CN102342929A

CN102342929A - 牛蒡子苷元及其衍生物在制备药物中的用途

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Publication number: CN102342929A
Application number: CN2010102426814A
Authority: CN
Inventors: 胡立宏; 沈旭; 赵坤; 陈静; 沈思达
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明涉及一类具有如下通式(1)所示结构的牛蒡子苷元及其衍生物在制备用于提高机体耐受力(抗疲劳)的药物中的用途，以及含有牛蒡子苷元及其衍生物的用于提高机体耐受力(抗疲劳)的药物组合物。所述牛蒡子苷元及其衍生物对AMPK磷酸化具有促进作用，整体动物试验表明该类化合物具有提高疲劳耐受能力。该类化合物可用于抗疲劳治疗。

Description

牛蒡子苷元及其衍生物在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，涉及牛蒡子苷元及其衍生物的医药用途，更具体而言，涉及促进AMPK磷酸化的牛蒡子苷元及其衍生物，以及其药物组合物和医药用途。

背景技术

规律的耐力训练(regular endurance training)或有氧运动(aerobic exercise)能够增强各器官的功能及清除氧化自由基的水平，提高肌肉和机体对疲劳的耐受能力；有益于身体健康，防止众多代谢性疾病的发生；在特定条件下还能作为疾病的治疗手段。

但事实是多数人没有时间或是部分人心脏状况无法负担最低限度的耐力训练，那么能否开发出具有提高肌肉和机体对疲劳耐受力的小分子药物达到跟耐力或有氧训练类似的效果？J.Mark Davis等报道槲皮素能够增加小鼠大脑和肌肉线粒体数量和增强其功能，提升小鼠运动能力^[1]；具有抗氧化作用的绿茶提取物(GTE-green tea extract)也被证明能提高小鼠的跑台运动能力^[2]。随着越来越多的小分子被报道具有提高运动耐力功能，它们作用的分子机制研究受到大家关注，大多研究集中于耐力训练过程中介导骨骼肌生理适应(skeletalmuscle adaptation)的重要代谢性调节蛋白^[3]。期望以这些蛋白为靶标开发高效的活性小分子能够模拟或促进耐力训练产生的骨骼肌生理适应，达到提高疲劳耐受能力和治疗或预防代谢性疾病的目的。

在以小鼠(或大鼠)的跑台(转轮)和游泳训练为模型的骨骼肌生理适应过程研究发现，AMPK(AMP-activated protein kinase，AMP激活的蛋白激酶)在耐力训练介导的腓肠肌II型肌纤维向I型肌纤维转化以及线粒体数量和β-氧化功能增强过程中起着重要作用^[4]。

AMPK是细胞中感应能量水平、调节能量代谢的重要激酶。它由三个亚基组成：包括一个催化亚基AMPKα和两个调节亚基AMPKβ、AMPKγ。小鼠训练过程中，ATP的需求量和线粒体合成ATP的能力处于不平衡状态，作为直接供能单位的ATP被大量消耗而线粒体的合成能力相对滞后。肌纤维内ATP与ADP比值下降，通过腺苷酸激酶进一步使得AMP与ATP比值增加，磷酸化AMPKα。被磷酸化激活的AMPK则可以激活PGC-1α等基因介导下游包括mCPT1、细胞色素C和UCP3在内的线粒体功能基因表达以及肌纤维的转化。短时间高强度的运动会使肌纤维中活性氧堆积，产生肌肉疲劳，引起线粒体功能退化。所以线粒体数目的增加，功能的增强，能够保证在一定时间内持续的供应ATP；而倾向于表达氧化脂肪酸酶类的I型肌纤维能氧化脂肪酸提供更多能量，与表达氧化葡萄糖酶类的II型肌纤维相比对疲劳更具有耐受力。

