CN103316339A - 用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，包括：重组酵母乙肝疫苗40～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。本发明还公开了相应的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗制剂的生产方法。本发明可产生更高的保护率，诱导产生更高的抗体滴度和更强更久的免疫记忆，纠正个体免疫差异，最大程度减少低应答和无应答人群，能使16岁及其以上年龄无应答人群达到更好的免疫效果，且具有良好的安全性及耐受性。

Description

用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物药品领域，尤其涉及一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。该病广泛流行于世界各国，是严重威胁人类健康的世界性疾病，估计目前全球有3亿5千万病毒携带者，每年有100～150万人死于与HBV感染相关的疾病。HBV感染是我国严重的公共卫生问题。根据卫生部发布的我国急性病毒性肝炎疫情资料和各型别构成资料推算，我国每年发生急性乙型肝炎约15～30万例。1992～1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查表明，我国一般人群的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性率为9.7%，据此估计我国约有1.2亿人为HBsAg慢性携带者，占全世界HBsAg慢性携带者人数1/3。如果慢性乙肝的病情控制不理想，乙肝病毒持续活跃复制、肝脏细胞不断的被破坏、肝脏组织中纤维组织增生活跃，经10～30年可发展为肝硬化，少部分患者（约1%～5%）经20～40年发展为肝癌。

乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即前S／S区、前C／C区、P区和X区。前S/S区编码大(前S1、前S2及S)、中(前S2及S)、小(S)3种包膜蛋白即HBsAg；前C/C区编码HBeAg及HBcAg；P区编码聚合酶；X区编码X蛋白。

HBsAg的3种组分中，226个氨基酸残基的S蛋白是主要成分，由糖基化的GP和非糖基化的P24两种单体组成。S蛋白的N端加PreS2(55个氨基酸残基)组成的M蛋白，也有两种形式即GP36和P33肽段。M蛋白N端再加上108或109个氨基酸残基构成了L蛋白，包含GP42和P39肽段。HBsAg在携带者血液中呈直径为22nm的球型和长链型颗粒，其主要成分为S蛋白及少量的M蛋白和L蛋白。HBsAg共有14个半胱氨酸残基(Cys)并以二硫键形成复杂的空间结构。HBsAg包括中和表位,又称“a”抗原决定簇。“a”抗原决定簇与其他两种HBsAg决定簇d/y和w/r确定HBV有4个血清亚型：adw、adr、ayw和ayr。“a”抗原共同决定簇置于S蛋白的124～147位氨基酸残基段，形成亲水性的双环状结构，这个构形与“a”抗原共同决定簇的抗原性密切相关，又与免疫原性(特异体液免疫)有重要关系。HBsAg的4个血清亚型之间抗原性和免疫原性有互相交叉关系，因此，用一个亚型基因表达的抗原制成疫苗能产生保护性免疫抵抗全部亚型病毒。

预防HBV感染的有效手段是接种乙肝疫苗，目的是产生保护性抗体—抗-HBs。国外于1981年正式批准血源性乙型肝炎疫苗；1986年正式批准基因重组乙型肝炎疫苗；1991年开始婴儿普遍接种乙型肝炎疫苗。我国于1986年正式生产血源性乙型肝炎疫苗；国产HBV CHO（中国仓鼠卵母细胞）疫苗于1992年试生产，1996年正式生产；于1989年引进默克（Merck）公司两条重组（酵母）乙型肝炎疫苗生产线，分别于1997年和1998年正式生产。我国于1998年7月1日停止生产血源性乙型肝炎疫苗，并于2000年1月1日停止使用该疫苗。当前我国生产的基因工程乙型肝炎疫苗包括CHO疫苗和酵母疫苗均为表面抗原主蛋白，不带前S区。重组（酵母）乙型肝炎疫苗与血源性疫苗比较，在免疫原性方面优于后者，并且生产量大，疫苗纯度高，疫苗内不含人血清成分和任何其它动物源蛋白，安全性更优越。

