CN110420247B - 珠芽蓼提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

珠芽蓼提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药材提取领域，提供了珠芽蓼提取物及其制备方法和应用，具体地，提供了一种珠芽蓼提取物的制备方法，及经这样的制备方法制备的具有较高抗肿瘤活性的珠芽蓼提取物，还提供了这样的珠芽蓼提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。

Description

珠芽蓼提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中药材提取领域，具体涉及珠芽蓼提取物的制备及其应用。
背景技术
癌症，即恶性肿瘤，其种类非常多。其中，乳腺癌、肺癌、血癌发病率极高，严重影响着人体健康。乳腺癌是女性癌症死亡的第一大凶手。肺癌更是在男性发病率和死亡率均占第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位的恶性肿瘤。黑色素瘤是指有恶性变化的色素斑痣，虽然发病率低，但恶性程度高，转移发生早，死亡率高，需要及时治疗。淋巴瘤由于淋巴系统的分布特点，使得淋巴瘤属于全身性疾病，几乎可侵犯全身任何组织及器官，其死亡率占所有恶性肿瘤第11-13位。癌症是由于癌细胞疯狂繁殖、扩散无法控制而导致。因此，通过抑制癌细胞生长可预防癌症或提高癌症患者的治愈率。目前抗癌药物选择性低，会无差别杀死癌细胞及机体正常细胞，副作用极强。因此，寻求更安全，副作用更小的抗肿瘤药物具有极其重要的意义。
机体的衰老与皮肤的衰老是同步进行的，引发机体衰老的因素同样也是引起皮肤老化的重要原因。自由基是机体衰老的重要因素之一，人体内产生的自由基具有极强的氧化能力，氧自由基是机体代谢过程中的正常中间产物，低浓度的活性氧是体内信号传导过程中的重要介质，为机体执行正常生理功能所需，但是，高浓度的活性氧可引起生物体内大分子物质的损伤，使蛋白质合成减少、诱导细胞调亡、线粒体DNA突变、形成脂褐质等，最终导致皮肤衰老。因此，有效降低自由基水平的物质可延缓皮肤衰老，这类物质常应用于化妆品领域。
目前常用的抗癌化疗药物，如顺铂等毒副作用很强，在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞，破坏人体的免疫系统，因此，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。大量研究结果和临床实验证明，中药及其提取物具有效果平和，耐受性好，毒副作用小，作用持久等独特优点。因此，具有抗肿瘤活性、抗氧化活性的中药提取物迎合了人们对抗癌药物的安全需求。
蓼科植物珠芽蓼(Polygonum viviparum L.)主要含有挥发油、黄酮类化合物、酚类化合物等有效成分，具有抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗菌、抗超氧自由基等作用。目前关于珠芽蓼各个部位的研究较少，主要研究对象是珠芽蓼全草。其中关于抗肿瘤活性的文献报道，大部分研究仅停留在笼统发现珠芽蓼中含有具有抗肿瘤活性的物质，如鞣质及挥发油β-榄香烯、香叶醇和香茅醇，但并未对其提取工艺、含量或活性效果等进行进一步的研究。如文献《珠芽蓼挥发油化学成分的研究》，从150g珠芽蓼全草蒸馏提取出1.13g总挥发性油，发现其中含有抗肿瘤物质β-榄香烯、香叶醇和香茅醇，但并未进行进一步提取纯化研究以及活性研究。如《珠芽蓼的化学成分和药理活性研究进展》中关于抗肿瘤方面的描述也仅限于发现珠芽蓼含有β-榄香烯、香叶醇和香茅醇这三种具有抗癌活性的物质。同时，对珠芽蓼抗氧化活性的研究也基本是停留在对粗提物的研究，如文献《珠芽蓼黄酮类化合物清除DPPH的作用》报道了当珠芽蓼黄酮提取液质量浓度为368.94μg/mL清除DPPH·的清除率为88.96％。
虽然现有技术中发现珠芽蓼具有黄酮类，酚类，萜烯类等天然抗肿瘤物质和抗氧化物质，但是众所周知，很多种类的药用植物都含有这些天然产物，真正最终能成为抗氧化、抗肿瘤、或者治疗肿瘤药的植物种类却很少，而且因为与化疗药相比中药的剂量偏大，还存在有毒有机试剂残留的问题，总体是作为癌症治疗的辅助治疗手段。因此，寻找到能真正在药效上和安全性上优于例如顺铂这样作为小细胞和非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌等癌症的一线用药的中药及其提取物是非常巨大的挑战。
本发明通过对珠芽蓼进行提取方法和提取物的深入研究，尤其是对珠芽蓼的各个部位进行了提取方法和提取物的深入研究，意外获得了具有优良应用前景的珠芽蓼提取物。
发明内容
本发明提供了一种珠芽蓼提取物的制备方法，提供了经这样的制备方法制备的具有较高抗肿瘤活性的珠芽蓼提取物，还提供了这样的珠芽蓼提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
第一方面，本发明提供了一种珠芽蓼提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将珠芽蓼药材粉碎，以乙醇溶液作为提取溶剂，在加热条件下进行提取，得到提取液，浓缩提取液得到浸膏；以及
(2)用乙醇溶液溶解浸膏，用大孔树脂进行吸附，并用不同梯度的乙醇溶液进行洗脱，合并相同梯度的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到珠芽蓼相应梯度的乙醇溶液洗脱冻干物。
可以根据需要将珠芽蓼药材粉碎至需要的粒径，例如，可以将干燥后的珠芽蓼药材粉碎后过3号筛。
优选地，所述珠芽蓼药材为珠芽蓼果实，珠芽蓼根茎，珠芽蓼花或珠芽蓼茎叶。
优选地，在步骤(1)中，以60％-80％乙醇溶液作为提取溶剂，并且提取溶剂的体积与珠芽蓼的质量比为15-30mL/g。
优选地，在步骤(1)中，以70％乙醇溶液作为提取溶剂，并且提取溶剂的体积与珠芽蓼的质量比为20mL/g。
优选地，在步骤(1)中，提取温度为70-100℃，提取时间为3-4小时。
优选地，在步骤(1)中，提取温度为回流温度，提取时间为4小时。
优选地，在步骤(1)中，将提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，并在水浴锅上蒸干得到浸膏。
优选地，在步骤(1)中，将提取液用旋转蒸发仪在60℃下进行浓缩，并在100℃的水浴锅上蒸干得到浸膏。
优选地，在步骤(2)中，用40％-60％的乙醇溶液溶解浸膏。
优选地，在步骤(2)中，用50％的乙醇溶液溶解浸膏。
优选地，在步骤(2)中，采用D101大孔吸附树脂或AB-8树脂装柱，以3.6BV/h流速上样，吸附2-6小时。
优选地，在步骤(2)中，以0.9-3.6BV/h的流速，采用纯水，10％乙醇溶液，20％乙醇溶液，30％乙醇溶液，50％乙醇溶液分别洗脱至少5BV，合并相同溶剂比例的洗脱液，将20％乙醇溶液洗脱液和30％乙醇溶液洗脱液合并得到20％-30％乙醇溶液洗脱液。优选地，以1.8BV/h的流速进行洗脱。
优选地，将洗脱液浓缩至无醇味，经真空冷冻干燥获得珠芽蓼水洗脱冻干物，20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物。
