CN109082440A - 一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。本发明通过将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。该外源蛋白体内快速积累模型能用于评估外源蛋白体内风险。本发明具有如下优点：在3个月内完成构建，可通过调整注射频率和注射剂量实现对体内外源蛋白剂量的调控；可同时构建多种待评估的外源重组载体，高通量评估；可放大外源蛋白暴露浓度，缩短评估周期。

Description

一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。
背景技术
对于转基因蛋白的长期累积的毒理性研究，常规的口服途径方法耗时长,成本高。“放大”肝组织内转基因成分浓度的方法可以成为口服给药毒理性研究的一种补充途径。
通常情况下，转基因蛋白在植物细胞的保护下进入肠胃道后的命运推测为两种，即一部分转基因蛋白在坚硬的植物细胞壁的保护下抵制胃酸、胰蛋白酶等消化酶的作用进入肠组织(谢雯琦，马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100)。进入肠胃组织的转基因蛋白首先会通过门静脉进入肝脏，其中大部分接受肝组织内代谢酶的生物转化，随后代谢物通过血液进入体循环如被输送至心脏等器官，少量转基因蛋白原型仍保留在肝中(刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。另一部分转基因蛋白在肠道释放后虽未被代谢，但会被水解酶降解为多肽易被小肠绒毛组织吸收，并通过跨细胞作用进入皮下组织进而进入体循环(Ledley F D.Somatic gene therapy in gastroenterology:approaches andapplications.Journal of pediatric gastroenterology and nutrition.1992，14:328～337；ChangA G and Wu G Y.Gene therapy:applications to the treatment ofgastrointestinal and liver diseases.Gastroenterology.1994,106：1076～1084)，或被小肠中M细胞胞吞、内化和胞饮等转运到上皮细胞下的淋巴组织，进而诱导免疫应答(谢雯琦,马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100；刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。结合目前研究转基因植物的安全性评估结果可以验证上述推测，即肝脏组织中负责肝细胞代谢、应激反应和线粒体代谢的蛋白表达降低，这一结果(Malatesta M et al.Finestructural analyses of pancreatic acinar cell nuclei from mice fed ongenetically modified soybean.European Journal of Histochemistry.2003,47(4):385～388)提示，一部分转基因蛋白的肝代谢作物明显，随后，转化后的代谢物进入体循环后被输送至各组织而引起潜在的心脏疾病(Tudisco R,et al.Fate of transgenic DNAand evaluation of metabolic effects in goats fed genetically modified soybeanand in their offsprings.Animal.2010，4(10):1662～1671)，另一部分通过小肠吸收后进入体循环而引起淋巴器官的异常(Séralini G E，et al.Long-term toxicity of aRoundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modifiedmaize.Environmental Sciences Europe.2014，26：14)，最终，转基因蛋白的代谢物经肾脏排泄，从而又表现出对肾肿瘤形成的潜在影响。
通过尾静脉注射质粒可实现外源基因在肝组织内的积累表达(Katsimpoulas M，et al.Animal models for hydrodynamic gene delivery.Chemical Biology.2012，Chapter 12：236～250；CrespoA，et al.Hydrodynamic liver gene transfer mechanisminvolves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocyticvesicles.Gene Therapy.2005，12(11)：927～935；Nakamura S，et al.Improvement ofhydrodynamics-based gene transfer of nonviral DNA targeted to murinehepatocytes.BioMed Research International.2013:928790；Oliveira N A，etal.Long-term human growth hormone expression and partial phenotypiccorrection by plasmid-based gene therapy in an animal model of isolatedgrowth hormone deficiency.The Journal of Gene Medicine.2010，12(7):580～585；陈有尧和黄雪玲.大鼠尾静脉注射法.南方医科大学学报.2009，29(6)：1312)。此时，肝组织内转基因蛋白的去路推测如下，即一部分转基因蛋白在肝代谢酶作用下转化为代谢物并进入体循环，从而影响其它器官如心脏等；另一部分重组蛋白会以原型形式保留于肝组织内并被释放至血液中(刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)，引起相应的免疫应答。最终，转基因蛋白及代谢物经肾排泄。
