CN114469932B

CN114469932B - 4-丁烯牛蒡子苷元及其在杀灭鱼类体外寄生虫中的应用

Info

Publication number: CN114469932B
Application number: CN202111606048.3A
Authority: CN
Inventors: 李鹏飞; 王高学; 凌飞; 谈晓萍
Original assignee: Northwest A&F University; Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Northwest A&F University; Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2021-12-25
Filing date: 2021-12-25
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-12-25
Also published as: CN114469932A

Abstract

本发明公开了4‑丁烯牛蒡子苷元及其在杀灭鱼类体外寄生虫中的应用，本发明制备了一种新的牛蒡子苷元衍生物即4‑丁烯牛蒡子苷元以及含有该化合物的鱼类体外寄生虫防治剂。实验表明4‑丁烯牛蒡子苷元对鱼类毒性低，以其为药物活性成分的防治剂可以一次性彻底杀灭三代虫，并且生产成本低、使用方法简单，可以作为无公害绿色渔药推广应用。

Description

4-丁烯牛蒡子苷元及其在杀灭鱼类体外寄生虫中的应用

技术领域

本发明涉及杀灭鱼类体外寄生虫的药物，具体涉及一种牛蒡子苷元衍生物。

背景技术

长期以来杀灭单殖吸虫主要采用的渔药为有机磷农药、甲苯咪唑等。由于产生耐药性、水产品安全和生态安全问题，商品渔药的开发成为制约单殖吸虫病害控制的关键。天然产物及其衍生物的合成研究为创制水产新药提供了物质基础，是提高水产病害控制效果、保障水产品和环境安全的重要途径之一。前期研究(涂笑.牛蒡子苷元作用鱼类单殖吸虫靶标及机制研究[D].西北农林科技大学,2019；王高学,牛蒡子苷元在杀灭水产动物体外寄生虫药物中的应用.陕西省,西北农林科技大学,2009-10-01)发现牛蒡子苷元具有高杀虫活性、专一性和对鱼类安全性高等优点，是理想渔药的开发前体。通过化学合成获得具有更高活性和对鱼毒性更低的衍生物，可以拓展牛蒡子苷元在水产病害防治中的应用。已公开报道的牛蒡子苷元衍生物的杀虫效果有限，例如4-丁烯牛蒡子苷元对中型指环虫(Dactylogyrus intermedius)的杀虫率为100％时的最小浓度为4.69mg/L，且在水体中施用时难以达到一次性彻底杀灭中型指环虫的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供4-丁烯牛蒡子苷元及其在杀灭鱼类体外寄生虫中的应用，4-丁烯牛蒡子苷元杀虫效果显著，可用于杀灭鱼类体外寄生虫(特别是三代虫)。

为达上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种牛蒡子苷元衍生物，该衍生物为4-丁烯牛蒡子苷元(C₂₆H₃₄O₆)，结构如下所示：

上述牛蒡子苷元衍生物的制备方法包括以下步骤：

以牛蒡子苷元和4-溴-1-丁烯为原料，将原料在有机溶剂(例如丙酮等)中进行取代反应，反应结束后依次进行抽滤、萃取、干燥(有机相)、柱层析、干燥(去除流动相溶剂)，得到牛蒡子苷元衍生物，即4-丁烯牛蒡子苷元。

优选的，所述反应的温度为60～70℃，反应的时间为9～14h；牛蒡子苷元与4-溴-1-丁烯的摩尔比为1:2～4。

优选的，所述反应进行前，先将催化剂无水碳酸钾与牛蒡子苷元于有机溶剂中混合后搅拌至牛蒡子苷元溶解，再与4-溴-1-丁烯混合；牛蒡子苷元:无水碳酸钾的摩尔比为1:2～3。