以跑台运动的力竭时间和距离指示小鼠耐力，注射AMPK特异性激动剂AICAR的静止小鼠与其溶剂对照组小鼠相比，其耐力提高44％，类似于进行规律耐力训练的运动组小鼠。而AMPKα敲除的小鼠与野生型相比，注射AICAR则无法引起SCD1、PGC-1α、FAS等基因的表达提高。说明AICAR是通过AMPKα介导的耐力提高。因此，AMPKα磷酸化的特异性激动剂能够模拟耐力训练过程，介导一定程度上的骨骼肌生理适应，提高对疲劳的耐受力。

牛蒡子，始载于《名医别录》，原名恶实，别名鼠粘子、大力子，为菊科牛蒡属(Arctium)植物牛蒡(Arctium lappa Linne)的干燥成熟果实。为历版中国药典收载，在全国各地均有分布，具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽之功效。用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痈肿疮毒等症。牛蒡子主要含牛蒡苷和牛蒡苷元等木脂素类成分。现代药理学研究发现，牛蒡子所含主要成分木脂素类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、防治糖尿病肾病、改善肾脏代谢功能、调节免疫、抗菌、抗氧化、钙拮抗剂及降血压等多种生理活性，引起了人们的广泛重视。但现有文献从未提及牛蒡子苷、牛蒡子苷元及其类似物具有促进AMPK磷酸化和提高机体抗疲劳的功能。

参考文献：

[1]J.Mark Davis，et al.Quercetin increases brain and muscle mitochondrialbiogenesis and exercise tolerance.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.296：R1071-R1077，2009。

[2]Takatoshi Murase，et al.Green tea extract improves running endurance in mice bystimulating lipid utilization during exercise.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，290：R1550-R1556，2006。

[3]Marie Lagouge，et al.Resveratrol Improves Mitochondrial Function and Protectsagainst Metabolic Disease by Activating SIRT1 and PGC-1a.Cell，127，1109-1122，2006。

[4]Vihang A.Narkar，et al.AMPK and PPARd Agonists Are Exercise Mimetics.Cell，134，1-11，2008。

[5]刘抗伦.牛蒡子的化学成分研究与抗肿瘤作用初步研究.广州中医药大学硕士学位论文，2008，16-21。

发明内容

通过随机筛选发现牛蒡子苷元具有促进AMPK磷酸化的活性，进一步体内动物试验证明其具有提高机体耐受力的功能(即，抗疲劳作用)。

本发明的目的在于提供如下通式1表示的牛蒡子苷元及其衍生物在制备用于提高机体的耐受力(抗疲劳作用)的药物中的用途。

本发明提供如下通式(1)所示的牛蒡子苷元及其衍生物：

其中，R为H；β-D-葡萄糖基；直链、支链或环状的饱和或不饱和的C1-C4烃基酰基；取代或未取代的苯基酰基；吡啶基酰基；未取代或卤素取代的C1-C4烷氧基酰基或苯氧基酰基，

所述取代的取代基选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素和-NO₂中。

进一步优选，本发明的牛蒡子苷元及其衍生物为选自如下所示的化合物1-17中：

本发明的牛蒡子苷元和牛蒡子苷可依据上述文献[5]制备得到。也可以根据下述的制备方法从牛蒡子中提取得到。

本发明的牛蒡子苷元衍生物可通过如下的合成方法合成：

其中，R的定义如上所述。

操作如下：

方法一：

在氩气保护下，取牛蒡子苷元(0.1mmol)溶于无水二氯甲烷中，再加入二异丙基乙二胺(0.15mmol)，将该混合液冷却至0℃，再加入R取代的酰氯(0.12mmol)，使反应过夜。用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤萃取液，然后用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干，通过柱层析得到目标化合物。

方法二：

在氩气保护下，取牛蒡子苷元(0.1mmol)溶于无水二氯甲烷中，加入R取代的酸酐(2mmol)，加热至130℃反应2h。然后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，依次用水、10％的氢氧化钠溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干，通过柱层析得到目标化合物。

