CN112957344B - 一种含西番莲黄酮纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含西番莲黄酮纳米制剂及其制备方法，包括如下质量百分含量的原料：西番莲黄酮提取物0.5％‑3.0％、油相5‑10％、乳化剂5‑10％、乳化助剂15‑30％，余量为水；所述油相由亚麻籽油、肉豆蔻酸异丙酯和地衣二醇葡萄糖苷组成；所述乳化剂由吐温、三聚甘油单硬脂酸酯和藻酸丙二醇酯组成；所述乳化助剂由多元醇和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。本发明将西番莲黄酮提取物制成纳米制剂后，能够提高黄酮的溶解度、溶出度、渗透性及生物利用度，更容易进入组织细胞，提高药物在靶器官的富集浓度或体内滞留时间，使得药效增强，且药物的包封率及载药量明显提高，防潮性能、稳定性，更容易保存及运输。

Description

一种含西番莲黄酮纳米制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是一种含西番莲黄酮纳米制剂及其制备方法。

背景技术

西番莲原产于南美洲，在我国广东、广西、福建等地有大面积栽培。在欧洲和北美等被作为传统药物使用，已被多个国家官方批准作为药物，其有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗焦虑及镇定作用。西番莲其发挥药效的主要物质是黄酮类物质。黄酮类化合物是一类以2个苯环通过3个碳原子连接成C6-C3-C6结构为母核的化合物，广泛存在于植物的茎、叶、果实中，有抗肿瘤、消除自由基和抗氧化活性等作用。

目前市场上的西番莲主要是直接食用、压榨成果汁饮料、加工成含片或直接提取黄酮类化合物，然而西番莲总黄酮存在在水中溶解度小，难以吸收，生物利用度低、容易受潮稳定性较低等缺陷。

纳米粒子(Nanoparticles)指的是生物活性物质、药物等吸附、附着于粒子表面，或者溶解、包裹于粒子内部，成为超微小球型载体的固状胶态粒子，包括纳米球(Nanospheres)和纳米囊(Nanocapsules)，直径在1～1000nm之间，已成为化妆品、医药、功能食品等领域的应用研究热点。因此，本发明将西番莲总黄酮制成纳米制剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种含西番莲黄酮纳米制剂及其制备方法。本发明将西番莲黄酮提取物制成纳米制剂后，能够提高黄酮的溶解度、溶出度、渗透性及生物利用度，更容易进入组织细胞，提高药物在靶器官的富集浓度或体内滞留时间，使得药效增强，且药物的包封率及载药量明显提高，防潮性能、稳定性，更容易保存及运输。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种含西番莲黄酮纳米制剂，包括如下质量百分含量的原料：西番莲黄酮提取物0.5％-3.0％、油相5-10％、乳化剂5-10％、乳化助剂15-30％，余量为水；所述油相由亚麻籽油、肉豆蔻酸异丙酯和地衣二醇葡萄糖苷组成；所述乳化剂由吐温、三聚甘油单硬脂酸酯和藻酸丙二醇酯组成；所述乳化助剂由多元醇和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。

进一步地，所述多元醇为乙醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇中的一种或多种组合。

进一步地，所述油相中亚麻籽油、肉豆蔻酸异丙酯和地衣二醇葡萄糖苷的质量比为5-10:1-3:1。

进一步地，所述乳化剂中吐温、三聚甘油单硬脂酸酯和藻酸丙二醇酯的质量比为10-20:3-5:1。

进一步地，所述多元醇和羟丙基二淀粉磷酸酯的质量比为3-5:1。

进一步地，所述吐温为吐温20、吐温60、吐温80中的一种或多种组合。

进一步地，所述西番莲提取物中总黄酮纯度达到80％以上。

本发明另一目的还提供所述西番莲黄酮提取物的提取方法，包括如下步骤：

(1)取西番莲茎叶，粉碎成粗粉，得到的西番莲粗粉，加入超声逆流提取罐，再加入西番莲重量6-10倍的乙醇和乙酸乙酯浸提液，再加入纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成生物酶，在温度为50-60℃下超声逆流提取1-2h，升温至 60-80℃，超声逆流提取1-2h，过滤，得到的浸提液经过浓缩，干燥，得西番莲总浸膏；

