CN101269066B - 异虎耳草素在制备渔药中的应用及其制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开化合物异虎耳草素(C₁₃H₁₀O₅)在杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的药物中的新用途，开拓了新的应用领域。本发明还公开了该产品是一种新型的植物源渔药，能一次性彻底杀灭鱼类体外寄生虫中的指环虫且不产生抗药性问题。本发明的产品原料来源丰富，价廉、制备工艺简单而且安全无毒，药理作用强，具有广阔的渔药应用市场前景。

Description

异虎耳草素在制备渔药中的应用及其制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及异虎耳草素的新用途，尤其涉及异虎耳草素在制备杀灭鱼类体外寄生虫——指环虫渔药中的新用途，以及一种运用异虎耳草素制成的杀灭鱼类体外寄生虫防治剂和这种防治剂的制备方法。 

背景技术

我国是世界水产养殖大国，据统计资料显示，2005年全国水产品总产量5 101.65万t，其中水产养殖面积754.50万hm²，水产养殖产量3 393.25万t，占总产量的67％，而水产品出口也占较大的比重，2005年全国水产品进出口总量为623万t，出口量257万t，出口额78.9亿美元。渔业生产中，目前存在着两个急需解决的问题，一是水产养殖中病害防治问题；二是水产品药物残留问题，两者对目前水产品的生产及其重要。据报道，2005年，水产养殖生物因病害造成的直接经济损失达110.00亿元，采取药物防治是目前渔业生产中最主要的措施，但是，有些药物的使用往往造成水产品质量下降、药残严重。曾经发生的一系列贸易事件给我国水产品出口敲响了警钟：2005年受“孔雀石绿残留事件”影响，广东烤鳗出口急降了21％；2006年8月来自中国海关的通报，日本在中国出口的鳗鱼中检测到农药硫丹的超标，严重限制了我国鳗鱼的出口。当前生产中的渔药主要是移植人药、兽药和部分农药等化学药物，长期使用带来的是环境污染、药物残留、耐药性等一系列问题，也成为我国水产品出口的绿色贸易堡垒问题。鱼类体外寄生单殖吸虫(Monogenoidea)病是危害水产养殖最为严重的病害之一，特别是寄生在鱼类鳃部的指环虫(Dactylogyrus)和拟指环虫 (Pseudodactylogyrus)，大量寄生在鱼类鳃部导致鱼类呼吸困难出现大批毁灭性死亡，往往给养殖业造成巨大的经济损失。关于该类寄生虫病的防治，长期以来，主要药物是甲苯咪唑(Mebendazolum)、吡喹酮(Praziquantelum)等化学药物，由于长期使用产生耐药性，并且有些化学药物因不易降解、污染水环境、残留、蓄积，危害人类的身体健康多被禁用。植物源药物，取之于自然，用之于自然，具有低毒、低残留、对非靶标生物毒害较低，对环境无污染等优点，从而降低或避免目前化学渔药带来的“药物公害”。另外，从植物中寻找新的活性物质或药物前体，不仅是有效创制新药的经济、快捷途径，而且也使得植物资源的得到更加合理的开发与利用。 

异虎耳草素(C₁₃H₁₀O₅)是一种可以从蛇床子中提取分离出来的化合物，其结构式为： 

该化合物的分子式为：C₁₃H₁₀O₅，分子量为246，在乙醇中为黄色长细针状晶体，在氯仿、丙酮等有机溶剂中易溶，在甲醇、乙醇等醇类溶剂中溶解度低，但是在它们的热溶剂中溶解度较高，在水中难溶。熔点为101℃～102℃。 

蛇床子制剂和异虎耳草素已知用途有： 

1.蛇床子提取物制剂能够应用杀灭鱼类指环虫，申请的专利为“水产 动物体外寄生虫防治剂及其制备方法”，专利号：ZL 200510041733.0，发明人：王高学等。 

2.蛇床子提取物在农用杀虫剂生产上的应用，申请号：01136788，申请人：林开春，主要是利用蛇床子提取物杀灭农业害虫。 

3.蛇床子制剂作为防治植物龙胆斑枯病的新用途，专利号：CN200510009691.2，，主要利用粗提物防治植物龙胆斑枯病。 

4.蛇床子提取物具有抗肿瘤、抗诱变、免疫增强、抗炎、抗氧化、抑制真菌、在农业上杀灭害虫等作用，同时对对心血管系统、中枢神经系统、生殖系统、内分泌系统、骨代谢具有积极作用。 

