CN109820844A - 亚精胺在制备减肥药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了亚精胺在制备减肥药物中的应用。本发明发现亚精胺能够减轻高热量饮食导致的体重增加，并改善肥胖相关的胰岛素敏感性以及炎症。

Description

亚精胺在制备减肥药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种多胺的应用，主要涉及亚精胺在制备减肥药物中的应用。

背景技术

随着人们生活水平及膳食结构的不断改变，超重及肥胖人口占比不断增加， 目前已成为一种全球性的“流行病”。根据2017年《柳叶刀》发表的关于全球成 年人体重调查的报告显示：从1979年到2016年，全球肥胖成人数量大约从1 亿增加到6.7亿人，另有2.13亿儿童和青少年及13亿成年人处于超重状态。如 今减重作为经久不衰的热门话题，人们的诉求早已不仅来自于求美之心，同样伴 随着许多因肥胖引起的健康问题，特别是多种慢性疾病的发生。全球每年因肥胖 造成的直接和间接死亡达340万，成为仅次于吸烟的第二个可预防的致死性危险 因素。有专家预测，肥胖可能成为21世纪的头号杀手，给人们招来一身病。因 此，肥胖已经成为严重的社会问题，科学减重刻不容缓。

肥胖发病机制的复杂性和个体差异的多样性，包括遗传背景、用药史、精神病史、运动习惯、营养情况和饮食习惯等，使肥胖的预防和治疗需综合考虑多种因素，如肥胖的严重程度、是否伴有其他慢性疾病等来制定个性化的减重方案。目前，有充分的临床数据支持的治疗肥胖的方案主要包括生活方式干预、药物治疗和减肥手术等，其中生活方式干预则主要是通过饮食习惯和结构的调整和以及增加运动来实现的。如近年来火热的生酮饮食就是提倡的是一种高脂肪、低碳水化合物和适量蛋白质的饮食方案，通过降低或避免碳水化合物的摄入，使脂肪和蛋白质成为主要的能量供应源，从而起到一定的减肥效果。另外，虽然目前国外针对生酮饮食对减重的效果已有很多临床试验研究，但我国生酮饮食的反馈基本上主要来自于临床医生和个别实践者，其是否适用于我国人群，是否真正有减肥作用能够达到理想效果，还值得进一步探讨。事实上，只有很少少数人能够坚持长时间改变饮食习惯，而减肥类药物的使用又伴随着一定的副作用或风险，因此，通过对天然的功能性成分的作用及其机制研究，并将这类功能性成分应用于减肥已成为近来研究的一个新热点。

近年来，亚精胺的研究备受关注，亚精胺是一类广泛存在与自然界的多胺类物质，在动物体内具有多种重要的生物学活性，天然存在于小麦胚芽、纳豆、黄豆、蘑菇、豌豆、腰果以及花椰菜等中。2018年1月《科学》杂志发表重磅论文，详细阐述了亚精胺与健康和疾病的关系，亚精胺具有延缓衰老、延长寿命、心血管保护、防癌与抗癌、神经调节与神经保护、改善代谢性疾病等多种作用。

因此，在本发明主要研究外源性补充亚精胺能否改善高脂饮食诱导的肥胖，并为将其运用到减肥药的制作中提供理论依据。

发明内容

在本发明中，将多胺类化合物亚精胺运用到小鼠中，通过高脂饮食诱导小鼠肥胖模型，同时以饮水方式外源性摄入亚精胺，发现亚精胺能够减轻小鼠高热量饮食导致的体重增加，并改善肥胖相关的胰岛素敏感性以及炎症。

本发明采用的技术方案是：亚精胺在制备减肥药物中的应用。

实验过程包括：

1)采用高脂饮食构建小鼠肥胖模型，将C57BL6J品系的小鼠随机分成5组(每组10-11只)，①普通饲料组：普通饮食饮水；②高脂饮食组：60％高脂饲料喂食，普通饮水；③低剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，5mg/Kg亚精胺饮水；④中剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，10mg/Kg亚精胺饮水；⑤高剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，20mg/Kg亚精胺饮水；

2)饲养期间，每周检测小鼠体重、摄水量和饮水量，检测小鼠体重变化情况以及亚精胺对小鼠饮食是否产生影响；

3)饲养期间，对小鼠进行葡萄糖耐量、胰岛素耐量试验，评价胰岛素抵抗变化情况；

4)饲养期间，采用荧光标记的右旋糖酐以及酶联免疫方法检测血液中脂多糖浓度评价小鼠肠道通透性变化情况；

5)实验结束后，检测一下指标：

a)脏器指数：称小鼠内脏脂肪、皮下脂肪、肠系脂肪以及附睾脂肪和肝脏重量并计算脏器指数；

b)苏木精-伊红染色：观察脂肪以及肝脏的病理学改变。

附图说明

图1：外源亚精胺干预对小鼠体重和摄食量的影响；(a)为每周小鼠体重变化， (b)为每周小鼠摄食量变化；

图2：外源亚精胺干预对肥胖小鼠附睾、肠系、内脏、皮下以及棕色脂肪的影响；

图3：外源亚精胺干预对肥胖小鼠肝脏的影响；(a)为普通饲料组，(b)为高脂饮食组，(c)为低剂量亚精胺组，(d)为中剂量亚精胺组，(e)为高剂量亚精胺组；

图4：外源亚精胺干预对肥胖小鼠肝脏中甘油三酯、总胆固醇以及游离脂肪酸的影响；(a)为肝脏中甘油三酯水平变化，(b)为肝脏中总胆固醇水平变化，(c) 为肝脏中游离脂肪酸水平变化；