优选地，所述珠芽蓼20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-22％和2-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5-5.5％和14-15％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5.3％和14.47％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-2.3％和2-2.5％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2.13％和2.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.5-4％和21-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.78％和22.13％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20-22％和8.7-9.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20.82％和9.09％的黄酮。
第二方面，本发明提供了由本发明的方法制备得到的珠芽蓼提取物。所述珠芽蓼提取物可以是珠芽蓼水洗脱液冻干物或珠芽蓼乙醇洗脱液冻干物。优选地，所述珠芽蓼提取物为珠芽蓼20％-30％乙醇洗脱液冻干物或珠芽蓼50％乙醇洗脱液冻干物。
优选地，所述珠芽蓼提取物为珠芽蓼果实提取物，珠芽蓼根茎提取物，珠芽蓼花提取物或珠芽蓼茎叶提取物。
优选地，所述珠芽蓼20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-22％和2-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5-5.5％和14-15％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5.3％和14.47％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-2.3％和2-2.5％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2.13％和2.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.5-4％和21-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.78％和22.13％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20-22％和8.7-9.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20.82％和9.09％的黄酮。
第三方面，本发明提供了由本发明的方法制备的珠芽蓼提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。所述珠芽蓼提取物可以是珠芽蓼水洗脱液冻干物，或珠芽蓼乙醇洗脱液冻干物。优选地，所述珠芽蓼提取物为珠芽蓼20％-30％乙醇洗脱液冻干物或珠芽蓼50％乙醇洗脱液冻干物。
优选地，所述珠芽蓼提取物为珠芽蓼果实提取物，珠芽蓼根茎提取物，珠芽蓼花提取物或珠芽蓼茎叶提取物。
优选地，所述珠芽蓼20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-22％和2-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5-5.5％和14-15％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5.3％和14.47％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-2.3％和2-2.5％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2.13％和2.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.5-4％和21-23％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.78％和22.13％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20-22％和8.7-9.3％的黄酮。
优选地，所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20.82％和9.09％的黄酮。
优选地，所述肿瘤为淋巴瘤，黑色素瘤，乳腺癌，肺癌和血癌。
本发明以常用的安全性较高的乙醇作为提取溶剂，对珠芽蓼果实进行提取制备的珠芽蓼果实乙醇提取物对淋巴瘤细胞、黑色素肿瘤的抑制效果明显，对淋巴瘤细胞抑制作用优于一线抗癌药物顺铂，而对乳腺癌、血癌细胞和肺癌细胞也有较好的抑制效果。
本发明方法制备的珠芽蓼果实20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤、黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50分别为0.005、0.033mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027mg/mL和0.008mg/mL。因此，本发明方法制备的珠芽蓼果实20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤细胞的抑制效果明显好于一线抗癌药物顺铂，对黑色素肿瘤抑制效果明显。而对乳腺癌细胞和血癌细胞的抑制效果较好，IC50值分别为0.150mg/mL mg/mL和0.100mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼果实50％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤和黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50值分别为0.002mg/mL和0.077mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027mg/mL和0.008mg/mL，因此，本发明方法制备的珠芽蓼果实50％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤细胞的抑制效果好于一线抗癌药物顺铂。本发明方法制备的珠芽蓼果实50％乙醇洗脱液冻干物对乳腺癌、肺癌细胞的抑制效果较好，其IC50值分别为0.114mg/mL和0.112mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼果实水洗脱液对血癌细胞的半抑制浓度IC50值为0.027mg/mL，抑制效果良好。
本发明以常用的安全性较高的乙醇作为提取溶剂，对珠芽蓼根茎进行提取制备的珠芽蓼根茎乙醇提取物对淋巴瘤细胞、黑色素肿瘤的抑制效果优于一线化疗药物顺铂或与顺铂等同，对乳腺癌细胞的抑制效果与顺铂相比仍有很好的抑制效果，对肺癌细胞和血癌细胞也同样有着良好的抑制效果。
