CN111150739B - 扁蓄苷的用途以及从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及扁蓄苷的用途以及从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法。具体地，本发明提出了扁蓄苷在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防包括选自血癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤或淋巴瘤的至少之一。本发明还提出了依次利用乙醇‑水体系、甲醇‑氯仿体系、甲醇‑水体系和乙腈‑水体系从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法，该提取方法步骤简单，参数精确，生产时间短，利于工业化应用，且获得的产品扁蓄苷的纯度高达98％，可以作为珠芽蓼鉴别和含量测定的对照品。

Description

扁蓄苷的用途以及从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，本发明涉及扁蓄苷的用途以及从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法。
背景技术
2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据。截至2017年8月30日，全国肿瘤登记中心共收集到全国31个省、自治区、直辖市的449个登记处提交的2014年肿瘤登记资料。按发病病例数排位，肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，其后依次为胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。中国的癌症发病率和死亡率一直在上升，从2010年开始已经成为主要的致死原因，成为了中国的一个主要公共卫生问题。目前抗癌药物选择性低，会无差别杀死癌细胞及机体正常细胞，副作用极强。因此，寻求更安全，副作用更小的抗肿瘤药物具有极其重要的意义。
大量研究结果和临床实验证明，中药及其提取物具有效果平和，耐受性好，毒副作用小，作用持久等独特优点。因此，植物来源的肿瘤抑制剂迎合了人们的安全需求，适合作为新抗癌物质进行研究。
珠芽蓼属蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum L.)，为多年生草本，根茎入药，主要化学成分为黄酮，酚酸，挥发油及微量元素。珠芽蓼具有利尿、清热解毒、消肿止血、散寒止痢、抗肿瘤等功效，现代药理研究表明珠芽蓼可抗氧化、抗菌、抗肿瘤。目前关于珠芽蓼的研究主要为珠芽蓼全草，其中关于抗肿瘤活性的文献报道，大部分研仅停留在发现珠芽蓼中含有具有抗肿瘤活性物质，如鞣质及挥发油β-榄香烯、香叶醇和香茅醇，但并未对其提取工艺、含量或活性效果等进行进一步研究。
因此，对珠芽蓼的提取工艺进行深入研究，从而获得安全、副作用小的珠芽蓼来源肿瘤抑制剂意义重大。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
本申请发明人在寻找中草药抗癌活性成分的过程中，发现珠芽蓼植物各部位的乙醇提取物均具有良好的抗肿瘤活性。发明人对茎叶部位的提取物进行了分离纯化研究，意外地获得了一种具有良好抗肿瘤活性的单体化合物，扁蓄苷。发明人发现，该分离纯化工艺步骤简单，参数精确，生产时间短，利于工业化应用，且获得的产品扁蓄苷的纯度高达98％，可以作为珠芽蓼鉴别和含量测定的对照品。另外，发明人发现，分离获得的扁蓄苷对血癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤癌、结肠癌、乳腺癌细胞均具有良好的抑制效果。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了扁蓄苷在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防包括选自血癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤或淋巴瘤的至少之一。