CN101649000A - 一种高纯度灵芝多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度灵芝多糖的制备方法，该方法包括水提法提取粗多糖、木瓜蛋白酶处理、阴离子树脂处理、透析或超滤处理收集大于1万分子量的部分，最后冷冻干燥得到。使用该方法制备的灵芝多糖的含量可达到50％以上，且多糖的活性高。并且该方法操作要求简便易行，适合放大到规模化生产。

Description

一种高纯度灵芝多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及药用真菌领域，具体地说涉及一种高纯度灵芝多糖的制备方法。
背景技术
灵芝多糖是药用真菌灵芝中的主要药效成分之一，具有免疫调节和抗肿瘤、抗衰老、抗高血压等活性，随着近年发现灵芝多糖有越来越多的生物活性，各种灵芝多糖产品开始也越来越多，但因提取方式粗糙，精深加工成本较高等原因导致其纯度均不高，加上消费者对产品的纯度、保健功能、安全性和方便性的要求也在逐渐提高。
目前广泛采用的提取方法是水提法，提取之后的粗多糖产品中含有色素、蛋白、小分子物质等不少杂质，使得多糖制品颜色较深且活性成分多糖的含量不高，往往只能达到10％-20％。对灵芝多糖采用的脱色方法主要有活性碳吸附和氧化两类，但是这两种方法往往会导致多糖的损失；脱蛋白方法大多使用Savag法，该方法因为使用了大量的有机溶剂并且毒性较大，且回收不便，成本较高，因而不适合规模化的处理。
发明内容
本发明提供了一种高纯度灵芝多糖的制备方法，解决了现有技术中的缺陷。
本发明高纯度灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤：
①水提法提取粗多糖；
将灵芝子实体粉碎成小块，按照1kg子实体：15-25L水的比例加水并加热至沸腾，1-3小时，之后用滤布(100目)过滤，滤渣重复上述步骤再提取1-2次后过滤，合并滤液，干燥。
②将粗多糖按0.5-2％的质量比配制成水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为粗多糖的3％-5％(质量百分比)，于37-40℃，反应20-40分钟；木瓜蛋白酶反应的作用是水解粗多糖中的蛋白。
③酶反应后的粗多糖溶液加入弱碱性阴离子树脂柱中进行处理，其中粗多糖溶液与弱碱性阴离子树脂的比例为：1升粗多糖溶液∶1.5-2公斤树脂；流速1-2ml/min；收集处理之后的流出液；这一步的作用是脱色和除去水解后的蛋白。
④将收集到的流出液用1万分子量级别的中空纤维柱进行超滤，或用1万分子量级别的透析膜进行透析处理；收集大于1万分子量的部分，浓缩、干燥。
最终得到脱色并除去大部分蛋白及其他杂质的灵芝多糖产品。
本发明使用的灵芝菌种为赤芝，产自浙江龙泉；
本发明使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司。
本发明使用的弱碱性阴离子树脂可选自下述树脂：环氧骨架，功能基团为-NH2，＝NH，≡N，＝N＝，具体如上海华震科技有限公司提供的335型树脂。树脂在使用前最好先经过预处理，使其pH值为7-8。预处理方法如：
先用3％的盐酸浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至中性；再用3％的NaOH溶液浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至pH7-8；
使用该方法制备的灵芝多糖的含量可达到50％以上，且多糖的活性也比粗多糖要高。并且该方法操作要求简便易行，适合放大到规模化生产。
附图说明
图1工艺路线图
图2灵芝多糖可见光吸收曲线对比图
图3灵芝多糖免疫活性对比图
具体实施方式
实施例1
水提法制备灵芝子实体粗多糖。
将灵芝子实体经切片机切片并用粉碎机粉碎成小块，按照1kg子实体：20L水的比例加水并加热至沸腾，沸腾持续2小时，之后用滤布(100目)过滤，滤渣重复上述步骤再提取一次后过滤，合并两次提取的滤液，浓缩之后进行喷雾干燥成粉末状。得到粗多糖。
实施例2
1.原料制备
实施例1的灵芝子实体粗多糖1克，按照1.5％质量比配制成水溶液，离心除去沉淀部分。
2.蛋白酶处理
将木瓜蛋白酶按照粗多糖质量的3％的量加入粗多糖溶液中，于40℃，反应半小时。
3.弱碱性阴离子树脂处理
弱碱性阴离子树脂预处理：用3％的盐酸浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至中性，再用3％的NaOH溶液浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至pH7-8；
将上述酶反应后的粗多糖溶液加入装填预处理后的弱碱性阴离子树脂柱中进行进一步的脱色和脱蛋白处理，其中1升水提溶液加入1.5公斤树脂中，流速为1ml/min；加入后继续用20倍体积的蒸馏水按同样流速冲洗，收集处理之后的流出液。