本发明方法制备的珠芽蓼根茎20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤、黑色素肿瘤、乳腺癌细胞的半抑制浓度IC50分别为0.002、0.004、0.017mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027、0.008、0.007mg/mL。因此，本发明方法制备的珠芽蓼根茎20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤细胞、黑色素肿瘤的抑制效果好于一线抗癌药物顺铂，对淋巴瘤细胞抑制作用尤为明显，而对乳腺癌细胞的抑制效果与顺铂相比仍有很好的抑制效果。对肺癌细胞也同样有着良好的抑制效果，IC50值为0.044mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼根茎50％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤、黑色素肿瘤、乳腺癌细胞的半抑制浓度IC50分别为0.003、0.008、0.066mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027、0.008、0.007mg/mL。因此，本发明方法制备的珠芽蓼根茎50％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤细胞的抑制效果明显好于一线抗癌药物顺铂，对黑色素瘤细胞抑制效果与顺铂等同，而对乳腺癌细胞的抑制效果与顺铂相比仍有很好的效果。对血癌细胞也有着较好的抑制效果，IC50值为0.123mg/mL。
本发明以常用的安全性较高的乙醇作为提取溶剂，对珠芽蓼花进行提取制备的珠芽蓼花乙醇提取物对淋巴瘤细胞、黑色素肿瘤的抑制效果明显，对淋巴瘤细胞抑制作用优于一线抗癌药物顺铂，而对乳腺癌、血癌细胞和肺癌细胞也有较好的抑制效果。
本发明方法制备的珠芽蓼花20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤、黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50分别为0.006和0.020mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027mg/mL和0.008mg/mL。因此，本发明方法制备的珠芽蓼花20％-30％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤细胞的抑制效果明显好于一线抗癌药物顺铂，对黑色素肿瘤抑制效果明显。而对乳腺癌细胞和血癌细胞的抑制效果较好，IC50值分别为0.185mg/mL和0.163mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼花50％乙醇洗脱液冻干物对黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50值为0.006mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值为0.008mg/mL，因此，本发明方法制备的珠芽蓼花50％乙醇洗脱液冻干物对黑色素肿瘤细胞的抑制效果好于一线抗癌药物顺铂。本发明方法制备的珠芽蓼花50％乙醇洗脱液冻干物对乳腺癌、肺癌细胞的抑制效果较好，其IC50值分别为0.113mg/mL和0.106mg/mL。
本发明以常用的安全性较高的乙醇作为提取溶剂，对珠芽蓼茎叶进行提取制备的珠芽蓼茎叶乙醇提取物对黑色素肿瘤、淋巴瘤细胞的抑制效果明显，对淋巴瘤细胞抑制作用甚至优于一线抗癌药物顺铂，而对乳腺癌也有较好的抑制效果。
本发明方法制备的珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇洗脱液冻干物对黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50值为0.044mg/mL，而阳性对照顺铂的IC50值为0.008mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼茎叶50％乙醇洗脱液冻干物对淋巴瘤、黑色素肿瘤细胞的半抑制浓度IC50值分别为0.0003mg/mL和0.051mg/mL，阳性对照顺铂的IC50值分别为0.027mg/mL和0.008mg/mL，因此对淋巴瘤的抑制效果好于一线抗癌药物顺铂。本发明方法制备的珠芽蓼茎叶50％乙醇洗脱液冻干物对乳腺癌的抑制效果较好，其IC50值为0.196mg/mL。
第四方面，本发明提供了由本发明的方法制备的珠芽蓼提取物在制备用于抗氧化的药物中的应用。
本发明方法制备的珠芽蓼提取物对DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基(自由基))也有着显著的抑制效果。
具体而言，本发明方法制备的珠芽蓼果实20％-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物对DPPH抑制的IC50值分别为0.007mg/mL和0.0072mg/mL，且对DPPH的抑制率分别为90.23％和92.79％时，其对应浓度分别为0.0198mg/mL和0.0177mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼根茎20％-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物对DPPH抑制的IC50值分别为0.0052mg/mL和0.0055mg/mL，抑制率分别为91.53％和85.12％时，其对应浓度分别为0.0148mg/mL和0.0125mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼花20％-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物对DPPH抑制的IC50值分别为0.0069mg/mL和0.0090mg/mL，抑制率分别为82.77％和83.65％时，其对应浓度分别为0.0154mg/mL和0.0203mg/mL。
本发明方法制备的珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物对DPPH抑制的IC50值分别为0.0141mg/mL和0.0137mg/mL，抑制率分别为86.86％和91.16％时，其对应浓度分别为0.0400mg/mL和0.0400mg/mL。
本发明的珠芽蓼提取物相较于单体药物具有进一步纯化提升效果的潜力。目前的一线抗癌药物如顺铂等副作用很强，以本发明方法制备的提取物源于植物表现出活性优于一线抗癌药物如顺铂的抗癌效果，是预料之外的技术效果，可作为植物性来源的抗癌药物。而且，本发明的提取方法简单，并未使用任何有毒有害的有机试剂，因此，不存在有毒试剂的残留问题。
名词解释：
DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)，别名1,1-二苯基-2-苦肼基(自由基)是一种稳定的自由基。广泛用于定量测定抗氧化能力，原理是根据DPPH自由基有单电子，在520nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色，抗氧化剂(或称自由基清除剂)能使单电子配对，从而使A520nm值降低，溶液褪色。
BV(bed volume)是指树脂柱内装载树脂的体积，称作床体积，BV/h是指每小时的床体积流量。