但是，已有的研究并没有规律性而言，从而，人们无法判断外源蛋白在体内的风险。因此，急需一种科学的，能有效对外源蛋白在体内风险的评估方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的外源蛋白体内快速积累模型。
本发明的再一目的在于提供上述外源蛋白体内快速积累模型的应用。
本发明的又一目的在于提供一种外源蛋白体内风险的评估方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；
(2)分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。
所述的啮齿类动物包括大鼠和小鼠。
所述的大鼠优选为Wistar大鼠。
所述的小鼠优选为昆明小鼠、Balb/C小鼠或Swiss小鼠。
所述的表达载体优选为pUBC载体。
所述的pUBC载体优选为通过如下步骤制备得到：通过引物Ubc-F和Ubc-R对含有如SEQ ID NO.3所示的UBC序列的模板进行扩增，使用NruI和NheI酶切后，再克隆入经NruI和NheI酶切的pSecTag2A载体中，得到pUBC载体；
引物F：5’-CCAAGCTTCTGCACGGCGCTTC-3’；
引物R：5’-GGTCTAGAGGCAGCCTTGGTGTCG-3’。
所述的外源蛋白指的是原先在食物中不存在、由于转基因农产品转基因带入食物中的外源蛋白，包括5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)和来源于苏云金芽孢杆菌所产的内源性晶体蛋白Cry1Ab；优选为CP4-EPSPS。
所述的外源蛋白表达基因可通过常规技术获得，如化学合成以及PCR扩增得到。
所述的重组载体优选为去除内毒素后的裸质粒溶液。
所述的重组载体的注射剂量优选为按照小鼠体重20mg/kg注射重组载体。
所述的重组载体的注射体积优选为不超过1ml。
一种外源蛋白体内快速积累模型，通过上述制备方法得到。
上述外源蛋白体内快速积累模型在外源蛋白体内风险评估中的应用。
一种外源蛋白体内风险的评估方法，包括如下步骤：
(A)日常观察啮齿类动物的健康状态；
(B)在制备上述外源蛋白体内快速积累模型的同时制备空白对照组和阴性对照组，空白对照组为注射生理盐水，阴性对照组为注射表达载体；在100天末处理啮齿类动物，取肝组织器官，石蜡切片；
(C)病理切片分析肝组织的炎症反应情况；
(D)依据炎症反应情况，判断该外源蛋白的安全性；
(E)代谢组技术分析血浆代谢物组成，通过分析差异性代谢物种类，判断潜在风险。
所述的健康状态包括饮食，精神状态以及有无发病。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发明人在前期的研究中发现，尾静脉注射方式较口服喂食方法更能快速放大转基因蛋白在靶组织肝中的积累效应，从而便于研究者在短时间内研究转基因蛋白因大量积累对肝组织造成的非预期效应。本发明能在短时内实现外源蛋白在动物体内的快速累积：获得动物体内的外源蛋白长期积累模型的常规方法至少需要进行为期1年以上构建，相比于常规方法，本方法可在短短3个月内完成构建。并且还可通过调整注射频率和注射剂量实现对体内外源蛋白剂量的调控。
(2)本发明能实现高通量评价：可同时构建多种待评估的外源重组载体，例如构建CP4-EPSPS基因及其衍生物等动物体内的长期表达载体，评价抗除草剂蛋白的潜在风险，如构建Cry1Ab重组载体，评价Bt蛋白的潜在风险。
(1)本发明可放大外源蛋白暴露浓度，缩短评估周期：例如目前研究将评估时间延长至2年，但在2年期间不论是对照组还是实验组均出现大量动物的生理性死亡，导致动物数量缺乏统计学意义，并且实验代谢数据差异小，又不能结合动物的组织器官切片结果分析死因，最终导致评价结果无意义。相比之下，采用本发明构建的重组载体，通过控制质粒注射的次数和浓度，实现外源蛋白的暴露浓度放大，在缩短动物的喂养时间的基础上，同时快速放大代谢差异。即通过放大外源蛋白的暴露剂量，放大风险效应，有助于明确非预期危害，从而有利于进行针对性的预防。
附图说明
图1是cp4-epsps的PCR扩增图；其中特异性条件大小为1362bp。
图2是pUBC-EPSPS载体的酶切鉴定图；重组载体经双酶切后产生两条带，其中之一为载体部分约5800bp，另一条为目的基因条带，大小为1362bp。
图3是小鼠肝组织免疫组化结果图；其中空白对照(生理盐水)和阴性对照(pUBC)中未见EPSPS物质，而实验组pUBC-EPSPS有明显EPSPS蛋白的免疫反应；n＝3，放大倍数400×。
图4是小鼠肝组织病理分析结果图；其中，空白对照组和pUBC肝组织病理分析均显示结构正常，肝细胞排列整齐，形态正常，无明显病变；pUBC-EPSPS肝组织病理分析显示肝组织血管周围可见少量炎性细胞灶性浸润，以中性粒细胞为主，如黑色箭头所示；n＝3，放大倍数400×。
图5是阴性对照pUBC的TIC图；其中，图A为正离子模式下的TIC图，图B为负离子模式下的TIC图。
图6是实验组PEB的TIC图；其中，图A为正离子模式下的TIC图，图B为负离子模式下的TIC图。
图7是正、负离子模式OPLS-DA得分图；其中，图(A)是正离子模式OPLS-DA得分图，图(B)是负离子模式OPLS-DA得分图；正、负离子模式数据建立的OPLS-DA模型，R2、Q2＞0.5，模型稳定可靠。
图8是正、负离子模式OPLS-DA置换检验图；其中，图(A)是正离子模式OPLS-DA置换检验图，图(B)是负离子模式OPLS-DA置换检验图；本实验正、负离子模式数据建立的OPLS-DA模型未发生过拟合。
图9是正、负离子模式的火山图；其中为FC>2.0且P value<0.05的代谢物，即单变量统计分析筛选的差异代谢物。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、Cp4-epsps基因的优化合成