(2)将西番莲总浸膏用水稀释后，萃取，再用恒流泵泵入大孔吸附树脂吸附，用水洗柱，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙腈和乙酸乙酯；

(3)再将洗脱液经过减压浓缩、干燥，即可得到西番莲黄酮提取物。

优选地，所述浸提液中乙醇和乙酸乙酯的体积比为2-4:1；所述乙腈和乙酸乙酯的体积比为1-3:1。

本发明还提供了所述含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1:将西番莲黄酮提取物加入油相中，于25-40℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将乳化剂、乳化助剂加入水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得到含西番莲黄酮的纳米制剂。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

1、本发明在西番莲黄酮提取物中加入油相、乳化剂和乳化助剂制成纳米制剂，能够提高黄酮的溶解度、溶出度、渗透性及生物利用度，更容易进入组织细胞，提高药物在靶器官的富集浓度或体内滞留时间，使得药效增强；且药物的包封率及载药量明显提高，防潮及稳定性能提高，更容易保存及运输。

2、本发明选择亚麻籽油、肉豆蔻酸异丙酯和地衣二醇葡萄糖苷作为油相，能够提高西番莲黄酮纳米制剂的包封率和载药量，提高其稳定性、生物利用度及靶向性。

3、本发明选用吐温、三聚甘油单硬脂酸酯和藻酸丙二醇酯作为乳化剂，以多元醇和羟丙基二淀粉磷酸酯作为乳化助剂，不仅能够提高黄酮的溶解度、溶出度及渗透性，还能提高水相与油相之间的相容性；促进药物的吸收，增强药效。

4、本发明还利用超声波逆流提取结合生物酶法提取西番莲的总黄酮，能够促进细胞壁破裂，有利于黄酮更快更好地从西番莲提取出来，使得黄酮的提取率和提取效率都显著提高。

5、本方法利用乙酸乙酯作为浸提剂，再经过大孔吸附树脂吸附，用乙腈和乙酸乙酯洗脱，能够提高黄酮的纯度。

6、本发明提供的西番莲黄酮纳米制剂，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，应用范围广。

附图说明

图1为紫外-可见光分光光度计法检测总黄酮的标准曲线图；

图2为HPLC检测方法的标准曲线图；

图3为荭草素标准品的HPLC色谱图；

图4为西番莲黄酮纳米乳供试液的HPLC色谱图；

图5为实施例4含西番莲黄酮纳米制剂的粒径图；

图6为实施例4含西番莲黄酮纳米制剂的Zeta电位图；

图7为实施例4含西番莲黄酮纳米制剂中荭草素的体外溶出度曲线图；

图8为小鼠足肿胀率图；

图9为TNF-α、IL-1β、IL-6因子检测结果图；

图10为免疫抑制模型小鼠的脾脏及胸腺指数

图11为IgM检测结果图；

图12为IgA检测结果图；

图13为IgG检测结果图；

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

本发明以下西番莲黄酮提取物的提取方法，包括如下步骤：

(1)取西番莲叶，粉碎成40目的粗粉，得到的西番莲粗粉，加入超声逆流提取罐，再加入西番莲重量8倍的乙醇和乙酸乙酯(体积比为3:1)浸提液，再加入质量比为3:2:1的纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成生物酶，所述生物酶的加入量为西番莲茎叶在温度为60℃下超声逆流提取1.5h，升温至80℃，超声逆流提取1.5h，过滤，得到的浸提液经过浓缩，干燥，得西番莲总浸膏；

(2)将西番莲总浸膏用10倍重量的水稀释后，石油醚萃取3-5次，水部分用乙酸乙酯萃取3-5次，蒸发有机溶剂，再配制成1mg/mL溶液，恒流泵泵入大孔吸附树脂吸附，先用水洗柱，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇；