5.异虎耳草素体外试验对发癣菌的须发癣菌有强的活性，同时对体外培养的骨细胞代谢有积极作用。 

本申请人以前的研究发现，蛇床子提取物能够杀灭鱼类体外寄生虫，并申请专利“水产动物体外寄生虫防治剂及其制备方法”，但还没有发现蛇床子中起到杀虫作用的化合物到底是何种物质，没有真正彻底的认清事物，使鱼药产业的发展收到一定程度的局限。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：确定蛇床子中能够杀灭鱼类体外寄生虫的确切物质，以便于能给出制备杀灭鱼类体外寄生虫药物的多种原料来源。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明的目的在于公开异虎耳草素在制备杀灭鱼类体外寄生虫药物中的应用。 

本发明的另一目的在于公开异虎耳草素在制备杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的指环虫药物中的应用。 

本发明的另一目的在于公开提供一种杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的 防治剂，它是由下列重量比的原料制成：异虎耳草素5％～30％，溶解剂10％～20％，表面活性剂5％～10％，其余为溶剂。 

所述溶解剂是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。 

所述表面活性剂是指吐温-80。 

所述的溶剂为无水乙醇。 

本发明优选的溶剂为无水乙醇。 

本发明还有一目的是提供上述杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的防治剂的制备方法，按以下步骤进行： 

1)称取异虎耳草素、溶解剂、表面活性剂、溶剂各原料，备用； 

2)将所述重量的异虎耳草素和溶解剂N，N-二甲基甲酰胺在不锈钢容器中搅拌完全溶解后，再加入溶剂； 

3)将5％～10％表面活性剂、加入步骤2)所得的溶液中混合，即得异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂。 

将异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂直接泼洒于池塘中，防治鱼类体外寄生虫—虫、拟指环虫、三代虫，其使用剂量为：0.5mL～6mL/m³。 

本发明的有益效果是，本发明基于研究发现蛇床子提取物中能杀灭鱼类体外寄生虫的物质是异虎耳草素，由此产生了如下技术效果： 

(1)本发明对已知化合物异虎耳草素发掘了新的用途，开拓了新的应用领域。 

(2)本发明的异虎耳草素安全低毒，药理作用强，预示着具有很好渔药应用前景。 

(3)本发明的异虎耳草素具有显著杀灭鱼类指环虫效果。 

(4)本发明的制备产品是一种新型的渔药，不会产生抗药性问题，能一 次性彻底杀灭指环虫。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 

图1是石油醚和氯仿萃取部分杀虫活性物质跟踪分离流程图。 

图2是C流分组杀虫活性物质跟踪分离流程图。 

图3是C₄流分组杀虫活性物质跟踪分离流程图。 

图4是异虎耳草素的红外吸收光谱图。 

图5是异虎耳草素的核磁共振碳谱图。 

图6是异虎耳草素的核磁共振氢谱图。 

具体实施方式

一、首先介绍申请人是如何发现异虎耳草素对鱼类寄生虫具有杀灭效果的： 

本发明人以前的研究发现，蛇床子提取物能够杀灭鱼类体外寄生虫，并申请专利“水产动物体外寄生虫防治剂及其制备方法”，但还不能确定蛇床子提取物中到底是什么样的化合物对鱼类体外寄生虫真正起杀灭作用的，所以申请人对蛇床子提取物进行了进一步的研究： 

(一)蛇床子提取物的分离、鉴定： 

1、供试样品提取和初步分离 

将20kg蛇床子粉碎物用无水工业乙醇在75℃热回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇浸膏2120.6g。取所得的粗提物200g依次用石油醚、氯仿、甲醇、水进行固液萃取，直至各萃取液几乎无色、最后残渣用碱水溶解，减压浓缩萃取液，蒸干后得到各萃取部分浸膏。对各萃取部分进行杀虫药效测定，淘汰无效部分，有效部分作为进一步分离的 对象。经测定石油醚和氯仿萃取部分均具有杀虫效果。 

1.1石油醚和氯仿萃取部分的柱层析分离及活性跟踪测定，见附图1 

A.样品处理 

为了简化分离，将上面所述的石油醚萃取部分和氯仿萃取部分合并，得到浸膏108.096g。取100g浸膏用甲醇溶解后加入100g硅胶(100～200目)拌匀，置恒温水浴锅(温度60℃)上蒸干，研磨均匀。 

1.2装柱与上样 

玻璃层析柱柱径100mm，柱长1200mm，柱层析硅胶1500g(100～200目)，石油醚湿法装柱，干法上样。 

1.3溶剂系统 

经薄层层析(TLC)预试，确定以石油醚-乙酸乙酯(50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1，甲醇和水洗柱)作为洗脱系统，进行梯度洗脱。 