根据Genebank KP212901.1序列、宿主细胞动物细胞的偏好性，GC含量酶切位点HindIII和XbaI，优化合成新的cp4-epsps基因，使之适合动物细胞表达系统。基因合成公司提供含cp4-epsps基因的质粒pUC57-EPSPS。
相应的优化后基因序列如下：
CTGCACGGCGCTTCCTCCAGACCTGCCACAGCCAGGAAAAGCAGCGGCCTGAGCGGAACCGTGAGGATCCCTGGCGACAAGTCCATCTCCCACAGGTCCTTCATGTTCGGCGGCCTGGCCAGCGGAGAGACCAGAATTACCGGCCTGCTGGAAGGAGAGGACGTGATCAATACCGGCAAAGCTATGCAAGCTATGGGCGCCAGAATCAGAAAGGAGGGCGACACCTGGATCATCGATGGAGTGGGCAATGGCGGACTGCTCGCCCCTGAAGCCCCTCTGGACTTTGGCAACGCCGCCACAGGCTGTAGGCTGACAATGGGACTGGTGGGCGTGTACGATTTCGACAGCACCTTCATCGGAGATGCTTCCCTCACCAAGAGACCTATGGGCAGGGTGCTCAACCCCCTGAGGGAGATGGGCGTCCAAGTGAAGAGCGAGGACGGCGACAGACTGCCTGTGACCCTGAGAGGCCCCAAGACCCCCACCCCTATCACCTACAGAGTGCCCATGGCCAGCGCCCAGGTGAAAAGCGCTGTGCTGCTGGCTGGACTGAACACACCCGGCATCACCACCGTGATCGAGCCCATCATGACCTGCGACCACACAGAGAAGATGCTGCAGGGCTTCGGCGCTAACCTGACCGTGGAGACCGACGCTGACGGAGTGAGGACAATCAGGCTGGAAGGAAGGGGCAAACTGACAGGCCAGGTGATTGATGTGCCCGGCGATCCTTCCAGCACAGCCTTTCCTCTCGTCGCTGCTCTCCTGGTGCCCGGATCCGACGTCACAATCCTGAACGTGCTGATGAACCCCACAAGAACCGGCCTCATCCTGACCCTGCAGGAGATGGGCGCCGACATCGAGGTGATCAACCTGAGGCTGGCCGGAGGAGAAGACGTGGCCGACCTGAGAGTGAGATCCAGCACACTGAAGGGAGTGACAGTGCCCGAGGATAGAGCCCCTCCCATGATCGATGAGTACCCCATCCTGGCCGTCGCCGCTGCTTTTGCCGAGGGAGCTACCGTGATGAACGGACTGGAAGAGCTGAGGGTCAAGGAAAGCGATAGACTGTCCGCCGTGGCCAATGGCCTGAAGCTGAACGGCGTGGACTGCGATGAGGGCGAAACAAGCCTCGTCGTGAGAGGAAGGCCCGACGGCAAGGGACTGGGCAACGCTAGCGGAGCTGCCGTGGCTACCCATCTGGACCACAGAATCGCTATGAGCTTCCTGGTGATGGGACTCGTGAGCGAAAACCCTGTGACCGTGGACGACGCCACAATGATCGCCACATCCTTCCCCGAGTTCATGGACCTCATGGCCGGCCTCGGCGCCAAAATCGAGCTGAGCGACACCAAGGCTGCC。
相应的氨基酸序列为：
LHGASSRPATARKSSGLSGTVRIPGDKSISHRSFMFGGLASGETRITGLLEGEDVINTGKAMQAMGARIRKEGDTWIIDGVGNGGLLAPEAPLDFGNAATGCRLTMGLVGVYDFDSTFIGDASLTKRPMGRVLNPLREMGVQVKSEDGDRLPVTLRGPKTPTPITYRVPMASAQVKSAVLLAGLNTPGITTVIEPIMTCDHTEKMLQGFGANLTVETDADGVRTIRLEGRGKLTGQVIDVPGDPSSTAFPLVAALLVPGSDVTILNVLMNPTRTGLILTLQEMGADIEVINLRLAGGEDVADLRVRSSTLKGVTVPEDRAPPMIDEYPILAVAAAFAEGATVMNGLEELRVKESDRLSAVANGLKLNGVDCDEGETSLVVRGRPDGKGLGNASGAAVATHLDHRIAMSFLVMGLVSENPVTVDDATMIATSFPEFMDLMAGLGAKIELSDTKAA。
2、Cp4-epsps目的基因的扩增
采用PrimeSTAR HS高保真聚合酶(宝生物，R010Q)扩增目的基因，反应体系为：pUC57-EPSPS质粒(250ng/ml)1μl，5×Buffer(Mg2+)10μl，dNTP混合液(各2.5mM)4μl，上下游引物(分别为引物F和引物R)(20pmol/μl)各0.5μl，DNA聚合酶0.5μl。反应条件为94℃5min；98℃10s、55℃10s、72℃1min，30个循环；72℃5min。凝胶电泳结果如图1所示。
引物F：5’-CCAAGCTTCTGCACGGCGCTTC-3’；
引物R：5’-GGTCTAGAGGCAGCCTTGGTGTCG-3’。
3、pUBC重组载体的构建
质粒pSecTag2A(Invitrogen)先采用NruI单酶切，反应体系为：pSecTag2A质粒(200ng/μl)5μl、10×Basal Buffer 5μl、0.1％BSA 5μl、Nru I(10U/μl)1μl、ddH2O 34μl。37℃水浴4h后，酶切产物使用TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification KitVer.3.0进行纯化片段，纯化片段再使用NheI酶切，反应体系为：纯化片段44μl、10×MBuffer 5μl、Nhe I(10U/μl)1μl，37℃水浴4h。再纯化，得到酶切后的pSec载体。
