CN102727518B - 氢氧化铝类化合物在制备治疗微生物持续性感染药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属化学药物领域，涉及氢氧化铝类化合物在制备治疗微生物持续性感染药物中的用途。本发明以氢氧化铝类化合物作为单独唯一成分进行正常小鼠及乙肝表面抗原转基因鼠动物实验，结果显示重复使用氢氧化铝可使Grl+细胞进入脾脏以及使鼠血清中HBsAg水平下降；多次使用氢氧化铝可致慢性乙型肝炎患者血清HBeAg由阳性转为阴性，并出现抗HBeAg的抗体，及血清乙肝病毒DNA下降。本发明的单独唯一成分的氢氧化铝可作为新的治疗慢性乙型肝炎药物，可进一步修饰改造以提高疗效，或用于其它有病毒抗原血症的持续性感染疾病，以及与其它药物联合后用于实验及临床研究。
Description
技术领域
本发明属化学药物领域，涉及氢氧化铝[Al(OH)3]类化合物的新的药用用途，具体涉及氢氧化铝类化合物在制备治疗微生物持续性感染药物中的用途。尤其涉及氢氧化铝类化合物在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的用途。
背景材料
据研究报道，乙型肝炎病毒(HBV)可引起人类慢性乙型肝炎(慢性乙肝)，其中部分可发展为肝硬化，甚至肝癌。迄今，用于治疗慢性乙肝的药物中的一大类为针对HBV聚合酶的核苷(酸)类药物，如Lamivudine，Entecavir，Telbivudine及Adefovir等，其作用为抑制HBV核酸的复制。这类药物需长期服用，停药后常发生病毒血症，并可出现耐药毒株；另一类治疗药物为免疫调节剂，如已上市的干扰素，分别为普通干扰素(IFN)与长效干扰素(Peg-IFN)。这类制品一方面通过诱生细胞产生的多种抗病毒蛋白，如2’-5’A合成酶等阻止病毒蛋白的合成而起抗病毒作用；另一方面也具有一定的免疫调节作用，如可增强巨噬细胞的作用，调节细胞表面MHC类分子的表达，以及调节T细胞的功能等。干扰素的作用没有针对某种病毒的特异性，但有种属特异性，但干扰素在乙肝治疗中存在的主要问题是可出现骨髓抑制如白细胞下降等副作用。而且，实践显示，仅有约30％的乙肝患者对干扰素治疗有应答，即使长效干扰素也需要每周注射一次，价格昂贵。但是应用干扰素后停止治疗的反跳率较药物治疗为低。以上两种治疗的费用均较高。
氢氧化铝类化合物(统称为Alum)是一类有三价铝的盐类，最早1926年用于破伤风类毒素疫苗作为佐剂，以后则用于小儿麻痹灭活疫苗(Salk疫苗)，至今已作为甲肝、乙肝疫苗等许多微生物疫苗中不可缺少的佐剂，此作用表现为可以加入后用更少量的微生物抗原，从Alum的历史来看，作为人用疫苗的佐剂，其有激活人体的B细胞提高抗体效果的作用以及有安全性。关于Alum作为佐剂促进抗体产生的机制已在近年有较多研究，最早是由于Alum与抗原蛋白结合可以在局部沉积并延长吸收抗原的时间，发展为加入Alum后可以激活B细胞母细胞化，而进一步延伸至Alum本身可激活免疫应答，近来有研究发现，注射Alum，一天后可有免疫炎症细胞如中性粒细胞、炎性单核细胞和树突状细胞即可聚集在局部，Alum可以作用于人的外周血单核细胞，上调MHC-II类分子，CD40与CD83。在小鼠腹腔内注入Alum后，DC和B细胞即可内吞抗原，进一步研究发现，Alum可以促进活化caspase-1与IL-1B。而且即使没有发生佐剂作用，Alum介导的IL-1B分泌是通过Nlrp3炎症抗体(inflammasome)所实现的。