图5：外源亚精胺干预对肥胖小鼠血液中甘油三酯、总胆固醇以及游离脂肪酸的影响；(a)为血液中甘油三酯水平变化，(b)为血液中总胆固醇水平变化，(c) 为血液中游离脂肪酸水平变化；

图6：外源亚精胺干预对肥胖小鼠糖耐受和胰岛素耐受的影响；(a)为葡萄糖耐受影响，(b)为胰岛素耐受影响；

图7：外源亚精胺干预对肥胖小鼠结肠中炎性细胞浸润和粘液分泌的影响；(a) 为普通饲料组，(b)为高脂饮食组，(c)为低剂量亚精胺组，(d)为中剂量亚精胺组，(e)为高剂量亚精胺组；

图8：外源亚精胺干预对肥胖小鼠结肠长度的影响；

图9：外源亚精胺干预对肥胖小鼠肠道通透性指标的影响；

图10：外源亚精胺干预对肥胖小鼠血清中内毒素水平的影响。

图中*P<0.05和**P<0.01表示为高脂饮食组、低剂量亚精胺组、中剂量亚精胺组以及高剂量亚精胺组与普通饲料组相比有显著性差异；#P<0.05和##P<0.01 表示为低剂量亚精胺组、中剂量亚精胺组以及高剂量亚精胺组与高脂饮食组相比有显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1.实验动物

选用7周龄雄性C57BL6J小鼠，体重20-22g，由上海斯莱康动物中心提供。实验动物饲养在严格的人工模拟昼夜循环的环境中，每笼4只，温度控制在 22±1℃，光周期为12小时光照和12小时黑暗，光源为日光灯，强度约200Lux，自由饮水饮食，实验动物在该环境中饲养一周以适应明暗周期和饮食习惯。

2.实验动物分组

待实验动物适应一周后，将小鼠随机分成5组，每组10-11只：

①普通饲料组：普通饮食饮水；

②高脂饮食组：60％高脂饲料喂食，普通饮水；

③低剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，5mg/Kg亚精胺饮水；

④中剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，10mg/Kg亚精胺饮水；

⑤高剂量亚精胺组：60％高脂饲料喂食，20mg/Kg亚精胺饮水；

其中，普通标准饲料的能量为3.52kcal/g，高脂饲料的能量为5.24kcal/g。每周检测小鼠体重、摄食量和饮水量。

在为期4个月的实验周期当中，各组之间的进食量并无统计学差异(P＞0.05)。可见，外源性亚精胺的处理对小鼠的食欲无抑制作用，其进食量一样。如图1 所示，补充高剂量亚精胺后，小鼠体重从第5周开始显著低于高脂对照组，中低剂量亚精胺组则从第12周开始体重显著低于高脂饮食组，高脂饮食能量摄入显著高于普通饮食组，但亚精胺处理各组与高脂饮食组能量摄入无显著性差异。

从图2可知，高脂饮食诱导的肥胖小鼠的附睾脂肪、内脏脂肪、皮下脂肪以及肠系脂肪质量均明显高于正常组，随后，不同剂量的亚精胺处理降低了各脂肪组织的重量，并呈现剂量依赖性。

实施例2

苏木精-伊红染色法观察亚精胺对小鼠肝脏脂肪以及炎症的影响

解剖当天，取新鲜的肝脏，左叶取一小块放入事先准备好的装有4％福尔马林的溶液中浸泡，切片的包埋准备由切片公司进行。

通过肝组织切片苏木精-伊红染色法染色观察发现(图3)，普通饮食组小鼠肝细胞大小和形态正常，而高脂饮食组小鼠肝脏细胞之间界限模糊，细胞内出现大量脂滴空泡，呈现明显的肝细胞脂肪变性。而亚精胺处理组整体的空泡形状少于高脂饮食组，说明肝脏组织中的脂滴明显减少，细胞形态也趋于正常，肝细胞脂肪变性情况得到不同程度的改善。同理，在肝脏组织的苏木精-伊红染色法染色中发现，高脂饮食出现了明显的炎性细胞浸润的现象，而外源性的亚精胺处理缓解了这一现状，并呈现剂量依赖性。可见，高脂饮食引起小鼠肝细胞脂质堆积，肝细胞脂肪变性，炎性细胞浸润，而亚精胺饮水干预可延缓高脂饮食引起的这些现象，并呈现剂量依赖。

实施例3

各小组小鼠肝脏中总胆固醇、甘油三酯以及游离脂肪酸水平变化

取解剖后的肝脏组织，60-80mg，加500μL异丙醇，研磨震荡，静置5min，离心机3000rpm，离心，取上清，移置新的离心管中，4℃保存，用于总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的指标检测，操作步骤严格按照说明书操作。

