CN101463022B - 一种中药玉郎伞查耳酮类单体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药玉郎伞查耳酮类单体的制备及其应用。运用先进的植化分离、纯化技术，从中药玉郎伞中分离出查耳酮单体成分，并证明了其具有的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用，对心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤、心血管系统的保护作用。为治疗过氧化损伤、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性损伤等提供化学成分明确、新型高效的制剂。

Description

一种中药玉郎伞查耳酮类单体的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种药物的制备方法及应用，具体地说，涉及中药玉朗伞查耳酮类单体的分离、纯化方法；玉朗伞查耳酮类单体的抗氧化、耐缺氧、抗凝血及对心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤的保护作用。

背景技术

玉郎伞(YLS，也叫龙眼参)，原植物经考证为蝶形花科植物疏叶崖豆Millettia pulchraKurz var-laxior(Dunn)Z.Wei的块根。本发明人对玉郎伞进行了大量的药学、药效学研究，并申请了专利(名称：玉郎伞提取物的制备及应用，专利申请号：200710034771.2)。本发明是玉郎伞提取物前期研究工作的补充，增加了玉郎伞查耳酮类的单体分离及对心血管系统的保护作用等内容。

发明内容

本发明是对中药玉郎伞查耳酮进行深度开发，目的是按照中药现代化的思维模式，以药理活性为靶点，运用先进的植化分离、纯化技术，得到玉郎伞查耳酮的活性单体，进一步明确玉郎伞查耳酮的作用机制，为治疗过氧化损伤、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性损伤等提供化学成分明确、新型高效的制剂。

本发明所采取的技术方案：

本发明研究在国内外首次从YLS中分离出一个苯并呋喃查耳酮单体成分(记为化合物I)，其具有显著的抗氧化、耐缺氧、抗凝血及保护心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤的作用。

新单体结构特点：

1、一般黄酮类化合物的C3结构和苯环形成环状或近似环状物以保持高强度聚合势态，而此新单体的特点是C3部位与苯环的连接成线状共平面结构的高度共轭体系。

2、分子结构中含α、β双键和烯醇结构。

本发明采取的玉朗伞查耳酮单体的分离、纯化方法为：

(1)玉郎伞饮片以石油醚：乙酸乙酯＝1：1冷浸提取，提取液经减压浓缩、石油醚萃取除色素、酯类后得到浸膏；以薄层层析硅胶H为固定相，样品：硅胶H＝1：30，用不同比例石油醚/乙酸乙酯洗脱进行柱层析分离；

(2)以体外抗氧化活性为靶点追踪收集活性最高的石油醚/乙酸乙酯＝9.8/0.2部位洗脱液，浓缩，所得浸膏同上法进行二级硅胶柱分离；

(3)收集石油醚/乙酸乙酯＝8:2流份，常规方法减压浓缩得到晶体；以适量氯仿于60℃ 加热使晶体恰好全部溶解后，按氯仿溶液：甲醇＝1：6～8比例进行多次重结晶、制备薄层色谱，得到桔色方晶；

(4)以桔色方晶为原料，经安马西亚-100型制备纯化液相色谱系统进行纯化；色谱条件：流动相：CH₃CN:0.2％HAC＝85：15；流速：3ml/min；检测波长：λ＝238nm，依据峰收集，洗脱液经氮气挥干，得淡黄色粉末状查耳酮单体。

玉朗伞查耳酮单体的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用。

玉朗伞查耳酮单体对心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤、心血管系统的保护作用。

本发明通过分离、纯化方法从中药玉郎伞中分离出查耳酮单体成分，并证明了其具有的抗氧化、耐缺氧、抗凝血作用，对心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤、心血管系统的保护作用。为治疗过氧化损伤、血栓性疾病、缺氧、心肌缺血再灌注性损伤等提供化学成分明确、新型高效的制剂。

附图说明

图1为YLS查耳酮提取分离流程图。

图2为浸膏B的分离流程图。

图3为化合物I甲醇溶液紫外吸收光谱图(UV)。

图4为MS光谱图。

图5为¹HNMR谱图。

图6为¹³CNMR谱图。

图7为IR光谱图。

图8为化合物I的空间立体结构图。

具体实施方式

1.玉郎伞查耳酮类的单体分离、纯化及鉴定

1.1 玉郎伞查耳酮类单体的提取、分离

取玉郎伞饮片粉碎成2mm粒径，以石油醚(PE)：乙酸乙酯(ETOAC)＝1：1冷浸提取10次，直至提取液颜色变浅。提取液经减压浓缩、石油醚萃取除色素、酯类后得到黄酮类提取物浸膏。以浸膏：硅胶＝1：2比例进行硅胶拌样后作柱层析分离，分离固定相为薄层层析硅胶H，按样品：硅胶H＝1：30比例，以不同比例PE/ETOAC由低到高极性梯度洗脱，每500mL接取一流份，经TLC检查合并相同流份，共得到17个不同部位的浸膏及晶体，记为A-M。见图1。