4.将流出液浓缩至30mL左右后，用截留分子量为1万透析膜进行透析处理；收集分子量大于1万的部分。
5.冷冻干燥
放置于-10℃冷冻3小时，然后置于-80摄氏度冷冻6小时，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到纯化后的灵芝多糖提取物。
实施例3
1.原料制备
实施例1的灵芝子实体粗多糖1克，按照1％质量比配制成水溶液，离心除去沉淀部分。
2.蛋白酶处理
将木瓜蛋白酶按照5％(相对粗多糖质量比)加入粗多糖溶液中，于39℃，反应40分钟。
3.弱碱性阴离子树脂处理
弱碱性阴离子树脂预处理：用3％的盐酸浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至中性，再用3％的NaOH溶液浸泡4小时，之后用蒸馏水冲洗至pH7-8；
将上述酶反应后的粗多糖溶液加入装填预处理后的弱碱性阴离子树脂柱中进行进一步的脱色和脱蛋白处理，其中1升水提溶液加入2公斤树脂中，流速2ml/min；收集处理之后的流出液。
4.将流出液浓缩至50mL左右后，将浓缩液转到1万分子量的超滤纤维柱上进行超滤；收集分子量大于1万的部分。
5.冷冻干燥
先放置于-20℃冷冻2小时，然后置于-90摄氏度冷冻5小时，之后转到冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，最后得到纯化后的灵芝多糖提取物。
实施例4多糖、蛋白质含量以及脱色率的测定
将实施例2和实施例3获得的灵芝多糖提取物与仅经过水提干燥后的实施例1的灵芝粗多糖各取一定质量溶解于蒸馏水中进行测定，多糖测定采用苯酚硫酸法，蛋白质测定采用Lowry法，脱色率测定由样品的可见光波段吸收曲线(附图2)计算得出。
  实施例1   实施例2   实施例3
  多糖含量   15.09％   54.67％   55.72％
  蛋白含量   36.24％   22.21％   10.96％
  脱色率   -   43.10％   83.40％
实施例5灵芝多糖体外刺激免疫细胞活性实验
先将待测的样品透析，冷冻干燥后，精确称取多糖样品于灭过菌的eppendorf管中，用PBS缓冲液配置成浓度10mg/mL。充分溶解然后以15000rpm/min离心30分钟，无菌条件下转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成浓度为5mg/mL、2mg/mL和0.5mg/mL待用。
小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3～4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎后的混悬液以400×g离心6min，吸去上清液，加入浓度为0.83％氯化氨溶液裂解红细胞，反复冲打，静置10min后400×g离心6min，收集的细胞用PBS缓冲液冲洗数遍后，台朌蓝检查活力在95％以上。用RPMI1640将细胞稀释成2×106个/mL，加入96孔细胞培养板中，在37℃、含5％的CO2条件下培养。
将180μL每mL含2×106个淋巴细胞的悬浮液加至96孔板中，同时加入20μL样品，PHA(植物血凝素)6μg/mL作为阳性对照，PBS缓冲液作为阴性对照。于37℃、含5％的CO2条件下培养3d，用酶标仪测定其570nm和600nm处的吸光度，然后加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，变色后再测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对细胞增殖的影响。
计算公式为：
增殖率(％)＝117216×Aλ570(sample)-80856×Aλ600(sample)/117216×Aλ570(control)-80856×Aλ600(control)×100％
结果见附图3，由此结果看出，实施例2和实施例3的灵芝多糖具有比实施例1的灵芝多糖更显著的刺激免疫细胞增殖的活性。

Claims (1)

1.一种高纯度灵芝多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
①水提法提取粗多糖；
②将粗多糖按0.5-2％的质量比配制成水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶的加入量为粗多糖重量的3％-5％，于37-40℃，反应20-40分钟；
③酶反应后的粗多糖溶液加入弱碱性阴离子树脂柱中进行处理，其中粗多糖溶液与弱碱性阴离子树脂的比例为1升粗多糖溶液：1.5-2公斤树脂；流速1-2ml/min；收集处理之后的流出液；
④将流出液经过透析或超滤处理，收集流出液中分子量大于1万的部分，浓缩、干燥。
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