本发明所述的乙醇溶液均指乙醇的水溶液。另外，60-80％乙醇溶液表示无水乙醇在乙醇水溶液中的体积百分比为60％-80％，同样的，70％乙醇溶液、10％乙醇溶液、20％乙醇溶液、30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、20％-30％乙醇溶液表示无水乙醇在乙醇水溶液中的体积百分比分别为70％、10％、20％、30％、50％、20％-30％。例如70％乙溶液醇表示100mL乙醇水溶液中含有70mL无水乙醇。
D101树脂是一种球状、非极性聚合物吸附剂。该树脂是一个交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物。基于适宜的孔径和比表面，该树脂对皂甙和黄酮有特殊的选择性。该树脂适于从水溶液中提取皂甙、黄酮类和某些有机物。
AB-8树脂是一种球状、聚苯乙烯型弱极性吸附树脂(注释：该树脂表面有一定的酯基，原标为弱极性；但吸附机理仍为疏水性，现定为非极性)。该树脂是一种交联聚合物，它与早期的憎水吸附剂不同，在其骨架结构中附加了弱亲水基团；又与一般离子交换树脂不同，在其结构中仅有非离子化功能基。该树脂的比表面积和孔径较大，适合于吸附各类具有一定疏水性的中药成分，吸附量较大，洗脱容易，吸附动力学性能良好。对热、有机溶剂和一般使用条件下的酸、碱稳定，因此使用寿命较长。对蛋白、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将一般中药成分与这些物质分离。最适宜水溶性、具有弱极性物质的提取、分离、纯化。
芦丁，又称为芸香甙，有典型的黄酮类结构和紫外特征，在总黄酮家族中是比较典型的代表物质，因此，常常以芦丁作为标准品来测定黄酮总量。
附图说明
图1显示了珠芽蓼果实提取物浸膏、珠芽蓼果实洗脱液冻干物的HPLC色谱图。
图2显示了珠芽蓼根茎提取物浸膏、珠芽蓼根茎洗脱液冻干物的HPLC色谱图。
图3显示了珠芽蓼花提取物浸膏、珠芽蓼花洗脱液冻干物的HPLC色谱图。
图4显示了珠芽蓼茎叶提取物浸膏、珠芽蓼茎叶洗脱液冻干物的HPLC色谱图。
具体实施例
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明实施例中的蓼科植物珠芽蓼(Polygonum viviparnm L.)购自西藏林芝。
实施例1：珠芽蓼果实提取物洗脱液冻干物的制备
将干燥后的珠芽蓼果实药材粉碎，过3号筛，取20g，以70％乙醇溶液为提取溶剂，提取溶剂体积与珠芽蓼果实原料质量之比为20mL/g。温度升温至反应液回流进行提取，提取时间4小时，得提取液。使用旋转蒸发仪在60℃将提取液浓缩后转移至蒸发皿上100℃水浴蒸干得到浸膏。取浸膏加50％乙醇溶液溶解，得80mg/mL浓度的溶液，采用D101大孔吸附树脂湿法装柱，以3.6BV/h流速上样，吸附2小时。随后以1.8BV/h流速，依次采用纯水，10％乙醇溶液，20％乙醇溶液，30％乙醇溶液，50％乙醇溶液分别洗脱5BV，合并相同溶剂比例洗脱液，将20％溶液洗脱液和30％乙醇溶液洗脱液合并得到20％-30％乙醇溶液洗脱液。分别将洗脱液浓缩至无醇味，在冷冻干燥机真空度0.1Mbar，冷肼温度-70℃条件下干燥，得珠芽蓼果实洗脱液冻干物。
实施例2：珠芽蓼果实提取物洗脱液冻干物抗肿瘤活性测试
仪器：超微量分光光度计(BMG LABTECH)，CO2恒温培养箱(Thermo FisherScientific)，96孔板(广州洁特生物过滤股份有限公司)。
试剂：0.25％胰酶-EDTA (1X)(gibco)，青链霉素混合液(hyclone)，乙醇(西陇科学股份有限公司)，RPMI1640培养基(hyclone)，DMEM培养基(hyclone)，CCK-8试剂盒(东仁化学科技股份有限公司)，PBS磷酸缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，EDTA(sigma)，胎牛血清(gibco)，细胞株均购于ATCC。
细胞培养：使用RPMI1640或DMEM完全培养基(1640/DMEM+10％胎牛血清+1％青链霉素混合液)培养，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每日倒置显微镜观察细胞1次，隔2天换培养液一次。培养瓶中，细胞生长到85％-95％融合时，进行细胞传代。弃去旧培养液，PBS磷酸缓冲液反复冲洗2次，加入2mL 0.25％胰酶消化液使细胞变圆﹑上浮后，加入4mL培养液终止消化，再转移至15mL无菌离心管中，1000r/min离心4分钟，弃上清液，以1:4比例转移至新无菌培养瓶中培养。
药物配置：将100％水洗脱样品使用培养基溶液稀释到3mg/mL，过0.45μm无菌滤器过滤除菌，再按3倍稀释成一系列梯度浓度(共9个浓度)；其余样品按照最大溶解度设置浓度为0.25mg/mL，用无水乙醇为母液溶解，用培养基进行稀释，过0.45μm无菌滤器除菌，再按3倍稀释成一系列梯度浓度，共设9个浓度点。
药效检测：收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板。在37℃，5％CO2条件下孵育24小时后。按100μL/孔加入相应药物。加完药之后，置于37℃，5％CO2培养箱中，孵育72小时。加入10％CCK-8，置于37℃培养箱中孵育1-2小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度(A)值。
表1：肿瘤细胞，使用培养基及接种密度
Figure BDA0002191660730000111
Figure BDA0002191660730000121
以下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度(细胞+CCK-8+待测提取物)
Ac:阴性对照的吸光度(细胞+CCK-8)
Ab:空白对照的吸光度(培养基+CCK-8)
表2：实施例2的结果
Figure BDA0002191660730000122
结论：根据表2的结果发现，本发明的提取方法所得的珠芽蓼果实20-30％乙醇溶液洗脱冻干物，50％乙醇溶液洗脱冻干物对淋巴瘤、黑色素瘤、血癌细胞具有明显的抑制活性，其中淋巴瘤细胞抑制效果最好，远超抗癌药物顺铂。而且，提取物来源于中药材，具有更高的安全研发前景。
实施例3：珠芽蓼果实提取物洗脱液冻干物抗氧化活性测试
DPPH溶液的配制：准确称取24mg DPPH，用95％乙醇溶解并配制成0.24mg/mL溶液，在0～4℃下避光保存。
DPPH乙醇溶液配制：0.1mL 95％乙醇与3mL 0.24mg/mL的DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30min，以无水乙醇为空白，在517nm波长处测定其吸光度Ac。
样品溶液的配制：按照下表配制浓度，样品使用95％乙醇配制，配制浓度见表3。
表3：样品溶液浓度信息表
Figure BDA0002191660730000123
Figure BDA0002191660730000131
将表3的样品溶液以及超纯水，DPPH乙醇溶液，95％乙醇，分别轻轻摇匀，室温下避光静置45分钟。
将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值，计算抑制率，并换算为IC50值(mg/mL)。
表4：反应溶液信息表
名称 T-样品管 T<sub>0</sub>-样品本底 C-DPPH管 C<sub>0</sub>-溶剂本底
样品溶液(ml) 1 1 N/A N/A
水或95％乙醇溶剂(ml) 2 2 3 3
DPPH乙醇溶液(ml) 1 N/A 1 N/A
