CN104478687B - 从五味子中提取分离的化合物及其方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从五味子中提取分离的具有药理活性的化合物及其方法和应用，属于植物化学技术领域。所述化合物具有以下的结构特征：

Description

从五味子中提取分离的化合物及其方法和应用
技术领域
本发明涉及一种药物化合物及其提取方法和用途，具体涉及从五味子中提取分离的具有药理活性的化合物及其方法和用途，属于植物化学技术领域。
背景技术
五味子是木兰科植物五味子（SchisandrachinensisBaill）的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采摘，晒干作药用，其性味酸、甘、温，功能为敛肺止咳，滋阴涩精，止汗止泻，生津止渴，一般是用于主治虚咳气喘，遗精遗尿，肾泻与多汗口渴，作为服用多是采用同其他中药配伍煎服或制成中成药。但随着科学技术的发展及对中药综合研究的深入，中医药有了新的开发前景，并有着更加广阔的用途，如何开发研制新的有效药物成分，开拓新的应用领域已是人们所关心的问题。
如在公开文献“五味子抗肿瘤活性成分及作用机制研究进展”（《中国药理学通报》2012年第1期，任丽佳李林殷放宙蔡宝昌）一文中指出：五味子是一味常用的中药材，其含有木脂素、有机酸、挥发油、氨基酸、鞣质及多糖等多种化学成分。近年来，国内外对其抗肿瘤活性成分及作用机制研究日趋活跃。目前认为五味子主要抗肿瘤活性成分为多糖和木脂素。五味子抗肿瘤机制有多个方面，包括诱导肿瘤细胞凋亡、提高机体的免疫调节作用、抗氧化、清除自由基作用、抗突变和逆转肿瘤细胞的多药耐药性。
而本发明人在对五味子的活性成分进行研究时发现，五味子中所含的倍半萜化合物也具有抑制肿瘤细胞的作用，同时目前还尚未见有关倍半萜化合物对抑制肿瘤细胞的报道，更未发现市场上有与此化合物相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从五味子中提取分离的具有药理活性的新的药用化合物及其方法和用途。
实现本发明目的所采用的具体技术方案如下：
一种从五味子中提取分离的新的药用化合物，所述化合物具有以下的结构特征：
其化学名称为：3,7,11,11-四甲基-1,5,6，7,9,10-六氢环戊二烯并[c]并环戊二烯-2-酮，自命名为：五味子烯。
所述药用化合物从五味子中提取分离的具体工艺步骤是：
A．将五味子干燥的果实粉碎后用6-12倍重量浓度为90-95%的乙醇加热回流提取3-5次，减压浓缩至无醇后，将得到的浓缩液体静置24-36h，虹吸上层油；
B．将所得的油层用等质量的乙酸乙酯分散，用油层质量的2-3倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10-20倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用石油醚:乙酸乙酯=10:1的体积比为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集洗脱液，每管100ml为一份，每份用正己烷：丙酮=10：1.5的体积比为展开剂进行薄层层析，254nm紫外光下检视暗斑，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至浸膏；
C．将所得的浸膏用2倍质量的甲醇分散，再用0.45μm滤膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，剩余水溶液以乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，45℃减压浓缩至无乙酸乙酯即得淡黄色产物。
所述C18反相色谱填料高压制备分离：A：甲醇B：水，A：B70:30V/V为流动相；检测波长254nm。
本发明制得的淡黄色产物，呈油状，具有一定香辛气味，沸点117-120℃0.02mmHg(lit.)。
进一步分析结果如下：
所述化合物的电喷雾电离质谱显示，ESI-MS（e/z）：正离子219.17[M+H]+，241.15[M+Na]+；提示该化合物分子量为218。高分辨质谱给出的准分子离子峰为：241.1595[M+Na]+，计算值为（C15H22O+Na）241.1607，可以确定其分子式为C15H22O。
在1HNMRδppm中1.64（3H，s），0.99（3H，s），0.95（3H，s），0.94（3H，d，J=7.2）均为甲基氢信号，其中δ1.64偏向低场，说明与它相连的官能团起到了去屏蔽作用，该甲基与双键相连；δ0.99,0.95均为单峰，说明它们是与一个季碳相连；δ0.94被裂分为双峰，提示它是与一个次甲基相连。
13CNMR给出了15个碳信号，结合DEPT135o，δ209.3,182.4,130.9,44.4,34.5为季碳信号，δ44.7,38.6为次甲基碳信号，δ45.5,39.9,24.5,23.6为亚甲基碳信号，δ30.9,24.8,12.0,7.6为甲基碳信号。其中δ209.3为酮羰基碳信号，δ182.4，130.9为双键碳信号。