发明人发现，扁蓄苷制备的药物对血癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤癌、结肠癌和乳腺癌细胞均具有良好的抑制效果。需要说明的是，所述“药物”的含义应该作广义理解，其不仅仅是指临床中治疗疾病的药物，也可以指如科学实验中用到的各种药物试剂，其并不以治疗疾病为目的，仅用于研究致病或治病机理等过程。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血癌为K562细胞血癌。根据本发明的实施例，所述结肠癌为COLO205细胞结肠癌。根据本发明的实施例，所述肺癌为H460细胞肺癌。根据本发明的实施例，所述乳腺癌为MDA-MB-453细胞乳腺癌。根据本发明的实施例，所述黑色素瘤为SK-MEL-28细胞黑色素瘤。根据本发明的实施例，所述淋巴瘤为RAJI细胞淋巴瘤。发明人发现，扁蓄苷制备的药物对K562细胞血癌、H460细胞肺癌、SK-MEL-28细胞黑色素瘤、RAJI细胞淋巴瘤、COLO205细胞结肠癌、MDA-MB-453细胞乳腺癌的抑制效果显著更优。
在本发明的第二方面，本发明提出了扁蓄苷在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于抑制血癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞或淋巴瘤细胞的至少之一。发明人发现，扁蓄苷制备的试剂盒对血癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤癌、结肠癌和乳腺癌细胞均具有良好的抑制效果。需要说明的是，所述试剂盒并非用于疾病的治疗，而是用于科学研究中，如用于研究致病或治病机理等过程。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述血癌细胞为K562细胞。根据本发明的实施例，所述结肠癌细胞为COLO205细胞。根据本发明的实施例，所述肺癌细胞为H460细胞。根据本发明的实施例，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-453细胞。根据本发明的实施例，所述黑色素瘤细胞为SK-MEL-28细胞。根据本发明的实施例，所述淋巴瘤细胞为RAJI细胞淋巴瘤细胞。发明人发现，扁蓄苷制备的试剂盒对COLO205细胞、H460细胞、SK-MEL-28细胞、RAJI细胞、COLO205细胞、MDA-MB-453细胞的抑制效果显著更优。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用乙醇对珠芽蓼(如，珠芽蓼茎叶)进行回流提取，获得珠芽蓼提取物；利用乙醇-水体系对所述珠芽蓼提取物进行第一分离，获得第一分离部分；利用甲醇-氯仿体系对所述第一分离部分进行第二分离，获得第二分离部分；利用甲醇-水体系对所述第二分离部分进行第三分离，获得第三分离部分；利用乙腈-水体系对所述第三分离部分进行第四分离，以便获得所述扁蓄苷。本发明的多级分离体系是发明人付出大量的实验劳动后获得的。发明人发现，第三分离中采用甲醇-水体系相比于其他体系，分离效果显著更优。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度较高。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述第一分离中，依次利用纯水、5％乙醇、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和80％乙醇对所述珠芽蓼提取物进行梯度洗脱，合并30％～70％乙醇洗脱液为所述第一分离部分。发明人发现，第一分离中，采用所述浓度的乙醇-水体系进行梯度洗脱，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第一分离中，梯度洗脱条件为：
梯度洗脱溶剂 洗脱流速 洗脱体积
纯水 0.8～1.2BV/h 5～9BV
5％乙醇 0.5～0.9BV/h 7～11BV
10％乙醇 0.5～0.9BV/h 7～11BV
30％乙醇 0.5～0.9BV/h 12～16BV
50％乙醇 0.3～0.7BV/h 7～11BV
70％乙醇 1.8～2.2BV/h 2～6BV
80％乙醇 2.4～2.8BV/h 11～15BV
