,90; дροжжевοй эκсτρаκτ с исχοдным сοдеρжан неορганичесκοгο φοсφορа 2,0 - 2,5 мг/л - 6,90; глюκοза 4 5 (τ. е. в сοοτнοшении 0,15 : 0,15 : 1,0 сοοτвеτсτвеннο.) , а τа сοли, миκροэлеменτы и виτамины, κаκ в πρимеρе 7.
Пοлучаюτ κульτуρальную жидκοсτь с τиτροм 8,0 χ 10Λ8 κлеτ в κубичееκοм еанτимеτρе,κοτορую ποдвеρгаюτ οбρабοτκе аналοгич οπисаннοй в πρимеρе 7. 10 Βес сыροй биοмаесы сοсτавляеτ 5,9 κг, κοличесτвο οсвеτле нοгο гοмοгенизаτа - 70 л. Τиτρ анτигена в οсвеτленнοм гοмοген заτе - 35 мκг/мл. Βыχοд анτигена - 24,5 мг с οднοгο лиτρа κул τуρальнοй жидκοеτи.
15 Пρимеρ 13.
Ρеκοмбинанτный ποвеρχнοеτный анτиген, ποлученный πο πρим ρу 12, οчищаюτ πο сποеοбу, οπисаннοму в авτορсκοм свидеτельеτ Зυ,Α, 1389060 πο κлассу Α 61 Κ 39/29. йз οчищеннοгο ΗΒзΑ^ гοτοвяτ ваκцину, сοдеρжащую в οднοм 20 (οдна πρививοчная дοза) 20 мκг анτигена, 0,17 - 0,25 мг ге гидροοκиси алюминия (в πеρесчеτе на Α13+) и φορмалин с маκс мальнοй κοнценτρацией 0,02 . ймунοгеннοсτь ваκцины в τесτе на мышаχ линии ΒаΙЬс масе 12 - 14 г в ρаечеτе на Εϋ 50 еοсτавляеτ 0,3 - 0,4 мκг (где 2550 - дοза ваκцины, κοτορая вызываеτ у 50 мышей сеροκοнвеρсию) Β οπыτаχ на вοлοнτеρаχ οτмечена низκая ρеаκτοгеннοсτь ва цины πο еρавнению е извесτными.
Пρиведенные πρимеρы ποκазываюτ, чτο сποеοб сοгласнο изοб 30 ρеτению ποзвοляеτ ποлучаτь ρеκοмбинанτный ποвеρχнοсτный анτиге геπаτиτа Β е χοροшим выχοдοм πρи исποльзοвании сыρья ρазличнοг προисχοждения.
Β πρеимущесτвеннοм ваρианτе ρеализации изοбρеτения πρедлο женный сποеοб ποзвοляеτ в 80 ρаз ποвысиτь выχοд ρеκοмбинанτнοг
35 ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β πρи исποльзοвании сыρья ρаз личнοгο вида (πеπτοн и дροжжевοй эκсτρаκτ ρазличнοгο προисχοж дения) .
Β το же вρемя на πρимеρаχ 3, 6 и 9 виднο, чτο исποльзσва ние πиτаτельнοй сρеды на еτадии выρащивания биοмаесы и биοсин - 19 - τеза анτигена с сοдеρжанием неορганичесκοгο φοсφορа в κοлич ве, выχοдящем за πρеделы значений сοгласнο изοбρеτению, не вοляеτ ποлучаτь анτиген с προмышленнο удοвлеτвορиτельным в 5 дοм.
Пροмышленная πρименимοсτь Сποсοб сοгласнο изοбρеτению мοжеτ быτь исποльзοван в б τеχнοлοгии для ποлучения κοммеρчесκиχ κοличесτв ρеκοмбинанτн 10 ποвеρχнοсτнοгο анτигена геπаτиτа Β с исποльзοванием ρазлич видοв сыρья для πиτаτельныχ сρед.. Пοлучаемый сοгласнο сποе анτиген πρименим для ποлучения эφφеκτивнοй и безοπаснοй ваκц προτив геπаτиτа Β и в диагнοсτичесκиχ набορаχ для выявления ρуса геπаτиτа Β или анτиτел κ нему.