由于发现抗体的产生需要Th细胞介导，对不同Th细胞的分析发现，Alum主要作用于Th2类细胞应答，然而与正常小鼠不同，在IL-4(Th2类细胞银子)、IL-4R及STAT6缺陷鼠中，Alum虽然可以产生低滴度的IgG1，但是，小鼠还可产生高效价的Th1类抗体(IgG2a)。反映Alum诱生的Th2类型应答抑制了Th1类因子的应答，然而另有报道认为在体内活化炎症体和Th2的免疫应答并不与Alum的佐剂作用及对T、B细胞的应答是直接相关的。此外，关于Alum可通过尿酸激活及募集炎症性的DC也是一种机制。最近，施扬等发现Alum只与DC作用，直接通过细胞表面脂类的活化可促使DC摄入抗原，而且通 过细胞间粘附分子(ICAM)和淋巴细胞功能相关的抗原(Lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)，可作用于CD4+细胞，并认为这一功能过程可发生于DC表面，针对多种的固相结构(如Alum晶体)而起作用。
虽然Alum作为佐剂的作用机制在小鼠中及体外做了大量实验研究，但迄今均未见有关进行人体临床试验研究的报道，更未有探索Alum单独治疗持续性感染的作用。
发明内容
本发明的目的是提供氢氧化铝[Al(OH)3](统称为Alum)类化合物的新的药用用途，尤其是Alum作为单独成分在制备治疗微生物持续性感染药物中的用途。特别是Alum作为单独唯一成分在制备治疗慢性乙型肝炎药物中的用途。
本发明的氢氧化铝类化合物Al(OH)3统称为Alum及其衍生物(含三价铝成分)，其各类制品广泛用于多种疫苗的佐剂。
本发明以复旦大学上海医学院医学分子病毒学实验室早在2004年开展的乙克(抗原抗体复合物型治疗性乙肝疫苗)免疫人体临床研究中采用的Alum(KAISO4)硫酸钾铝制剂作为对照并据此构成了本发明。
本发明利用长期以来作为免疫佐剂使用的氢氧化铝类化合物作为单独唯一成分在正常小鼠及乙肝表面抗原(HBsAg)转基因鼠中试验，进行Grl+细胞分布及HBsAg水平分析，实验结果显示，重复注射氢氧化铝可使Grl+细胞进入脾脏以及可以使鼠血清中HBsAg水平下降；在慢性乙型肝炎患者中多次注射氢氧化铝可致患者血清HBeAg由阳性转为阴性，并出现抗HBeAg 的抗体，及血清乙肝病毒DNA下降，实验结果证明，所述的氢氧化铝类化合物作为单独唯一成分有治疗乙肝患者的效果。
本发明中，采用Alum及其衍生物作为单独唯一成分进行动物实验，
用正常鼠两次腹腔内注射Alum(KAISO4)(已公开作用于重组乙肝疫苗的佐剂)，观察Grl+细胞在脾内分布；
Alum腹腔注射HBsAg阳性转基因鼠(品系#59)，采用ELISA检测方法对Alum免疫鼠进行血清HBsAg水平的测定；
选取临床试验对象：慢性乙肝患者分别为6次与12次(每次间隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首个6次注射后停止一个月，再同样注射第二6次；本发明中，参照乙肝免疫治疗的常用技术，无论6次与12次方案，注射后均随访24周；
注射Alum后进行疗效检测：包括血清HBeAg定量，抗HBe测定，血清HBV DNA定量以及HBsAg定量检测。
本发明中，用于注射Alum后的疗效检测试剂等，包括血清HBeAg定量(Abbott试剂)，抗HBe测定(Abbott试剂)，血清HBV DNA定量(PCR法定量技术)，HBsAg定量(Abbott试剂)均为市售认可的商品。
本发明经上述动物实验以及临床试验结果显示，多次注射Alum后，9-18％慢性乙肝患者发生e抗原血清转换，63％出现HBeAg阴转，同时伴有血清HBVDNA下降，与未经注射Alum治疗的HBeAg自然转换率5-8％比较，表明本发明采用Alum及其衍生物作为单独唯一成分能抑制微生物持续性感染。