1.4流分的薄层层析分析 

洗脱时，每300mL收集一个流分，共收集到150个流分。采用TLC检查，合并相似流分，最后共得到8个流分组：A(第1～19流分)、B(第20～39流分)、C(第40～99流分，)、D(第100～134流分)、E(第135～147流分)、F(148流分)、G(149流分)、H(150流分)。 

1.5.杀虫活性跟踪测定，对收集合并的各组分进行药效试验，确定各流分组杀虫活性，具体方法同于本说明书第20至22页的试验例2的方法，有效流分组用于进一步分离。经测定C流分组具有杀虫活性。 

2、C流分组的柱层析分离及活性跟踪测定，见附图2 

2.1样品处理 

C流分组蒸干后得到浸膏14.324g，将其用甲醇溶解后加入20g硅胶 (100～200目)拌匀，置恒温水浴锅(温度60℃)上蒸干，研磨均匀。 

2.2装柱与上样 

玻璃层析柱柱径60mm，柱长800mm，柱层析硅胶300g(200～300目)，石油醚湿法装柱，干法上样。 

2.3溶剂系统 

经薄层层析(TLC)预试，确定以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.05、8∶1∶0.1、20∶3∶0.1、5∶1∶0.2、3∶1∶0.3、1∶1∶0.4、1∶2∶0.5，乙酸乙酯、甲醇和水洗柱)作为洗脱系统，进行梯度洗脱。 

2.4流分的薄层层析分析 

洗脱时，每100mL收集一个流分，共收集到91个流分。采用TLC检查，合并相似流分，最后共得到8个流分组：C₁(第1～3流分)、C₂(第4～17流分)、C₃(第18～29流分，)、C₄(第30～42流分)、C₅(第43～58流分)、C₆ (第59～76流分)、C₇(第77～85流分)、C₈(第86～91流分)。 

2.5杀虫活性跟踪测定 

对收集合并的各组分进行药效试验，确定各流分组杀虫活性，具体方法同于本说明书第20至22页的试验例2的方法，有效流分组用于进一步分离。经测定C₄流分组具有杀虫活性。 

3、C₄流分组的分离纯化以及活性测定，见附图3 

3.1样品处理 

C₄流分组蒸干后得到浸膏0.48g，用0.8mL氯仿溶解，溶液过0.45μm滤膜。 

3.2装柱与上样 

玻璃层析柱柱径20m，柱长400mm，葡聚糖-LH20(Sephadex-LH20) 20g(200～300目)。将葡聚糖用氯仿∶甲醇(1∶1)浸泡5h，湿法上柱，湿法上样。 

3.3溶剂系统 

氯仿-甲醇(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、甲醇)作为洗脱系统，进行梯度洗脱。 

3.4流分的薄层层析分析 

洗脱时，按环带收集流分，无环带时以每10mL收集一个流分，共收集到30个流分。采用TLC检查，合并相似流分，最后共得到9个流分组：C_4-1(第1～2流分)、C_4-2(第3～10流分)、C_4-3(第11流分)、C_4-4(第12流分)、C_4-5(第13～15流分)、C_4-6(第16～17流分)、C_4-7(第18～22流分)、C_4-8(第23～24流分)、C_4-9(第25～30流分)。其中C_4-3、C_4-6、C_4-8为结晶物质。 

3.5杀虫活性跟踪测定 

对收集合并的各组分进行药效试验，确定各流分组杀虫活性，具体方法同于本说明书第20至22页的试验例2的方法，有效流分组用于进一步分离。经过药效测定，仅C_4-8具有杀虫效果。 

4、活性化合物的结构鉴定 

对活性化合物采用熔点仪进行熔点测定，并结合质谱(EI-MS)、红外光谱(IR)、质子核磁共振谱(¹H-NMR)、¹³C核磁共振谱(¹³C-NMR)等波谱对其结构进行鉴定。 

(二)活性追踪测定结果 

1、供试样品提取和初步分离 

依次用石油醚、氯仿、甲醇、水、碱水对蛇床子乙醇粗提物进行提取 和溶解，得到不同提取部分的浸膏。对各提取部分进行杀虫药效测定，其中对照组寄生虫平均存活数量为32.7个/尾，样品浓度、试验组寄生虫平均存活数量、杀虫率、鱼死亡率均列于表1中。结果如表1所示，作用48h时，石油醚提取部分和氯仿提取部分均能彻底杀灭指环虫，其100％杀虫浓度均是4.5mg·L^-1；而甲醇、水、碱水部分对指环虫没有杀灭效果，当它们浓度为20mg·L^-1时，杀虫率均小于20％，故视为无效。因此，将石油醚提取部分和氯仿提取部分作为进一步分离的对象，淘汰甲醇、水和碱水部分。 