根据本发明，本发明提供包含治疗有效剂量的一种或多种牛蒡子苷元及其衍生物的药物组合物，该组合物可以进一步包括药学上的常规辅料，例如赋形剂、甜味剂等。

本发明的牛蒡子苷元及其衍生物，具有促进AMPK磷酸化的活性，可用于制备用于抗疲劳的药物。

本发明的牛蒡子苷元及其衍生物可用于抗疲劳，该治疗方法包括向病人给予治疗有效量的牛蒡子苷元及其衍生物。

有益效果

本发明制备的牛蒡子苷元及其衍生物对AMPK磷酸化具有促进作用，整体动物试验表明，该类化合物具有改善疲劳之功效。该类化合物可用于抗疲劳。本发明化合物合成简单，易于制备，且合成原料丰富。

附图说明

图1为化合物1在H9C2细胞系中对AMPK磷酸化的影响，其中GAPDH为内参。

图2为化合物1对小鼠最终力竭时间(A)和距离(B)的影响；与对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.005。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不局限于此。

下述制备例中，¹H-NMR用Varian Mercury AMX300，400，500型仪器测定。MS用VG ZAB-HS或VG-7070型以及Esquire 3000plus-01005测定。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得。除另有说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程。产品的纯化除另有说明外均使用硅胶的柱色谱法，所使用的硅胶为200-300目，GF₂₅₄为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。

制备实施例

方法一：

在氩气保护下，取牛蒡子苷元(37mg，0.1mmol)溶于1mL无水二氯甲烷中，再加入DIPEA(二异丙基乙二胺)(26μL，0.15mmol)，将该混合液冷却至0℃，再加入R取代的酰氯(0.12mmol)，使反应过夜。用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤萃取液，然后用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干，通过柱层析得到目标化合物。

方法二：

在氩气保护下，取牛蒡子苷元(37mg，0.1mmol)溶于1mL无水二氯甲烷中，加入R取代的酸酐(2mmol)，加热至130℃反应2h。然后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，依次用水、10％的氢氧化钠溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干，通过柱层析得到目标化合物。

化合物1的制备

称取干燥牛蒡子1公斤，用75％的乙醇溶液加热回流3h，过滤，滤渣以同样方法再提取2次，合并滤液，减压回收乙醇溶液后，得浸膏。将浸膏用5％的稀硫酸加热回流4-6h，冷却至室温，用二氯甲烷萃取数次，浓缩二氯甲烷溶液，将浓缩液用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1过硅胶柱，得牛蒡子苷元粗品，粗品经甲醇重结晶，得到纯品牛蒡子苷元(1)35克。

化合物1，C₂₁H₂₄O₆，MW：372；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ6.76(d，J＝7.8Hz，1H)，6.75(d，J＝7.8Hz，1H)，6.63(d，J＝2Hz，1H)，6.58(d，J＝7.8Hz，1H)，6.55(d，J＝7.8Hz，1H)，6.46(s，1H)，5.55(s，1H)，4.11-4.13(m，1H)，3.88-3.90(m，1H)，3.85(s，3H)，3.81(s，3H)，3.75(s，3H)，2.85-3.00(m，2H)，2.67-2.43(m，4H)。

化合物2的制备

称取干燥牛蒡子1公斤，用75％的乙醇溶液加热回流3h，过滤，滤渣以同样方法再提取2次，合并滤液，减压回收乙醇溶液后，得浸膏。将浸膏用30％乙醇超声溶解，过滤得滤液，滤液上大孔树脂AB-8，继续用2倍柱体积的30％乙醇水溶液洗脱，然后换70％乙醇水溶液洗脱，浓缩70％乙醇水洗脱液得总苷部位。总苷部位通过HPLC-UV检测，牛蒡子苷含量为53.7％。总苷部位用氯仿：甲醇＝5∶1过硅胶柱，得牛蒡子苷粗品，粗品经甲醇重结晶，得到纯品牛蒡子苷(2)65克。

