CN1887351B - 一种预防性乙肝疫苗及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种预防性乙肝疫苗。该疫苗的活性成分为酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的混合物；其中，所述酵母产乙肝表面S抗原占上述两种乙肝表面S抗原总质量的70％以下。动物实验结果表明，该混合型预防性乙肝疫苗同时具有酵母预防性乙肝疫苗和CHO预防性乙肝疫苗的优势，并具有比这两类现有预防性乙肝疫苗更强、更广泛的免疫保护作用，并可极大地降低乙肝疫苗的总体生产成本，乙肝疫苗的接种普及率可获得进一步提高。此外，该疫苗的制备方法简单，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制备方法将乙肝的预防中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种预防性乙肝疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗及其制备方法，特别是涉及一种预防性乙肝疫苗及其制备方法。
背景技术
乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病，约三分之二的慢性感染者会发展成为肝硬化、肝癌等恶性肝疾患者，全球每年约有55万人死于肝癌，而包括中国在内的东亚死亡人数就达36万(骆抗先主编，乙型肝炎基础和临床，北京：人民卫生出版社，2001第二版；Asian Liver center-statistcs)。乙肝病毒(HBV)属于DNA病毒，且具有很强的种属特异性，人HBV只能感染人、猩猩和狒狒。
通过对HBV结构的研究发现，外膜蛋白是引起宿主保护性应答的主要免疫原表位。而外膜蛋白又分为3种膜成分：大蛋白(preS1+preS2+S)、中蛋白(preS2+S)和主蛋白(S)。其中，preS1和preS2对S免疫原性有协同作用。
目前，我国生产的预防性乙肝疫苗有两种，一种是酵母表达的基因工程乙肝疫苗，另一种是哺乳动物(CHO)细胞表达的基因工程乙肝疫苗，两种疫苗的活性成分均为乙肝表面S抗原，统称为第二代预防性乙肝疫苗。
上述两种乙肝疫苗能在竞争日益激烈的中国市场长期并存的原因主要是这两种由不同表达系统生产的疫苗各具相互间不可替代的优势和无法克服的不足。酵母产乙肝疫苗主要优势是成本较低，免疫起效快、母婴阻断率高等特点(梁争论等，国产重组酵母乙型肝炎疫苗人体免疫效果观察。中华微生物学和免疫杂志，1999年第19卷第1期)，但存在以下几方面问题：①乙肝抗原在细胞内表达，不能分泌，需要破碎菌体后纯化抗原，因此需要发酵一批纯化一批，并且纯化工艺相对复杂，导致质量控制工艺也较复杂。②酵母表达系统不能提供抗原的翻译后修饰、蛋白质折叠、大分子装配和糖基化，而糖基化对诱导强的免疫效果起到重要作用。CHO产疫苗虽然表达量低、生产成本较高(目前生产使用的仍是转瓶工艺)，但具有以下优势：1)分泌表达，因此纯化工艺相对简单，回收率高；2)哺乳动物细胞更接近于人体细胞，因此抗原的表达后修饰加工更完善，糖基化完全，产生的乙肝表面抗原更接近于人血液中的乙肝表面抗原，不仅免疫效果好，而且稳定性高、免疫保护周期长(陈长顺等，不同剂量和种类基因工程乙型肝炎疫苗免疫效果研究。中国计划免疫，2000年第3期第6卷)。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备方法简单、免疫效果较好的第二代预防性乙肝疫苗。
本发明所提供的预防性乙肝疫苗，它的活性成分为酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的混合物；其中，所述酵母产乙肝表面S抗原占上述两种乙肝表面S抗原总质量的70％以下。
所述酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的重量份数比可为3-7∶7-3。
如前所述，CHO产乙肝表面S抗原比酵母产乙肝表面S抗原具有更高的体液免疫效力，但其母婴阻断效果逊于酵母产乙肝表面S抗原。另一方面，CHO产乙肝表面S抗原比酵母产乙肝表面S抗原的生产成本大得多。因此，本疫苗的发明原则是在达到纯CHO疫苗具有的体液免疫水平的前提下使用尽可能多的酵母产乙肝表面S抗原。这样，可在不影响免疫效果并最大限度保证酵母疫苗优势情况下的使生产成本大幅降低。
所述酵母包括酿酒酵母和汉逊酵母。
所述酵母产乙肝表面S抗原的来源是广泛的，可来源于任意生产同类产品的厂家，如北京天坛生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大连汉信生物制药公司或葛兰素史克公司等。