优选的，所述萃取的试剂为饱和食盐水和乙酸乙酯，柱层析中石油醚与乙酸乙酯的体积比为4:1。

4-丁烯牛蒡子苷元在制备用于防治寄生虫病的药物中的应用。

优选的，所述药物用于杀灭鱼类体外寄生虫。

优选的，所述寄生虫为单殖吸虫(特别是三代虫)。

优选的，所述药物为外用。

一种鱼类体外寄生虫防治剂，该防治剂包括下列质量百分比的成分：1％～20％的4-丁烯牛蒡子苷元、5％～10％的表面活性剂以及1％～4％的透皮剂。

优选的，所述表面活性剂为吐温-20。

优选的，所述透皮剂为水溶性氮酮(XW-02)，即1-正十二烷基氮杂环庚-2-酮(分子式C₁₈H₃₅NO)。

优选的，所述防治剂(例如杀灭鱼类体外寄生虫的外用药物的制剂)还包括制剂溶剂。

优选的，所述制剂溶剂为无水乙醇。

优选的，所述防治剂由下列质量百分比的成分组成：1％～20％的4-丁烯牛蒡子苷元、5％～10％的吐温-20、1％～4％的水溶性氮酮，其余为无水乙醇，即以上各成分总和为100％。

优选的，所述防治剂中4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为8％～16％，可以获得更高的杀虫率(例如100％或接近100％的杀虫率)，且鱼类无中毒死亡现象。

上述鱼类体外寄生虫防治剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取4-丁烯牛蒡子苷元、表面活性剂、透皮剂以及制剂溶剂，备用；

2)将4-丁烯牛蒡子苷元和制剂溶剂混合后搅拌至完全溶解，得混合溶液；

3)将表面活性剂及透皮剂加入步骤2)所得的混合溶液中后搅拌均匀，即得鱼类体外寄生虫防治剂。

将制备得到的鱼类体外寄生虫防治剂按9～20mL/m³的剂量泼洒于水体(例如养殖鱼类的池塘)中，即可有效的杀灭鱼类体外寄生虫(特别是三代虫)。

本发明的有益效果体现在：

1)本发明以天然产物牛蒡子苷元为原料制备了具有高效抗虫活性的4-丁烯牛蒡子苷元，制备所得目标化合物的纯度高。本发明对4-丁烯牛蒡子苷元发掘了新的用途，开拓了新的应用领域。

2)本发明制备的4-丁烯牛蒡子苷元对鱼类毒性低、杀虫(特别是三代虫)效果显著。

3)本发明提出的鱼类体外寄生虫防治剂能一次性彻底杀灭鱼类体外寄生虫(特别是三代虫)，并且生产成本低、使用方法简单。

附图说明

图1为4-丁烯牛蒡子苷元合成路线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)4-丁烯牛蒡子苷元的制备

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

试验所用牛蒡子苷元纯度为99.50％，购自上海麦克林生化科技有限公司；4-溴-1-丁烯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 实验设备

由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室提供。

1.2 以牛蒡子苷元为原料合成、分离获得目标化合物

参见图1，称取372mg的牛蒡子苷元和276mg的无水碳酸钾加入到250mL的圆底烧瓶中，再向圆底烧瓶中加入100mL左右的无水丙酮，置于常温条件下搅拌1h后向圆底烧瓶中加入3倍摩尔当量(牛蒡子苷元:4-溴-1-丁烯的摩尔比＝1:3)的4-溴-1-丁烯，并将圆底烧瓶转移至70℃条件下加热回流12h，反应完成。然后减压抽滤掉丙酮，用饱和食盐水(20mL)和乙酸乙酯(30mL×3)进行萃取，合并后的有机相用无水硫酸钠干燥4h。过滤掉无水硫酸钠，滤液减压抽滤后得粗产物。采用柱层析分离体系对粗产物进行纯化，其中流动相为石油醚-乙酸乙酯(4:1,v/v)，TLC监测目标化合物(区别于原料)，收集的溶液经过蒸除溶剂，得到无色块状晶体(目标化合物)。