化合物2，C₂₇H₃₄O₁₁，MW：534；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃，)：δ6.97(d，J＝8.1Hz，1H)，6.75(d，J＝8.2Hz，1H)，6.60(d，J＝8.2Hz，1H)，6.57(s，1H)，6.49(d，J＝8.1Hz，1H)，6.76(d，J＝6.7Hz，1H)，4.14-4.18(m，1H)，3.90-3.94(m，1H)，3.84(s，3H)，3.80(s，3H)，3.75(s，3H)，3.67-3.89(m，6H)，2.82-2.92(m，2H)，2.47-2.58(m，4H)。

化合物3的制备

按照方法二操作，加入乙酸酐，得到白色粉末状的化合物3。

化合物3，C₂₃H₂₆O₇，MW：414；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃，δ)：7.08(d，J＝8.0Hz，1H)，6.81(s，1H)，6.77(d，J＝8.2Hz，1H)，6.73(d，J＝8.0Hz，1H)，6.65(d，J＝8.2Hz，1H)，6.53(s，1H)，4.14-4.18(m，1H)，3.90-3.94(m，1H)，3.85(s，3H)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.82-2.92(m，2H)，2.52-2.58(m，4H)，2.20(s，3H)。

化合物4的制备

按照方法一操作，加入正丁酰氯，得到白色粉末状的化合物4(90％)。

化合物4，C₂₅H₃₀O₇，MW：442；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ6.92(d，J＝9Hz，1H)6.93-6.95(m，2H)，6.65(d，J＝9Hz，1H)，6.52(d，J＝9Hz，1H)，6.47(d，J＝2Hz，1H)，4.13-4.19(m，1H)，3.85-3.88(m，1H)，3.85(s，3H)，3.81(s，3H)，3.75(s，3H)，2.95-2.97(m，2H)，2.51-2.58(m，6H)，1.83-1.88(m，1H)，1.77(m，2H)，1.04(t，J＝8Hz，3H)。

化合物5的制备

按照方法一操作，加入反式2-丁烯酰氯，得到白色粉末状的化合物5(93％)。

化合物5，C₂₇H₂₈O₇，MW：440；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ6.95(d，J＝9Hz，1H)，6.78(s，1H)，6.75(d，J＝6Hz，1H)，6.67(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.53(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.49(d，J＝2Hz，1H)，6.06(dd，J＝17，2Hz，1H)，4.15-4.19(m，1H)，3.89-3.92(m，1H)，3.85(s，3H)，3.82(s，3H)，3.76(s，3H)，2.97-2.99(m，2H)，2.49-2.67(m，4H)，1.95(dd，J＝7，2Hz，3H)。

化合物6的制备

按照方法一操作，加入环丙基甲酰氯，得到白色粉末状的化合物6(88％)。

化合物6，C₂₅H₂₈O₇，MW：440；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ6.93-6.95(m，2H)，6.75(d，J＝9，1H)，6.65(d，J＝9，1H)，6.52(d，J＝9，1H)，6.47(d，J＝2Hz，1H)，4.13-4.19(m，1H)，3.88-3.91(m，1H)，3.85(s，3H)，3.81(s，3H)，3.76(s，3H)，2.90-2.97(m，2H)，2.44-2.68(m，4H)，1.83-1.88(m，1H)，1.15-1.17(m，2H)，0.99-1.03(m，2H)。

化合物7的制备

按照方法一操作，加入苯甲酰氯，得到白色粉末状的化合物7(70％)。

化合物7，C₂₈H₂₈NO₇，MW：476；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃，)：δ8.20(d，J＝7.8Hz，2H)，7.64(t，J＝7.8Hz，1H)，7.51(t，J＝7.8Hz，2H)，7.10(d，J＝8.0Hz，1H)，6.80(s，1H)，6.79(d，J＝8.2Hz，1H)，6.73(d，J＝8.0Hz，1H)，6.65(d，J＝8.2Hz，1H)，6.53(s，1H)，4.20(t，J＝7.7Hz，1H)，3.92(t，J＝8.0Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.84(s，3H)，3.76(s，3H)，3.01(t，J＝4.6Hz，2H)，2.51-2.70(m，4H)。