所述CHO产乙肝表面S抗原的来源是广泛的，可来源于任意生产同类产品的厂家，如长春生物技术研究所、华北制药集团金坦生物技术公司、北京华尔盾生物技术有限公司、长春生物技术研究所、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所或成都生物技术研究所等。
本发明的第二个目的是提供一种所述预防性乙肝疫苗的制备方法。
本发明所提供的预防性乙肝疫苗的制备方法，是将酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原混合，得到疫苗；其中，所述酵母产乙肝表面S抗原可占上述两种乙肝表面S抗原总质量的70％以下。
在上述制备方法中，所述酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的重量份数比可为3-7∶7-3。
所述酵母包括酿酒酵母和汉逊酵母。
所述酵母产乙肝表面S抗原的来源是广泛的，可来源于任意生产同类产品的厂家，如北京天坛生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大连汉信生物制药公司或葛兰素史克公司等。
所述CHO产乙肝表面S抗原的来源是广泛的，可来源于任意生产同类产品的厂家，如长春生物技术研究所、华北制药集团金坦生物技术公司、北京华尔盾生物技术有限公司、长春生物技术研究所、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所或成都生物技术研究所等。
需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂等。
为获得更好的免疫效果，在上述疫苗中还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子作为免疫佐剂。
本发明的疫苗可以制成注射液，该剂型的疫苗可以按照药学领域的常规方法制备。
上述疫苗共需免疫3次。分别在第0、1、2(或6)个月注射免疫，每次注射剂量10-20微克。
本发明提供了一种混合型预防性乙肝疫苗。该疫苗是将酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原按一定比例混合后得到的疫苗。动物实验结果表明，该混合型预防性乙肝疫苗同时具有酵母预防性乙肝疫苗和CHO预防性乙肝疫苗的优势，并具有比这两类现有预防性乙肝疫苗更强、更广泛的免疫保护作用，并可极大地降低乙肝疫苗的总体生产成本，乙肝疫苗的接种普及率可获得进一步提高。此外，该疫苗的制备方法简单，具有工业化生产的可行性。本发明的疫苗及其制备方法将乙肝的预防中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原混合比例的确定
人体临床实验表明(梁争论等，国产重组酵母乙型肝炎疫苗人体免疫效果观察。中华微生物学和免疫杂志，1999年第19卷第1期；李河民等，关于乙型肝炎疫苗免疫原性的评价，http://www.cfhpc.net/20040509-temp/013.ppt)，CHO预防性乙肝疫苗比酵母预防性乙肝疫苗的体液免疫效果更好(即含相同量的HBsAg，CHO疫苗可以比酵母疫苗诱发产生更多的抗-HBs)，特别是在动物实验中，通常诱发ED50所需的最低CHO抗原量仅为酵母抗原量的1/3。现进行下述实验检测本发明的混合型预防性乙肝疫苗能否达到和纯CHO疫苗相同的ED50值，并确定本发明的混合型预防性乙肝疫苗达到和纯CHO疫苗相同的ED50值时所需的CHO疫苗的最低比例，实验方法如下：
实验分为实验样品组和对照组，实验样品组：将CHO预防性乙肝疫苗(购自山东莱芜市防疫站，10微克/剂)与酵母预防性乙肝疫苗(购自山东莱芜市防疫站，10微克/剂)按不同比例(1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1)混合；对照组包括上述纯CHO预防性乙肝疫苗组、纯酵母预防性乙肝疫苗组和生理盐水组(阴性对照组)。按照“中国生物制品规程”中的规定进行动物效力测定实验(ED50)，方法为：每个实验组使用4周龄的BALB/c雌性小鼠10只，每只腹腔注射1毫升疫苗样品或阴性对照样品。4-6周采血，用RIA法测抗-HBs。
CHO预防性乙肝疫苗∶酵母预防性乙肝疫苗＝3∶7组的抗-HBs阳性小鼠比例见表1(抗原含量分别为2.5、0.625、0.3125、0.1563微克)，该混合比例实验组的ED50值见表2，表明本发明混合型疫苗中能够获得与纯CHO预防性乙肝疫苗同等效力(相同ED50值)所需的最低CHO预防性乙肝疫苗比例为30％，按照重量份数比为3(CHO产乙肝表面S抗原)∶7(酵母产乙肝表面S抗原)配制而成的混合疫苗完全可以达到和纯CHO预防性乙肝疫苗或纯酵母预防性乙肝疫苗相同的体液免疫效果。