由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度进一步提高。
根据本发明的实施例，所述第一分离中，梯度洗脱条件为：
Figure BDA0002227958110000031
Figure BDA0002227958110000041
由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第一分离是利用大孔树脂柱进行的。在一些实施例中，所述大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述甲醇-氯仿体系中，所述甲醇的浓度为15～40％，如为15％、20％、25％。发明人发现，第二分离中，采用所述浓度的甲醇-氯仿体系进行等度洗脱，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述甲醇-氯仿体系中，所述甲醇的浓度为15～20％。在一些实施例中，所述甲醇-氯仿体系中，所述甲醇的浓度为15％。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度进一步提高。
根据本发明的实施例，所述第二分离中，洗脱流速为1.0～1.5BV/h，洗脱体积为5～9BV。在一些实施例中，所述第二分离中，洗脱流速为1.2BV/h，洗脱体积为7BV。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第二分离是利用硅胶柱进行的。在一些实施例中，所述硅胶为100～200目硅胶。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将甲醇-氯仿体系洗脱液浓缩至干，甲醇复溶，并用孔径为0.4～0.5μm的滤膜过滤，滤液为所述第二分离部分。
根据本发明的实施例，所述甲醇-水体系中，所述甲醇的浓度为45～65％，如为50％、55％、60％、45～60％、45～55％、50～60％或50～55％。发明人发现，第三分离中，采用所述浓度的甲醇-水体系进行等度洗脱或梯度洗脱，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述甲醇-水体系中，所述甲醇的浓度为50％。发明人发现，第三分离中，采用所述浓度的甲醇-水体系进行等度洗脱，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度进一步提高。
根据本发明的实施例，所述第三分离中，洗脱流速为0.6～0.8mL/min，洗脱体积为7450～7500mL，合并第58～72h的洗脱液为所述第三分离部分。在一些实施例中，所述第三分离中，洗脱流速为0.73mL/min，共洗脱935管，每管8mL，合并第335～385管洗脱液为所述第三分离部分。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第三分离是利用凝胶柱进行的。在一些实施例中，所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将甲醇-水体系洗脱液浓缩，并用孔径为0.4～0.5μm的滤膜过滤，滤液为所述第三分离部分。
根据本发明的实施例，所述第四分离中，利用乙腈-水体系对所述第三分离部分进行梯度洗脱，其中，所述乙腈-水体系中，所述乙腈的浓度为19～85％。发明人发现，第四分离中，采用所述浓度的乙腈-水体系进行梯度洗脱，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第四分离中，梯度洗脱条件为：
时间(min) A％ B％
0 81 19
10 81 19
20 80 20
21 15 85
25 15 85
26 81 19
其中，流动相A为水，流动相B为乙腈，保留时间为15～20min的流分中包含所述扁蓄苷。在一些实施例中，保留时间为17.6min的流分中包含所述扁蓄苷。发明人发现，第四分离中，采用所述梯度洗脱条件时，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述流动相A中添加有甲酸，所述甲酸在所述流动相A中的浓度为0.1％。由此，分离效果更好。
根据本发明的实施例，所述第四分离是利用高效液相半制备色谱柱进行的。在一些实施例中，所述半制备色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18半制备色谱柱。由此，根据本发明实施例的方法可以有效分离获得扁蓄苷，且分离的扁蓄苷纯度更高。