本发明的氢氧化铝可进一步修饰改造以提高疗效，或用于其它有病毒抗原血症的持续性感染疾病，以及与其它药物联合后用于实验及临床研究。
进一步本发明的Alum及其衍生物作为单独唯一成分能制备治疗慢性乙型肝炎药物。
该Alum及其衍生物作为单独唯一成分制备的药物，治疗慢性乙肝患者分别为6次与12次(每次间隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首个6次注射后停止一个月，再同样注射第二6次，注射后均随访24周。
本发明的Alum及其衍生物作为单独唯一成分制备的药物，可用于治疗不同类型的慢性乙肝患者；尤其适用于HBeAg阳性的慢性乙肝患者。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。。
具体实施方式
实施例1正常小鼠注射Alum两次后Grl+细胞在脾内的数目比较
两组C57/B1小鼠每组10只，将0.25ul Alum(KAISO4)悬浮于250ul生理盐水内，或仅用生理盐水250ul分别腹腔注射，4周后再注射1次，6天后杀鼠取脾。用荧光标记的Grl抗体进行两组脾细胞染色，同时用CD11b荧光抗体染色，用流式细胞仪检测CD11b/Grl+双阳性细胞及Grl+细胞数，同时用抗CD3抗体染色作为对照，表1是C57/B1小鼠注射Alum两次后脾内Grl+细胞计数结果。
表1
结果证明经上述Alum免疫的C57/BL鼠中脾脏中Grl+与CD11/Grl双阳性的细胞数增多，而CD3+细胞无变化。
实施例2Alum免疫HBsAg阳性转基因鼠(#59)后对HBsAg水平的影响
24只HBsAg阳性鼠随机分为3组，A组注射盐水，B组注射Alum，C组用HBsAg-抗HBs不加Alum。各组均腹腔内注射，共注射两次，剂量同实例1，间隔期为4周。三组均以WHO的HBsAg标准品，用科华试剂来定量检测。表2是Alum免疫HBsAg阳性转基因鼠后HBsAg水平结果。
表2
结果显示，单独注射Alum两针后，HBsAg有下降，但单独注射盐水或不加Alum的抗原抗体复合物，均无降低HBsAg的作用，说明Alum有一定作用，而HBs Ag-抗HBs必须有Alum加入方可发挥作用。
实施例3对比多次注射Alum后在乙肝患者中的特异性免疫应答
对78名与130名HBs Ag/HBeAg双阳性，且抗-HBs、抗-HBe均为阴性的慢性乙肝患者分别给予6剂与12剂的Alum，每次注射间隔1个月。其中注射12剂分为两个6剂，每个6剂间间隔1个月。注射完成后随访24周。研究中采集的血清采用Abbott试剂检测HBeAg与抗-HBe。e抗原消失，e抗体产生定义为e抗原血清转换，是目前国际公认的慢性乙肝疗效银标准(金 标准为s抗原转换，尚无治疗药物能采用)。表3是Alum治疗后慢性乙肝患者e抗原血清转换率。
表3
结果显示，注射6剂Alum后，e抗原转换率为9％，两个6剂后，该转换率上升至19％，与目前核苷类似物的疗效相当。
Claims (2)
1.氢氧化铝类化合物Alum作为单一活性组分在制备抗乙肝感染药物中的用途，所述药物的使用方式12次，每次间隔四周，氢氧化铝类化合物Alum肌注；其中，12次方案中，首个6次注射后停止一个月，再同样注射第二6次，注射后均随访24周。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的氢氧化铝类化合物Alum含三价铝成分，其分子式为Al(OH)3。
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