CN110199942A - 一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法与应用。所述构建方法包括提取高表达感染患者血清，排除实验小鼠自发感染HBV，高压水动力尾静脉法将患者血清注入小鼠体内，分别于注射后7、15、30d经小鼠眼内眦静脉采血检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，判断阳性者为造模成功等步骤。本发明所提供的方法可以成功感染乳鼠，成功建模的乳鼠可持久在1个月内检测到HBV的表达，同时乳鼠不会引起体温升高、体质量改变，费用低廉，不存在伦理问题，可以此作为研究慢性HBV感染的动物模型，符合当前科研的需要。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型制备技术领域，具体地，涉及一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法与应用。
背景技术
乙型肝炎是危及全人类健康的疾病，可通过血液传播、医源性传播、母婴传播及性传播，续发为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭，甚至肝细胞癌。全球估计约20亿人曾感染HBV，其中约4亿人为慢性乙型肝炎感染者。干扰素α、核苷类似物是目前主要的抗病毒药物，在一定程度上抑制病毒复制，减轻肝细胞炎症、坏死程度，然而不能彻底清除体内共价闭环DNA(covalent-ly closed circular DNA,ccc DNA)，从而无法根治慢性乙型肝炎。因此如何彻底清除体内HBV仍是当今的研究热点。
建立HBV的动物模型有利于探究HBV的致病机理及制备相应的治疗药物。目前，HBV的动物模型主要为转基因小鼠模型、鸭乙型肝炎模型、树鼩动物模型及黑猩猩模型。HBV转基因小鼠广泛用于药物研究及基因治疗对HBV的复制干扰，甚至可用于研究ccc DNA的清除，然而其费用高，可重复性一般，且对于HBV生命周期研究尚未清楚；鸭乙型肝炎模型主要针对的是禽类嗜肝病毒，与人HBV在结构上有较大差别，不能很好再现人HBV感染过程；树鼩是近年来发现可以感染HBV的小型哺乳动物，现研究已成功通过接种感染者血清感染，使其体内复制HBV，但所用于研究的树鼩多为野生型，存在遗传背景不清楚、培养困难、表达HBV时间短及不稳定等缺点；黑猩猩是除人类外可感染HBV的灵长类动物，由于其价格昂贵、存在伦理问题，难以推广。故建立一种经济而有效的HBV的动物模型对于研究HBV的感染机制和治疗具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法，通过本发明方法成功建模的乳鼠可持久在1个月内检测到HBV的表达，同时乳鼠不会引起体温升高、体质量改变，费用低廉，不存在伦理问题，可以此作为研究慢性HBV感染的动物模型，符合当前科研的需要。
本发明的另一目的在于提供上述构建方法在乙肝病毒感染机制研究中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述构建方法在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述构建方法在抗肝炎药物评价中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
S1.提取高表达感染患者血清；
S2.排除实验小鼠自发感染HBV；
S3.高压水动力尾静脉法将患者血清注入小鼠体内，分别于注射后7、15、30d经小鼠眼内眦静脉采血检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，若为阳性者则判定造模成功。
通过本发明方法成功建模的乳鼠可持久在1个月内检测到HBV的表达，同时乳鼠不会引起体温升高、体质量改变，费用低廉，不存在伦理问题，可以此作为研究慢性HBV感染的动物模型，符合当前科研的需要。
优选地，步骤S1的具体操作是先提取高表达HBV感染患者血清，室温放置2h，离心分离得到血清，采用荧光定量PCR测定血清HBV DNA浓度，若血清HBV DNA浓度大于105拷贝/mL，则判定血清制备成功。
优选地，步骤S2的具体操作是接种前3d，经小鼠眼内眦静脉采血，应用ELISA检测HBs Ag、HBe Ag，若检测结果均为阴性，则判定排除自发感染HBV。
优选地，步骤S3的具体操作是采用高压水动力尾静脉法将患者血清按小鼠体质量(g)的0.8％注入，以PBS稀释，分别于注射后7、15、30d经小鼠眼内眦静脉采血，离心收集血清上清，检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，若为检测结果为阳性者则判定造模成功。
优选地，步骤S3中所述的离心条件为3000rpm离心5min。
本发明还请求保护上述构建方法在乙肝病毒感染机制研究中的应用。
本发明还请求保护上述构建方法在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。
本发明还请求保护上述构建方法在抗肝炎药物评价中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的方法可以成功感染乳鼠，成功建模的乳鼠可持久在1个月内检测到HBV的表达(由于研究经费及精力问题，只观察到1个月内)，同时乳鼠不会引起体温升高、体质量改变，费用低廉，不存在伦理问题，可以此作为研究慢性HBV感染的动物模型，符合当前科研的需要。
附图说明
图1为乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法流程图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、主要试剂和仪器
乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒、乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自深圳华康生物医学有限公司；
乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司；