95％乙醇(ml) N/A 1 N/A 1
(3)抑制率计算公式：
计算DPPH自由基清除率：
消除率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0))×100％(1)式
(1)式中：
T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—样品本底吸光值；
C—DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—溶剂本底吸光值。
实验结果：珠芽蓼果实提取液、20-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液洗脱冻干物抑制DPPH的IC50值分别为0.0178mg/mL、0.0070mg/mL和0.0072mg/mL，具体抑制结果如下表5所示。
可见，珠芽蓼果实20-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物对DPPH的抑制效果较好，最高抑制率分别为90.23％和92.79％。
表5：珠芽蓼果实不同洗脱液冻干物对DPPH的抑制率
Figure BDA0002191660730000132
Figure BDA0002191660730000141
实施例4：珠芽蓼果实提取物洗脱液冻干物黄酮成分指纹图谱分析及含量测定
样品制备：称取珠芽蓼果实提取物浸膏、珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼果实50％乙醇溶液洗脱冻干物样品各约20mg于50mL容量瓶中加入95％乙醇溶解定容，过0.45μm有机滤膜，备用。
对照品制备：精密称取芦丁25.2mg于50mL容量瓶中，加入95％乙醇溶解定容，得到芦丁对照品浓度为0.504mg/mL。
HPLC条件为：色谱柱Aglient Poroshell 120EC-C18(3.0×150mm，2.7μm)，流动相为0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件为：0～30min，5～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B，流速为0.4mL/min；设置变波长检测：0～34.5min，275nm；34.5～65min，360nm；柱温30℃，样品进样量为80μL，对照品进样量为5μL。
实验结果：结果如图1所示，由图可知珠芽蓼果实提取物浸膏、珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼果实50％乙醇溶液洗脱冻干物的色谱峰主要集中于34.5～65min内，即主要为黄酮成分，因此选择这个区段内峰型和吸收都较好的色谱峰计算样品中总黄酮的相对百分含量。根据34.5～65min内色谱峰的总面积与芦丁对照品峰面积的比值计算出珠芽蓼果实提取物浸膏、珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼果实50％乙醇溶液洗脱冻干物中含有的总黄酮含量，进而得出相对百分含量，计算公式如下：
Figure BDA0002191660730000151
注：W％为黄酮相对百分含量，S样品为样品单位峰面积(单位峰面积等于峰面积除以进样量)，S对照品为对照品的单位峰面积，C对照品为芦丁对照品的浓度，m总为总的称样量，V配制溶液的体积。
通过计算可知，珠芽蓼果实提取物浸膏、珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼果实50％乙醇溶液洗脱冻干物含有的黄酮相对百分含量分为0.74％、5.30％、14.47％，具体见下表6。
表6：珠芽蓼果实提取物特征峰的保留时间和峰面积
Figure BDA0002191660730000152
Figure BDA0002191660730000161
实施例5：珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物的制备
采用与实施例1相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，除了取干燥后的珠芽蓼根茎药材进行珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物的制备，得到珠芽蓼根茎水洗脱冻干物、20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液脱液冻干物。
实施例6：珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物抗肿瘤活性测试
采用与实施例2相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物的抗肿瘤活性测试。
表7：肿瘤细胞，使用培养基及接种密度
名称 编号 培养基 接种密度(个/孔)
黑色素瘤 SK-MEL-28 DMEM 4000
肺癌 H460 1640 4000
血癌 K-562 1640 6000
乳腺癌 MDA-MB-453 1640 4000
淋巴瘤癌 RAJI 1640 10000
按以下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度(细胞+CCK-8+待测提取物)
Ac:阴性对照的吸光度(细胞+CCK-8)
Ab:空白对照的吸光度(培养基+CCK-8)
表8：实施例6的结果
Figure BDA0002191660730000171
注：提取液浸膏的抗肿瘤效果较差，因此未放数据
结论：根据表8的结果发现，本发明的提取方法所得的珠芽蓼根茎20-30％乙醇、50％乙醇洗脱部位的冻干提取物对黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、血癌、淋巴瘤细胞具有明显抑制活性的，其中淋巴瘤、黑色素瘤细胞抑制效果尤为明显。其次提取物来源于中药材，具有更高安全研发前景。
实施例7：珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物抗氧化活性测试
采用与实施例3相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼根茎提取物洗脱液冻干物的抗氧化活性测试。
样品溶液的配制：按照下表配制浓度，样品使用95％乙醇配制，配制浓度见表9。
表9：样品溶液浓度信息表
Figure BDA0002191660730000172
将表9的样品溶液以及超纯水，DPPH乙醇溶液，95％乙醇，分别轻轻摇匀，室温下避光静置45分钟。
将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值，计算抑制率，并换算为IC50值(mg/mL)。
表10：反应溶液信息表
名称 T-样品管 T<sub>0</sub>-样品本底 C-DPPH管 C<sub>0</sub>-溶剂本底
样品溶液(ml) 1 1 N/A N/A
水或95％乙醇溶剂(ml) 2 2 3 3
DPPH乙醇溶液(ml) 1 N/A 1 N/A
95％乙醇(ml) N/A 1 N/A 1
(3)抑制率计算公式：
计算DPPH自由基清除率：
消除率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0))×100％(1)式
(1)式中：