根据本发明的实施例，所述第四分离中，梯度洗脱的流速为3mL/min，检测波长为254/275/360nm。由此，分离效果更好。需要说明的是，发明人发现，第四分离中，检测波长为254nm、275nm或360nm时，获得的图谱以及分离效果无显著差别，因此，检测波长可以选择254nm、275nm或360nm。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述保留时间为15～20min的流分浓缩至干以便获得所述扁蓄苷。
根据本发明的实施例，所述回流提取中，所述珠芽蓼茎叶与所述乙醇的料液比为(1:15)～(1:30)kg/mL，如为1:17、1:19、1:20、1:23、1:25、1:27或1:30kg/mL。在一些实施例中，料液比为1:20或1:30kg/mL。由此，根据本发明实施例的方法对珠芽蓼活性成分的提取更充分，回流提取效果更好。
根据本发明的实施例，所述回流提取中，所述乙醇的浓度为60％～80％，如为65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，所述乙醇的浓度为70％。由此，根据本发明实施例的方法对珠芽蓼活性成分的提取更充分，回流提取效果更好。
根据本发明的实施例，所述回流提取的时间为3-4小时。在一些实施例中，所述回流提取的时间为4小时。由此，根据本发明实施例的方法对珠芽蓼活性成分的提取更充分，回流提取效果更好。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将回流提取液浓缩至无醇状态，并利用石油醚将回流提取浓缩液进行洗涤处理，以便获得珠芽蓼提取物。发明人发现，所述洗涤处理不仅对珠芽蓼活性成分(扁蓄苷)没有影响，同时可以洗涤除去叶绿素等杂质。由此，根据本发明实施例的方法获得的珠芽蓼提取物纯度较高。
根据本发明的实施例，所述洗涤处理中，所述回流提取浓缩液与所述石油醚的体积比为1:1。由此，珠芽蓼提取物纯度更高。
附图说明
图1是根据本发明实施例的扁蓄苷的化学结构式；
图2是根据本发明实施例的黄色粉末(扁蓄苷)样品的质谱图，显示化合物的分子量为435[M+H]+；
图3是根据本发明实施例的扁蓄苷的1H-NMR图谱，其中，1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:7.53(d,J＝2.1Hz,1H),7.49(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),6.39(d,J＝2.0Hz,1H),6.21(d,J＝2.1Hz,1H),5.47(s,1H),4.33(dd,J＝3.0,0.9Hz,1H),3.91(dd,J＝5.1,3.0Hz,1H),3.86(dd,J＝8.8,4.8Hz,1H),3.50(t,J＝4.4Hz,2H)；
图4是根据本发明实施例的扁蓄苷的13C-NMR图谱，其中，13C-NMR(151MHz,CD3OD)δ:158.63(C-2),134.96(C-3),180.05(C-4),163.14(C-5),99.95(C-6),166.14(C-7),94.83(C-8),159.40(C-9),109.58(C-10),123.02(C-1′),116.89(C-2′),146.42(C-3′),149.91(C-4′),116.49(C-5′),123.15(C-6′),105.66(C-1″),83.36(C-2″),78.75(C-3″),88.08(C-4″),62.60(C-5″)；
图5是根据本发明实施例的小试实验中珠芽蓼提取液萃取前后色谱图，minutes表示分钟；
图6是根据本发明实施例的珠芽蓼大孔树脂小试洗脱液色谱图，minutes表示分钟；
图7是根据本发明实施例的珠芽蓼硅胶小试洗脱液色谱图，minutes表示分钟；
图8是根据本发明实施例的小试实验第三分离中甲醇-氯仿体系洗脱色谱图，minutes表示分钟；
图9是根据本发明实施例的小试实验第三分离中甲醇-水体系洗脱色谱图，minutes表示分钟。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，本申请的分离体系中涉及到的溶剂的浓度均指体积浓度。比如，第二分离的甲醇-氯仿体系中，所述甲醇的浓度为15～40％，指的是甲醇的体积在由甲醇和氯仿两种溶剂组成的混合溶剂体系的总体积中的百分数为15～40％。