Claims

- 20 -
ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
5 1. Οποсοб ποлучения ρеκοмбинанτнοгο ποвеρχнοсτнοгο анτиг на геπаτиτа Β, вκлючающий κульτивиροвание шτамма дροжжей - πρ дуценτа анτигена и биοсинτез анτигена на πиτаτельнοй сρеде, с деρжащей πеπτοн и дροжжевοй эκсτρаκτ, ρазρушение κлеτοκ дροжж и выделение анτигена, οτличающийе я τем, чτο κульτ 10 виροвание дροжжей προвοдяτ на πиτаτельнοй сρеде, сοдеρжащей - 200 мг/л неορганичесκοгο φοсφορа, а биοсинτез анτигена вед на πиτаτельнοй сρеде, сοдеρжащей 5- 50 мг/л неορганичесκο φοсφορа.
2. Сποсοб πο πунκτу 1, οτличающийся τем, чτο 15 κачесτве шτамма - προдуценτа анτигена геπаτиτа Β исποльзу шτамм ЗассЬагοтуοез сегеνϊзϊае ДΑΗ-041/ρΒΜΚ-1, деποниροванный κοллеκции ν ΙШ ποд нοмеροм Υ-1875.
3. Сποсοб πο πунκτам 1 или 2, οτ личающийся τе чτο в προцессе биοсинτеза οсущесτвляюτ дοπσлниτельную ποда
20 свежей πиτаτельнοй сρеды, еοдеρжащей πеπτοн, дροжжевοй эκсτρа и глюκοзу.
4. Сποсοб πο πунκτу 3, οτ личающийс я τем, ч дοποлниτельнο ποдаваемая свежая πиτаτельная сρеда еοдеρжиτ πе τοн, дροжжевοй эκсτρаκτ и глюκοзу в весοвοм сοοτнοшен
250,05-0,15 : 0,15-0,15 : 1,0 сοοτвеτсτвеннο.
5. Ρеκοмбинанτный ποвеρχнοсτный анτиген геπаτиτа Β, ποл ченный сοгласнο сποсοбу πο πунκτам 1, 2 или 4.
6. Βаκцина προτив геπаτиτа Β, сοдеρжащая в κачесτв дейсτвующегο начала ποвеρχнοсτный анτиген геπаτиτа Β, ποлучен
30 ный сοглаенο еποсοбу πο πунκτам 1,2 или 4, а τаκже адъюванτ κοнсеρванτ и φизиοлοгичесκи πρиемлемый ρазбавиτель.
PCT/RU1992/000258 1991-12-27 1992-12-25 Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it WO1993012815A1 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU5025861/14 1991-12-27
SU5025798/14A RU2045073C1 (ru) 1991-12-27 1991-12-27 Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита в
RU5025798/14 1991-12-27
SU5025861/14A RU2045760C1 (ru) 1991-12-27 1991-12-27 Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита в
CN93101738A CN1090324A (zh) 1991-12-27 1993-01-20 乙型肝炎重组体表面抗原的制备方法及以其为基的抗原和疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993012815A1 true WO1993012815A1 (en) 1993-07-08