表1  48h时不同提取物对指环虫的杀灭效果 

2、石油醚和氯仿提取部分的柱层析分离及活性跟踪测定结果 

为简化分离步骤，将石油醚提取部分和氯仿提取部分合并，然后进行硅胶柱层析分离，通过TLC法合并收集的流分得到A、B、C、D、E、F、G、H8个流分组。对各个流分组进行杀虫药效测定，其中对照组寄生虫平均存活数量为26.7个/尾，样品浓度、试验组寄生虫平均存活数量、杀虫率、鱼死亡率均列于表2中。结果如表2所示，作用48h时，在鱼不发生死亡情况下，只有C流分组能100％杀灭寄生在鱼鳃上的指环虫，其100％杀虫的最低浓度为2.0mg·L^-1；B流分组对指环虫也有一定的杀灭效果，当浓度为10.0mg·L^-1时，其杀虫率达到78.7％，但是该浓度对鱼也具有一定毒杀作用，引起26.7％的鱼死亡；其它流分组在鱼中毒死亡浓度或20.0mg·L^-1时，仍对指环虫没有杀灭效果。因此，对C流分组进行进一步分离。 

表2  48h时石油醚提和氯仿提取部分分离物对指环虫的杀灭效果 

3、C流分组的柱层析分离及活性跟踪测定结果 

对C流分组进行硅胶柱层析分离，通过TLC法合并各流分得到8个流分组(C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈)。对各流分组进行杀虫药效测定，其中对照组寄生虫平均存活数量为31.0个/尾，样品浓度、试验组寄生虫平均存活数量、杀虫率、鱼死亡率均列于表3中。结果如表3所示，作用48h时，C₂流分组对指环虫的杀灭作用最强，当浓度为4.0mg·L^-1时，对指环虫的杀灭率为100％，浓度为3.0mg·L^-1时，对指环虫具有53.3％的杀灭效果；C₄流分组在浓度为16.0mg·L^-1时，能100％杀灭指环虫，浓度为12.0mg·L^-1时，开始对指环虫表现出杀灭活性，此时杀虫率为37.7％；其它流 分组在鱼中毒死亡浓度或20.0mg·L^-1时，仍对指环虫没有杀灭效果。因此，对C₂和C₄流分组进行进一步分离、纯化。 

表3  48h时C流分组分离物对指环虫的杀灭效果 

4、C₄流分组的分离纯化以及活性测定结果 

对C₄流分组进行葡聚糖柱层析分离，通过TLC法合并各流分得到9个流分组(C_4-1、C_4-2、C_4-3、C_4-4、C_4-5、C_4-6、C_4-7、C_4-8、C_4-9，其中C_4-3、C_4-6、C_4-8 为结晶物)。对C_4-3、C_4-6和C_4-8进行杀虫药效测定，其中对照组寄生虫平均存活数量为36.7样品浓度、试验组寄生虫平均存活数量、杀虫率、鱼死亡率均列于表4中。结果如表4所示，作用48h时，C_4-8对指环虫表现出较好的杀灭活性，当其浓度最为8.0mg·L^-1时，对指环虫杀灭率为100％，在浓度为13.0mg·L^-1时，对鱼的毒性较大；C_4-3和C_4-6在浓度为20.0mg·L^-1 时，仍对指环虫没有杀灭效果。因此可以确定，C_4-8是C₄流分组中杀灭指环虫的主要活性物质。其它流分组由于量很低，且根据C₄流分组杀虫活性判断，其杀虫活性也很低或者没有杀虫活性，故不具有进一步分离的必要。 

表4  48h时C₄流分组中3种化合物对指环虫的杀灭效果 

5、C_4-8的活性测定 

对C_4-8进行杀虫效果测试。其中对照组寄生虫平均存活数量为22.6个/ 尾，样品浓度、试验组寄生虫平均存活数量、杀虫率、鱼死亡率也均列于表5中。由表5可知，当C_4-8的浓度从8.0mg·L^-1开始，C_4-8对指环虫的杀灭率达100％；而当浓度达到11.0mg·L^-1时，开始对鱼表现出一定的毒性，此时鱼的死亡率为20％。由表5结果可以说明，C_4-8对指环虫也具有较好的杀灭活性，其杀虫的安全浓度范围是从8.0mg·L^-1～12.0mg·L^-1。 

表5  C_4-8的杀指环虫活性测定 

4.2.3.2 C_4-8的结构鉴定 

在乙醇中为黄色长细针状晶体，在氯仿、丙酮等有机溶剂中易溶，在甲醇、乙醇等醇类溶剂中溶解度低，但是在它们的热溶剂中溶解度较高，在水中难溶。TLC检测在三种以上溶剂系统展开情况下为单点。熔点为101℃～102℃。 