按本发明方法，以体外抗氧化活性为靶点对以上17个部位进行进一步的追踪筛选，最终确定对体外抗氧化活性最高的晶体B以不同比例PE/ETOAC作进一步的多级分离，固定相比例 为1:200～400薄层H，每100mL接取一流份。

晶体B经PE:ETOAC/8:2洗脱分离出一黄色条带，洗脱液减压浓缩得到易溶于氯仿的物质，经多次CHCl₃/MEOH重结晶、制备薄层色谱，得到桔色方晶，记为桔晶。见图2。

1.2 玉郎伞查耳酮类单体的纯化

以桔晶为原料，经安马西亚-100型制备纯化液相色谱系统进行纯化。色谱条件：流动相：CH₃CN:0.2％HAC＝85：15；流速：3ml/min；检测波长：λ＝238nm，依据峰收集，洗脱液经氮气挥干，得淡黄色粉末状查耳酮单体，记为：化合物I。

1.3 定性实验

对化合物I进行盐酸—镁粉反应、乙酸镁反应、三氯化铝反应、Pb(AC)₂水溶液显色反应、Gregg-Gisroly反应、α-萘酚反应(Molish反应)等定性试验。结果见表1：

表1 化学定性实验结果

部位

盐酸—镁粉反应

乙酸镁反应

三氯化铝反应

Pb(AC)2显色反应

Gregg-Gisroly反应

α-萘酚反应

化合物I

+

+

+

-

-

-

1.4 性状、熔点、分子量测定及TLC分析

化合物I为淡桔色粉末，不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂；熔点为：120.0-121.0℃；以三种不同配比展开剂进行TLC分析均只显示一个斑点，结果见表2。

表2 化合物I TLC分析结果

展开液	PE：ETOAC＝4：1	PE：ACEt＝1：1	CH3Cl：ETOAC＝3：1
				化合物I(Rf)	0.16	0.56	0.65

1.5 紫外、红外、质谱、核磁、X—射线单晶衍射分析

1.5.1 紫外图谱

将化合物I的甲醇溶液在200-500nm间扫描，结果显示：化合物I在260nm和300nm处分别有两个吸收峰，均属黄酮类特异吸收峰。

1.5.2 红外图谱

化合物I少许经KBr压片，在红外光谱仪上进行分析，结果显示：3500，2529，2831，1600，1562，3133cm^-1为其特征吸收峰，其中，3500cm^-1是-OH的伸缩振动峰；2929，2831cm^-1为-CH₃的伸缩振动峰；1562cm^-1是C＝C共轭振动峰；3133cm^-1为苯环伸缩振动峰；1600cm^-1是C＝O伸缩振动峰，频率较低，说明羰基与α、β-不饱和双键共轭。

1.5.3 质谱APCL-MS(m/z)：293.22[M-1]⁺，277.44。分子量为294。

1.5.4 核磁图谱

从图谱可知各峰归属为：¹HNMR(CDCl₃)δ：3.95(3H，s，-OCH₃)，7.2(1H，d，5’-H)，8.2(1H，d，2’-H)，8.16、8.17(2H，s，2，6-H)，7.77(1H，s，α-H)，7.56、7.57(5H，m，3’，4’，3，4，5-H)。

¹³CNMR(CDCl₃)δ：60.2(C-9’)，104.2(C-α)，110.0(C-5’)，117.0(C-3’)，119.8(C-8’)，122.0(C-1’)，128.4(C-2’)，128.6(C-2，4，6)，130.6(C-3，5)，141.8(C-1)，145.7(C-4’)，150.0(C-6’)，154.8(C-7’)，158.2(C-β)，175.0(C＝O)。

1.5.2 X—射线单晶衍射单晶衍射数据见附录。

结果表明化合物I的空间立体结构如图8。

综合以上各谱图分析，得知化合物I的化学结构及相关参数如下：

(Z)-3-hydroxy-1-(4-methoxybenzofuran-5-yl)-3-phenylprop-2-en-1-one

Chemical Formula：C₁₈H₁₄O₄

Exact Mass：294.09

Molecular Weight：294.30

m/z：294.09(100.0％)，295.09(19.6％)，296.10(1.9％)