1.3 化合物鉴定

目标化合物在氯仿、甲醇、乙醇中易溶，在石油醚中难溶，产率为71.5％。其1H NMR(500MHz,CD3OD)、13C NMR(126MHz,MeOD)和HRMS m/z数据如下：1H NMR(500MHz,CD3OD)δ6.76(dd,J＝15.2,8.1Hz,2H),6.70(d,J＝2.0Hz,1H),6.63(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.54(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),6.49(d,J＝2.0Hz,1H),5.91～5.98(m,1H),5.16～5.20(m,1H),5.08～5.16(m,1H),4.17(dd,J＝9.1,7.1Hz,1H),4.00～4.02(t,J＝6.7Hz,1H),3.93～3.94(m,1H),3.82(s,3H),3.80(s,3H),3.79(s,3H),2.90～2.97(m,2H),2.49～2.68(m,6H)；13C NMR(126MHz,MeOD)δ181.39,150.39,149.07,148.93,146.34,135.90,132.77,130.72,123.00,122.01,117.23,116.08,113.87,113.60,113.03,72.80,69.69,56.35,47.66,42.42,38.78,35.39,34.76；HRMS m/z:449.1932([M+Na]+)。经1H NMR(500MHz,CD3OD)、13C NMR(126MHz,MeOD)和HRMS m/z分析确定目标化合物是4-丁烯牛蒡子苷元，结构式如下：

(二)4-丁烯牛蒡子苷元对斑马鱼的急性毒性试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品

试验所用4-丁烯牛蒡子苷元纯度为99.50％，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室提供(制备方法参照(一)中1.2节)。精确称取1.0g 4-丁烯牛蒡子苷元，用无水乙醇(购自西安化学试剂厂)充分溶解，定容于100mL容量瓶中，即药液浓度为10mg/mL，4℃冰箱保存备用。

1.1.2 试验动物

试验所用斑马鱼购于西安朱雀花卉市场，体质健壮、规格均一，平均体重0.47g。购回后在实验室水簇箱中暂养7d左右，每天投喂1～2次，投入的饲料在10min内吃完为限。待适应实验室环境条件后再进行毒性试验。

1.1.3 试验仪器

ALC-1100.2百分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-500E型超声波清洗器；5～10μL、20～200μL移液器；自动控温加热棒，浙江舟山市渔具厂；塑料盆(容积为8L)等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验条件

采用静水式试验法，每盆加充分曝气的自来水5L，pH7.2，控制水温为20±1℃，先加入试验药液充分混匀后再加入试验用斑马鱼，每盆放养10尾。放养后保持水中溶氧在5mg/L以上。为了保持恒定的药物(4-丁烯牛蒡子苷元)浓度，每隔24h换水重新加药。

1.2.2 试验药物浓度的设定

首先反复进行预试验，确定正式试验药物浓度的大致范围，即斑马鱼在24h内全部中毒死亡的药物浓度(18.0mg/L)和96h内不发生死亡的药物浓度(12.0mg/L)。然后在预试验基础上，在药物浓度12.0与18.0mg/L之间按浓度等差(公差d＝1)插入13.0、14.0、15.0、16.0、17.0mg/L五个药物浓度试验组，进行正式试验，观察各药物浓度下斑马鱼的中毒死亡情况。

在正式试验期间随时观察记录斑马鱼的死亡情况，如发现斑马鱼中毒死亡，应即时捞出，以免影响水质和试验结果。判断斑马鱼死亡的方法是当鱼鳃盖运动停止后用玻璃棒或镊子轻击鱼的尾柄部，如果在3min之内鱼体不产生任何应激反应，即可判断死亡。

正式试验期间统计在24h、48h、72h和96h内各药物浓度下斑马鱼的死亡情况。正式试验期间应保持安静，尽可能避免对斑马鱼的任何干扰，斑马鱼死亡率按下式计算。

当空白对照组(不加药)的死亡率小于5％，各时间段内斑马鱼的死亡率可不予校正；若空白对照组的死亡率大于5％，则应予校正，校正公式采用Abbott公式；如果空白对照组死亡率达20％以上，则在查找原因后，重新进行毒性试验。