紫外UV(MeOH)v/nm：312.0，267.5，247.5，241.0； 

红外IR(KBr)，v/cm^-1：3123.5-2948.8(CH)，1718.0(＞CH＝0)，1591.5，1482.0(苯环)； 

核磁共振氢谱¹H-NMR(CDCl₃)δppm：4.2(6H，s，C5，8-OCH3)，6.3(1H，d，C3-H)，7.0(1H，d，C2-H)，7.6(1H，d，C8-H)，8.1(1H，d，C7-H)； 

核磁共振碳谱¹³C-NMR(CDCl₃)δppm：160.5(C-1)，128.1(C-2)，143.6(C-3)，112.8(C-4)，128.1(C-5)，139.5(C-6)，105.1(C-7)，150.0(C-8)，145.1(C-9)，144.3(C-10)，107.5(C-11)，61.7(C-12)，60.8(C-13)。 

结构式为： 

根据上述物理和波谱数据，鉴定C_4-8为异虎耳草素(Isopimpinellin)，分子式为C₁₃H₁₀O₅。附图4至6给出了异虎耳草素的红外吸收光谱图，异虎耳草素的核磁共振碳谱图和异虎耳草素的核磁共振氢谱图。 

二、其次，再介绍一下本发明人对异虎耳草素进行鱼类试验的过程：试验例1异虎耳草素对鲫鱼的急性毒性试验 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1供试样品 

异虎耳草素，纯度为95.7％，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室制备提供。 

1.1.2试验动物 

试验所用鲫鱼要求体质健壮，规格均一，体重3.5～5g。购回后用浓度20mg.L^-1的K₂MnO₄药浴15～20min，捞出后在水簇箱中暂养7d左右， 每天投喂1～2次，投入的饲料(实验室自制饲料)在10min内吃完为限。待适应实验室环境条件后再进行毒性试验。 

1.1.3试验仪器 

ALC-1100.2百分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-500E型超声波清洗器；5～10μL，20～200μL移液器：VoluMate，Madein Germany；自动控温加热棒，浙江舟山市渔具厂生产；塑料盆(容积为8L)等。 

1.2试验方法 

1.2.1试验条件 

采用静水式试验法，每盆加充分瀑气的自来水5L，pH 7.2，控制水温为25±1℃，先加入试验药液充分混匀后再加入试验用鱼，每盆放养10尾。放养鱼后，要求保持水中溶氧在5mg.L^-1以上。为了保持恒定的药物浓度，每隔24h换水重新加药。 

1.2.2试验药物浓度的设定 

首先，反复进行预试验，确定正式试验药液浓度的大致范围，即试验鱼在24h内全部中毒死亡的药液浓度(14.0mg.L^-1)和96h内不发死亡的药液浓度(5.0mg.L^-1)。然后在预试验基础上，在药液浓度5.0～14.0mg.L^-1范围内按浓度对数等差(公差d＝0.0559)插入5.687、6.468、7.357、8.368、9.517、10.824、12.388mg.L^-1七个浓度试验组，进行正式试验，观察各浓度下试验鱼的中毒死亡情况。 

在试验期间随时观察记录试验鱼的死亡情况，如发现鱼中毒死亡，应即时捞出，以免影响水质，影响试验结果。判断鱼死亡的方法是当鱼停止呼吸后(鳃盖运动停止)，用玻璃棒或镊子轻击鱼的尾柄部，如果在3min 之内鱼体不产生任何应激反应，即可判断死亡。 

试验期间统计在24h、48h、72h和96h内各药物浓度下试验鱼的死亡情况。试验期间应保持安静，尽可能避免对试验鱼的任何干扰。当对照组的死亡率小于5％，各时间段内试验鱼的死亡率可不予校正；若对照组的死亡率大于5％，则应予校正，校正公式采用Abbott公式；如果对照组死亡率达20％以上，则在查找原因后，重新进行毒性试验。 

Abbott公式：p＝p′-C/1-C 

P：校正死亡率，即纯属药物引起的死亡率 

P′：试验组死亡率，即自然因素和药物引起的死亡率 

C：对照组死亡率，即自然因素引起的死亡率 

1.2.3异虎耳草素最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC₅₀) 

观察记录供试鱼在第24h、48h、72h和96h内的死亡情况，试验鱼各时间段开始出现死亡的最低浓度和下一个浓度为该时间段的最低致死浓度范围，并计算致死率。利用直线回归法，用直线回归方程y＝a+bx(x-药物浓度的浓度对数；y-死亡率转换成的概率单位；a，b分别为直线的截距与斜率。)，求出a与b，a与b的计算公式为： 