Elemental Analysis：C，73.46；H，4.79；O，21.75

经检索CA、Scifinder数据库未见报道，因此化合物I为一新化合物。

2.玉朗伞查耳酮类单体的体外抗氧化作用

依据表3-4建立体外氧自由基(·O₂ ^-)、羟自由基(·OH)发生体系，研究化合物I对·O₂ ^-和·OH的清除和抑制作用。实验发现：与空白对照组相比，终浓度分别为0.5、1.0、2.0mg.ml^-1的化合物1均能清除·O₂ ^-和·OH、抑制·O₂ ^-的生成(P<0.05)并呈浓度依赖性。其中，高浓度组效果最佳。结果表明化合物I有较强的抗氧化作用。结果见表5-7。

表3 抗氧自由基实验

注：·O₂ ^-抑制率的测定：用动态方法测定·O₂ ^-生成的反应初速率V₀(A.min^-1)，即反应取得启动后每30s测一相应A₃₂₂nm值，至4.5min止，将所得A₃₂₂nm值与时间进行回归分析，其斜率为V₀。

表4 抗羟自由基实验

表5 化合物I对·O₂ ^-的清除作用(x±s，n＝6)

注：与正常对照组比较，^*P<0.01

表6 化合物I对·O₂ ^-生成的抑制作用(x±s，n＝6)

注：与正常对照组比较，^*P<0.01

表7 化合物I对·OH的清除作用(x±s，n＝6)

注：与损伤组比较，^*P<0.01

3.玉朗伞查耳酮类单体的体内抗凝血及耐缺氧作用

化合物1以适量3％吐温-80生理盐水溶液溶解，分为高剂量组(100mg·kg^-1)、中剂量组(50mg·kg^-1)、低剂量组(25mg·kg^-1)进行试验。

将30只小鼠随机分为正常对照、阳性对照、化合物I高、中、低剂量共5组，每组6只，均通过腹腔注射给药(0.2ml/20g)。正常对照组注射生理盐水，阳性对照组注射维生素C(70mg·kg^-1)。给药20min后，用内径为1mm的毛细管插入小鼠内眦静脉，至毛细管血柱达到约5cm时取出，平放于桌上。每隔30s折断一小段毛细管(约5mm)，缓慢拉开，观察有无血凝丝出现，从毛细管采血到出现血凝丝的时间为凝血时间。取血后立即将小鼠置于内放15g钠石灰，体积为150ml的广口瓶中，用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不漏气。立即计时，以小鼠呼吸停止为死亡指标，观察记录小鼠因缺氧至死亡的时间。实验发现，与正常对照组相比，化合物I低、中、高剂量组均能延长小鼠的凝血及缺氧存活时间，其中，中剂量组效果最好；化合物I中剂量对小鼠耐缺氧能力的提高与Vit.C相似(P>0.05)。结果表明，化合物I具较强的抗凝血及耐缺氧作用并以中剂量组效应最显著。实验结果详见表8。

表8 化合物I抗凝血及耐缺氧实验结果(x±s，n＝6)

注：与空白组比较，*P<0.01；与VitC对照，**P>0.05

4.玉朗伞查耳酮类单体对心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤的保护作用

心肌细胞培养：取出生1-3天的乳鼠，按Harry方法加以改良进行心肌细胞的原代培养，培养三天后进行实验。

含药血清制备：取2只SD大鼠进行十二指肠给药，各注射2ml(60mg/kg)的化合物I，2ml 生理盐水，1h后腹主动脉取血，4℃，3500rpm离心15min，取上清液，即得含药血清和空白血清。

取搏动良好的细胞，随机分为7组：1.正常对照组(Control)2.阳性药维拉帕米组(终浓度20μM)3.化合物I10％含药血清(高剂量组)4.化合物I5％含药血清(中剂量组)5.化合物I2.5％含药血清(低剂量组)6.空白血清组(Blank)7.模型组(Model)。

以上各组细胞除正常对照组外，均按本室方法建立心肌细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤模型，缺氧2h，复氧4h后以MTT法进行各组细胞活力的检测；ELISA法测定各组心肌细胞Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性和细胞培养上清夜LDH、NOS活性。

实验发现，与空白血清相比，化合物1的高、中剂量含药血清均能明显增加心肌细胞的存活力，增强Na⁺-K⁺-ATP酶、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性，降低细胞培养上清夜LDH、NOS活性并呈剂量依赖性(P<0.05)。结果表明，化合物1对心肌细胞缺糖缺氧/复糖复氧损伤具有保护作用。实验结果详见表9-11。

表9 化合物I缺氧复氧心肌细胞存活力的影响(x±s，n＝8)