化合物8的制备

按照方法一操作，加入对甲基苯甲酰氯，得到白色粉末状的化合物8(80％)。

化合物8，C₃₀H₃₂NO₆，MW：490；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ6.81(d，J＝9.0Hz，2H)，6.74(dd，J＝9，8Hz，2H)，7.06(d，J＝8Hz，1H)，6.79(s，1H)，6.76(s，1H)，6.53(s，1H)，6.72(dd，J＝8，2Hz，1H)，6.57(d，J＝2Hz，1H)，6.52(d，J＝4Hz，1H)，4.14-4.18(m，1H)，3.88-3.98(m，1H)，3.83(s，3H)，3.78(s，3H)，3.68(s，3H)，2.71-3.02(m，2H)，2.54-2.68(m，4H)，2.38(s，3H)。

化合物9的制备

按照方法一操作，加入对氟苯甲酰氯，得到白色粉末状的化合物9(50％)。

化合物9，C₂₈H₂₇FO₇，MW：494；淡黄色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ8.21(dd，J＝9，4Hz，2H)，7.17(t，J＝10Hz，2H)7.04(d，J＝9Hz，1H)，6.71-6.80(m，3H)，6.56(d，J＝9Hz，1H)，6.52(s，1H)，4.11-4.30(m，1H)，3.88-3.93(m，1H)，3.85(s，3H)，3.83(s，3H)，3.75(s，3H)，2.00-3.01(m，2H)，2.49-2.71(m，4H)。

化合物10的制备

按照方法一操作，加入对硝基苯甲酰氯，得到淡黄色粉末状的化合物10(63％)。

化合物10，C₂₈H₂₇NO₉，MW：521；淡黄色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ8.34-8.36(m，4H)，7.06(d，J＝9Hz，1H)，6.82(d，J＝2Hz，1H)，6.78(d，J＝9Hz，1H)，6.73(dd，J＝7，2Hz，1H)，6.57(dd，J＝7，2Hz，1H)，6.52(d，J＝2Hz，1H)，4.19-4.20(m，1H)，3.88-3.93(m，1H)，3.85(s，3H)，3.83(s，3H)，3.76(s，3H)，3.00-3.02(m，2H)，2.54-2.68(m，4H)。

化合物11的制备

按照方法一操作，加入邻氯苯甲酰氯，得到白色粉末状的化合物11(88％)。

化合物11，C₂₈H₂₇ClO₇，MW：511；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ8.07(d，J＝9Hz，1H)，7.38-7.51(m，3H)7.85(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.79(d，J＝2Hz，1H)，6.77(s，1H)，6.71(dd，J＝7，2Hz，1H)，6.56(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.51(d，J＝2Hz，1H)，4.16-4.21(m，1H)，3.87-3.93(m，1H)，3.84(s，3H)，3.83(s，3H)，3.78(s，3H)，2.99-3.01(m，2H)，2.52-2.56(m，4H)。

化合物12的制备

按照方法一操作，加入烟酰氯，得到白色粉末状的化合物12(40％)。

化合物12，C₂₇H₂₇NO₇，MW：477；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ9.38(s，1H)，8.84(d，J＝4，1H)，8.42(m，1H)，7.45(m，1H)，7.06(d，J＝8Hz，1H)，6.80(dd，J＝6，2Hz，1H)，6.747(s，1H)，6.72(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.56(dd，J＝9，2Hz，1H)，6.52(d，J＝2Hz，1H)，4.16-4.21(m，1H)，3.87-3.93(m，1H)，3.85(s，3H)，3.83(s，3H)，3.76(s，3H)，2.99-3.01(m，2H)，2.51-2.69(m，4H)。