(3)再将洗脱液减压浓缩、在70℃下温度为干燥，即可得到西番莲黄酮提取物。

实施例1

一种含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1:将100g西番莲黄酮提取物加入油相中，所述油相为由亚麻籽油600g、肉豆蔻酸异丙酯200g和地衣二醇葡萄糖苷100g，于30℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将吐温80750g、三聚甘油单硬脂酸酯200g和藻酸丙二醇酯50g配成的乳化剂、1,2-丙二醇1600g和羟丙基二淀粉磷酸酯400g配成的乳化助剂加入 6000g水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得含西番莲黄酮的纳米制剂。

实施例2

一种含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1:将200g西番莲黄酮提取物加入油相中，所述油相为由亚麻籽油500g、肉豆蔻酸异丙酯100g和地衣二醇葡萄糖苷100g，于35℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将吐温80600g、三聚甘油单硬脂酸酯150g和藻酸丙二醇酯50g配成的乳化剂、聚乙二醇-4001500g和羟丙基二淀粉磷酸酯300g配成的乳化助剂加入 6500g水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得含西番莲黄酮的纳米制剂。

实施例3

一种含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1:将50g西番莲黄酮提取物加入油相中，所述油相为由亚麻籽油400g、肉豆蔻酸异丙酯150g和地衣二醇葡萄糖苷50g，于30℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将吐温60400g、三聚甘油单硬脂酸酯82.5g和藻酸丙二醇酯27.5g配成的乳化剂、1,3-丙二醇1500g和羟丙基二淀粉磷酸酯500g配成的乳化助剂加入 7800g水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得含西番莲黄酮的纳米制剂。

实施例4

一种含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1:将300g西番莲黄酮提取物加入油相中，所述油相为由亚麻籽油700g、肉豆蔻酸异丙酯200g和地衣二醇葡萄糖苷100g，于30℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将吐温80675g、三聚甘油单硬脂酸酯180g和藻酸丙二醇酯45g配成的乳化剂、乙醇2240g和羟丙基二淀粉磷酸酯560g配成的乳化助剂加入5000g 水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得含西番莲黄酮的纳米制剂。

二、质量检测方法的建立

(一)建立西番莲提取物中总黄酮含量测定的紫外-可见光分光光度(UV)

分析方法

1.溶剂的配制：

1.1样品溶液的配制：称取一定量的样品溶于60％乙醇，配成1mg/mL溶液。

1.2标准品溶液的配制：将荭草素溶于60％乙醇，配制成0.2mg/mL样品。

1.3硼酸-草酸溶液：称取2.5g硼酸和2g草酸，用甲酸溶解，定容至100mL。

2.方法学验证

2.1标准曲线的绘制

将标准品溶液稀释成10、20、50、100、200、300、400、500、600ug/mL，各取100ul标准品溶液于离心管中，蒸干，加入90ul甲醇，加910ul冰乙酸，涡旋溶解后，加1mL硼酸-草酸溶液(对照溶液，加甲酸)，加0.5mL冰乙酸至 2.5mL，混匀，静置显色50min后检测。以对照溶液在401nm处调零，检测对照品溶液的OD值。以吸光度值为X轴，标准品溶液的含量为Y轴，绘制标准曲线。见图1，结果显示：R²＝0.9996；表明在1-60ug含量范围内荭草素含量与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2精密度试验

精密取样品溶液20ul，按2.1方法进行处理，共测6次，计算总黄酮含量及各测量值的RSD值。结果测得西番莲提取物中总黄酮含量为的16.60±0.02ug (Mean±SD,n＝6)，RSD＝0.11％，表明仪器精密度良好。

2.3稳定性试验

精密取样品20ul，按2.1方法进行处理，在显色50min至2h内，每10min 测1次，计算总黄酮含量及各测量值的RSD值。结果50-120min内测得西番莲提取物中总黄酮含量为16.10±0.28ug(Mean±SD,n＝6)，RSD＝1.75％，表明方法的稳定性良好。