扁蓄苷为黄色固体，分子式为C20H18O11，分子量为434，图1即其化学结构式。扁蓄苷存在于珠芽蓼药材中，可作为珠芽蓼鉴别和含量测定用的对照品，用于珠芽蓼和相关药物制剂的质量监控，为珠芽蓼在抗肿瘤治疗的应用提供良好的研究基础。
目前的抗癌药物如顺铂等副作用很强，而通过本发明纯化分离方法和系统制备的扁蓄苷样品源于植物提取物，有望成为安全性高、活性良好的植物性来源抗癌药物。发明人发现，扁蓄苷对淋巴瘤癌、血癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌细胞的半抑制浓度IC50依次为0.243、0.002、0.267、0.014、0.006、0.053mg/mL，与阳性对照顺铂的半抑制浓度IC50(对淋巴瘤癌、血癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌细胞分别为0.005、0.008、0.001、0.002、0.004、0.010mg/mL)相比，其对血癌、肺癌、黑色素瘤细胞有明显的抑制效果，且对淋巴瘤癌、结肠癌、乳腺癌有良好的抑制效果。
本发明提供了一种提取分离扁蓄苷的方法，该方法包括以下步骤：利用乙醇对珠芽蓼进行加热提取浓缩，获得珠芽蓼提取物；利用有机体系对所述提取物进行多级色谱分离。其中包括利用乙醇-水体系对所述提取物进行第一级分离，获得第一分离部分。利用甲醇-三氯甲烷体系对第一分离部分进行第二级分离，获得第二分离部分。利用甲醇-水体系对第二分离部分进行第三级分离，获得第三分离部分。最后利用乙腈-水体系对第三分离部分进行第四级分离，获得单体化合物扁蓄苷。
本发明的方法，利用多级分离色谱，包括组合利用大孔树脂纯化技术、硅胶柱层析纯化技术、中压制备凝胶纯化技术和液相制备纯化技术，利用有机体系从珠芽蓼提取物中分离提取扁蓄苷，该工艺参数精确，生产时间短，产品纯度高，获得的扁蓄苷可作为珠芽蓼鉴别和含量测定的对照品。其中，该多级分离色谱体系中各溶剂的比例是发明人结合后续色谱分离条件，多次检测洗脱部位中的扁蓄苷，经多次调整优化所得的。
在本发明的一些实施例中，所述第一色谱柱体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇浓度为0-90％，较佳的为30-70％。所述第二色谱体系为甲醇-氯仿体系，该体系的甲醇浓度为15-40％，较佳的为15％。所述第三色谱体系为甲醇-水体系，该体系的甲醇浓度为45-65％，较佳的为50％。所述第四色谱体系为乙腈-水体系，该体系为梯度洗脱。第四色谱体系是发明人结合第一分离部分中目标成分的比例确定的，多次实验确定优化，利于简单操作，以获得纯度高的扁蓄苷。
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1扁蓄苷制备的前期小试实验
1.大孔树脂小试实验
1.1实验步骤
珠芽蓼茎叶10g，粉碎后按1:30料液比加入70％乙醇回流提取4小时，提取液使用旋转蒸发仪浓缩。提取浓缩液按体积比1:1加入石油醚，萃取(洗涤)3次，弃去石油醚，得处理液。取适量处理后的净品级D101大孔树脂装柱，柱体积为10mL，取萃取处理液，按0.7BV/h的流速湿法上样，吸附2小时。依次使用10％、30％、50％、70％、90％乙醇洗脱，洗脱流速0.7BV/h。将上述处理液以及洗脱液分别进高效液相色谱仪分析。
1.2色谱条件
色谱柱Aglient ZORBAX SB-Aq 5μm，4.6×150mm，流动相A：0.1％甲酸，B相：乙腈，柱温30℃，流速0.8mL/min，分析时间85min，检测波长275nm。梯度洗脱条件为：0～8min，1％B；8～10min，1～7％B；10～30min，7～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B。
1.3实验结果
①发明人发现，石油醚萃取提取后石油醚由无色变成了深绿色，该现象表明石油醚基本可以将叶绿素等色素去除。同时，将提取液以及处理液进入液相色谱仪中，发现叶绿素在275nm波长下是没有吸收的，因为萃取前后的色谱图基本一致(如图5所示)。由此可见，该方法可以有效去除叶绿素等杂质的同时对样品黄酮成分影响小。
