CN105481820A - 一种新的环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的环烯醚萜类化合物，可以从杜仲的干燥树皮中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够使H₂O₂应激损伤后心肌细胞存活率明显增加，培养液中LDH活性明显降低，可以用来开发成心肌保护的药物。

Description

一种新的环烯醚萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从杜仲的干燥树皮中分离得到的一种具有心肌保护作用的环烯醚萜类化合物及其制备方法。

背景技术

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)属被子植物门，杜仲科，杜仲属(单科单属)，落叶乔木。其高达20m、树皮灰褐色，粗糙，连同枝、叶、根均含胶，折断有银白色细丝。叶椭圆或椭圆伏卵型，长6～18cm，边缘有锯齿，下边脉上有毛，叶柄长1～2cm，果为翅果扁平而薄，内含一种子。杜仲作为中药在我国已有2000多年的药用历史，《神农本草经》和《本草纲目》均将其列为上品，其具有多种功效，主要用于治疗肾虚腰痛，筋骨无力，妊娠漏血，胎动不安，高血压症。

近年来，各国学者对杜仲的化学成分进行了大量研究，目前经过分离和鉴定的有机化合物约有70种以上，无机矿物元素不少于15种。研究还发现，杜仲皮、花、叶和枝条等各部分中含有相似的化学成分，主要包括：木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、多糖、氨基酸和杜仲胶等有机化合物，及钙、铁等无机元素。

现代药理学也证明，杜仲具有多种功能活性，如：降血压作用，抗衰老、抗癌、抗菌、镇痛、消炎，利尿、镇静、安神，抗病毒作用，增强机体非特异免疫力，并能对细胞免疫进行双相调节等功效，另外对神经中枢也有一定作用等。杜仲也因其显著的生理活性得到了众多学者的关注。但目前，对杜仲的研究主要还集中在化学成分方面，而杜仲功能成分的研究还处于浅层的验证性研究阶段，多种活性功能的物质基础还有待于进一步的确定。同时，随着杜仲化学成分研究的进一步深入，杜仲的新型活性功能也有待于发掘。分析杜仲化学成分同类化合物的功能活性，将有助于杜仲活性功能的物质基础研究及新型活性功能的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种从杜仲的干燥树皮中分离得到的一种具有心肌保护作用的环烯醚萜类化合物及其制备方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)杜仲的干燥树皮粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备心肌保护的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

制备方法：(a)将杜仲的干燥树皮(8kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(145g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积)、50:1(8个柱体积)、30:1(6个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(239mg)。

结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z405.1926，结合核磁特征可得分子式为C₂₀H₃₀O₇，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，600MHz)：H-1(5.75，d，J＝5.4)，H-3(6.24，s)，H-5(2.74，dd，J＝15.0，7.8)，H-6(1.68，m)，H-6(1.89，m)，H-7(3.87，m)，H-8(2.31，m)，H-9(2.68，ddd，J＝10.0，5.0，5.0)，H-10(9.75，m)，H-11(4.23，d，J＝15.0)，H-11(4.46，d，J＝15.0)，H-2’(2.08，dd，J＝8.5，4.5，2H)，H-3’(2.00，m)，H-4’(0.90，d，J＝4.5)，H-5’(0.91，d，J＝4.5)，H-2”(2.06，d，J＝9.0，2H)，H-3”(2.01，m)，H-4”(0.88，d，J＝5.5)，H-5”(0.88，d，J＝5.5)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，150MHz)：90.7(CH，1-C)，139.8(CH，3-C)，112.7(C，4-C)，32.1(CH，5-C)，39.6(CH₂，6-C)，73.2(CH，7-C)，47.3(CH，8-C)，39.2(CH，9-C)，204.5(CH，10-C)，63.0(CH₂，11-C)，171.5(C，1’-C)，42.7(CH₂，2’-C)，25.2(CH，3’-C)，21.7(CH₃，4’-C)，21.6(CH₃，5’-C)，172.8(C，1”-C)，43.1(CH₂，2”-C)，25.1(CH，3”-C)，21.7(CH₃，4”-C)，21.7(CH₃，5”-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱表明该化合物含有羟基，羰基和烯烃结构(3310cm^-1，1748cm^-1和1664cm^-1)。¹HNMR谱显示了两个异戊酰基结构[δH2.08(dd，J＝8.5，4.5Hz，2H，H-2’)，2.00(m，H-3’)，0.90(d，J＝4.5Hz，H-4’)，0.91(d，J＝4.5Hz，H-5’)，2.06(d，J＝9.0Hz，2H，H-2”)，2.01(m，H-3”)，0.88(d，J＝5.5Hz，H-4”)，0.88(d，J＝5.5Hz，H-5”)]，一个烯属质子信号[δH6.24(s，H-3)]，以及一个醛基质子信号[δH9.75(m，H-10)]。¹³CNMR谱显示了20个碳信号，包括四个甲基信号[δC21.7(C-4’)，21.6(C-5’)，21.7(C-4”)和21.7(C-5”)]，四个亚甲基[一个含氧亚甲基δC63.0(C-11)]，九个次甲基[两个含氧次甲基δC90.7(C-1)和73.2(C-7)，一个含氧烯烃次甲基δC139.8(C-3)，以及一个醛基δC204.5(C-10)]和三个季碳[一个烯烃季碳δC112.7(C-4)，两个酯羰基δC171.5(C-1’)和172.8(C-1”)]。HMBC谱中，H-1(δH5.75，d，J＝5.4Hz)和H₂-2’(δH2.08，dd，J＝8.5，4.5Hz，2H)与C-1’(δC171.5)，以及H₂-11(δH4.23，d，J＝15.0Hz和4.46，d，J＝15.0Hz)，H₂-2”(δH2.08，dd，J＝8.5，4.5Hz，2H)和H-3”(δH2.01，m)与C-1”(δC172.8)的相关性表明了两个异戊酰基分别于C-1和C-11相连。通过核磁数据分析可知C-8位连有一个醛基；HMBC谱中H-10(δH9.75，m)与C-7(δC73.2)，H-9(δH2.68，ddd，J＝10.0，5.0，5.0Hz)与C-10(δC204.5)的相关性验证了上述推论。含氧碳信号(δC73.2，C-7)以及质子信号(δH3.87，m，H-7)表明C-7位连有一个羟基。ROESY谱中，H-9与H-5，H-9与H-6β，H-5与H-6β的交叉峰表明H-5和H-9为β构型；H-1与H-8和H-6α的相关性表明H-1和H-8为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