2.4重复性试验

精密取样品20ul，共6份，按2.1方法进行处理，计算总黄酮含量及RSD 值。结果测得西番莲提取物中总黄酮含量为16.15±0.16ug(Mean±SD,n＝6)， RSD＝0.96％，表明方法的重复性良好。

2.5加样回收试验

精密取样品20ul，共6份，加入0.2mg/mL标准品溶液25ul，按2.1方法进行处理，计算总黄酮含量及RSD值。结果方法的回收率为94.52±2.27ug(Mean±SD, n＝6)，RSD＝2.27％，表明本方法的准确度良好。

2.6样品中总黄酮含量检测结果

取三批西番莲提取物，按1.1方法配制，取20ul样品溶液，依照2.1中方法进行进行处理，结果三批西番莲提取物中总黄酮的含量为16.72±0.63ug (Mean±SD,n＝3)，RSD＝0.77％，结果表明三个批次样品中总黄酮的纯度均大于80％。

结论：本试验以荭草素为对照品成功建立了西番莲中总黄酮的含量测定分析方法，该方法简便、可靠，能很好地对西番莲提取物进行质量控制。通过本方法实测，发现西番莲提取物样品中总黄酮的纯度均大于80％。

(二)建立西番莲纳米乳剂中荭草素含量测定的高效液相色谱(HPLC)分

析方法

1.溶液的配制

1.1对照品溶液的配制：精密称定荭草素0.0030±0.0005g于10mL容量瓶中，甲醇超声溶解后定容至刻度，即得荭草素对照品溶液母液。

1.2西番莲黄酮纳米乳供试液的配制：精密量取西番莲黄酮纳米制剂1mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇，涡旋，超声10min，定容,取破乳液，经0.45um 滤膜过滤，备用。

1.3西番莲黄酮提取物供试液的配制：精密量称取西番莲黄酮提取物3g，加入一定量甲醇，超声溶解后定容至100mL，经0.45um滤膜过滤，备用。

2.方法学验证

2.1色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm， 5μm)；检测波长：348nm；柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；流动相组成：乙腈(A)-0.1％磷酸(B)；梯度洗脱程序：0～25min，A＝19％； 25～30min，A＝19～50％；30～40min，A＝50％；40～45min，A＝50～19％；45～60 min，A＝19％。

2.2.系统适应性试验

取荭草素对照品溶液及西番莲黄酮纳米供试液稀释至一定浓度，用0.45μm 的微孔滤膜过滤，吸取1mL滤液于供试品瓶中，依照2.1色谱条件进行HPLC 检测，记录色谱图(见图3、图4)。结果表明：供试品溶液中荭草素与相邻峰的分离度良好，拖尾因子T＝1.004(在0.95-1.05之间，符合《中国兽药典》要求)，该峰理论板数大于8000。结果表明方法专属性良好。

2.3.标准曲线的绘制

将依照“1.1对照品溶液的制备”制得的荭草素对照品溶液，倍比稀释8次，得到9份倍数浓度的对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，吸取1mL滤液于进样品瓶中，依照色谱条件进行HPLC检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。结果：标准曲线方程为：y＝0.00064x+0.119699， R²＝0.9999；表明方法在1.29～331μg/mL浓度范围内荭草素含量与峰面积呈现良好的线性关系。

2.4精密度试验

精密取西番莲黄酮纳米乳供试液稀释后，制得3个不同浓度的供试品溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，吸取1mL滤液于进品瓶中，依照色谱条件进行 HPLC检测。每个供试品每天重复测定3次，连续测定3天，通过标准曲线计算出供试品中荭草素的浓度。结果：3个不同浓度的供试品溶液中荭草素的含量分别为40.15±0.07μg/mL、19.17±0.06μg/mL和9.66±0.10μg/mL(Mean±SD,n＝3)， RSD分别为0.18％、0.30％和0.98％。结果表明本法测定西番莲黄酮纳米乳荭草素含量的仪器精密度良好。