根据HSQC与HMBC，δH1.64（δC7.6）与δC182.4,130.9相关，说明δH1.64的甲基是与双键相连；δH0.99（δC24.8）与δC34.5,30.9相关，δH0.95（δC30.9）与δC34.5,24.8相关，说明δH0.99，0.95这两个甲基是与季碳δC34.5相连；δH0.94（δC12.0）与δC38.6相关，提示δH0.94该甲基信号是与次甲基δC38.6相连。
通过核磁二维HSQC，HMBC，H-HCOSY，NOESY等分析技术手段，对该化合物碳氢进行了全归属（见下表1），并根据它们的相关性，确定该化合物的结构。
通过以上数据分析，该化合物为3,7,11,11-四甲基-1,5,6，7,9,10-六氢环戊二烯并[c]并环戊二烯-2-酮，自命名为：五味子烯，其分子结构式如下：
经更深入的研究表明，所述药用化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，可作为在抑制肿瘤细胞药物中的应用。
本发明的有益技术效果在于：
1、化合物结构确定，明确了其药理活性。
2、化合物产品提取分离容易，方法简单，得率高。
3、进一步发掘了五味子新的药用作用，对于制备抑制肿瘤细胞生长药物具有很好的参考价值。
五味子烯作为一种首次报道其结构，并根据核磁二维等相关数据确定了其相对构型的新化合物，药理研究表明其对神经母细胞瘤细胞(neuroblastoma，NB)生长具有很好的抑制效果，在研制新型抗肿瘤物方面，能够作为一种潜体结构进行开发利用。
具体实施方式
实施例1化合物的提取分离
取五味子干燥果实500g，粉碎后加入6倍重量浓度为90%的乙醇加热回流提取5次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩提取液300ml，静置24h后，得到上层的油层120g；将所得的油层用120g乙酸乙酯分散，用油层质量的2倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比10：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集洗脱液，每管100ml为一份，每份用正己烷：丙酮=10：1.5为展开剂进行薄层层析，254nm紫外光下检视暗斑，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至浸膏,浸膏重5g；用10g甲醇分散，再用0.45μm滤膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，A：甲醇B：水，A：B70:30V/V为流动相；检测波长254nm，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，剩余水溶液以乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，45℃减压浓缩至无乙酸乙酯即得淡黄色产物0.85g。
实施例2化合物的提取分离
取五味子干燥果实500g，粉碎后加入10倍重量浓度为95%的乙醇加热回流提取4次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩提取液400ml，静置24h后，得到上层的油层130g；将所得的油层用130g乙酸乙酯分散，用油层质量的2.5倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以15倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比10：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集洗脱液，每管100ml为一份，每份用正己烷：丙酮=10：1.5为展开剂进行薄层层析，254nm紫外光下检视暗斑，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至浸膏,浸膏重6g；用12g甲醇分散，再用0.45μm滤膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，A：甲醇B：水，A：B70:30V/V为流动相；检测波长254nm，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，剩余水溶液以乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，45℃减压浓缩至无乙酸乙酯即得淡黄色产物0.90g。
实施例3化合物的提取分离