UBC启动子基因扩增，反应体系为：通过基因合成公司合成UBC启动子序列(如下所示)，构建为重组载体pUC57-UBC(由GENEWIZ公司合成)，配制该质粒浓度为200pmol/L 1μl，引物Ubc-F和Ubc-R各0.5μl，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μl，5×Prime STAR Buffer(Mg2+Plus)10μl，Prime STAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，ddH2O 33.5μl。反应条件30循环：98℃10s，55℃10s，72℃1.5min。扩增UBC片段为1.5kb，UBC片段分别使用NruI和NheI单酶切，酶切反应条件同pSecTag2A载体酶切。
经酶切后的pSec载体与UBC片段进行连接，连接反应：UBC片段(100ng/μl)1μl，pSec载体片段(约100ng/μl)1μl，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μl，ddH2O 6μl，50℃水浴15min。将连接产物热转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选菌落，经双酶切验证和测序验证后，从阳性菌株中提取出质粒pUBC载体。
UBC序列：
TCGCGATCTGCCGAGTCATTGTCCTTGTCCCGCGGCCCCGGGAGCCCCCCGCGACCGGCCTGGGAGGCTCAGGGAGGTTGAAGGGGGCTGAGCAAAGGAAGCCCCGTCATTACCTCAAATGTGACCCAAAAATAAAGACCCGTCCATCTCGCAGGGTGGGCCAGGGCGGGTCAGGAGGGAGGGGAGGGAGACCCCGACTCTGCAGAAGGCGCTCGCTGCGTGCCCCACGTCCGCCGAACGCGGGGTTCGCGACCCGAGGGGACCGCGGGGGCTGAGGGGAGGGGCCGCGGAGCCGCGGCTAAGGAACGCGGGCCGCCCACCCGCTCCGGGTGCAGCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGACGGCTAGC。
Ubc-F：5’-TTTTGCGCTGCTTCGCGATCTGCCGAGTCAT TGTCC-3’；
Ubc-R：5’-CTCCATGGTGGCTA GCCGTCTAACAAAAAAGCCA AAAACGGC–3’。
5、pUBC-EPSPS重组载体构建及鉴定
pUBC质粒(250ng/ml)采用HindIII和XbaI酶切位点，37℃反应2h，酶切并纯化，总反应体系100μl为：质粒25μl、HindIII和XbaI各5μl，10×Buffer 10μl，ddH2O 55μl。PCR产物酶切反应2h，反应体系100μl：产物20μl、HindIII和XbaI各5μl、10×Buffer 10μl，ddH2O60μl。
连接：上述pUBC质粒和目的基因经HindIII和XbaI双酶切后，进行连接，反应体系为10μl：pUBC(50ng/μl)1μl，目的基因(约80ng/μl)2μl，NEB buffer 2.1 1μl，加dH2O至10μl。T4连接酶16℃连接反应过夜，随后取1μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抗氨苄青霉素筛选的阳性克隆提取重组质粒，进一步鉴定正确性。pUBC-epsps重组载体经HindIII和XbaI双酶切鉴定及测序鉴定确定epsps基因的正确性。50μl双酶切反应体系(ddH2O 35μl、10×Quickcut buffer 5μl、XbaI 1μl、HindIII 1μl、pUBC-EPSPS载体8μl)，37℃反应20min。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。
去内毒素质粒提取：培养100ml含pUBC-EPSPS载体的DH5α菌株至OD600至1.1，根据无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN,DP117)说明书操作提取去内毒素质粒，并调整浓度为200ng/μl。同时提取无内毒素的pUBC质粒。
6、小鼠尾静脉注射重组载体pUBC-EPSPS
昆明小鼠(购于南方医科大学动物实验中心)均为18g-22g，雄性，共45只，所有小鼠进入无菌动物实验室后，每组正常饲养3天，以适应饲养环境。之后采取尾静脉注射方式，按照小鼠体重20mg/kg注射目标质粒，每只小鼠注射量约1mL质粒溶液或生理盐水。分为三组，组A注射pUBC-EPSPS为实验组，组B注射生理盐水为空白组，组C注射空载体pUBC为阴性对照。
7、小鼠血液及器官组织样品收集
分别于0d、15d、30d、60d、90d注射质粒载体，分别于0d、15d、30d、60d、98d，从每只小鼠眶静脉窦处采血约0.3ml，置于1.5mL离心管，4℃静置过夜待血清和血红细胞明显分层后，3000rpm离心5min，-20℃保存用于ELISA检测。
于100d时处死所有小鼠，先股动脉取血，血液直接采集至抗凝管(推荐采用肝素抗凝剂)，室温静止30分钟，1300g-2000g离心10min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。
解剖取肝、脾等器官浸泡于10％vol的福尔马林溶液常温保存24h后用于石蜡切片。
8、肝组织的免疫组化
脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min–二甲苯Ⅱ15min–无水乙醇Ⅰ5min–无水乙醇Ⅱ5min–85％酒精5min–75％酒精5min–蒸馏水洗脱蜡。
抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(0.01M、pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液(30％双氧水：纯水＝体积比1:9混合得到)，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(0.01M、pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
BSA或者血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用浓度为质量百分比3％的BSA室温封闭30min。
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按1:500比例稀释好的一抗(抗CP4-EPSPS单克隆抗体购自Fitzgerald,货号10R-10541)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。
加二抗：玻片置于PBS(0.01M、pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗Rabbit anti-mouse IgG-HRP(购自SantaCruz)(1:5000)覆盖组织，室温孵育50min。
DAB显色：玻片置于PBS(0.01M、pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
脱水封片：将切片依次放入75％酒精6min–85％酒精6min–无水乙醇Ⅰ6min–无水乙醇Ⅱ6min–二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
显微镜镜检，图像采集分析，结果见图3。
9、肝组织的病理切片分析
固定：新鲜组织固定于4％vol多聚甲醛24h以上。
脱水：将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
显微镜镜检，图像采集分析。
染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色，结果见图4。
10、血浆中差异代谢物分析
(1)样品信息：
a.待测样本信息：共2组样本，每组10份生物学重复样本(样本具体信息见表1)。
b.质控样本(QC)的制备：样品等量混合用于制备QC样本。QC样本用于测定进样前仪器状态及平衡色谱-质谱系统，并用于评价整个实验过程中系统稳定性。
表1样品信息
(2)样本预处理方法
取样本在4℃环境下缓慢解冻后，加入1mL预冷甲醇/乙腈/水溶液(2:2:1，v/v)，涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min，14000g 4℃离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液进样分析。
(3)色谱-质谱分析
a.色谱条件:样品采用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.3mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0—1min，85％B；1—12min，B从85％线性变化至65％；12—12.1min，B从65％线性变化至40％；12.1—15min，B维持在40％；15—15.1min，B从40％线性变化至85％；15.1—20min，B维持在85％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
b.Q-TOF质谱条件:分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品经UHPLC分离后用Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析。
HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas1)：60，Ion SourceGas2(Gas2)：60，Curtain gas(CUR)：30，source temperature：600℃，IonSapary VoltageFloating(ISVF)±5500V(正负两种模式)；TOF MS scan m/z range：60-1000Da，production scan m/z range：25-1000Da，TOF MS scan accumulation time 0.20s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05s/spectra；二级质谱采用informationdependent acquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declusteringpotential(DP)：±60V(正负两种模式)，Collision Energy：35±15eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4Da，Candidate ions to monitor per cycle：6。结果见图5和图6。
(4)数据处理
原始数据经ProteoWizard转换成.mzML格式，然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。
对XCMS提取得到的数据，删除组内缺失值>50％的离子峰。应用软件SIMCA-P 14.1(Umetrics，Umea，Sweden)进行模式识别，数据经Pareto-scaling预处理后，进行多维统计的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，结果见图7和图8。单维统计分析包括Student’st-test和变异倍数分析，R软件绘制火山图，结果见图9。具体的差异代谢物见表2和表3。
表2正离子模式差异代谢物列表
表3负离子模式差异代谢物列表
综合上述列表发现，可引起安全风险的代谢物质有吡哆酸，胆酸，甘氨胆酸和吲哚乙酸，提示通过上述方法，最终发现四种代谢物质可以作为代谢风险评估的标志物加以监控。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cp4-epsps基因
<400> 1
ctgcacggcg cttcctccag acctgccaca gccaggaaaa gcagcggcct gagcggaacc 60
gtgaggatcc ctggcgacaa gtccatctcc cacaggtcct tcatgttcgg cggcctggcc 120
agcggagaga ccagaattac cggcctgctg gaaggagagg acgtgatcaa taccggcaaa 180
gctatgcaag ctatgggcgc cagaatcaga aaggagggcg acacctggat catcgatgga 240
gtgggcaatg gcggactgct cgcccctgaa gcccctctgg actttggcaa cgccgccaca 300
ggctgtaggc tgacaatggg actggtgggc gtgtacgatt tcgacagcac cttcatcgga 360
gatgcttccc tcaccaagag acctatgggc agggtgctca accccctgag ggagatgggc 420
gtccaagtga agagcgagga cggcgacaga ctgcctgtga ccctgagagg ccccaagacc 480
cccaccccta tcacctacag agtgcccatg gccagcgccc aggtgaaaag cgctgtgctg 540
ctggctggac tgaacacacc cggcatcacc accgtgatcg agcccatcat gacctgcgac 600
cacacagaga agatgctgca gggcttcggc gctaacctga ccgtggagac cgacgctgac 660
ggagtgagga caatcaggct ggaaggaagg ggcaaactga caggccaggt gattgatgtg 720
cccggcgatc cttccagcac agcctttcct ctcgtcgctg ctctcctggt gcccggatcc 780
gacgtcacaa tcctgaacgt gctgatgaac cccacaagaa ccggcctcat cctgaccctg 840
caggagatgg gcgccgacat cgaggtgatc aacctgaggc tggccggagg agaagacgtg 900
gccgacctga gagtgagatc cagcacactg aagggagtga cagtgcccga ggatagagcc 960
cctcccatga tcgatgagta ccccatcctg gccgtcgccg ctgcttttgc cgagggagct 1020
accgtgatga acggactgga agagctgagg gtcaaggaaa gcgatagact gtccgccgtg 1080
gccaatggcc tgaagctgaa cggcgtggac tgcgatgagg gcgaaacaag cctcgtcgtg 1140
agaggaaggc ccgacggcaa gggactgggc aacgctagcg gagctgccgt ggctacccat 1200
ctggaccaca gaatcgctat gagcttcctg gtgatgggac tcgtgagcga aaaccctgtg 1260
accgtggacg acgccacaat gatcgccaca tccttccccg agttcatgga cctcatggcc 1320
ggcctcggcg ccaaaatcga gctgagcgac accaaggctg cc 1362
<210> 2
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cp4-epsps氨基酸序列
<400> 2
Leu His Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ala Thr Ala Arg Lys Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Ser Gly Thr Val Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg
20 25 30
Ser Phe Met Phe Gly Gly Leu Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr Gly
35 40 45
Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile Asn Thr Gly Lys Ala Met Gln Ala
50 55 60
Met Gly Ala Arg Ile Arg Lys Glu Gly Asp Thr Trp Ile Ile Asp Gly
65 70 75 80
Val Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ala Pro Glu Ala Pro Leu Asp Phe Gly
85 90 95
Asn Ala Ala Thr Gly Cys Arg Leu Thr Met Gly Leu Val Gly Val Tyr
100 105 110
Asp Phe Asp Ser Thr Phe Ile Gly Asp Ala Ser Leu Thr Lys Arg Pro
115 120 125
Met Gly Arg Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Val Lys
130 135 140
Ser Glu Asp Gly Asp Arg Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Pro Lys Thr
145 150 155 160
Pro Thr Pro Ile Thr Tyr Arg Val Pro Met Ala Ser Ala Gln Val Lys
165 170 175
Ser Ala Val Leu Leu Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Ile Thr Thr Val
180 185 190
Ile Glu Pro Ile Met Thr Cys Asp His Thr Glu Lys Met Leu Gln Gly
195 200 205
Phe Gly Ala Asn Leu Thr Val Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Arg Thr
210 215 220
Ile Arg Leu Glu Gly Arg Gly Lys Leu Thr Gly Gln Val Ile Asp Val
225 230 235 240
Pro Gly Asp Pro Ser Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu
245 250 255
Val Pro Gly Ser Asp Val Thr Ile Leu Asn Val Leu Met Asn Pro Thr
260 265 270
Arg Thr Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Glu Met Gly Ala Asp Ile Glu
275 280 285
Val Ile Asn Leu Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Asp Leu Arg
290 295 300
Val Arg Ser Ser Thr Leu Lys Gly Val Thr Val Pro Glu Asp Arg Ala
305 310 315 320
Pro Pro Met Ile Asp Glu Tyr Pro Ile Leu Ala Val Ala Ala Ala Phe
325 330 335
Ala Glu Gly Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Glu Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Glu Ser Asp Arg Leu Ser Ala Val Ala Asn Gly Leu Lys Leu Asn Gly
355 360 365
Val Asp Cys Asp Glu Gly Glu Thr Ser Leu Val Val Arg Gly Arg Pro
370 375 380
Asp Gly Lys Gly Leu Gly Asn Ala Ser Gly Ala Ala Val Ala Thr His
385 390 395 400
Leu Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Leu Val Met Gly Leu Val Ser
405 410 415
Glu Asn Pro Val Thr Val Asp Asp Ala Thr Met Ile Ala Thr Ser Phe
420 425 430
Pro Glu Phe Met Asp Leu Met Ala Gly Leu Gly Ala Lys Ile Glu Leu
435 440 445
Ser Asp Thr Lys Ala Ala
450
<210> 3
<211> 1555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> UBC核苷酸序列
<400> 3
tcgcgatctg ccgagtcatt gtccttgtcc cgcggccccg ggagcccccc gcgaccggcc 60
tgggaggctc agggaggttg aagggggctg agcaaaggaa gccccgtcat tacctcaaat 120
gtgacccaaa aataaagacc cgtccatctc gcagggtggg ccagggcggg tcaggaggga 180
ggggagggag accccgactc tgcagaaggc gctcgctgcg tgccccacgt ccgccgaacg 240
cggggttcgc gacccgaggg gaccgcgggg gctgagggga ggggccgcgg agccgcggct 300
aaggaacgcg ggccgcccac ccgctccggg tgcagcggcc tccgcgccgg gttttggcgc 360
ctcccgcggg cgcccccctc ctcacggcga gcgctgccac gtcagacgaa gggcgcagcg 420
agcgtcctga tccttccgcc cggacgctca ggacagcggc ccgctgctca taagactcgg 480
ccttagaacc ccagtatcag cagaaggaca ttttaggacg ggacttgggt gactctaggg 540
cactggtttt ctttccagag agcggaacag gcgaggaaaa gtagtccctt ctcggcgatt 600
ctgcggaggg atctccgtgg ggcggtgaac gccgatgatt atataaggac gcgccgggtg 660
tggcacagct agttccgtcg cagccgggat ttgggtcgcg gttcttgttt gtggatcgct 720
gtgatcgtca cttggtgagt agcgggctgc tgggctggcc ggggctttcg tggccgccgg 780
gccgctcggt gggacggaag cgtgtggaga gaccgccaag ggctgtagtc tgggtccgcg 840
agcaaggttg ccctgaactg ggggttgggg ggagcgcagc aaaatggcgg ctgttcccga 900
gtcttgaatg gaagacgctt gtgaggcggg ctgtgaggtc gttgaaacaa ggtggggggc 960
atggtgggcg gcaagaaccc aaggtcttga ggccttcgct aatgcgggaa agctcttatt 1020
cgggtgagat gggctggggc accatctggg gaccctgacg tgaagtttgt cactgactgg 1080
agaactcggt ttgtcgtctg ttgcgggggc ggcagttatg gcggtgccgt tgggcagtgc 1140
acccgtacct ttgggagcgc gcgccctcgt cgtgtcgtga cgtcacccgt tctgttggct 1200
tataatgcag ggtggggcca cctgccggta ggtgtgcggt aggcttttct ccgtcgcagg 1260
acgcagggtt cgggcctagg gtaggctctc ctgaatcgac aggcgccgga cctctggtga 1320
ggggagggat aagtgaggcg tcagtttctt tggtcggttt tatgtaccta tcttcttaag 1380
tagctgaagc tccggttttg aactatgcgc tcggggttgg cgagtgtgtt ttgtgaagtt 1440
ttttaggcac cttttgaaat gtaatcattt gggtcaatat gtaattttca gtgttagact 1500
agtaaattgt ccgctaaatt ctggccgttt ttggcttttt tgttagacgg ctagc 1555
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物F
<400> 4
ccaagcttct gcacggcgct tc 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物R
<400> 5
ggtctagagg cagccttggt gtcg 24
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Ubc-F
<400> 6
ttttgcgctg cttcgcgatc tgccgagtca ttgtcc 36
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Ubc-R
<400> 7
ctccatggtg gctagccgtc taacaaaaaa gccaaaaacg gc 42

Claims (9)

1.一种外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；
(2)分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。
2.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的啮齿类动物包括大鼠和小鼠。
3.根据权利要求2所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：
所述的大鼠为Wistar大鼠；
所述的小鼠为昆明小鼠、Balb/C小鼠或Swiss小鼠。
4.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为pUBC载体。
5.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的外源蛋白为5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶或来源于苏云金芽孢杆菌所产的内源性晶体蛋白Cry1Ab。
6.根据权利要求1所述的外源蛋白体内快速积累模型的制备方法，其特征在于：所述的重组载体的注射剂量按照小鼠体重20mg/kg注射重组载体；
所述的重组载体的注射体积不超过1ml。
7.一种外源蛋白体内快速积累模型，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法得到。
8.权利要求7所述的外源蛋白体内快速积累模型在外源蛋白体内风险评估中的应用。
9.一种外源蛋白体内风险的评估方法，其特征在于包括如下步骤：
(A)日常观察啮齿类动物的健康状态；
(B)在制备上述外源蛋白体内快速积累模型的同时制备空白对照组和阴性对照组，空白对照组为注射生理盐水，阴性对照组为注射表达载体；在100天末处理啮齿类动物，取肝组织器官，石蜡切片；
(C)病理切片分析肝组织的炎症反应情况；
(D)依据炎症反应情况，判断该外源蛋白的安全性；
(E)代谢组技术分析血浆代谢物组成，通过分析差异性代谢物种类，判断潜在风险。
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TRINE DALSGAARD ET AL.: "Improved Lentiviral Gene Delivery to Mouse Liver by Hydrodynamic Vector Injection through Tail Vein", 《MOL THER NUCLEIC ACIDS.》 *
TRINE DALSGAARD ET AL.: "Improved Lentiviral Gene Delivery to Mouse Liver by Hydrodynamic Vector Injection through Tail Vein", 《MOL THER NUCLEIC ACIDS.》, vol. 12, 6 August 2018 (2018-08-06), pages 672 *
王先峰等: "《最新传染病学与国家强制性标准规范实用手册 第1卷》", 31 March 2009 *

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