Abbott公式:P＝P′-C/1-C

P—校正死亡率，即纯属药物引起的死亡率；

P′—试验组死亡率，即自然因素和药物引起的死亡率；

C—空白对照组死亡率，即自然因素引起的死亡率。

1.2.3 4-丁烯牛蒡子苷元最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC₅₀)

根据观察记录的斑马鱼在24h、48h、72h和96h内的死亡情况，斑马鱼各时间段开始出现死亡的最低浓度和下一个浓度为该时间段的最低致死浓度范围，并计算致死率。

利用直线回归法(直线回归方程)：

y＝a+bx

x—药物浓度的浓度对数；

y—死亡率转换成的概率单位；

a、b—分别为直线的截距、斜率；

求出a、b，a、b的计算公式为：

k—药物浓度的组数(死亡率为0和100％的浓度不计算在内)；

求出a、b后，便可确定出回归方程，然后再将50％死亡率的概率单位y＝5.0带入方程，求出x，取其反对数，便得出该时间段内的LC₅₀，并计算其95％的可信限，公式为：

N—供试的动物总数(死亡率为0和100％的浓度不计算在内)；

x—LC₅₀值的对数。

1.2.4 4-丁烯牛蒡子苷元安全浓度的计算

根据Turbell公式计算安全浓度：

2结果与分析

2.1 4-丁烯牛蒡子苷元各试验组在不同时间段内对斑马鱼致毒情况

各试验药物浓度在24h、48h、72h、96h内的斑马鱼死亡情况见表1。在药物浓度为18.0mg/L的高浓度试验组，斑马鱼中毒反应非常明显，用药后2h左右出现异常表现：斑马鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在药物浓度为12.0mg/L的低浓度试验组中，斑马鱼表现较安静，对外界反应灵敏，活动正常。

表1.不同浓度4-丁烯牛蒡子苷元试验组的斑马鱼中毒死亡结果

2.2 最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC50)

计算不同浓度试验药物在12h、24h、48h和96h内的死亡率，结果见表2。

将各试验浓度取其对数，得其浓度对数，并将各时间段斑马鱼中毒死亡率查表得其概率值，将各时间段的药物浓度对数及其对应的死亡率的概率值代入公式，求出回归方程，可计算出各时间段的半数致死浓度(LC₅₀)和LC₅₀的95％可信限(表3)。

表2. 4-丁烯牛蒡子苷元对斑马鱼的急性毒性结果

表3.各时间段的LC₅₀及其95％的可信限

2.3 安全浓度计算结果

根据Turbell公式计算出4-丁烯牛蒡子苷元对斑马鱼的安全浓度：

结果显示，4-丁烯牛蒡子苷元浓度在12mg/L的情况下，48h没有出现鱼死亡的现象。(三)4-丁烯牛蒡子苷元对三代虫杀灭效果

1 材料与方法

1.1 试验动物

寄主模型为金鱼(Carassius auratus)，寄生虫模型为小林三代虫；感染了小林三代虫(Gyradactylus kobayashii)的金鱼体重均小于5g，来源于陕西省陈鑫观赏鱼养殖场。

1.2 试验药物

试验所用4-丁烯牛蒡子苷元纯度为99.5％，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室提供。试验所用牛蒡子苷元纯度为99.5％，购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 试验方法

使用容积为8L的搪瓷盆，盛入充分曝气地下水5L，使用自动控温加热棒控制水温20±1℃，pH7.0～7.5。试验开始时，首先对感染了小林三代虫的金鱼随机抽检，当小林三代虫平均寄生数量和感染率达到试验要求时，在各盆中分别投放感染金鱼10尾，然后根据试验所设立的不同药物浓度分别向水体中投药，并搅拌均匀。投药后48h时取金鱼全鳃制片、镜检，观察药物对小林三代虫的杀灭效果，统计有效浓度、杀虫率、鱼中毒浓度以及中毒浓度时的鱼死亡率。试验重复3次，并设阴性对照组(不投药)。