②从图6可以看出，珠芽蓼洗脱液的黄酮组分(35～55min)主要集中在30％、50％乙醇洗脱液中，但70％洗脱液中也有少量黄酮成分(部分出峰)，证明该树脂对黄酮具有很好的富集效果。因此，为了尽可能多的富集黄酮类成分，后续将30％-70％的洗脱液合并之后再做进一步的分离纯化。
2.硅胶小试实验
2.1实验步骤
①将上述大孔树脂得到的30％-70％合并洗脱液浓缩，然后分批次转移至放了硅胶的蒸发皿上(蒸发皿放置在水浴锅上，水浴锅温度为100℃)，然后边搅拌硅胶边加入样品，直到硅胶把样品完全吸收，水分挥发干。
②适量硅胶加入20％甲醇-氯仿浸润后倒入Bond Elat柱管中。
③在柱子上方倒入拌有样品的硅胶粉末吸附2小时。
④使用20％、40％、60％、80％、100％甲醇-氯仿溶液依次进行梯度洗脱，各洗脱2BV(1BV＝15mL，相当于每种洗脱液洗脱两管，每管15mL，然后分别进高效液相色谱仪分析)后氮吹浓缩。
⑤洗脱液过0.45μm有机滤膜，进行液相分析。
2.2色谱条件
色谱柱Aglient ZORBAX SB-Aq 5μm，4.6×150mm，流动相A：0.1％甲酸，B相：乙腈，柱温30℃，流速0.8mL/min，分析时间85min，检测波长360nm。梯度洗脱条件为：0～8min，1％B；8～10min，1～7％B；10～30min，7～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B；65～85min，50～85％B；
2.3实验结果分析
从图7可知，20％-40％梯度已基本完成所有成分洗脱，但20-40％梯度对样品的洗脱能力过强，谱图上的峰太过紧密，在制备液相里不利于目标成分的有效分离，因此放大实验时将洗脱梯度放缓，便于有效分离各成分，选取15％、25％、40％、90％为洗脱梯度进行梯度洗脱，发现目标成分主要富集在15％的洗脱液中。
3.LH-20小试实验
3.1实验步骤
将前处理完毕的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱(2根)，将上述放大硅胶实验的15％硅胶洗脱浓缩液上样，吸附20min，分别使用50％甲醇-水溶液、50％甲醇-氯仿溶液进行等度洗脱，共洗脱7BV(1BV＝15mL，相当于每管15mL，共接了7管洗脱液，分别进高效液相色谱仪分析)，使用高效液相色谱检测。
3.2色谱条件
色谱柱Aglient ZORBAX SB-Aq 5μm，4.6×150mm，流动相A：0.1％甲酸，B相：乙腈，柱温30℃，流速0.8mL/min，分析时间42min，检测波长360nm。梯度洗脱条件为：0～42min，20～37％B。
3.3实验结果
如图8、图9分别为两个体系进行相同体积洗脱的液相色谱图，从结果可知，甲醇-氯仿体系未能进行有效分离，甲醇-水体系所得洗脱部位较多，分离效果明显优于甲醇-氯仿体系。因此选用甲醇-水体系进行放大实验。
实施例2扁蓄苷的制备实施例
Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(9.4×250mm，5μm)，D101型大孔树脂(天津南开和成科技有限公司)，Sephadex LH-20凝胶(Sigma公司)，100-200目硅胶(青岛海洋化工有限公司)，珠芽蓼茎叶购自西藏林芝。
选用珠芽蓼茎叶1.5kg，剪碎为3-4cm小段，按1:20料液比(kg：mL，1:15～1:30)加入70％乙醇回流提取4小时，浓缩回收乙醇至无醇味。提取浓缩液按体积比1:1加入石油醚，萃取(洗涤)3次，弃去石油醚，得处理液。取适量处理后的净品级D101大孔树脂装柱，柱体积为650mL，取萃取处理液3.5L，按0.72BV/h(0.6BV/h～0.8BV/h)的流速湿法上样，吸附12小时。依次使用纯水洗脱，洗脱流速1BV/h，洗脱体积7BV；5％乙醇溶液洗脱，洗脱流速0.7BV/h，洗脱体积9BV；10％乙醇溶液洗脱，洗脱流速0.7BV/h，洗脱体积9BV；30％乙醇溶液洗脱，洗脱流速0.7BV/h，洗脱体积14BV；50％乙醇溶液洗脱，洗脱流速0.5BV/h，洗脱体积9BV；70％乙醇溶液洗脱，洗脱流速2BV/h，洗脱体积4BV；80％乙醇溶液洗脱，洗脱流速2.6BV/h，洗脱体积13BV。合并30-70％乙醇洗脱液，浓缩至无醇味，得大孔树脂洗脱浓缩液。