T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—样品本底吸光值；
C—DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—溶剂本底吸光值。
实验结果：珠芽蓼根茎提取液、20-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液洗脱冻干物抑制DPPH的IC50值分别为0.0074mg/mL、0.0052mg/mL、0.0055mg/mL，具体抑制结果如下表11所示。
可见，珠芽蓼根茎提取液、20-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物对DPPH抑制效果较好，最高抑制率分别为91.53％和85.12％。
表11：珠芽蓼根茎不同洗脱部位冻干物对DPPH抑制率
Figure BDA0002191660730000181
Figure BDA0002191660730000191
实施例8：珠芽蓼根茎提取物洗脱液黄酮成分指纹图谱分析及含量测定
样品制备：称取珠芽蓼根茎提取物浸膏、珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液洗脱冻干物样品各约20mg于50mL容量瓶中加入95％乙醇溶解定容，过0.45μm有机滤膜，备用。
对照品制备：精密称取芦丁25.2mg于50mL容量瓶中，加入95％乙醇溶解定容，得到芦丁对照品浓度为0.504mg/mL。
HPLC条件为：色谱柱Aglient Poroshell 120EC-C18(3.0×150mm，2.7μm)，流动相为0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件为：0～30min，5～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B，流速为0.4mL/min；设置变波长检测：0～34.5min，275nm；34.5～65min，360nm；柱温30℃，样品进样量为80μL，对照品进样量为5μL。
实验结果：结果如图2所示，可以看出珠芽蓼根茎浸膏、珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物的色谱峰主要集中于34.5～65min内，即主要为黄酮成分，因此选择这个区段内峰型和吸收都较好的色谱峰计算样品中总黄酮的相对百分含量。根据34.5～65min内色谱峰的总面积与芦丁对照品峰面积的比值计算出珠芽蓼根茎浸膏、珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中含有的总黄酮含量，进而得出相对百分含量，计算公式如下：
Figure BDA0002191660730000192
注：W％为黄酮相对百分含量，S样品为样品单位峰面积(单位峰面积等于峰面积除以进样量)，S对照品为对照品的单位峰面积，C对照品为芦丁对照品的浓度，m总为总的称样量，V为配制溶液的体积。
通过计算可知，珠芽蓼根茎浸膏、珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物含有的黄酮相对百分含量分别为0.43％、2.13％、2.30％，具体见下表12。
表12：珠芽蓼根茎提取物特征峰的保留时间和峰面积
Figure BDA0002191660730000201
实施例9：珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物的制备
采用与实施例1相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，除了取干燥后的珠芽蓼花药材进行珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物的制备，得到珠芽蓼花水洗脱冻干物、20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液脱液冻干物。
实施例10：珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物抗肿瘤活性测试
采用与实施例2相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物的抗肿瘤活性测试。
表13：肿瘤细胞，使用培养基及接种密度
名称 编号 培养基 接种密度(个/孔)
黑色素瘤 SK-MEL-28 DMEM 4000
肺癌 H460 1640 4000
血癌 K-562 1640 6000
乳腺癌 MDA-MB-453 1640 4000
淋巴瘤癌 RAJI 1640 10000
按以下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度(细胞+CCK-8+待测提取物)
Ac:阴性对照的吸光度(细胞+CCK-8)
Ab:空白对照的吸光度(培养基+CCK-8)
表14：实施例10的结果
Figure BDA0002191660730000211
结论：根据表14的结果发现，本发明的提取方法所得的珠芽蓼花20-30％乙醇级分的冻干物对黑色素瘤、淋巴瘤细胞具有明显抑制活性，对淋巴瘤细胞抑制活性明显好于一线抗癌药物顺铂，50％乙醇洗脱级分的冻干物对黑色素瘤、淋巴瘤细胞具有明显抑制活性，对黑色素瘤的抑制活性比一线抗癌药物顺铂明显。对乳腺癌、肺癌、血癌细胞则具有较好的抑制效果。而且，提取物来源于中药材，具有更高的安全研发前景。
实施例11：珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物抗氧化活性测试
采用与实施例3相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物的抗氧化活性测试。
样品溶液配制：按照下表配制浓度，其余样品使用95％乙醇配制，配制浓度见下表15。
表15：样品溶液浓度信息表
Figure BDA0002191660730000221
将表15的样品溶液以及超纯水，DPPH乙醇溶液，95％乙醇，分别轻轻摇匀，室温下避光静置45分钟。
将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值，计算抑制率，并换算为IC50值(mg/mL)。
表16：反应溶液信息表
名称 T-样品管 T<sub>0</sub>-样品本底 C-DPPH管 C<sub>0</sub>-溶剂本底
样品溶液(ml) 1 1 N/A N/A
水或95％乙醇溶剂(ml) 2 2 3 3
DPPH乙醇溶液(ml) 1 N/A 1 N/A
95％乙醇(ml) N/A 1 N/A 1
(3)抑制率计算公式：
计算DPPH自由基清除率：
消除率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0))×100％(1)式
(1)式中：
T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—样品本底吸光值；
C—DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—溶剂本底吸光值。
实验结果：珠芽蓼花提取液、20-30％乙醇洗脱冻干物、50％乙醇洗脱冻干物抑制DPPH的IC50值分别为0.016mg/mL、0.0069mg/mL、0.0090mg/mL，具体抑制结果如下表17所示。