新生1～3天SD大鼠乳鼠(SPF级)，雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供(试验动物生产许可证：SCXK桂2009-0002)。化合物(Ⅰ)(纯度≥98％)为自制。胎牛血清购于HyClone公司，DMEM培养基购于GIBCO公司，二甲基亚砜(DMSO)、0.25％胰酶(含EDTA)购于Solarbio公司，5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司，LDH测试盒购于南京建成生物工程研究所，NOS试剂盒(分型)南京建成生物工程研究所，ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，cTnI酶联免疫吸附测试试剂盒、CK-MB酶联免疫吸附测试试剂盒购于武汉优尔生。

CO₂培养箱(ThermoForma)，CKX41相差显微镜(OLUMPUS)，Model450自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)，96孔板(JET)，722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，可调式微量移液器(ThermoForma)，单人单面超净工作台(苏州净化设备总厂)，XD-101型倒置生物显微镜(南京江南光电)，DW-40L262(低温保存箱)、DW-86L628立式超低温保存箱(Haier特种电器有限公司)，手提式压力蒸汽灭菌器、立式蒸汽灭菌器(广州华南医药器械有限公司)，JA2003微量天平(上海第二天平仪器厂)，5415D型低温高速离心机(德国Eppendorf)，LQP-B-4颗粒制冰机(上海安亭)。

二、试验方法

1、心肌细胞的原代培养

具体步骤：(1)超净工作台中，将乳鼠放置于250mL烧杯中，喷以75％酒精进行皮肤消毒。(2)左手捏住鼠背部，右手持无菌眼科剪在胸骨正中偏左平剑突刺入胸腔，抬起剪刀头端，向前挑起剪一纵向切口，再平剑突往左右剪开约2cm，左手捏住背部皮肤挤压胸部，就可以见跳动的心脏，换无菌弯镊将心脏取出，置于冷的PBS溶液培养皿中。用无菌眼科剪和镊除去心房、结缔组织及细胞膜后将心脏放入10mL西林瓶中，用冷PBS溶液反复冲洗三遍，洗净残血。(3)用无菌弯剪剪碎心脏(约1～2mm大小)，加入冷PBS溶液，并冲洗无菌弯镊，用吸管将小组织块悬液转移至离心管中，冷PBS再清洗两遍。(4)第一、二次消化：按预温好的胰酶与组织块以2:1的比例缓慢沿离心管壁缓慢加入，室温下以无菌吸管反复轻柔吹打帮助消化，观察组织块出现丝状物，上清变浑浊，根据浊度停止消化，吸出第一、二次消化的上清液，弃去。(5)继续消化，步骤同(4)，直至小组织块基本消化完全为止。收集细胞悬液。(6)将所有细胞悬液过200目细胞筛，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，冷PBS洗涤，1000rpm离心2次，每次8min，弃去上清。(7)台盼兰计数：(6)所得沉淀中加入适量DMEM培养基，制成细胞悬液，取0.4％台盼兰染液10μL与细胞悬液90μL混匀，室温放置2～3min，将清洁的细胞计数板放置在倒置显微镜台上，在盖玻片边缘滴1～2滴已染色好的细胞悬液，镜检可见圆形分散的细胞分布在各处，活细胞整体完整，透明而不着色，而不健康细胞会着色，计数时除去，计数四大方格的细胞数。压线的细胞只记左线和上线者，细胞团按一个细胞计数，按以下公式计算悬液的细胞数。细胞数/mL＝四大方格细胞数总数/4×10000×稀释倍数(8)按3×10⁵～5×10⁵细胞密度接种到培养瓶中，放入95％O₂，5％CO₂培养箱中差速贴壁约2h。差速贴壁后的细胞悬液接种至培养板中，前48h加入终浓度为100μmol/L的5-Brdu，以抑制非心肌细胞的生长，置于培养箱中继续培养。每24h进行换液。