化合物13的制备

按照方法一操作，加入3，4-二甲氧基苯甲酰氯，得到白色粉末状的化合物13(96％)。

化合物13，C₃₀H₃₂O₉，MW：536；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ7.85(dd，J＝9，2Hz，1H)，7.66(d，J＝2Hz，1H)，6.94(d，J＝9Hz，1H)，6.80(dd，J＝8，2Hz，1H)，6.74(d，J＝2Hz，1H)，6.72(dd，J＝7，2Hz，1H)，6.56(dd，J＝7，2Hz，1H)，6.51(d，J＝2Hz，1H)，4.15-4.20(m，1H)，3.87-3.95(m，1H)，3.70(s，3H)，3.95(s，3H)，3.85(s，3H)，3.83(s，3H)，3.76(s，3H)，2.99-3.02(m，2H)，2.51-2.69(m，4H)

合物14的制备

按照方法一操作，加入氯甲酸甲酯，得到白色粉末状的化合物14(94％)。

化合物14，C₂₃H₂₆O₈，MW：430；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ7.02(d，J＝8Hz，1H)，6.75-6.78(m，2H)，6.66(d，J＝9Hz，1H)，6.50-6.53(m，2H)，4.13-4.20(m，1H)，3.86-3.92(m，1H)，3.85(s，3H)，3.82(s，3H)，3.80(s，3H)，3.79(s，3H)，2.96-2.98(m，2H)，2.48-2.68(m，4H)。

化合物15的制备

按照方法一操作，加入氯甲酸异丁酯，得到白色粉末状的化合物15(94％)。

化合物15，C₂₆H₃₀O₈，MW：472；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ7.02(d，J＝9Hz，1H)，6.74-6.78(m，2H)，6.65(dd，J＝9，2Hz 1H)，6.49-6.54(m，2H)，4.13-4.19(m，1H)，4.01-4.03(d，J＝7Hz，1H)，3.86-3.92(m，1H)，3.84(s，3H)，3.81(s，3H)，3.78(s，3H)，2.96-2.98(m，2H)，2.48-2.68(m，4H)，2.02-2.06(m，1H)，0.97-1.06(m，6H)

化合物16的制备

按照方法一操作，加入1-氯乙基氯甲酸酯，得到白色粉末状的化合物16(40％)。

化合物16，C₂₄H₁₇ClO₈，MW：478；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ7.04(d，J＝9Hz，1H)，6.75-6.77(m，2H)，6.65(d，J＝9Hz，1H)，6.43-6.54(m，3H)，4.13-4.21(m，1H)，3.84-3.91(m，1H)，3.81(s，3H)，3.79(s，3H)，3.78(s，3H)，2.95-2.97(m，2H)，2.48-2.68(m，4H)，1.89(d，J＝6Hz，3H)

化合物17的制备

按照方法一操作，加入氯甲酸苯酯，得到白色粉末状的化合物17(98％)。

化合物17，C₂₈H₂₈O₈，MW：492；白色粉末状固体，易溶于二氯甲烷和丙酮。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃，)：δ7.41(d，J＝2Hz，1H)，7.38(t，J＝6Hz，1H)，7.27(d，J＝4Hz，2H)，7.25(d，J＝4Hz，1H)，7.11(d，J＝9Hz，1H)，6.77(d，J＝2Hz，1H)，6.74(d，J＝9Hz，1H)，6.69(d，J＝2Hz，1H)，6.66(d，J＝2Hz，1H)，6.53(d，J＝2Hz，1H)，6.49(d，J＝3Hz，1H)，4.10-4.20(m，1H)，3.86-3.91(m，1H)，3.83(s，3H)，3.82(s，3H)，3.78(s，3H)，2.96-2.98(m，2H)，2.47-2.67(m，4H)。