2.5重复性试验

精密取同一批西番莲黄酮纳米乳溶液稀释至一定浓度，制备成供试品溶液6 份，用0.45μm的微孔滤膜过滤，吸取1mL滤液于进样品瓶中，依照色谱条件进行HPLC检测，结果乳荭草素的含量为27.80±0.32μg/mL(Mean±SD,n＝6)， RSD为1.15％。结果表明本法测定西番莲黄酮纳米乳中荭草素含量的重复性良好。

2.6.加样回收率试验

在6份已知荭草素浓度的西番莲黄酮纳米乳溶液中加入一定量的已知浓度的荭草素对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，吸取1mL滤液于进样品瓶中，依照色谱条件进行HPLC检测，通过标准曲线计算出供试品中荭草素浓度及回收率。结果平均回收率为107.11±2.12μg/mL(Mean±SD,n＝6)，RSD为1.98％，结果表明本法测定西番莲黄酮纳米乳荭草素含量的准确度良好。

2.7稳定性试验

精密量取一定西番莲黄酮纳米乳供试液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，吸取 1mL滤液于进样品瓶中，依照色谱条件分别在第0、4、8、12、16、20、24h进行HPLC检测，通过标准曲线计算出供试品中荭草素浓度。结果荭草素含量为 40.42±0.15μg/mL(Mean±SD,n＝6)，RSD为0.38％，表明本法测定西番莲黄酮纳米乳荭草素含量在室温下24h内保持稳定。

2.8测定西番莲总黄酮纳米乳包封率

依照“1.溶液配制方法”，将西番莲黄酮提取物供试品和西番莲黄酮纳米乳供试品稀释至一定浓度，在色谱条件下，检测西番莲黄酮提取物供试品和西番莲黄酮纳米乳供试品中荭草素含量，代入标准曲线求得荭草素含量。以荭草素含量计算包封率。其中包封率＝纳米乳中药物含量/加入纳米乳中药物的总质量×100％。结果三个批次(批号分别为：20200101、20200102和20200103)西番莲纳米乳样品的包封率分别为93.00％、94.20％和93.70％。

结论：本试验成功建立了西番莲总黄酮纳米乳中有效成分荭草素的含量测定的HPLC分析方法，该方法简便灵敏、准确可靠、重现性好，可用于测定西番莲总黄酮纳米乳中荭草素的含量测定。通过本方法测定西番莲总黄酮纳米乳的包封率，发现西番莲总黄酮纳米乳的包封率大于93％。

三、西番莲纳米乳的质量评价

(一)粒径及电位分析

取西番莲纳米乳5mL，用蒸馏水稀释5倍，按2015版中国药典第二部附录 IXE粒度和粒度分布测定方法第三法光散射法，采用马尔文纳米粒度仪测定纳米乳的粒径和Zeta电位。

(二)包封率

按上述“(二)建立西番莲纳米乳剂中荭草素含量测定的高效液相色谱 (HPLC)分析方法中”的“2.7测定西番莲总黄酮纳米乳包封率”进行测定，计算纳米乳剂的包封率。

(三)载药量

精密量取1mL西番莲叶黄酮纳米乳液至10mL容量瓶中，加甲醇，涡旋，超声10min，定容,取破乳液，按总黄酮检测方法测总黄酮含量。测得西番莲黄酮纳米乳中黄酮质量浓度为22.5mg/mL，载药量为2.25％。

(四)溶解度测定

采用摇床法测定溶解度：取10mL西番莲黄酮纳米乳直接注入装有90mL水的具塞锥形瓶中，震荡、超声，制成过饱和溶液，过饱和溶液遮光并密封之后置于37℃恒温气浴振荡器中，100rpm水平振荡72h，在1h、2h、3h、10h、 24h、48h、72h后取样，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液适量，在2500r/min条件下离心10min，取上清液作为供试品溶液，进样10μL，在348nm检测波长高效液相色谱法进行含量测定，求得其平衡溶解度。