在设定杀虫时间取供试鱼全鳃制片、镜检观察并统计三代虫从鳃部脱落情况，如果没有脱落，观察是否死亡，虫体头腺周围口器在1～2min不发生收缩者视为死亡，若鳃部无虫脱落或虫已死亡均确定杀虫率为100％；如果部分脱落，则统计每尾鱼鳃部存活寄生虫数量，计算平均值，并以阴性对照组为参考计算杀虫率，以此来评价杀虫效果。

2.牛蒡子苷元衍生物活性单体杀灭三代虫效果

2.1 4-丁烯牛蒡子苷元杀虫活性测定

4-丁烯牛蒡子苷元杀灭三代虫的活性测定结果见表4。

表4. 4-丁烯牛蒡子苷元对小林三代虫的杀灭活性(48h)

由表4可知，当4-丁烯牛蒡子苷元的浓度从1.5mg/L开始，对三代虫的杀虫率达100％(即杀虫率100％时的最小浓度或有效浓度为1.5mg/L)；而当4-丁烯牛蒡子苷元的浓度达到13.0mg/L时，供试鱼开始表现出中毒现象(即试验鱼出现中毒现象的最小浓度或中毒浓度为13.0mg/L)，此时鱼的死亡率为10％。

2.2 与牛蒡子苷元的杀虫活性比较

牛蒡子苷元杀灭三代虫的活性测定结果见表5。

表5.牛蒡子苷元对小林三代虫的杀灭活性(48h)

由表5可知，牛蒡子苷元杀虫率100％时的最小浓度为4.0mg/L，试验鱼出现中毒现象的最小浓度为8.0mg/L。4-丁烯牛蒡子苷元与其相比，杀灭三代虫活性提高、毒性降低。结合4-丁烯牛蒡子苷元对斑马鱼的安全浓度以及杀灭三代虫的有效剂量(1.5mg/L)综合考虑，4-丁烯牛蒡子苷元作为杀虫渔药活性成分具有很好的推广价值，具有开发为候选渔药的潜力。

(四)鱼类体外寄生虫防治剂的药效学试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

寄主模型为金鱼(Carassius auratus)，寄生虫模型为小林三代虫；感染了小林三代虫的金鱼体重均小于5g，来源于陕西省陈鑫观赏鱼养殖场。

1.1.2 供试药品

含4-丁烯牛蒡子苷元的水产动物体外寄生虫防治剂，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室提供，制剂实例如下：

实例1

取4-丁烯牛蒡子苷元1.0g和溶剂无水乙醇86.0g混合，搅拌至完全溶解后加入表面活性剂吐温-20 10.0g和透皮剂水溶性氮酮3.0g，充分混合均匀，即得以4-丁烯牛蒡子苷元(质量百分比为1％)为药物活性成分(包括杀灭寄生虫活性)的鱼类体外寄生虫防治剂。

实例2

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元4.0g，吐温-20 8.0g，水溶性氮酮2.0g，无水乙醇86.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为4％。

实例3

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元8.0g，吐温-20 10.0g，水溶性氮酮2.0g，无水乙醇80.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为8％。

实例4

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元12.0g，吐温-20 7.0g，水溶性氮酮2.0g，无水乙醇79.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为12％。

实例5

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元16.0g，吐温-20 5.0g，水溶性氮酮1.0g，无水乙醇78.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为16％。

实例6

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元20.0g，吐温-20 5.0g，水溶性氮酮4.0g，无水乙醇71.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为20％。

实例7

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元16.0g，吐温-20 7.0g，水溶性氮酮2.0g，无水乙醇75.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为16％。

实例8

本例鱼类体外寄生虫防治剂中，4-丁烯牛蒡子苷元1.0g，吐温-20 10.0g，水溶性氮酮4.0g，无水乙醇85.0g，即4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为1％。