荧光定量PCR仪购自中国测试技术研究所广州分院。
2、实验动物
实验用Babl/c乳鼠20只，13日龄，体质量10～15g，SPF级购自广东省动物实验中心，购回后饲养于广州军区广州总医动物实验中心，恒温、恒湿条件下自由摄取食水，饲养3d后开始实验。
凡涉及动物的实验均严格遵循动物保护法进行。
实施例1
一、一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法
如图1所示，具体包括如下步骤：
1、提取高表达HBV感染患者血清(HBsAg、HBeAg阳性HBV DNA浓度大于105拷贝/mL)，室温放置2h，离心分离得到血清，采用荧光定量PCR测定血清HBV DNA浓度，保存于-80℃冰箱备用。
取HBV感染者血清5支复融混匀，实时荧光定量PCR测得HBV DNA浓度为3.05×106拷贝/mL。
2、接种前3d，经小鼠眼内眦静脉采血，应用ELISA检测HBs Ag、HBe Ag，以排除自发感染HBV。
3、将20只乳鼠随机分为4组，接种HBV血清组为实验组，共8只；接种正常人血清组为对照组，共4只；接种PBS组为PBS组，共4只；无处理组为空白组，共4只。采用高压水动力尾静脉法将患者血清按小鼠体质量(g)的0.8％注入，以PBS稀释(约0.5mL)，采用1mL注射针头，10～15s注射完成。分别于注射后7、15、30d，经眼内眦静脉采血，每次采血约为0.5mL，于3000rpm离心5min，收集上层血清，所得血清用于检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，其中阳性者为造模成功。
其中，ELISA检测HBs Ag、HBe Ag按试剂说明书操作；实时荧光定量PCR检测HBVDNA浓度按试剂说明书操作；且每隔3d称体质量一次，注射前及注射后1min测小鼠体温。
二、试验结果
1、所有实验动物均无自发感染
接种前3d，采集20只乳鼠血清行ELISA检测HBs Ag、HBe Ag均为阴性，说明实验动物无自发HBV感染。
2、接种后各组小鼠体温及体质量均无明显变化
各组小鼠注射前体温为36.3～37℃，经高压水动力尾静脉注射后1min，测体温均为36.5～37.3℃，故注射前后体温无明显变化。注射后实验组与其余各组体质量称量均无明显差异。
3、Babl/c乳鼠可感染HBV
注射后于不同时间点采集小鼠血清进行ELISA检测HBs Ag、HBe Ag，实时荧光定量PCR检测HBV DNA浓度。
结果如表1所示，实验组在7、15、30d检测到HBs Ag阳性共4只，HBe Ag均为阴性，HBV DNA均低于500拷贝/mL。对照组、PBS组及空白组在各个时间点检测HBs Ag、HBe Ag均为阴性。
表1 ELISA检测各样本HBsAg的OD值
综上，通过本发明方法构建的乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型，成功建模的乳鼠可持久在1个月内检测到HBV的表达(由于研究经费及精力问题，只观察到1个月内)，同时乳鼠不会引起体温升高、体质量改变，费用低廉，不存在伦理问题，可以此作为研究慢性HBV感染的动物模型，符合当前科研的需要。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种乙型肝炎病毒感染的乳鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取高表达感染患者血清；
S2.排除实验小鼠自发感染HBV；
S3.高压水动力尾静脉法将患者血清注入小鼠体内，分别于注射后7、15、30d经小鼠眼内眦静脉采血检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，若为阳性者则判定造模成功。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S1的具体操作是先提取高表达HBV感染患者血清，室温放置2h，离心分离得到血清，采用荧光定量PCR测定血清HBV DNA浓度，若血清HBV DNA浓度大于105拷贝/mL，则判定血清制备成功。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S2的具体操作是接种前3d，经小鼠眼内眦静脉采血，应用ELISA检测HBs Ag、HBe Ag，若检测结果均为阴性，则判定排除自发感染HBV。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤S3的具体操作是采用高压水动力尾静脉法将患者血清按小鼠体质量(g)的0.8％注入，以PBS稀释，分别于注射后7、15、30d经小鼠眼内眦静脉采血，离心收集血清上清，检测HBs Ag、HBe Ag及HBV DNA浓度，若为检测结果为阳性者则判定造模成功。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤S3中所述的离心条件为3000rpm离心5min。
6.权利要求1至5任一项所述构建方法在乙肝病毒感染机制研究中的应用。
7.权利要求1至5任一项所述构建方法在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。
8.权利要求1至5任一项所述构建方法在抗肝炎药物评价中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057754A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-24 | 四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所 | 鉴定适用于hbv研究的动物模型的方法和应用 |
| CN111057754B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-01-12 | 四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所 | 鉴定适用于hbv研究的动物模型的方法和应用 |
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