可见，珠芽蓼花提取液、20-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物部位对DPPH抑制效果较好，最高抑制率分别为82.77％和83.65％。
表17：珠芽蓼花不同洗脱液冻干物对DPPH抑制率
Figure BDA0002191660730000231
实施例12：珠芽蓼花提取物洗脱液冻干物黄酮成分指纹图谱分析及含量测定
样品制备：称取珠芽蓼花提取物浸膏、珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼花50％乙醇溶液洗脱冻干物样品各约20mg于50mL容量瓶中加入95％乙醇溶解定容，过0.45μm有机滤膜，备用。
对照品制备：精密称取芦丁25.2mg到50mL容量瓶中，加入95％乙醇溶解定容，得到芦丁对照品浓度为0.504mg/mL。
HPLC条件为：色谱柱Aglient Poroshell 120EC-C18(3.0×150mm，2.7μm)，流动相为0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件为：0～30min，5～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B，流速为0.4mL/min；设置变波长检测：0～34.5min，275nm；34.5～65min，360nm；柱温30℃，样品进样量为80μL，对照品进样量为5μL。
实验结果：结果如图3所示，由图可知珠芽蓼花提取物浸膏、珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼花50％乙醇溶液洗脱冻干物的色谱峰主要集中于34.5～65min内，即主要为黄酮成分，因此选择这个区段内峰型和吸收都较好的色谱峰计算样品中总黄酮的相对百分含量。根据34.5～65min内色谱峰的总面积与芦丁对照品峰面积的比值计算出珠芽蓼花提取物浸膏、珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼花50％乙醇溶液洗脱冻干物中含有的总黄酮含量，进而得出相对百分含量，计算公式如下：
Figure BDA0002191660730000241
注：W％为黄酮相对百分含量，S样品为样品单位峰面积(单位峰面积等于峰面积除以进样量)，S对照品为对照品的单位峰面积，C对照品为芦丁对照品的浓度，m总为总的称样量，V配制溶液的体积。
通过计算可知，珠芽蓼花提取物浸膏、珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼花50％乙醇溶液洗脱冻干物含有的黄酮相对百分含量分为2.05％、3.78％、22.13％，具体见下表18。
表18：珠芽蓼花提取物特征峰的保留时间和峰面积
Figure BDA0002191660730000242
Figure BDA0002191660730000251
实施例13：珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物的制备
采用与实施例1相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，除了取干燥后的珠芽蓼茎叶药材进行珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物的制备，得到珠芽蓼茎叶水洗脱冻干物、20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、50％乙醇溶液脱液冻干物。
实施例14：珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物抗肿瘤活性测试
采用与实施例2相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物的抗肿瘤活性测试。
表19：肿瘤细胞，使用培养基及接种密度
名称 编号 培养基 接种密度(个/孔)
黑色素瘤 SK-MEL-28 DMEM 4000
肺癌 H460 1640 4000
血癌 K-562 1640 6000
乳腺癌 MDA-MB-453 1640 4000
淋巴瘤癌 RAJI 1640 10000
按以下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
As:样品的吸光度(细胞+CCK-8+待测提取物)
Ac:阴性对照的吸光度(细胞+CCK-8)
Ab:空白对照的吸光度(培养基+CCK-8)
表20：实施例14的结果
Figure BDA0002191660730000261
结论：根据表20的结果发现，本发明制备的珠芽蓼茎叶20-30％乙醇溶液洗脱冻干物，珠芽蓼茎叶50％溶液洗脱冻干物对黑色素瘤、淋巴瘤细胞具有明显的抑制活性，其中珠芽蓼茎叶50％溶液洗脱冻干物对淋巴瘤胞的抑制效果尤为明显。而且本制备的提取物来源于中药材，具有更高的安全研发前景。
实施例15：珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物抗氧化活性测试
采用与实施例3相同的条件，实验步骤，试剂和仪器，进行珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物的抗氧化活性测试。
样品溶液的配制：按照下表配制浓度，样品使用95％乙醇配制，配制浓度见表21。
表21：样品溶液浓度信息表
Figure BDA0002191660730000262
将表21的样品溶液以及超纯水，DPPH乙醇溶液，95％乙醇，分别轻轻摇匀，室温下避光静置45分钟。
将各支反应溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值，计算抑制率，并换算为IC50值(mg/mL)。
表22：反应溶液信息表
名称 T-样品管 T<sub>0</sub>-样品本底 C-DPPH管 C<sub>0</sub>-溶剂本底
样品溶液(ml) 1 1 N/A N/A
水或95％乙醇溶剂(ml) 2 2 3 3
DPPH乙醇溶液(ml) 1 N/A 1 N/A
95％乙醇(ml) N/A 1 N/A 1
(3)抑制率计算公式：
计算DPPH自由基清除率：
消除率(％)＝(1-(T-T0)/(C-C0))×100％(1)式
(1)式中：
T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—样品本底吸光值；
C—DPPH管吸光值3次平均值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—溶剂本底吸光值。
实验结果：珠芽蓼茎叶提取液、20-30％乙醇洗脱冻干物、50％乙醇洗脱冻干物抑制DPPH的IC50值分别为0.0305mg/mL、0.0141mg/mL和0.0137mg/mL，具体抑制结果如下表23所示：
可见，珠芽蓼茎叶20-30％乙醇洗脱冻干物和50％乙醇洗脱冻干物对DPPH抑制效果较好，最高抑制率分别为86.86％和91.16％。
表23：珠芽蓼茎叶不同洗脱部位冻干物对DPPH抑制率
Figure BDA0002191660730000271
Figure BDA0002191660730000281
实施例18：珠芽蓼茎叶提取物洗脱液冻干物黄酮成分指纹图谱分析及含量测定样品制备：称取珠芽蓼茎叶提取物浸膏、珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼茎叶50％乙醇溶液洗脱冻干物样品各约20mg于50mL容量瓶中加入95％乙醇溶解定容，过0.45μm有机滤膜，备用。
对照品制备：精密称取芦丁25.2mg于50mL容量瓶中，加入95％乙醇溶解定容，得到芦丁对照品浓度为0.504mg/mL。
HPLC条件为：色谱柱Aglient Poroshell 120EC-C18(3.0×150mm，2.7μm)，流动相为0.1％甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件为：0～30min，5～10％B；30～32min，10～15％B；32～44min，15～18％B；44～55min，18～32％B；55～65min，32～50％B，流速为0.4mL/min；设置变波长检测：0～34.5min，275nm；34.5～65min，360nm；柱温30℃，样品进样量为80μL，对照品进样量为5μL。
实验结果：结果如图4所示，由图可知珠芽蓼茎叶提取物浸膏、珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼茎叶50％乙醇溶液洗脱冻干物的色谱峰主要集中于34.5～65min内，即主要为黄酮成分，因此选择这个区段内峰型和吸收都较好的色谱峰计算样品中总黄酮的相对百分含量。根据34.5～65min内色谱峰的总面积与芦丁对照品峰面积的比值计算出珠芽蓼茎叶提取物浸膏、珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼茎叶50％乙醇溶液洗脱冻干物中含有的总黄酮含量，进而得出相对百分含量，计算公式如下：
Figure BDA0002191660730000291
注：W％为黄酮相对百分含量，S样品为样品单位峰面积(单位峰面积等于峰面积除以进样量)，S对照品为对照品的单位峰面积，C对照品为芦丁对照品的浓度，m总为总的称样量，V配制溶液的体积。
通过计算可知，珠芽蓼茎叶提取物浸膏、珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物、珠芽蓼茎叶50％乙醇溶液洗脱冻干物含有的黄酮相对百分含量分别为2.05％、20.82％和9.09％，具体见下表24。
表24：珠芽蓼茎叶提取物特征峰的保留时间和峰面积
Figure BDA0002191660730000292
Figure BDA0002191660730000301

Claims (22)

1.一种珠芽蓼提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将珠芽蓼药材粉碎，以乙醇溶液作为提取溶剂，在加热条件下进行提取，得到提取液，浓缩提取液得到浸膏；以及
(2)用乙醇溶液溶解浸膏，用大孔树脂进行吸附，并用不同梯度的乙醇溶液进行洗脱，合并相同梯度的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得到珠芽蓼相应梯度的乙醇溶液洗脱冻干物；
其中，所述珠芽蓼相应梯度的乙醇溶液洗脱冻干物为珠芽蓼20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物或珠芽蓼50％乙醇溶液洗脱冻干物；
其中，所述大孔树脂为D101树脂或AB-8树脂。
2.根据权利要求1所述的方法，所述珠芽蓼药材为珠芽蓼果实，珠芽蓼根茎，珠芽蓼花或珠芽蓼茎叶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，以60％-80％乙醇溶液作为提取溶剂，并且提取溶剂的体积与珠芽蓼的质量比为15-30mL/g。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，以70％乙醇溶液作为提取溶剂，并且提取溶剂的体积与珠芽蓼的质量比为20mL/g。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(1)中提取温度为70-100℃，提取时间为3-4小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在步骤(1)中，提取温度为回流温度，提取时间为4小时。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，采用大孔吸附树脂柱，以3.6BV/h流速上样，吸附2-6小时。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，以0.9-3.6BV/h的流速，采用纯水，10％乙醇溶液，20％乙醇溶液，30％乙醇溶液，50％乙醇溶液分别洗脱至少5BV，合并相同溶剂比例的洗脱液，将20％乙醇溶液洗脱液和30％乙醇溶液洗脱液合并得到20％-30％乙醇溶液洗脱液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于以1.8BV/h的流速进行洗脱。
10.由权利要求1-9任一项的方法制备的珠芽蓼提取物。
11.根据权利要求10所述的珠芽蓼提取物，其特征在于所述珠芽蓼提取物为珠芽蓼果实提取物，珠芽蓼根茎提取物，珠芽蓼花提取物或珠芽蓼茎叶提取物。
12.根据权利要求10所述的珠芽蓼提取物，其特征在于珠芽蓼20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-22％和2-23％的黄酮。
13.根据权利要求12所述的珠芽蓼提取物，其特征在于珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5-5.5％和14-15％的黄酮。
14.根据权利要求13所述的珠芽蓼提取物，其特征在于所述珠芽蓼果实20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计5.3％和14.47％的黄酮。
15.根据权利要求12所述的珠芽蓼提取物，其特征在于珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2-2.3％和2-2.5％的黄酮。
16.根据权利要求15所述的珠芽蓼提取物，其特征在于所述珠芽蓼根茎20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计2.13％和2.3％的黄酮。
17.根据权利要求12所述的珠芽蓼提取物，其特征在于珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.5-4％和21-23％的黄酮。
18.根据权利要求17所述的珠芽蓼提取物，其特征在于所述珠芽蓼花20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计3.78％和22.13％的黄酮。
19.根据权利要求12所述的珠芽蓼提取物，其特征在于珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20-22％和8.7-9.3％的黄酮。
20.根据权利要求19所述的珠芽蓼提取物，其特征在于所述珠芽蓼茎叶20％-30％乙醇溶液洗脱冻干物和50％乙醇溶液洗脱冻干物中分别含有以重量计20.82％和9.09％的黄酮。
21.权利要求10-20任一项所述的珠芽蓼提取物在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为黑色素瘤，淋巴瘤，乳腺癌，肺癌和血癌。
22.权利要求10-20任一项所述的珠芽蓼提取物在制备用于抗氧化的药物中的应用。
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