(五)体外溶出度测定

量取超纯水900ml，注入每个溶出杯中，加温使溶液温度保持37±0.5℃，定量精密称取实施例4中的纳米制剂和提取物样品各6份，投入转篮中，开动机器以转速为100rpm运转，分别于以5，10，15，30，45，60，90，120min取样，经 0.8um微孔水相滤膜过滤，自取样至滤过在30s内完成，按照上述“(二)建立西番莲纳米乳剂中荭草素含量测定的高效液相色谱(HPLC)分析方法”进行HPLC 检测，按外标法计算荭草素溶出百分率。结果如图7所示，西番莲黄酮纳米制剂中荭草素5min的累积溶出率为41.21％，15min即达到83.47％，而西番莲黄酮提取物15min仅达到49.37％，表明西番莲黄酮纳米制剂中药物的溶出速率更快，更完全。

将上述实施例1-4制得的含西番莲黄酮纳米制剂按照上述(一)至(五)法测定产品的粒径、包封率、载药量、溶解度和溶出度，测试结果如表1所示。实施例4粒径见图5、Zeta电位见图6、体外溶出度曲线见图7。

表1本发明制得含西番莲黄酮纳米制剂的产品性能测试结果

产品	平均粒径(nm)	包封率(％)	溶解度(mg/mL)	Zeta电位
					实施例1	66.21	85.6	1.95	-51.6
实施例2	62.40	87.4	2.17	-32.8
					实施例3	53.53	90.3	2.13	-29.5
实施例4	50.56	93.6	2.25	-23.1

结果表明：实施例4的粒径为50.56nm，包封率93.6％，药物溶解度大。相较于西番莲提取物在水中的溶解度(50ug/mL)和溶出度，显著提高了西番莲总黄酮的溶解度和溶出度。

四、西番莲纳米乳的药效学评价

(一)西番莲总黄酮纳米乳制剂对小鼠的足肿胀的抗炎作用试验

1.试验药物

应用实施例4所制备的西番莲总黄酮纳米乳制剂、西番莲总黄酮提取物。

2.试验动物

BALB/c系小鼠，SPF级，4周龄，体重20±2g，雌雄各半。

3.试验方法

3.1试验分组与处理

将60只小鼠(雌雄对半)随机分为6组，每组10只。空白组和模型组腹腔注射(Intraperitoned injection，i.p)无菌生理盐水，地塞米松组(阳性对照组) 腹腔注射2mg/kg·bw地塞米松(使用灭菌生理盐水溶解)，西番莲黄酮提取物 300mg/kg·bw和西番莲黄酮纳米乳(300mg/kg·bw，以总黄酮计)剂量组腹腔注射(灭菌生理盐水为溶剂)；各组给药容积均为0.1mL/10g·bw，每组连续给药 5天。最后一次在给药前用游标卡尺测量对每只小鼠左右后足趾厚度进行测量并记录，最后一次给药后1小时，空白组小鼠左右后足趾注射50μL生理盐水，其余各组小鼠左后足趾注射1％角叉菜胶悬浮液50μL，右足注射等体积的生理盐水。在120min后，对小鼠进行摘眼球采血，脱颈处死小鼠后沿踝关节下缘剪下左右两足，准确称量。

3.2小鼠足肿胀率的测定

小鼠的足肿胀率按如下公式进行计算：

足肿胀率(％)＝(左后足趾厚度-右后足趾厚度)/(右后足趾厚度)×100％。

3.3小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的测定

将摘眼球采集的血液离心，静置1-2小时，置于离心机内以3000rpm速度4℃离心15分钟，用移液管吸出分离的血清(上层乳黄色的上清液)，使用分离的血清检测指标。采用商品化酶联免疫分析试剂盒检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。