与模型组比较：^*P<0.05

表10 化合物I对缺氧复氧心肌细胞ATP酶活性的影响(x±s，n＝8)

与模型组比较：^*P<0.05，与对照组比较：^#P<0.05

表11 化合物I对缺氧复氧心肌细胞培养液中LDH、NOS活性的影响(x±s，n＝8)

与模型组比较：*P<0.05，与对照组比较：^#P<0.05

实施例1

玉郎伞查耳酮类单体的提取、分离

将玉郎伞饮片粉碎成2mm粒径，取粗粉18kg，以石油醚(PE)：乙酸乙酯(ETOAC)＝1：1冷浸提取10次，直至提取液颜色变浅。过滤，取其滤液，经减压浓缩、石油醚萃取除色素、酯类后得到黄酮类提取物浸膏100g。以浸膏：硅胶＝1：2比例进行硅胶拌样后作柱层析分离(分离固定相为薄层层析硅胶H，按样品：硅胶H＝1：30比例)，以不同比例PE/ETOAC由低到高极性梯度洗脱，每500mL接取一流份，经TLC检查合并相同流份，共得到17个不同部位的浸膏及晶体，记为A-M，即：浸膏A(F_r31-40)4.15g；浸膏B(F_r64-85)4.35g；白色C晶(F_r64-85)5.23g；白色D晶(F_r90-103)1.97g；浸膏E(F_r111-120)3.12g；白色F晶(F_r131-147)2.66g；浸膏G(F_r148-170)6.83g；浸膏H(F_r178-191)5.5g；浸膏I(F_r196-210)3.05g；浸膏J(F_r215-221)2.1g；浸膏K(F_r225-269)2.93g；浸膏L(F_r241-252) 4.09g；白色M晶(F_r255-269)1.38g。详见图1。

按本发明方法，以体外抗氧化活性为靶点对以上17个部位进行进一步的追踪筛选，最终确定对体外抗氧化活性最高的晶体B以不同比例PE/ETOAC作进一步的多级分离，固定相比例为1:200～400薄层H，每100mL接取一流份。

晶体B经PE:ETOAC/8:2洗脱分离出一黄色条带，洗脱液减压浓缩得到晶体，以适量氯仿于60℃加热，按氯仿溶液：甲醇＝1：6～8比例，多次CHCl₃/MEOH重结晶、制备薄层色谱，得到1.234g桔色方晶，记为桔晶。详见图2。

实施例2

玉郎伞查耳酮类单体的纯化

以1.234g桔晶为原料，经安马西亚-100型制备纯化液相色谱系统进行纯化。色谱条件：流动相：CH₃CN:0.2％HAC＝85：15；流速：3ml/min；检测波长：λ＝238nm，依据峰收集，洗脱液经氮气挥干，得1.016g淡黄色粉末状查耳酮单体。

Claims (3)

1.一种玉郎伞查耳酮类单体的制备方法，其特征是：

(Z)-3-羟基-1-(4-甲氧基苯并呋喃-5-基)-3-苯基-2-丙烯-1-酮单体的分离、纯化方法为：

(1)玉郎伞饮片以石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1冷浸提取，提取液经减压浓缩、石油醚萃取除色素、酯类后得到浸膏；以薄层层析硅胶H为固定相，样品∶硅胶H＝1∶30，用不同比例石油醚/乙酸乙酯洗脱进行柱层析分离；

(2)以体外抗氧化活性为靶点追踪收集活性最高的石油醚∶乙酸乙酯＝9.8∶0.2部位洗脱液，浓缩，所得浸膏同上法进行二级硅胶柱分离；

(3)收集石油醚∶乙酸乙酯＝8∶2流份，常规方法减压浓缩得到晶体；以适量氯仿于60℃加热使晶体恰好全部溶解后，按氯仿溶液∶甲醇＝1∶6～8比例进行多次重结晶、制备薄层色谱，得到桔色方晶；

(4)以桔色方晶为原料，经安马西亚-100型制备纯化液相色谱系统进行纯化；色谱条件：流动相：CH₃CN∶0.2％HAc＝85∶15；流速：3ml/min；检测波长：λ＝238nm，依据峰收集，洗脱液经氮气挥干，得淡黄色粉末状查耳酮单体。

2.根据要求1所述的玉朗伞苯并呋喃查耳酮单体在制备抗氧化、耐缺氧、抗凝血药中的应用。

3.根据要求1所述的玉朗伞苯并呋喃查耳酮单体在制备治疗心肌缺糖缺氧/复糖复氧损伤及心血管系统疾病药中的应用。

Images