被动和主动免疫的实验研究结果表明，抗-HBs达10mIU/ml为预防感染的最低水平。目前，将首次完成3针乙肝疫苗接种后抗-HBs的峰值期抗-HBs≥10mIU/ml确定为抗体保护性阳转。完成3针乙肝疫苗接种后在抗-HBs的峰值期抗-HBs<10mIU/ml者被称为无应答者。自1981年开始应用血源性疫苗到1989年应用重组基因疫苗，疫苗的有效性及安全性都已被广泛证实，但无论是血源性疫苗还是重组基因疫苗，在完成3针疫苗接种后，总有部分接种者不能产生足够的抗-HBs。成人接种乙肝疫苗后约有5%～10%的人为无应答者，这部分无应答人群仍是HBV的易感人群。乙肝疫苗无应答的原因较为复杂，一方面可能与机体的一般特征如性别、年龄、体重指数以及遗传因素等有关，另一方面也可能与疫苗的接种因素如疫苗种类、接种剂量、接种途径等因素有关。目前人们对如何通过复种乙肝疫苗使无应答者产生保护性抗体做了许多尝试，包括提高接种剂量、增加针次，改变接种途径，增加使用佐剂等，但效果并不明显。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，该疫苗可产生更高的保护率，诱导产生更高的抗体滴度和更强更久的免疫记忆，纠正个体免疫差异，最大程度减少低应答和无应答人群，能使16岁及其以上年龄无应答人群达到更好的免疫效果，且具有良好的安全性及耐受性。

本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗的制备方法，该方法制备的疫苗可产生更高的保护率，诱导产生更高的抗体滴度和更强更久的免疫记忆，纠正个体免疫差异，最大程度减少低应答和无应答人群，能使16岁及其以上年龄无应答人群达到更好的免疫效果，且具有良好的安全性及耐受性。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，包括：重组酵母乙肝疫苗：40～80μg/ml，铝0.5mg/ml，其余成分为生理盐水。

优选地，包括：重组酵母乙肝疫苗：50～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

优选地，重组酵母乙肝疫苗60～70μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

优选地，包括：重组酵母乙肝疫苗60μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

相应地，本发明还公开了一种制备上述的用于低无应答人群的新型乙型肝炎疫苗制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

选用表达乙型肝炎表面抗原的酵母工程菌种在适宜温度下进行三角瓶、种子罐和生产罐三级发酵，收获的酵母细胞冷冻保存；

用细胞破碎器破碎酵母细胞，除去细胞碎片后，按每克蛋白质加入1.43克的比例加入硅胶，采用硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水层析法精提HBsAg，将产品与6mol/L硫氰酸钾溶液等体积混合，进行硫氰酸盐处理，再用6.2mmol/LPBS进行超滤去除硫氰酸钾，稀释和除菌过滤；

按终浓度为100μg/ml加入甲醛，37℃保温适宜时间，氢氧化铝吸附后，即为半成品；

经分装和包装后，即为成品。

本发明的有益效果是：

本发明的实施例通过大幅度提高乙肝表面抗原的含量，从而产生了更高的保护率，诱导产生了更高的抗体滴度和更强更久的免疫记忆，纠正了个体免疫差异，最大程度减少了低应答和无应答人群，使16岁及其以上年龄无应答人群达到了更好的免疫效果，且具有良好的安全性及耐受性。

具体实施方式

下面详细描述本发明提供的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗的第一实施例，本实施例具体包括有：重组酵母乙肝疫苗40～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

下面详细描述上述用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗制剂的方法，该方法主要包括以下步骤：

选用表达乙型肝炎表面抗原的酵母工程菌种在适宜温度下进行三角瓶、种子罐和生产罐三级发酵，收获的酵母细胞冷冻保存；

用细胞破碎器破碎酵母细胞，除去细胞碎片后，按每克蛋白质加入1.43克的比例加入硅胶，采用硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水层析法精提HBsAg，将产品与6mol/L硫氰酸钾溶液等体积混合，进行硫氰酸盐处理，再用6.2mmol/LPBS进行超滤去除硫氰酸钾，稀释和除菌过滤；

按终浓度为100μg/ml加入甲醛，37℃保温适宜时间，氢氧化铝吸附后，即为半成品；

经分装和包装后，即为成品。

下面详细描述本发明提供的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗的第二实施例，本实施例具体包括有：重组酵母乙肝疫苗50～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。本实施例的制备方法与前述第一实施例基本相同，不再赘述。

下面详细描述本发明提供的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗的第三实施例，本实施例具体包括有：重组酵母乙肝疫苗60～70μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。本实施例的制备方法与前述第一实施例基本相同，不再赘述。

下面详细描述本发明提供的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗的第四实施例，本实施例具体包括有：重组酵母乙肝疫苗60μg/ml，铝0.5mg/ml，其余成分为生理盐水。本实施例的制备方法与前述第一实施例基本相同，不再赘述。

下面详细描述对本实施例进行的接种试验及其结果。

试验1

筛选出78名16岁及其以上年龄无应答健康成人，经知情同意后共有68人参加本期临床试验。受试者按性别、年龄和体重的均衡性分成三组，每人均按0、1、2免疫程序接种3针，三组的剂量分别为10μg、30μg、60μg；每针接种后，按照方案要求观察接种反应情况。最终有66名受试者完成了全部试验并获得有效数据。