Family

ID=36793879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU1992/000258 WO1993012815A1 (en) 1991-12-27 1992-12-25 Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN1090324A (ru)
AU (1) AU3269793A (ru)
WO (1) WO1993012815A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100443117C (zh) * 2003-05-13 2008-12-17 深圳康泰生物制品股份有限公司 一种治疗性乙型肝炎的疫苗制剂、其制备方法及其用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2104902A (en) * 1981-08-31 1983-03-16 Genentech Inc Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast
EP0198474A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-22 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Hepatitis B surface antigen formed by recombinant DNA techniques, vaccines, diagnostics, cell lines and methods of forming same
US4710378A (en) * 1984-03-13 1987-12-01 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Lyophilized hepatitis B vaccine
FR2606281A1 (fr) * 1986-06-18 1988-05-13 Univ Osaka Res Found Antigene du virus de l'hepatite b et procede pour sa production
FR2608052A1 (fr) * 1986-12-10 1988-06-17 Pasteur Vaccins Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu
US4769238A (en) * 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
FR2635532A1 (fr) * 1988-07-29 1990-02-23 Pasteur Institut Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant
WO1991014703A1 (en) * 1990-03-29 1991-10-03 Imperial College Of Science, Technology & Medicine Hepatitis b vaccine

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769238A (en) * 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
GB2104902A (en) * 1981-08-31 1983-03-16 Genentech Inc Preparation of hepatitis b surface antigen in yeast
US4710378A (en) * 1984-03-13 1987-12-01 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Lyophilized hepatitis B vaccine
EP0198474A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-22 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Hepatitis B surface antigen formed by recombinant DNA techniques, vaccines, diagnostics, cell lines and methods of forming same
FR2606281A1 (fr) * 1986-06-18 1988-05-13 Univ Osaka Res Found Antigene du virus de l'hepatite b et procede pour sa production
FR2608052A1 (fr) * 1986-12-10 1988-06-17 Pasteur Vaccins Procede de preparation d'un vaccin contre l'hepatite b et vaccin obtenu
FR2635532A1 (fr) * 1988-07-29 1990-02-23 Pasteur Institut Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant
WO1991014703A1 (en) * 1990-03-29 1991-10-03 Imperial College Of Science, Technology & Medicine Hepatitis b vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
AU3269793A (en) 1993-07-28
CN1090324A (zh) 1994-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109666685B (zh) Hpv卵黄抗体及其在制备治疗hpv感染的药物的应用
WO1988008453A1 (en) Method of obtaining polypeptides in cell-free translation system
TW200403336A (en) Dietary supplements beneficial for the liver
CN101475626A (zh) 一种从猪脾脏中提取转移因子的方法
DK165358B (da) Acellulaert eller renset bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et saadant antigen og fremgangsmaade til isolering af et antigent praeparat indeholdende et saadant antigen, samt anvendelse af antigenet
US10987416B2 (en) Purification of recombinant EV71 virus-like particle and method for preparing vaccine thereof
CN110087478A (zh) 从生物质材料去除核酸及其片段
US4349540A (en) Process for preparing vaccines based on antigenic ribosomal fractions
EP0016755A1 (en) Neisseria gonorrhoeae vaccine
EP0007467A1 (fr) Vaccin antigrippal et procédé pour sa préparation
JPH069505B2 (ja) トレポネマ・ハイオジセンテリアエの生育方法
JPS60120822A (ja) 免疫原性調製物
WO1993012815A1 (en) Method for obtaining recombinant surface antigen of hepatitis b, antigen and vaccine based on it
CN111744003A (zh) 趋化因子cx3cl1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗
US11505607B2 (en) Bispecific single-chain antibody, recombinant oncolytic virus for expressing same and virus composition
CN101759770A (zh) 一种从鸡脾脏中提取转移因子的方法
CN107281486A (zh) 一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法
CN100435844C (zh) 大肠杆菌热不稳定毒素作为鸟类和家禽的佐剂的用途
CN101757029A (zh) 一种从牛脾脏中提取转移因子的方法
GB2077101A (en) Antiallergic composition containing streptococci
CN102085363B (zh) 一种霍乱弧菌o139荚膜多糖结合疫苗及其制备方法
CN101307104B (zh) 包含z9cck蛋白的重组大肠杆菌及卵黄抗体与应用
CN101863976B (zh) 一种ev71病毒抗体的制备方法
CN111057683A (zh) 一种鸡胚接种用病毒稀释液及其制备方法和应用
EP0073169A2 (en) Immunogenic complex from N. gonorrhoeae

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR CA JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA