CN108042603A - 黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用，所述的黄芪黄酮提取物的黄酮含量为40‑60％，主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖、7,2′‑二羟基‑3′,4′‑二甲氧基异黄烷、2′‑羟基‑3′,4′‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖、3‑羟基‑9,10‑二甲氧基紫檀烷和9,10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖。本发明的黄芪黄酮提取物对肾病综合征大鼠具有较好的改善作用，可用于制备治疗肾病综合征的药物。

Description

黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用
技术领域
本发明涉及黄芪黄酮提取物的新用途，特别涉及黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用。
背景技术
肾病综合征是由于各种病因导致的肾小球滤过膜通透性发生改变的一个症候群，大量尿蛋白是其主要特点和诱因，其引发的高血压、高血脂会促进肾小球硬化，且多种肾小球疾病可引起肾病综合征，系统性疾病以及某些结缔组织疾病，如感染、慢性炎症状态、恶性肿瘤，药物和浆细胞恶液质均可引起肾病综合征。
肾病综合征的治疗主要是通过抑制免疫和炎症反应对其进行有效控制，包括糖皮质激素治疗，细胞毒性药物，免疫抑制剂。其中，糖皮质激素治疗主要是发挥抗炎作用，其次可通过降低毛细管通透性以及减少纤维蛋白形成及沉积达到改善作用，主要针对微小病变肾病疗效最为确切，但糖皮质激素的副作用较多，可诱发或加重感染、溃疡，长期使用可引起程度不同的骨质疏松等；细胞毒性药物一般针对激素治疗无效或激素依赖以及反复发作病人，常用的细胞毒性药物有环磷酰胺，长期使用会加重肾功能的损害，且对正常细胞具有毒副作用；免疫抑制剂的应用，具体治疗方案需根据不同的病理类型进行个性化治疗，因此副作用较小，但价格昂贵，限制了免疫抑制剂的广泛使用。
黄芪是常用中药材之一，始载于《神农本草经》，具有补气固表，利尿，托毒排脓，敛疮生肌等功效。临床研究文献报道黄芪颗粒(崔冰等，中医研究，2017，30(1)：19-21；戴宇文,傅海东等，浙江中西医结合杂志，2011，21(11)：781-782；李白恩等，中国中西医结合肾病杂志，2007，8(7)：413-414)以及黄芪注射液(张雷等，海南医学院学报，2016，22(2)：157-159；谌辉等，当代医学，2015，21(14)：36-137；刘姝，中医药学报，2014，42(1)：134-136)具有改善肾病综合征的作用。
中国专利CN 104107184A报道了黄芪中的黄酮苷类成分芒柄花苷具有血管舒张的作用；中国专利CN 101596185A、CN 102100691 A、CN 102552241 A、CN 103565790 A、CN103565791 A、CN 103565793 A、CN 103585143等报道了芒柄花素具有舒张血管、降低血压的作用，抑制补体系统的作用；对呼吸系统的作用；抗真菌作用；抗过敏作用；抗病毒的作用；中国专利CN 104107181 A、CN 104107182 A、CN 1403452、CN 101590072 A分别报道了毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖的免疫抑制和抗炎作用、免疫抑制及血管舒张作用、抗心肌缺血作用抗艾滋病作用；中国专利CN 101653438 A、CN 104013637 A、CN 1403452、104107175 A、CN 104107181 A、CN 102657641 A、CN 105232522 A分别报道了毛蕊异黄酮在心血管系统方面的作用、促进骨形成的作用、抗心肌缺血作用、免疫抑制作用、抗血管性痴呆作用、抗过敏作用；中国专利CN 104107182 A报道了2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖的免疫抑制及血管舒张作用；中国专利CN 104107183 A、CN104510752 A报道了9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖的免疫抑制作用；防治帕金森氏病的作用。
目前，黄芪及黄芪注射液虽然对肾病综合征具有改善作用，但其有效成分尚不清楚，且药效作用有限，此外尚无黄芪黄酮类成分及其提取物用于肾病综合征的相关作用报道，以上述有效成分为主的提取物也未见用于治疗肾病综合征的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供黄芪黄酮提取物在制备治疗或预防肾病综合征药物中的应用。
本发明所提供的黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用，所述的黄芪黄酮提取物通过包括以下步骤的方法制备得到：
a.取黄芪药材适量，加入液固比为6-8L/Kg的0-95％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-3小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；
b.将上述膏状物用AB-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、10％、35％乙醇洗脱，收集35％乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；
c.取上述35％乙醇洗脱液浓缩物分散于适量水中，加1-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。
按照上述方法所制备的黄芪黄酮提取物黄酮含量为40-60％，所含有的主要化学成分包括芒柄花素(1)、芒柄花苷(2)、毛蕊异黄酮(3)、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖(4)、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷(5)、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖(6)、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷(7)、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(8)，结构如下：
药效学实验结果显示，本发明制备的黄芪黄酮提取物可明显降低肾病综合征模型大鼠的尿蛋白水平，且提取工艺简单，成本低廉，可用于制备治疗或预防肾病综合征药物。
附图说明
图1为黄芪黄酮提取物的高效液相分析图谱，A：混合标准品，B：黄芪黄酮提取物。图中1.毛蕊异黄酮苷；2.芒柄花苷；3.紫檀烷苷；4.异黄烷苷；5.毛蕊异黄酮；6.芒柄花素；7.紫檀烷；8.异黄烷。
具体实施方式
实施例1黄芪黄酮提取物的制备
取3000g的黄芪药材，粉碎后加水8L，加热回流提取3次，每次1小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物。将上述膏状物用AB-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、10％、35％乙醇洗脱，收集35％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，取上述35％乙醇洗脱液浓缩物分散于200mL水中，加1倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥，即得黄芪黄酮提取物3375mg。
实施例2黄芪黄酮提取物的制备
取1000g的黄芪药材，加20％乙醇8L，加热回流提取2次，每次2小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物。将上述膏状物用AB-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、10％、35％乙醇洗脱，收集35％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，取上述35％乙醇洗脱液浓缩物分散于200mL水中，加2倍体积的乙酸乙酯萃取1次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥，即得黄芪黄酮提取物943mg。
实施例3黄芪黄酮提取物的制备
取1000g的黄芪药材，加95％乙醇8L，加热回流提取2次，每次1小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物。将上述膏状物用AB-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、10％、35％乙醇洗脱，收集35％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，取上述35％乙醇洗脱液浓缩物分散于200mL水中，加2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥，即得黄芪黄酮提取物1064mg。
实施例4黄芪黄酮提取物的化学成分及含量分析
1、材料：对照品：毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖(毛蕊异黄酮苷)(批号：20120428)、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(紫檀烷苷)(批号：20120515)、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖(异黄烷苷)(批号：20100202)、芒柄花素(批号：20120528)、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷(紫檀烷)(批号：20120505)、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷(异黄烷)(批号：20120506)均购于上海永恒生物科技有限公司，芒柄花苷(批号：13021808)、毛蕊异黄酮(批号：13082713)均购于成都曼斯特公司。对照品纯度均达到98％以上。氘代甲醇(99.8％，Merck公司，Germany)，三甲基硅烷丙酸钠盐(TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA)，乙酸乙酯(分析纯，北京化学试剂公司)，乙腈(色谱纯，Fisher公司，USA)。
2、仪器：Waters e2695高压泵，Waters 2689紫外可见检测器，紫外可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)。
3、高效液相色谱分析
色谱条件采用C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈(A)-水(B)为流动相，洗脱条件见表1。流动相流速为1.0mL/min，检测波长230nm。
表1梯度洗脱条件
对照品溶液的制备：称取毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、紫檀烷、异黄烷，8个对照品适量，用色谱甲醇溶解，配成浓度分别为56.48μg/mL、81.28μg/mL、75.48μg/mL、86.70μg/mL、9.808μg/mL、8.352μg/mL、24.52μg/mL和83.68μg/mL的混合标准品溶液，备用。
供试品溶液的制备：取黄酮提取物约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，使通过0.22μm微孔滤膜，即得。
4、紫外分光光度法测定总黄酮
毛蕊异黄酮苷对照品系列浓度的制备：取毛蕊异黄酮苷对照品，依次配成浓度分别为1.086、2.172、4.344、8.688、17.376μg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取黄芪黄酮提取物约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
光谱条件的选择：取上述毛蕊异黄酮苷对照品溶液和黄芪黄酮提取物供试品溶液，于200～400nm波长范围内进行光谱扫描，结果其最大吸收波长均在260nm。因此确定紫外检测波长为260nm。
以吸光度为纵坐标，毛蕊异黄酮苷的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A＝0.055C，R2＝0.9950，说明在1.086～17.376μg/mL范围内，毛蕊异黄酮苷浓度与吸光度呈良好的线性关系。