$a=\frac{\mathrm{\Σ}{x}^2\mathrm{\Σy}-\mathrm{\Σx\Σ}\left(\mathrm{xy}\right)}{\mathrm{k\Σ}{x}^2-{\left(\mathrm{\Σx}\right)}^2}$

$b=\frac{\mathrm{k\Σ}\left(\mathrm{xy}\right)-\mathrm{\Σx\Σy}}{\mathrm{k\Σ}{x}^2-{\left(\mathrm{\Σx}\right)}^2}$

k：药物浓度的组数(死亡率为0和100％的浓度不计算在内) 

求出a、b后，便可确定出回归方程，然后再将50％死亡率的概率单位y＝5.0带入方程，求出x，取其反对数，便得出该时间内的LC₅₀，并计算其95％的可信限，公式为： 

式中： $s=\frac{1}{b}$

N：供试的动物总数(死亡率为0和100％的浓度不计算在内 

x：LC₅₀值的对数 

1.2.4异虎耳草素安全浓度的计算 

根据Turbell公式计算安全浓度： 

2结果与分析 

2.1异虎耳草素半数致死浓度(LC₅₀) 

2.1.1异虎耳草素各试验浓度在不同时间内对鲫鱼致毒情况 

各试验药物浓度在第24h、48h、72h和96h内的鲫鱼死亡情况见表6。在药物浓度为6.5mg.L^-1的高浓度试验组，试验鱼中毒反应非常明显，用药后2h左右出现异常表现，鲫鱼将头浮出水面，继而行动迟缓，出现侧游，不久后开始出现麻痹，失去平衡，腹部朝上而死。在浓度为3.112mg.L^-1 的低浓度试验组中，鲫鱼表现较安静，对外界反应灵敏，活动正常。 

表6  异虎耳草素对鲫鱼的中毒死亡结果 

2.1.2最低致死浓度范围、半数致死浓度(LC₅₀) 

统计不同浓度试验药液在第24h、48h、72h和96h内的死亡情况，结果见表7，可看出在24h、48h和72h 3个时间段内最低致死浓度范围为7.357～8.368mg.L^-1，致死率为10％～20％。 

表7  异虎耳草素对鲫鱼的急性毒性结果 

将各试验浓度取其对数，得其浓度对数，并将各时间段试验鱼中毒死亡的百分率查表得其概率值，将各时间段的药物浓度对数及其对应的死亡率的概率值代入公式，求出回归方程，可计算出各时间段的半数致死浓度(LC₅₀)，和其LC₅₀的95％可信限，结果见表8。由表8可知，第24h内所得的回归方程为：y＝-9.6944758+13.704559x，LC₅₀＝11.722mg.L^-1，95％的可信限为10.897～12.915mg.L^-1；第48h内所得的回归方程为：y＝-8.0322651+12.77475x，LC₅₀＝10.476mg.L^-1，95％的可信限为9.752～11.421mg.L^-1；第72h内所得的回归方程为：y＝-8.8610072+13.72898x，LC₅₀＝10.224mg.L^-1，95％的可信限为9.395～11.135mg.L^-1；第96h内所得的回归方程为：y＝-9.7317639+15.055456x，LC₅₀＝9.517mg.L^-1，95％的可信限为9.005～10.340mg.L^-1。 

表8  各时间段的LC₅₀及其95％的可信限 

试验 时间	直线回归方程	LC50(mg.L-1)	95％的可信限   (mg.L-1)
				第24h	y＝-9.6944758+13.704559x	11.722	10.897～12.915
第48h	y＝-8.0322651+12.77475x	10.476	9.752～11.421
				第72h	y＝-8.8610072+13.72898x	10.224	9.395～11.135
第96h	y＝-9.7317639+15.055456x	9.517	9.005～10.340

2.2安全浓度计算结果 

根据Turbell公式计算出M1对鲫鱼的安全浓度， 

$=2.5095\mathrm{mg}.L^{-1}$

从结果显示，异虎耳草素对鲫鱼的安全浓度比较低，但是，实际药效测试中，浓度在11.000mg.L^-1的情况下，48h没有出现金鱼死亡的发生，结合杀灭指环虫的有效剂量是6.0mg.L^-1综合考虑，异虎耳草素作为杀虫渔药仍然具有很好的推广价值。 

试验例2异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫药效学试验 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1试验动物 

寄主模型为金鱼(Carassius auratus)，寄生虫模型为中型指环虫，均为西北农林科技大学水产科学实验室活体保种；感染金鱼体重均小于5g，来源于陕西省水产研究所观赏鱼养殖场。 