1.1.3仪器设备

XH-B旋涡混合器，姜堰市康健医疗器具有限公司；BX41光学显微镜，OLYMPUS；Satorius万分之一电子天平；水族箱与控温装置。

1.2试验方法

杀虫试验具体方法为：使用8个玻璃水族箱(50cm×40cm×30cm)，盛入充分曝气地下水，pH7.0～7.5，控制水温25±1℃，分别投放感染有小林三代虫的金鱼100尾。首先大范围设定供试药品浓度进行预试验，再根据(三)中确定的杀虫有效浓度和鱼中毒浓度进行梯度递增或递减方式重新设定，分别投加各浓度供试药品并搅拌均匀，投加48h后取金鱼全鳃制片、镜检，观察不同投加浓度下供试药品对三代虫的杀灭效果，统计有效浓度、杀虫率。试验重复3次，并设阴性对照组(不投加)。

2 结果与分析

2.1 阴性对照组

试验中设立的阴性对照组为100尾，分别在试验的0h、48h随即抽检30尾，解剖全鳃后镜检统计感染小林三代虫平均数量。在试验的0h镜检，小林三代虫平均数量为22.1个/尾，试验进行48h，小林三代虫平均数量为25.6个/尾。以此结果为参考计算试验组寄生虫(小林三代虫)的杀虫率。

2.2 鱼类体外寄生虫防治剂对三代虫杀灭结果

鱼类体外寄生虫防治剂(含12％的4-丁烯牛蒡子苷元)，在48h内杀灭小林三代虫的结果见表6。从表6可以看出，当防治剂浓度为1.0mL/m³(指每立方米水体投入防治剂1.0mL)时，杀虫率较低，仅为15.4％；当浓度为3.0mL/m³时，其杀虫率可达56.1％，而浓度为9.0mL/m³时杀虫率为100％；当浓度为21.0mL/m³时，供试鱼仍然没有出现中毒现象，表明该防治剂是一种应用前景良好的生物杀虫渔药制剂。

表6.鱼类寄生虫防治剂对小林三代虫的杀灭效果(48h内)

本发明对制备的目标化合物4-丁烯牛蒡子苷元进行的鱼类急性毒性实验、药理试验，以及对相应防治剂的药理试验结果表明，4-丁烯牛蒡子苷元作为牛蒡子苷元衍生物活性单体，在杀灭鱼类体外寄生虫(特别是三代虫)中效果显著，有利于无公害绿色渔药推广应用，为防治水产动物寄生虫提供了新的途径。

Claims

1. 4-丁烯牛蒡子苷元在制备用于防治寄生虫病的药物中的应用，其特征在于：所述药物用于杀灭鱼类体外寄生虫，所述寄生虫为三代虫。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为外用。

3.一种鱼类体外寄生虫防治剂，其特征在于：该防治剂包括下列质量百分比的成分：1％~20％的4-丁烯牛蒡子苷元、5％~10％的表面活性剂以及1％~4％的透皮剂；

所述表面活性剂为吐温-20，透皮剂为水溶性氮酮。

4.根据权利要求3所述一种鱼类体外寄生虫防治剂，其特征在于：所述防治剂还包括制剂溶剂。

5.根据权利要求4所述一种鱼类体外寄生虫防治剂，其特征在于：所述制剂溶剂为乙醇。

6.根据权利要求3所述一种鱼类体外寄生虫防治剂，其特征在于：所述防治剂中4-丁烯牛蒡子苷元的质量百分比为8％~16％。

7. 4-丁烯牛蒡子苷元在杀灭鱼类体外寄生虫中的应用，其特征在于：将如权利要求3所述的鱼类体外寄生虫防治剂按9~20 mL/m³的剂量泼洒于水体中，所述寄生虫为三代虫。

8.如权利要求4或5所述的鱼类体外寄生虫防治剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

将4-丁烯牛蒡子苷元和制剂溶剂混合后搅拌至完全溶解，得混合溶液；将表面活性剂及透皮剂加入所得的混合溶液中后搅拌均匀，即得鱼类体外寄生虫防治剂。