66名受试者中60μg组有1人在每次接种后24小时注射部位出现轻度疼痛和红、中度肿及硬结，但接种后72小时内自行恢复正常。其他受试者在每一针疫苗接种后30分钟、6、24、48、72小时均未观察到全身及局部不良反应。所有受试者从接种第4天起至第4周止，每周进行随访，均未观察到其它异常反应、偶合反应和任何具有临床意义的不良事件。所有受试者的生命体征、血常规、血生化、心电图检查各项指标未见任何有临床意义的改变，提示该试验疫苗具有较好的安全性，可进行II-III期临床试验。

试验2

采用随机、盲态、同类制品平行对照设计进行II-III期临床试验。首先进行无应答人群的筛选，然后对筛选出的同一目标人群，通过疫苗编盲按照2：2：1比例随机分成三个组，其中两个试验疫苗组（分别为60μg组、30μg组）和一个对照疫苗组（10μg组），观察、对比并分析两个不同剂量的高剂量乙肝疫苗对无应答人群的免疫效果。最终从筛选期全程接种10μg/1.0ml/支乙肝疫苗的37221人中筛选出1209名16岁及其以上年龄无应答者，其中的1105人完成试验并获得有效数据。

免疫原性分析显示，试验期全程复种后60μg、30μg和10μg组的抗-HBs阳转率分别为92.79%、87.06%和78.60%，在60μg和30μg剂量组内，抗-HBs水平有随针次增加而上升的趋势，10μg则无此趋势；在受试者接种针次相同的情况下，抗-HBs阳转率有随剂量增高而上升的趋势。

60μg组第1针免后对无应答人群的免疫效果相当于10μg组第3针免后的免疫效果，提示用60μg乙肝疫苗复种1针次即可对无应答者达到良好的免疫效果。60μg组第2针免后对无应答人群的免疫效果优于10μg组第3针免后的免疫效果，提示用60μg乙肝疫苗复种2针次能对无应答者达到更好的免疫效果。

安全性分析显示，疫苗接种后安全性观察期内，不良反应总发生率为31.7%，60μg、30μg和10μg组间差异无统计学意义；未观察到3级以上不良反应；三组间1、2、3级不良反应发生率差异均无统计学意义。

局部、全身不良反应总发生率分别为27.7%和16.0%，60μg、30μg和10μg组间差异无统计学意义；三组间1、2、3级局部和全身不良反应总发生率差异均无统计学意义。

除30μg组发热的发生率（58/439）高于60μg组(39/445)和10μg组(15/221)，差异有统计学意义，其它主要全身不良反应在三组间的差异均无统计学意义。各针次免后不良反应总发生率、局部不良反应总发生率和全身不良反应总发生率在60μg、30μg和10μg组间差异均无统计学意义。

对不良反应总发生率按照年龄进行分层分析，结果显示在不同年龄层中，60μg、30μg和10μg组间不良反应总发生率差异无统计学意义。

在临床试验期间，随访和不良反应观察中均未观察到其它异常反应、偶合反应和任何有临床意义的严重不良事件。

本发明与现有技术的乙肝疫苗相比，具有以下优点：

具有更高的抗原含量，能产生更高的保护率，诱导产生更高的抗体滴度和更强更久的免疫记忆，纠正个体免疫差异，最大程度减少低应答和无应答人群，能使16岁及其以上年龄无应答人群达到更好的免疫效果，且具有良好的安全性及耐受性。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，其特征在于，包括：重组酵母乙肝疫苗40～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

2.如权利要求1所述的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，其特征在于，包括：重组酵母乙肝疫苗50～80μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

3.如权利要求2所述的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，其特征在于，包括：重组酵母乙肝疫苗60～70μg/ml，铝0.35-0.62mg/ml，其余成分为生理盐水。

4.如权利要求3所述的用于低无应答人群的乙型肝炎疫苗，其特征在于，包括：重组酵母乙肝疫苗：60μg/ml，铝0.5mg/ml，其余成分为生理盐水。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的用于低无应答人群的新型乙型肝炎疫苗制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

选用表达乙型肝炎表面抗原的酵母工程菌种在适宜温度下进行三角瓶、种子罐和生产罐三级发酵，收获的酵母细胞冷冻保存；

用细胞破碎器破碎酵母细胞，除去细胞碎片后，按每克蛋白质加入1.43克的比例加入硅胶，采用硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水层析法精提HBsAg，将产品与6mol/L硫氰酸钾溶液等体积混合，进行硫氰酸盐处理，再用6.2mmol/LPBS进行超滤去除硫氰酸钾，稀释和除菌过滤；

按终浓度为100μg/ml加入甲醛，37℃保温适宜时间，氢氧化铝吸附后，即为半成品；

经分装和包装后，即为成品。