表1CHO∶酵母＝3∶7组的抗原注射量及抗-HBs阳性小鼠比例
  每只小鼠的腹腔抗原注射量   纯酵母乙肝疫苗对照组阳性只数/小鼠总数   纯CHO乙肝疫苗对照组阳性只数/小鼠总数   混合组(CHO∶酵母＝3∶7)阳性只数/小鼠总数
  2.5微克   7/10   7/10   10/10
  0.625微克   4/10   6/10   7/10
  每只小鼠的腹腔抗原注射量   纯酵母乙肝疫苗对照组阳性只数/小鼠总数   纯CHO乙肝疫苗对照组阳性只数/小鼠总数   混合组(CHO∶酵母＝3∶7)阳性只数/小鼠总数
  0.3125微克   0/10   4/10   4/10
  0.1563微克   1/10   1/10   1/10
表2 CHO∶酵母＝3∶7组的ED50值
  组别   ED<sub>50</sub>
  纯酵母预防性乙肝疫苗   1.41微克
  纯CHO预防性乙肝疫苗   0.469微克
  混合疫苗(CHO∶酵母＝3∶7)   0.449微克
实施例2、预防性乙肝疫苗的制备及其检测
一、预防性乙肝疫苗的制备
无菌条件下，将市售酿酒或汉逊酵母预防性乙肝疫苗和CHO预防性乙肝疫苗(均购自山东莱芜市防疫站，10微克/剂)按重量份数比为1∶1混合，得到疫苗。
二、检测
对步骤一制备的预防性乙肝疫苗进行以下方面检测：
1、无菌试验
按照《生物制品无菌试验规程》对步骤一制备的预防性乙肝疫苗及其每亚批进行无菌试验，结果均无杂菌生长，符合标准。
2、安全试验
每亚批疫苗皮下注射14-16g小白鼠，每只0.5mL，注射后观察四周，免疫小鼠健存，表明本发明的疫苗具有较高的安全性。
3、免疫效力和鉴别试验
将本发明疫苗4倍递增稀释(以上述CHO预防性乙肝疫苗为参比)，每个稀释度接种BALB/cH2d雌性小白鼠20只，每只腹腔注射0.5mL，4-6周后采血，用RIA法测抗-HBs，计算本发明疫苗的ED50值与参比疫苗的ED50值，以检品ED50值/参比ED50值为判定值，结果该比值≥1，符合标准。
上述检测结果表明本发明的预防性乙肝疫苗具有较高的生物安全性及免疫效力。

Claims (8)

1.一种预防性乙肝疫苗，它的活性成分为酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的混合物；所述酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的重量份数比为7∶3。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述酵母为酿酒酵母或汉逊酵母。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述酵母产乙肝表面S抗原来源于北京天坛生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大连汉信生物制药公司或葛兰素史克公司。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述CHO产乙肝表面S抗原来源于长春生物技术研究所、华北制药集团金坦生物技术公司、北京华尔盾生物技术有限公司、长春生物技术研究所、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所或成都生物技术研究所。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的预防性乙肝疫苗的方法，是将酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原混合，得到疫苗；其中，所述酵母产乙肝表面S抗原和CHO产乙肝表面S抗原的重量份数比为7∶3。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述酵母为酿酒酵母或汉逊酵母。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述酵母产乙肝表面S抗原来源于北京天坛生物制品股份有限公司、深圳康泰生物制品股份有限公司、大连汉信生物制药公司或葛兰素史克公司。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CHO产乙肝表面S抗原来源于长春生物技术研究所、华北制药集团金坦生物技术公司、北京华尔盾生物技术有限公司、长春生物技术研究所、兰州生物技术研究所、武汉生物技术研究所或成都生物技术研究所。
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