5、黄芪黄酮提取物化学成分分析
由图1可知：与对照品色谱峰比对，黄芪黄酮提取物的HPLC图谱中有8个色谱峰的保留时间分别与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、紫檀烷、异黄烷8个黄酮类成分一致，说明黄芪黄酮提取物中含有这8个黄酮类成分。
6、黄芪黄酮提取物中总黄酮的含量分析
采用HPLC法和紫外分光光度法(UV)分别对上述实施例1-3制备的黄芪黄酮提取物进行分析，其总黄酮的含量如表2所示，分别为50％、46％、48％(HPLC)和55％、50％、51％(UV)。
表2黄芪黄酮提取物中总黄酮的含量
实施例5黄芪黄酮提取物对肾病综合征大鼠指标的影响
1、材料：SPF级雄性SD大鼠，体重180-200g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK(京)2015-0014。动物自由摄食、水，适应1周后进行实验。阿霉素(注射用盐酸多柔比星，深圳万乐药业股份有限公司，批号:1409E3)。受试药物为实施例1制备方法得到的黄芪黄酮提取物，用灭菌注射用水稀释至浓度为0.35mg/ml。
2、仪器：Bruker 600-MHz AVANCE III NMR检测仪(德国布鲁克公司)；TGL-16高速台式冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Sartorius BSA124S分析天平(德国Sartorius公司)。
3、实验方法
雄性SD大鼠共40只，适应环境一周后，收集40只大鼠24h的尿液，并记录尿液体积。以大鼠的尿蛋白含量和体重为依据进行初筛，去除尿蛋白或体重过高与过低的不合格大鼠，将合格大鼠随机分为空白对照组(K组)，阿霉素肾病模型组(M组)与黄芪黄酮提取物组(HQF组)每组10只。
M组与HQF组大鼠分别于实验第1天尾静脉注射4mg/kg的阿霉素，随后隔1周，于第7天尾静脉注射1mg/kg的阿霉素，复制阿霉素肾病模型。K组以相同的方式给予等剂量的生理盐水。第14天，K、M组每天早上8点灌胃自来水；HQF组腹腔注射黄芪黄酮提取物1.1mg/Kg体重，一直持续给药35天。
各组大鼠在第0、14、28、42、49天分别收取24h尿液，用双辛丁酸(BCA)法测定尿蛋白含量。实验结束后，用20％的乌拉坦麻醉大鼠，股动脉取血。血液样本于4℃、3500r/min离心15min，取上清液，分装至1.5mL EP管中，置于-80℃冰箱中贮存，备用。所有大鼠右肾组织放到10％福尔马林中固定。
4、对尿蛋白的影响结果
由表3可知，阿霉素肾病大鼠模型造模成功，与K组比较，M组大鼠于造模后第14天尿蛋白含量明显升高，且随着时间的变化，尿蛋白的含量持续升高(P<0.05)，表明造模成功；给予黄芪黄酮提取物后，HQF组尿蛋白显著降低。
表3不同组大鼠尿蛋白定量动态变化趋势
Note：与K组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与M组比较，#p＜0.05。
5、对肾组织病理切片的影响结果
对各组大鼠肾脏组织病理切片进行分析，主要观察肾小管炎性细胞浸润、蛋白管型、空泡变性程度与嗜碱性变程度等现象。K组大鼠肾组织切片未见明显异常，M组出现肾小管嗜碱性变、肾小管与集合管均有形成蛋白管型、以及细胞浸润严重，且部分肾小球硬化萎缩甚至出现空腔；HQF组在肾小管和集合管偶见蛋白管型，嗜碱性程度较低，总的病变程度较轻，具有改善作用。
对肾小管损伤进行评估(Tubular Injury Score，TIS)，(损伤程度定义为0-4分，0＝未见异常现象；1＝轻度损伤，偶见蛋白管型肾小管；2＝轻度损伤，偶见蛋白管型肾小管以及肾小管嗜碱性变，3＝中度损伤，蛋白管型肾小管、肾小球嗜碱性变；4＝高度损伤，肾小管嗜碱性变以及细胞浸润严重)。病理切片评分如表4所示，其中M组大鼠平均评分3.0；HQF组平均评分2.2，说明黄芪黄酮提取物对肾组织病变有明显的改善作用。
表4组织病理评分
Note：与K组比较，***p＜0.001。
6、对血清生化的影响结果
肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)是反映肾功能的重要指标；总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平能够反映大鼠血清中蛋白状况；总胆固醇(TCHO)和总甘油三酯(TG)能够反映机体脂质代谢情况。由表5可以看出，与K组相比，M组BUN、CREA、TCHO、TG、TP水平升高，而ALB水平降低；给予黄芪黄酮提取物后，TCHO、TG、ALB和TP水平与M组相比均有一定回调。
综上所述，黄芪黄酮提取物对肾病综合征大鼠的异常指标具有明显的改善作用，可用于制备治疗肾病综合征的药物。
表5黄芪黄酮提取物给药后对血清生化的影响
Note：与正常组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

Claims (3)

1.黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用。
2.如权利要求1所述的黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用，其特征在于，所述的黄芪黄酮提取物通过包括以下步骤的方法制备得到：
a.取黄芪药材适量，加入液固比为6-8L/Kg的0-95％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-3小时，将所得的提取液合并，减压浓缩得膏状物；
b.将上述膏状物用AB-8大孔吸附树脂柱分离，依次用水、10％、35％乙醇洗脱，收集35％乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩至溶剂尽干；
c.取上述35％乙醇洗脱液浓缩物分散于适量水中，加1-3倍体积的乙酸乙酯萃取1-2次，合并萃取液，减压浓缩得浸膏，60℃真空干燥成干粉。
3.如权利要求2所述的黄芪黄酮提取物在制备治疗肾病综合征药物中的应用，其特征在于，所述的黄芪黄酮提取物的黄酮含量为40-60％，所含有的主要化学成分包括芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖、7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖。
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