4.结果与分析

4.1西番莲黄酮纳米制剂对小鼠足肿胀率的抑制作用

小鼠足肿胀率的测定结果如图8所示，在图8中从左到右依次为空白组、模型组、西番莲黄酮提取物组、西番莲西番莲黄酮纳米制剂、地塞米松组。

统计分析结果表明，与模型组比较，地塞米松组和西番莲黄酮给药组对足肿胀都有极显著性的降低作用(p＜0.01)，西番莲黄酮纳米制剂与西番莲提取物的抑制足肿胀率差异显著(P<0.05)，表明西番莲黄酮纳米制剂的抗炎效果优于西番莲提取物。

4.2西番莲黄酮纳米制剂对炎症小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的影响

西番莲黄酮纳米制剂对炎症小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的影响，见图9，在图9中从左到右依次为空白组、模型组、地塞米松组、西番莲黄酮提取物组、西番莲西番莲黄酮纳米制剂。结果表明：小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量注射角叉菜胶后，小鼠血清中TNF-α、IL-1β和 IL-6的含量水平有极显著升高(p＜0.01)，表明角叉菜胶可引起小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量水平极明显上升，腹腔给予2mg/kg·bw的地塞米松、西番莲黄酮提取物300mg/kg·bw和西番莲黄酮纳米乳组(300mg/kg·bw，以总黄酮计)剂量组均对角叉菜胶诱导的足肿胀小鼠血清中细胞因子TNF-α、 IL-1β和IL-6的含量有抑制作用(p＜0.05或p＜0.01)，说明西番莲黄酮和地塞米松均可抑制小鼠分泌细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。并且西番莲黄酮纳米乳组相对西番莲黄酮提取物组抑制能力更强。

5.结论

西番莲黄酮纳米制剂和西番莲提取物对小鼠的足肿胀均有良好的抗炎效果，但西番莲黄酮纳米制剂的抗炎效果更优，可能与西番莲黄酮提取物制成纳米乳剂后生物利用度更高有关。

(二)西番莲总黄酮纳米制剂对环磷酰胺致小鼠免疫抑制免疫的调节作用

1.试验药物

应用实施例4所制备的西番莲总黄酮纳米乳制剂、西番莲总黄酮提取物。

2.试验动物

BALB/c系小鼠，SPF级，4周龄，体重20±2g，雌雄各半。

3.试验方法

3.1分组与处理

将60只小鼠(雌雄对半)随机分为6组，每组10只。空白组和模型组腹腔注射(Intraperitoned injection，i.p)无菌生理盐水，黄芪多糖组(阳性对照组) 腹腔注射400mg/kg·bw黄芪多糖提取物(使用灭菌生理盐水溶解)，西番莲提取物300mg/kg和西番莲总黄酮纳米乳组(300mg/kg·bw)剂量组(使用灭菌生理盐水溶解)，各组给药容积均为0.1mL/10g·bw，每组连续给药7天，最后一次给药后4小时，空白组腹腔注射0.1mL/10g·bw无菌生理盐水，其余组腹腔注射250mg/kg·bw环磷酰胺(使用灭菌生理盐水溶解)，24h后，称量记录小鼠体重后眼眶采血，断颈椎处死并立即进行解剖，迅速采集脾脏和胸腺，用分析天平称重后做好记录，用中性福尔马林保存胸腺和脾脏。

3.2脾脏指数和胸腺指数的测定

根据试验记录的小鼠体重、胸腺和脾脏重量，根据公式计算胸腺和脾脏指数。胸腺和脾脏指数公式如下：

3.3血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-10、TNF-α和IFN-γ的检测

将摘眼球采集的血液离心，静置1-2小时，置于离心机内以3000P/m离心 15分钟，用移吸管吸出分离的血清(上层乳黄色的上清液)，使用分离的血清检测指标。采用商品化酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测血清中IgA、IgG、IgM、 IL-2、IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量。