将大孔树脂洗脱浓缩液加入适量硅胶拌样，然后按照硅胶拌样与上样硅胶的柱体积比1:3干法装柱，硅胶柱体积为500mL，干法上样，按照1.2BV/h的流速，依次使用15％甲醇-氯仿溶液洗脱，洗脱体积7BV；25％甲醇-氯仿溶液洗脱，洗脱体积7BV；40％甲醇-氯仿溶液洗脱，洗脱体积8BV；90％甲醇-氯仿溶液洗脱，洗脱体积10BV。将15％甲醇-氯仿溶液浓缩至干，甲醇复溶，过0.45μm有机滤膜，得硅胶洗脱浓缩液。
将前处理完毕的Sephadex LH-20凝胶湿法装柱，硅胶洗脱浓缩液上样，吸附12小时，按照0.73mL/min流速，使用50％甲醇-水溶液进行等度洗脱，共洗脱935管，每管8mL，使用高效液相色谱检测后合并335-385管流分(其他管中没有物质)，浓缩，过0.45μm有机滤膜，得凝胶洗脱浓缩液。
将所得的凝胶洗脱浓缩液进行高效液相半制备分离，采用Agilent ZORBAX SB-C18(9.4*250mm，5μm)半制备色谱柱，流动相A 0.1％甲酸溶液，流动相B乙腈，流速3mL/min，检测波长254/275/360nm，梯度洗脱，洗脱梯度见表1，收集保留时间为17.6min的流分，浓缩至干，加入适量甲醇溶解，置于西林瓶中挥干，得黄色粉末，备用。
表1：洗脱梯度
Figure BDA0002227958110000101
Figure BDA0002227958110000111
采用高效液相-电喷雾质谱联用仪(HPLC-ESI-MS)，核磁共振光谱仪(1H-NMR和13C-NMR)对所得黄色粉末进行结构鉴定，鉴定结果如图1～4所示，确定从珠芽蓼茎叶中分离所得的粉末为扁蓄苷。另外，经HPLC检测，分离的扁蓄苷纯度达98％，可作为鉴别珠芽蓼和含量测定的对照品，应用于珠芽蓼相关制剂的质量控制及抗肿瘤活性研究。
实施例3扁蓄苷抗癌活性测定实施例
仪器：超微量分光光度计(BMG LRBTECH)，CO2恒温培养箱(Thermo FisherScientific)，96孔板(广州洁特生物过滤股份有限公司)。
试剂：0.25％胰酶-EDTA(1X)(gibco)，青链霉素混合液(hyclone)，乙醇(西陇科学股份有限公司)，RPMI1640培养基(hyclone)，DMEM培养基(hyclone)，CCK-8试剂盒(东仁化学科技股份有限公司)，PBS磷酸缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，EDTA(sigma)，胎牛血清(gibco)，细胞株均购于ATCC。
细胞培养：使用RPMI1640或DMEM完全培养基(1640/DMEM+10％胎牛血清+1％青链霉素混合液)培养，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每日倒置显微镜观察细胞1次，隔2天换培养液一次。培养瓶中，细胞生长到85％-95％融合时，进行细胞传代。弃去旧培养液，PBS磷酸缓冲液反复冲洗2次，加入2mL 0.25％胰酶消化液使细胞变圆﹑上浮后，加入4mL培养液终止消化，再转移至15mL无菌离心管中，1000r/min离心4分钟，弃上清液，以1：4比例转移至新无菌培养瓶中培养。
药物配置：阳性对照顺铂用EDTA配置为30mg/mL的母液。再用培养基稀释到0.6mg/mL的初始浓度(终浓度为0.3mg/mL)，过0.22μm无菌滤器过滤除菌，再用含2％EDTA培养基按3倍稀释成一系列梯度浓度(共9个浓度)。
标准品配置：萹蓄苷使用培养基溶解，稀释到6mg/mL的初始浓度，过0.22μm无菌滤器过滤除菌，再按3倍稀释成一系列梯度浓度(共9个浓度)。
药效检测：收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板。在37℃，5％CO2条件下孵育24小时后。按100μL/孔加入相应药物。加完药之后，置于37℃，5％CO2培养箱中，孵育72小时。加入10％CCK-8，置于37℃培养箱中孵育1-2小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度(A)值。其中，各肿瘤细胞使用的培养基及接种密度如表2所示。
表2：肿瘤细胞使用培养基及接种密度
名称 编号 培养基 接种密度(个/孔)
黑色素瘤 SK-MEL-28 DMEM 4000
肺癌 H460 1640 4000
血癌 K-562 1640 6000
乳腺癌 MDA-MB-453 1640 8000
淋巴瘤癌 RAJI 1640 10000