以上牛蒡子苷元衍生物的制备例作参考，其它的牛蒡子苷元衍生物也可以参照上述方法制得。

试验实施例

实验实施例1：细胞水平测试化合物1及其衍生物对AMPK磷酸化的影响

本发明测试了化合物1及其衍生物在细胞水平上对AMPK磷酸化的影响，已知AMPK的磷酸化水平直接反映了其活性水平。

1、实验原理

AMPK作为调节细胞和身体能量代谢平衡的能量感受器，其磷酸化水平直接反映了其活性水平。运动状态下，能够通过增加AMP/ATP的比值从而激活骨骼肌、脂肪组织和心肌等组织中的AMPK，激活的AMPK能够通过增加葡萄糖的摄取，促进脂肪酸的氧化等一系列生物过程增加ATP的产生。已知激活AMPK能够显著增加小鼠的运动耐力，因此我们将AMPK的磷酸化水平作为筛选化合物的生物指标，进行了一系列的化合物筛选。

2、实验材料

1)细胞培养：H9C2细胞，用DMEM培养基(加10％血清)在12孔板里培养(培养条件为37℃，5％CO₂)。

2)实验所使用的抗体及使用稀释比例：

a.一抗：磷酸化AMPK抗体(anti-phospho-AMPK(Thr172)(1∶1000，CellSignaling technology公司))；总AMPK抗体(anti-AMPK(1∶1000，Cell Signalingtechnology公司))；GAPDH(1∶10,000，康城生物)。

b.二抗：兔抗(anti-Rabbit(1∶5000，Jackson))，鼠抗(anti-mouse(1∶10,000，AbCam有限公司))。

3、AMPK磷酸化水平测试实验

H9C2细胞用DMEM培养基(加10％血清)在12孔板里培养，当细胞生长至60-70％密度时孵育20μM化合物培养24小时，然后用冰预冷的PBS洗2遍，加入SDS样品缓冲液(60μg/孔)裂解细胞，将裂解的细胞收集，进行Western blot实验检测AMPK磷酸化水平。

Western blot主要实验参数：实验所使用的抗体比例如实验材料中所述。取上述样品各8μL进行SDS-PAGE，电泳完后，半干法电转2h。电转好的PVDF膜在封闭液中室温封闭30min，再和相应的一抗在4℃孵育过夜。然后，用TBST缓冲液洗膜，5min/次，洗3次。吸去TBST，再将PVDF膜和二抗在室温孵育1.5h。接着用TBST缓冲液洗PVDF膜，5min/次，洗3次。最后用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，Pierce)显影系统显影。

4、实验结果

本发明考察了化合物1及其衍生物在H9C2细胞系中对AMPK磷酸化的影响，如图1所示，给予化合物1后能明显增加AMPK磷酸化的水平，并呈浓度依赖性，另外通过Western blot实验，我们还筛选了一批能够增加AMPK磷酸化水平的牛蒡子苷元衍生物。表1中为化合物激动AMPK作用与DMSO的比值。

表1

化合物	AMPK磷酸化水平相对量
		DMSO	1.00
1	1.47
		2	1.30
3	6.30
		4	3.27
5	3.54
		6	3.84
7	2.79
		8	3.31
9	3.21
		10	3.36
11	3.58
		12	2.57
13	5.08
		14	1.62
15	1.43
		16	1.37
17	1.56
		总苷部位	1.38