1.1.2供试样品 

异虎耳草素，纯度为95.7％，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室制备提供。 

1.2杀灭指环虫活性试验方法 

对感染了中型指环虫的活体金鱼抽样镜检观察，当金鱼鳃部中型指环虫感染的数量平均15～25个/尾时便可进行药效试验。 

使用体积为10L的10个塑料盆，盛入充分曝气地下水8L，pH 7.0～7.5，控制水温25±1℃，分别投放感染有中型指环虫的金鱼30尾。首先大范围设定异虎耳草素的使用浓度进行预试验，再根据杀虫的有效浓度按照梯度递增或递减重新设定，分别加入各浓度药物并搅拌均匀，48h时取金鱼全鳃制片、镜检，观察在不同浓度下对指环虫的杀灭效果，统计最高有效 浓度、最高杀虫率。试验重复3次，并设对照组。 

2结果与分析 

(1)对照组 

试验进行中设立的对照组鱼一般为30尾，分别在试验的0h、48h随即抽检10尾，解剖全鳃镜检统计感染中型指环虫平均数量。在试验的0h镜检，中型指环虫平均数量为16.6个/尾，试验进行48h，中型指环虫平均数量为22.5个/尾。以此与各药物测定的结果计算寄生虫的杀灭率。 

(2)异虎耳草素对指环虫杀灭结果 

表9  异虎耳草素在48h对中型指环虫杀灭效果 

异虎耳草素在48h杀灭中型指环虫的结果见表9。从表9可以看出，异虎耳草素当浓度为4.0mg/L时，杀虫力较弱，仅为25.6％；当浓度为6.0～8.0mg/L时，其杀虫率可达91～100％，浓度为8.0mg/L时杀虫率为100％，而对鱼是安全的；当浓度为11.0mg/L时，试验鱼出现中毒死亡，死亡率达20％。 

试验例3异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂药效学试验 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1试验动物 

寄主模型为金鱼(Carassius auratus)，寄生虫模型为中型指环虫，均为西北农林科技大学水产科学实验室活体保种；感染金鱼体重均小于5g，来源于陕西省水产研究所观赏鱼养殖场。 

1.1.2供试药品 

含30％异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂，由西北农林科技大学动物科技学院水产科学实验室制备提供。 

1.1.3仪器设备 

XH-B旋涡混合器：姜堰市康健医疗器具有限公司；BX41光学显微镜：日本奥林巴斯；德国赛多利斯公司万分之一电子天平；控温装置。 

1.2试验方法 

使用体积为10L的10个塑料盆，盛入充分曝气地下水8L，pH 7.0～7.5，控制水温25±1℃，分别投放感染有中型指环虫的金鱼30尾。首先大范围设定C₂₀H₂₇O₃的使用浓度进行预试验，再根据杀虫的有效浓度按照梯度递增或递减重新设定，分别加入各浓度药物并搅拌均匀，48h时取金鱼全鳃制片、镜检，观察在不同浓度下对指环虫的杀灭效果，统计最高有效浓度、最高杀虫率。试验重复3次，并设对照组。方法同前述的试验例2。 

2结果 

2.1对照组 

试验进行中设立的对照组鱼一般为30尾，分别在试验的0h、48h随即抽检10尾，解剖全鳃镜检统计感染中型指环虫平均数量。在试验的0h镜检，中型指环虫平均数量为20.3个/尾，试验进行48h，中型指环虫平均数量为23.3个/尾。以此与药物不同浓度测定的结果计算寄生虫的杀灭率。 

2.2异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂对指环虫杀灭结果 

异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂(异虎耳草素含量30％)在48h杀灭中型指环虫的结果见表10。从表10可以看出，当浓度为0.25mL/m³时，杀虫率较弱，仅为26.1％；当浓度为1.00mL/m³时，其杀虫率可达96.7％，浓度为5.00mL/m³时杀虫率为100％，而对鱼是安全的；当浓度为6.00mL/m³时，试验鱼出现中毒死亡，死亡率达13.3％。 

表10  异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂 

在48h对中型指环虫杀灭效果 

本研究结果表明，30％异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂对鱼类的中型指环虫具有显著的杀灭作用，其浓度为1.00-5.00mL/m³，杀灭率达100％，表明该制剂是一种应用前景良好的生物杀虫渔药。 