2、过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤模型的建立

选取培养3～4天、生长良好、搏动规律的心肌细胞，吸弃孔内旧培养基，换新培养基，同时加入终浓度为600μmol/L的H₂O₂，重置于CO₂培养箱中，常规培养24h，建立H₂O₂诱发心肌细胞氧化应激损伤模型。

3、实验分组及给药

化合物(Ⅰ)给药设低、中、高三个剂量组，浓度分别为0.6、6和60μmol/L；阳性药物维拉帕米(Verapamil)组的终浓度为25μmol/L。选择生长良好、搏动规律的细胞，随机分为：正常(control)；模型(Model)；阳性药物组；溶媒对照组(DMSO)；化合物(Ⅰ)低、中、高剂量，共7组，每组设6个复孔。各组均于造模前12h吸去孔内旧培养液，换成Hanks液以使各组细胞同步生长(即平衡)，各给药组在造模前加入相应药物预孵2h。除正常组外，平衡后的各组细胞均按上方法加入建立心肌细胞H₂O₂损伤模型。造模结束后吸取各组细胞培养上清液，-20℃冰箱保存待测生化指标。各组心肌细胞则按常规方法加入适量0.125％胰蛋白酶消化，4℃、800rpm离心10min，弃去上清，以生理盐水制成2×10⁶～3×10⁶细胞悬液，-80℃冰箱保存备用。

4、MTT法测定心肌细胞存活力

用96孔板培养的各组心肌细胞于造模后加入10μLMTT继续培养4h，倾去培养液，加入DMSO150μL，平板震荡器震荡5min，使结晶物充分溶解。以Hanks液培养调零，用酶标仪以570/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度(OD值)，重复3次。

5、心肌细胞培养液中LDH活力的测定

实验原理：乳酸脱氢酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。样品前处理，按照下表进行。依照试剂盒要求将辅酶Ⅰ、碱性溶液适当稀释。

计算心肌细胞培养液中LDH活力：LDH活力(U/L)＝(OD_U-OD_C)/(OD_S-OD_B)×C_s×N×1000。N为培养液的稀释倍数。

6、统计分析

数据采用平均值±标准差表示，应用SPSS13.0统计软件分析处理数据，计量资料组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。

三、结果及结论

1、过氧化氢损伤前后心肌细胞活力

正常组的细胞存活率按100％计，试验结果显示：H₂O₂应激损伤后心肌细胞存活率较正常组心肌细胞下降(P<0.05)；DMSO溶媒组与模型组相比较，DMSO对心肌细胞存活率无影响(P>0.05)；而化合物(Ⅰ)各给药组均能使心肌细胞存活率明显增加(P<0.01)。结果见表1(*P<0.01vs正常组，#P<0.01vs模型组，▲P>0.05vs模型组)。

2、心肌细胞过氧化氢损伤培养液中LDH的活性

与正常组比，模型组LDH含量明显增高(P<0.01)；与模型组比较，溶媒组的LDH含量无显著性差异(P>0.05)，而化合物(Ⅰ)低、中、高剂量组、阳性药物组的LDH活性明显降低(P<0.01)。结果见表2(*P<0.01vs正常组，#P<0.01vs模型组，▲P>0.05vs模型组)。

提示化合物(Ⅰ)可以进一步研究开发成心肌细胞保护的药物。

表1化合物(Ⅰ)对H₂O₂应激损伤后心肌细胞存活率的影响(x±s，n＝6)

组别	OD	存活率％
			正常组	0.434±0.023	100
模型组	0.276±0.036*	63.696±8.409*
			溶媒对照组	0.304±0.038*▲	69.958±8.721*▲
低剂量组	0.364±0.027#	85.095±6.285#
			中剂量组	0.364±0.027#	85.095±5.295#
高剂量组	0.394±0.024#	90.741±5.552#6 -->
			阳性药组	0.382±0.019#	88.129±4.834#

表2化合物(Ⅰ)对H₂O₂应激损伤后心肌细胞LDH含量影响(x±s，n＝6)

组别	n	LDH(U/L)
			正常组	6	699.337±39.015
模型组	6	931.165±79.233*
			溶媒对照组	6	914.447±33.704*▲
低剂量组	6	816.082±20.076#
			中剂量组	6	771.092±32.905#
高剂量组	6	716.445±49.829#
			阳性药组	6	725.410±12.564#

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将杜仲的干燥树皮粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备心肌保护的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。