4.结果与分析

4.1小鼠脾脏指数和胸腺指数的测定结果

脾脏指数和胸腺指数的测定结果如图10所示：腹腔注射环磷酰胺后，小鼠的脾脏指数和胸腺指数极显著下降(p＜0.01)，表明环磷酰胺可引起脾脏和胸腺萎缩。腹腔给药西番莲黄酮提取物和西番莲黄酮纳米制剂可显著缓解注射环磷酰胺后的小鼠脾脏指数和胸腺指数下降(p＜0.05或p＜0.01)，说明西番莲提取物和西番莲黄酮制成纳米对免疫抑制小鼠的脾脏和胸腺有一定保护作用。但西番莲黄酮制成纳米制剂后的保护作用更优。

4.2小鼠血清中IgA、IgG和IgM的含量检测结果

小鼠血清中IgA、IgG和IgM的含量测定结果如图11-13所示：结果发现，腹腔注射环磷酰胺后，小鼠血清中IgA、IgG和IgM极显著下降(p＜0.01)，表明腹腔注射环磷酰胺可引起小鼠血清中IgA、IgG和IgM含量水平下降。腹腔给予200mg/kg·bw的黄芪多糖、300mg/kg·bw的西番莲黄酮提取物和300mg/kg·bw 的西番莲黄酮纳米乳组剂量组均可极显著升高腹腔注射环磷酰胺后小鼠血清中 IgA、IgG和IgM的含水平(p＜0.01)，说明西番莲黄酮和黄芪多糖均可促进小鼠分泌IgA、IgG和IgM。并且西番莲黄酮制成纳米制剂后，提升效果更为显著。

5.结论

等剂量条件下，西番莲黄酮纳米制剂和西番莲提取物对小鼠环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制有良好的免疫调节作用，但西番莲黄酮纳米制剂的免疫调节效果更优，可能与西番莲黄酮提取物制成纳米乳剂后体外溶出度更好、生物利用度更高有关。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：包括如下质量百分含量的原料：西番莲黄酮提取物0.5％-3.0％、油相5-10％、乳化剂5-10％、乳化助剂15-30％，余量为水；所述油相由质量比为5-10:1-3:1的亚麻籽油、肉豆蔻酸异丙酯和地衣二醇葡萄糖苷组成；所述乳化剂由质量比为10-20:3-5:1的吐温、三聚甘油单硬脂酸酯和藻酸丙二醇酯组成；所述乳化助剂由质量比为3-5:1的多元醇和羟丙基二淀粉磷酸酯组成。

2.根据权利要求1所述含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：所述多元醇为乙醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1所述含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：所述吐温为吐温20、吐温60、吐温80中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1所述含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：所述西番莲黄酮提取物中总黄酮纯度达到80％以上。

5.根据权利要求4所述含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：所述西番莲黄酮提取物的提取方法，包括如下步骤：

(1)取西番莲茎叶，粉碎成粗粉，得到的西番莲粗粉，加入超声逆流提取罐，再加入西番莲重量6-10倍的乙醇和乙酸乙酯浸提液，再加入纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成生物酶，在温度为50-60℃下超声逆流提取1-2h，升温至60-80℃，超声逆流提取1-2h，过滤，得到的浸提液经过浓缩，干燥，得西番莲总浸膏；

(2)将西番莲总浸膏用水稀释后，萃取，再用恒流泵泵入大孔吸附树脂吸附，用水洗柱，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙腈和乙酸乙酯；

(3)再将洗脱液经过减压浓缩、干燥，即可得到西番莲黄酮提取物。

6.根据权利要求5所述含西番莲黄酮纳米制剂，其特征在于：所述浸提液中乙醇和乙酸乙酯的体积比为2-4:1；所述乙腈和乙酸乙酯的体积比为1-3:1。

7.如权利要求1所述一种含西番莲黄酮纳米制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1:将西番莲黄酮提取物加入油相中，于25-40℃恒温水浴振摇24h，得含西番莲黄酮的油相；

S2:将乳化剂、乳化助剂加入水中，混合均匀，加热使其完全溶解，获得水相；

S3:将含西番莲黄酮的油相加入至水相中，搅拌混合均匀，过微孔滤膜，即可得到含西番莲黄酮的纳米制剂。

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