3讨论 

本研究结果表明，30％异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂对鱼类的中型指环虫具有显著的杀灭作用，其杀虫浓度为1.0mL/m³，杀灭率达100％，在该浓度下，换算成纯异虎耳草素用量为0.3mg.L^-1，低于试验例2种纯单体异虎耳草素的8.0mg.L^-1的用量，说明30％制剂中加入乳化剂后显著提高了在水体中的溶解度，从而也提高了药效，降低了异虎耳草素的用量。试验例4异虎耳草素与市场常规渔药杀虫效果比较试验 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1试验动物 

寄主模型为金鱼(Carassius auratus)，寄生虫模型为中型指环虫，均为西北农林科技大学水产科学实验室活体保种；感染金鱼体重均小于5g，来源于陕西省水产研究所观赏鱼养殖场。 

1.1.2供试药品 

甲苯咪唑(Mebendazolum)，含量99.8％，陕西汉江制药厂生产，吡喹酮(Praziquantelum)，含量96.5％，南京制药厂生产。 

1.1.3仪器设备 

XH-B旋涡混合器：姜堰市康健医疗器具有限公司；BX41光学显微镜：OLYMPUS。Made in Japan；德国赛多利斯公司万分之一电子天平；控温装置。 

1.2试验方法 

使用体积为10L的10个塑料盆，盛入充分曝气地下水8L，pH 7.0～7.5，控制水温25±1℃，分别投放感染有中型指环虫的金鱼30尾。首先大 范围设定血根碱的使用浓度进行预试验，再根据杀虫的有效浓度按照梯度递增或递减重新设定，分别加入各浓度药物并搅拌均匀，48h时取金鱼全鳃制片、镜检，观察在不同浓度下对指环虫的杀灭效果，统计最高有效浓度、最高杀虫率。试验重复3次，并设对照组。方法同前述的试验例2。 

2结果 

2.1对照组 

试验进行中设立的对照组鱼一般为30尾，分别在试验的0h、48h随即抽检10尾，解剖全鳃镜检统计感染指环虫平均数量。指环虫平均数量为29.7个/尾和44.3。以此与各浓度药物测定的结果计算寄生虫的杀灭率。 

2.2两种药物对寄生虫杀灭结果比较 

由表11可以看出，2种杀虫药物在试验48h时，甲苯咪唑的浓度为2.0g/m³时，杀虫率只有69.3％；吡喹酮2.0g/m³时，杀虫率为73.7％。而结合试验例3中异虎耳草素防治剂在2.0mL/m³，杀虫率为100％，可以看出，异虎耳草素防治剂比甲苯咪唑杀虫效果略好，显著高于吡喹酮的杀虫效果，异虎耳草素防治剂是一种杀灭鱼类指环虫很高活性的植物源渔药。 

表11  两种杀虫药物48h对指环虫杀灭结果 

三、最后，本发明人再给出几个关于异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂的3个具体制作方法： 

制作方法1： 

称取异虎耳草素5g和N，N-二甲基甲酰胺15g倒入不锈钢容器中搅拌完全溶解后，再加入70g无水乙醇，最后将吐温-80 10g混合均匀，即得100g异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂； 

制作方法2： 

称取异虎耳草素15g加入不锈钢罐中，再称量溶解剂N，N-二甲基甲酰胺20g，加入罐内，充分搅拌后，再加入无水工业乙醇57g搅拌完全溶解后，加入表面活性剂吐温-80为8g，充分搅拌均匀，即得该制剂100g。 

制作方法3： 

称取异虎耳草素30g加入不锈钢罐中，再称量溶解剂N，N-二甲基甲酰胺20g，加入罐内，充分搅拌后，再加入无水工业乙醇45g搅拌完全溶解后，加入表面活性剂吐温-80为5g，充分搅拌均匀，即得该制剂100g。 

Claims (6)

1.异虎耳草素在制备杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的药物中的应用。

2.一种杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的防治剂，其特征在于：它是由下列重量比的原料制成：异虎耳草素5％~30％，溶解剂10％~20％，表面活性剂5％~10％，其余为溶剂。

3.根据权利要求2所述的防治剂，其特征在于：所述的溶解剂是N，N-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求2所述的防治剂，其特征在于：所述的表面活性剂是指吐温-80。

5.根据权利要求2所述的防治剂，其特征在于：所述的溶剂为无水乙醇。

6.如权利要求2所述的杀灭鱼类体外寄生虫中指环虫的防治剂的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1)称取异虎耳草素、溶解剂、表面活性剂、溶剂各原料，备用；

2)将所述重量的异虎耳草素和溶解剂N，N-二甲基甲酰胺加入不锈钢容器中搅拌完全溶解后，再加入溶剂；

3)将5％～10％表面活性剂、加入步骤2)所得的溶液中混合，即得异虎耳草素杀灭鱼类体外寄生虫防治剂。

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