上述结果表明，化合物1及其衍生物能够在细胞水平上增加AMPK磷酸化。

实验实施例2：化合物1对C57BL6小鼠耐力(抗疲劳能力)的影响

本发明通过测定C57BL6小鼠跑台力竭的时间和距离，检测了化合物1对小鼠力竭时间和距离的影响，结果表明化合物1能延长小鼠力竭时间和距离。

1、实验原理

动物耐力水平的测定可以使用大小鼠的跑台、转轮或是游泳的力竭时间、距离或是最终速度来指示。

本发明以C57BL6小鼠的平板跑台力竭时间和距离来指代小鼠的耐力即抗疲劳能力。平板跑台的每个跑道由前方的皮带和尾部的电极组成，皮带以一定的速度转动，电极上带有0.2毫安的电流。小鼠在电级上会有痛觉，但是这样的电流不会对小鼠的肌肉和运动能力产生伤害。在正常状态下小鼠会避免掉落到电极上而维持与皮带一样的速度跑动。但是小鼠在疲劳状态下无法保持与皮带相似的速度更容易掉落或呆在电极上。小鼠持续呆在电极上一段时间而不愿意再继续跑动时认为小鼠力竭。小鼠经过一段时间的训练或是给药后，肌肉产生适应性变化，抗疲劳能力提高，表现为最终力竭测试时跑台跑步的时间和距离与对照组比较有较显著的延长。

2、实验材料与方法

1)动物培养：6周龄雄性C57BL6小鼠分为5只/笼，不限制水和饲料，在12小时光明12小时黑暗的生物节律下，培养于温度为23℃的无特定病原体(SPF)屏障系统中。小鼠由史莱克公司提供，其培养，给药，力竭测试和处死均严格按照动物实验和福利的指导。

2)初次力竭筛选初始耐力值均一的小鼠：80只6周龄小鼠给予为期一周的适应性训练(10米/分钟、10分钟/天、4天/周)。适应性训练后进行第一次力竭测试，筛掉力竭时间过长或过短的小鼠40只。平板跑台力竭程序如下：

10米/分钟、10分钟；

15米/分钟、10分钟；

20米/分钟、20分钟；

22米/分钟、10分钟；

此后每10分钟速度增加2米/分钟直到小鼠力竭。小鼠力竭判断标准为无法保持与皮带相似的速度而连续呆在电极上10秒钟或以上。

3)牛蒡子苷元处理：连续给药6周，给药方式及剂量如下表2所示：

表2

溶剂组	腹腔注射：含有1％吐温80的生理盐水
		低剂量组	腹腔注射：2mg/kg/天
中剂量组	腹腔注射：4mg/kg/天
		高剂量组	腹腔注射：8mg/kg/天

化合物1的配制：牛蒡子苷元溶于吐温80配成80mg/ml母液。见下表3。

表3

溶剂组	4.5mL生理盐水+4.5μL吐温80
		低剂量组	3mL生理盐水+7.5μL化合物1母液+22.5μL生理盐水
中剂量组	3mL生理盐水+15μL化合物1母液+15μL生理盐水
		高剂量组	3mL生理盐水+30μL化合物1母液

4)小鼠耐力测试：连续6周给药后停药两天。按照上述初次力竭方法进行最后耐力测试(测试时不予给药处理)。

5)小鼠处死及组织保存：力竭测试后小鼠休息两天恢复至常态。牛蒡子苷元给药一天后处死。取腓肠肌，四头肌保存于-80℃。

3、实验结果

本发明通过跑台力竭测试的方法测定了化合物1给药组和对照组的耐力，结果如图2所示，化合物1能显著并浓度依赖性的提高小鼠力竭时间和距离，增强小鼠耐力。

Claims

1.由如下通式(1)表示的牛蒡子苷元及其衍生物在制备用于提高机体的耐受力的药物中的用途，

其中，R为H；β-D-葡萄糖基；直链、支链或环状的饱和或不饱和的C1-C4烃基酰基；取代或未取代的苯基酰基；吡啶基酰基；未取代或卤素取代的C1-C4烷氧基酰基或苯氧基酰基；

所述取代的取代基选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素和-N0₂中。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述牛蒡子苷元及其衍生物为：

3.如权利要求1或2所述的用途，其中，所述牛蒡子苷元及其衍生物用于促进AMPK磷酸化。

4.一种用于提高机体的耐受力的药物组合物，其含有治疗有效剂量的一种或多种权利要求1或2中所述的牛蒡子苷元及其衍生物。