人结肠癌 COLO205 1640 8000
肿瘤细胞生长率的计算：
获得检测结果后，按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As：样品的吸光度(细胞+CCK-8+待测提取物)
Ac：阴性对照的吸光度(细胞+CCK-8)
Ab：空白对照的吸光度(培养基+CCK-8)
其中，扁蓄苷抗肿瘤活性实验结果如表3所示。
表3：扁蓄苷抗肿瘤活性IC50值(mg/mL)
Figure BDA0002227958110000121
由上表3可知，扁蓄苷对血癌、肺癌、黑色素瘤细胞有明显的抑制效果，对淋巴瘤癌、结肠癌、乳腺癌有良好的抑制效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种从珠芽蓼中提取扁蓄苷的方法，其特征在于，包括：
利用乙醇对珠芽蓼进行回流提取，获得珠芽蓼提取物；
利用乙醇-水体系对所述珠芽蓼提取物进行第一分离，获得第一分离部分；
利用甲醇-氯仿体系对所述第一分离部分进行第二分离，获得第二分离部分；
利用甲醇-水体系对所述第二分离部分进行第三分离，获得第三分离部分；
利用乙腈-水体系对所述第三分离部分进行第四分离，以便获得所述扁蓄苷；
其中，所述第一分离中，依次利用纯水、5%乙醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和80%乙醇对所述珠芽蓼提取物进行梯度洗脱，合并30%~70%乙醇洗脱液为所述第一分离部分；
所述第一分离中，梯度洗脱条件为：
所述第一分离是利用D101大孔树脂柱进行的；
所述甲醇-氯仿体系中，所述甲醇的浓度为15%；
所述第二分离中，洗脱流速为1.0~1.5 BV/h，洗脱体积为5~9 BV；
所述第二分离是利用100~200目硅胶柱进行的；
所述甲醇-水体系中，所述甲醇的浓度为50%；
所述第三分离中，洗脱流速为0.6~0.8 mL/min，洗脱体积为7450~7500 mL，合并第58~72 h的洗脱液为所述第三分离部分；
所述第三分离是利用Sephadex LH-20凝胶柱进行的；
所述第四分离中，利用乙腈-水体系对所述第三分离部分进行梯度洗脱，其中，所述乙腈-水体系中，所述乙腈的浓度为19~85%；
所述第四分离中，梯度洗脱条件为：
其中，流动相A为水，流动相B为乙腈，保留时间为17.6 min的流分中包含所述扁蓄苷；
所述流动相A中添加有甲酸，所述甲酸在所述流动相A中的浓度为0.1%；
所述第四分离是利用高效液相Agilent ZORBAX SB-C18半制备色谱柱进行的；
所述第四分离中，梯度洗脱的流速为3 mL/min，检测波长为254/275/360 nm；
所述回流提取中，所述珠芽蓼茎叶与所述乙醇的料液比为1:15～1:30 kg/mL；
所述回流提取中，所述乙醇的浓度为70%；
所述回流提取的时间为3-4小时；
将回流提取液浓缩至无醇状态，并利用石油醚将回流提取浓缩液进行洗涤处理，以便获得珠芽蓼提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述第一分离中，梯度洗脱条件为：
。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二分离中，洗脱流速为1.2 BV/h，洗脱体积为7 BV。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将甲醇-氯仿体系洗脱液浓缩至干，甲醇复溶，并用孔径为0.4~0.5μm的滤膜过滤，滤液为所述第二分离部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三分离中，洗脱流速为0.73 mL/min，共洗脱935管，每管8 mL，合并第335~385管洗脱液为所述第三分离部分。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将甲醇-水体系洗脱液浓缩，并用孔径为0.4~0.5 μm的滤膜过滤，滤液为所述第三分离部分。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤处理中，所述回流提取浓缩液与所述石油醚的体积比为1:1。
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