取五味子干燥果实500g，粉碎后加入12倍重量浓度为92%的乙醇加热回流提取3次，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩提取液500ml，静置24h后，得到上层的油层150g；将所得的油层用150g乙酸乙酯分散，用油层质量的3倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以20倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比10：1为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集洗脱液，每管100ml为一份，每份用正己烷：丙酮=10：1.5为展开剂进行薄层层析，254nm紫外光下检视暗斑，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至浸膏,浸膏重5.5g；用11g甲醇分散，再用0.45μm滤膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，A：甲醇B：水，A：B70:30V/V为流动相；检测波长254nm，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，剩余水溶液以乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，45℃减压浓缩至无乙酸乙酯即得淡黄色产物0.89g。
实施例4化合物（五味子烯）抑制肿瘤细胞实验
用MTT法测定化合物对神经母细胞瘤细胞(neuroblastoma，NB)的抑制效果。把培养好的神经母细胞瘤细胞制成单细胞悬液，用细胞板计数并稀释至细胞浓度为6×104个/mL于96孔板中接种细胞，每孔80uL。另设2孔无细胞、仅有80μL培养液[Dulbecco’smodifiedEagle’smedia(DMEM,Gibeo,USA)+10%小牛血情]的用于仪器调零的空白对照孔。置37℃，5%CO2的培养箱中培养24h，然后加入20μL用培养液稀释好的样品。同时，往阳性对照孔加20μL顺铂，往阴性对照孔和空白对照孔各加入20μL培养液。继续培养72h，每孔加10uL5mg/mLMTT。37℃反应4h，每孔加100μL10%SDS-0.01moL/LHCL溶液过夜。酶标仪比色测定（测定波长570nm，参考波长655nm）。对肿瘤细胞的抑制率计算方法为（阴性对照组OD值-实验组OD值）/（阴性对照组OD值-空白组OD值）×100%。采用SPSS软件计算IC50值。实验表明，化合物对神经母细胞瘤细胞的IC50值为0.162mM，化合物显示了较强的抑制神经母细胞瘤细胞的活性。可见，本发明所述的倍半萜化合物可作为抗肿瘤药物或其他生物活性先导物。

Claims (6)

1.一种从五味子中提取分离的药用化合物，其特征在于：所述化合物具有以下的结构特征：
其化学名称为：3,7,11,11-四甲基-1,5,6，7,9,10-六氢环戊二烯并[c]并环戊二烯-2-酮，自命名为：五味子烯。
2.如权利要求1所述的从五味子中提取分离的药用化合物，其特征在于：所述化合物为淡黄色油状，具有一定香辛气味，沸点117-120℃0.02mmHg(lit.)。
3.如权利要求1或2所述的从五味子中提取分离的药用化合物，其特征在于：所述化合物的电喷雾电离质谱ESI-MS显示：正离子219.17[M+H]+，241.15[M+Na]+；即该化合物分子量为218；且高分辨质谱给出的准分子离子峰为：241.1595[M+Na]+，计算值为241.1607[M+Na]+，分子式为C15H22O。
4.制备如权利要求1或2所述的从五味子中提取分离的药用化合物的方法，其特征在于：具体工艺步骤是：
A．将五味子干燥的果实粉碎后用6-12倍重量浓度为90-95%的乙醇加热回流提取3-5次，减压浓缩至无醇后，将得到的浓缩液体静置24-36h，虹吸上层油；
B．将所得的油层用等质量的乙酸乙酯分散，用油层质量的2-3倍硅胶拌样，所得硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，以10-20倍的硅胶为填料，湿法装柱，干法上样，用石油醚:乙酸乙酯=10:1的体积比为洗脱剂进行常压洗脱，分管收集洗脱液，每管100ml为一份，每份用正己烷：丙酮=10：1.5的体积比为展开剂进行薄层层析，254nm紫外光下检视暗斑，将含有目标化合物的收集液合并，于45℃减压浓缩至浸膏；
C．将所得的浸膏用2倍质量的甲醇分散，再用0.45μm滤膜过滤，滤液再经C18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰,回收甲醇，剩余水溶液以乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯相用无水硫酸钠脱水后，45℃减压浓缩至无乙酸乙酯即得淡黄色产物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述C18反相色谱填料高压制备分离：A：甲醇B：水，A：B70:30V/V为流动相；检测波长254nm。
6.如权利要求1所述的从五味子中提取分离的药用化合物在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。
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