结果显示(图4)，高脂饮食引起了肝脏组织中总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的水平升高，而亚精胺处理可以显著的改善这个情况，并呈剂量相关性。

实施例4

各小组小鼠血液中总胆固醇、甘油三酯以及游离脂肪酸水平变化

取解剖后的血液，离心机7000rpm，7min，取上清用于总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的指标检测，操作步骤严格按照说明书操作。结果显示(图5)，高脂饮食引起了血液中总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的水平升高，而亚精胺处理可以显著的改善这个情况，并呈剂量相关性。

实施例5

1.葡萄糖耐量试验

亚精胺干预10周后对五组小鼠进行葡萄糖耐量试验：小鼠实验前一晚，更换垫料，禁食不禁水，16h后，次日上午称小鼠体重并进行小鼠葡萄糖耐量实验。首先，用剪刀剪去尾尖，轻拭去第一滴血，轻压尾巴出血，并用血糖仪测定基础血糖(0min)，随后，用1ml无菌注射器按照2g/Kg体重给小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，检测葡萄糖注射后的15min、30min、60min、90min和120min后尾静脉血的血糖值变化，记录绘制葡萄糖耐量曲线。

结果如图6所示：亚精胺处理显著改善了高脂饮食诱导的葡萄糖不耐受，并呈剂量相关性。

2.胰岛素耐量试验

喂食11周后对五组小鼠进行胰岛素耐量试验：基本操作与小鼠葡萄糖耐受实验类似，禁食不禁水，4h后，首先，用剪刀剪去尾尖，轻拭去第一滴血，轻压尾巴出血，并用血糖仪测定基础血糖(0min)，随后，用1ml无菌注射器按照0.5U/Kg体重给小鼠腹腔注射胰岛素溶液，检测胰岛素注射后的15min、30 min、60min、90min和120min后尾静脉血的血糖值变化，记录绘制胰岛素耐量曲线。

结果如图6所示亚精胺处理显著改善了高脂饮食诱导的胰岛素不耐受，并呈剂量相关性。

实施例6

1.各组小鼠的结肠组织病理学变化

解剖当天，取新鲜结肠组织，0.2cm长一小段，轻轻放入装有4％的福尔马林中浸泡，外送进行包埋以及苏木精-伊红染色法和AB-PAS染色，这种技术广泛用作粘蛋白的染色。

如图7所示，小鼠结肠炎症程度以及AB-PAS染色显示的小鼠黏膜粘液蛋白分泌情况比较发现，高脂小鼠的结肠中出现明显的炎性细胞浸润，且黏液蛋白分泌明显减少，但是外源性的亚精胺处理后，该情况明显改善，且炎性细胞的浸润明显减少，但仍高于正常饮食组，且黏液蛋白分泌有所增加在亚精胺处理小鼠中。

实施例7

小鼠的结肠长度比较

解剖当天，取小鼠结肠组织，轻放置直尺旁，量取长度，记录。如图8所示，较正常饮食组而言，高脂饮食组小鼠的结肠明显缩短，在亚精胺处理组中，结肠缩短幅度均有改善，且高剂量组的改善情况最明显。

实施例8

荧光标记的右旋糖苷检测通透性

饲养期间，通过荧光标记的右旋糖酐检测了小鼠肠道的通透性。小鼠禁食不禁水，4h后用荧光标记的右旋糖酐对小鼠进行灌胃，根据0.5mg/g体重计算具体灌注量，灌注浓度为50mg/mL。4小时后，小鼠尾静脉取血，立即离心(7000 rpm，7min)，收集血清。利用荧光酶标仪，在激发光490nm和探测光525nm 条件下检测荧光标记的右旋糖酐的含量。如图9所示，亚精胺干预明显减缓了由高脂饮食引发的肠道通透性的增加。

实施例9

检测小鼠血清的中的内毒素水平

采用酶联免疫试剂盒检测小鼠血清中的内毒素水平(严格按照试剂盒操作)。分别设标准品孔、待测样品孔。每孔分别加标准品或者待测样本100μL，轻轻晃动混匀，附上贴板，37℃温育2h。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μL，附上新的板贴，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和工作液100μL，附上新的板贴，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2min，200μL/孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30min。依序每孔加终止液50μL，终止反应。在反应终止内的5min 内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

由图6-10分析可得，亚精胺能够缓解由高脂饮食导致的结肠组织炎症以及黏膜分泌减少，且外源性的亚精胺处理缓解了肠道通透性的增加，从而降低了体内血清的内毒素水平。

综上，高脂膳食能诱导小鼠肥胖，外源性的亚精胺饮水干预能够改善高脂饮食诱导的肥胖，并明显改善肝脏中炎症以及脂质堆积现象，减小脂肪组织中脂肪细胞大小，此外，外源性的亚精胺摄入还改善了高脂饮食导致的肠道通透性增加现象。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容作任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.亚精胺在制备减肥药物中的应用。