具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1黄芪总黄酮及单体化合物制备
取干燥黄芪药材10kg,以8倍量80%乙醇回流提取3次(2小时,1小时,1小时),过滤,合并滤液,减压回收溶剂,浓缩至无醇味,得黄芪醇提液,置4℃冰箱中冷藏2天,上清液用D101型大孔树脂吸附,先用纯水洗脱至流出液澄清,再用50%乙醇洗脱至TLC检测无毛蕊异黄酮苷斑点为止。收集50%乙醇洗脱液经减压浓缩后,用等体积的醋酸乙酯萃取7次,合并萃取液后回收溶剂,真空干燥,得到黄芪总黄酮。经紫外分光光度法检测总黄酮含量为54.3%。
黄芪总黄酮再经200~300目硅胶柱层析,以氯仿-甲醇梯度洗脱(50∶1~1∶1),薄层跟踪检测,合并相同的流份,静置析晶,抽滤,甲醇重结晶,分别得到毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、(3R)-2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷等成分,以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证,纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实施例2黄芪总黄酮及单体化合物制备
取干燥黄芪药材100kg,分别以10倍量80%乙醇、5倍量60%乙醇、5倍量90%乙醇回流提取3次(2小时,1小时,0.5小时),过滤,合并滤液,减压回收溶剂,浓缩至无醇味,得黄芪醇提液,置4℃冰箱中冷藏1天,上清液用AB-8型大孔树脂吸附,先用纯水洗脱至流出液澄清,再用40%乙醇洗脱至TLC检测无毛蕊异黄酮苷斑点为止。收集40%乙醇洗脱液经减压浓缩后,用等体积的醋酸乙酯萃取7次,合并萃取液后回收溶剂,真空干燥,得到黄芪总黄酮。经紫外分光光度法检测总黄酮含量为53.3%。
黄芪总黄酮再经200~300目硅胶柱层析,以氯仿-甲醇梯度洗脱(50∶1~1∶1),薄层跟踪检测,合并相同的流份,静置析晶,抽滤,甲醇重结晶,分别得到毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、(3R)-2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、(6aR,11aR)-9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷等成分,以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证,纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实施例3含黄芪总黄酮的胶囊(片剂)
制剂处方:
黄芪总黄酮 80g
微晶纤维 80g
淀粉 20g
乳糖 18g
糊精 2g
制法:取实施例1制备的黄芪总黄酮提取物,粉碎,过80目筛,与上述辅料混合均匀后,用80%乙醇制粒,整粒;取一半装胶囊,制成500粒;另一半压制成片,制成500片。
实施例4含黄芪总黄酮的颗粒剂
颗粒剂处方:
黄芪总黄酮 80g
乳糖 920g
制法:取实施例2制备的黄芪总黄酮提取物,粉碎,与乳糖混合均匀,用70%乙醇制软材,制粒、干燥、整粒、分装即得。
实施例5含黄芪总黄酮的注射液
注射液处方:
黄芪总黄酮 10g
注射用水加至 1000ml
制法:取黄芪总黄酮提取物超微粉碎,加适量注射用水,加热溶解,调pH值至7.0,加活性炭0.2g,加热80℃保温,4号垂熔玻璃滤器预滤,加注射用水至1000ml,0.2μm微孔滤膜过滤,灌封,即得。
实施例6黄芪总黄酮对肾小球系膜细胞增殖的影响
1.材料与试剂
采用实施例5制备得到的黄芪总黄酮注射液。大鼠肾小球系膜细胞株HBZY21,武汉细胞生物研究所提供;DMEM培养基,GIBCO;新生牛血清,杭州四季青血清厂;Thiazolyl噻唑蓝,Amresco分装;牛血清白蛋白,D-葡萄糖,均为Sigma产品;二甲亚砜,AR级,上海久仡化学试剂有限公司。
CO2培养箱,NAPC05410,PERCISION SCIENTIFIC;XSZ-D2倒置显微镜,重庆光学仪器厂;超净工作台,苏州市洁净技术研究所;Microplate Spectrophotometer,SPECTRA max190,美国AD公司;医用离心机,LDZ5-2,北京医用离心机厂。
2.实验方法
2.1模型的建立
取对数生长期细胞制成单细胞悬液,以100μl/孔接种于96孔板,细胞数1×104/孔,37℃5%CO2培养箱培养24h后,加入无血清的DMEM,再孵育24h使细胞生长同步进入休止期。吸弃细胞上清液,同一水平6孔并列,分别加入不同浓度的葡萄糖和AGEs,分别于培养箱中培养24h、48h、72h和96h,MTT法观察不同浓度葡萄糖或AGEs对鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。结果表明,25mM的葡萄糖或0.25mg/ml AGEs作用肾小球系膜细胞24h效果最好,作为本实验造模条件。
其中所用的AGEs的制备为:将质量分数为5%的无球蛋白的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)与0.5mol/L D-葡萄糖共同溶解于0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2)中,经0.22μm滤膜过滤除菌后,置37℃培养箱内孵育60d。糖基化产物孵育结束后,未结合的物质通过对磷酸缓冲盐溶液的广泛透析而除去,Folin酚法测定AGEs浓度,并稀释至实验所需各浓度,然后再用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
2.2对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖实验
给药组:加用纯水梯度稀释的本发明药物溶液0.1ml/孔(终浓度分别为0.01、0.1、1mg/L)以及黄芪水提液(50mg生药/ml),每个稀释度6个复孔。再加葡萄糖终浓度为25mM的培养基,培养24h,MTT法测定细胞增殖情况。
正常对照组:每孔加培养液(含5.5mM葡萄糖)0.1ml。
高糖组:每孔加培养液(含25mM葡萄糖)0.1ml。
2.3对AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖实验
给药组:加注射用水梯度稀释的本发明药物溶液0.1ml/孔(终浓度分别为0.01、0.1、1mg/L)以及黄芪水提液(50mg生药/ml),每个稀释度6个复孔。再加AGEs终浓度为含0.25mg/ml的培养基,培养24h,MTT法测定细胞增殖情况。
正常对照组:每孔加培养液0.1ml。
AGEs组:每孔加培养液(含0.25mg/ml AGEs)0.1ml。
3.实验结果
3.1黄芪总黄酮对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
实验结果见表1所示,结果表明,25mM葡萄糖能显著促进大鼠肾小球系膜细胞增殖,中高剂量组黄芪总黄酮均能显著抑制高糖作用下的大鼠系膜细胞的增殖,且高剂量组的效果更为明显;中高剂量组的效果都优于黄芪水提液组;低剂量的黄芪总黄酮(0.01mg/L)的效果与黄芪水提组的效果接近,都对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖有抑制作用。
表1黄芪总黄酮对高糖培养下的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
和葡萄糖组比较:*p<0.05,**p<0.01;和黄芪水提组比较:#p<0.05
3.2黄芪总黄酮对AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
实验结果见表2,结果表明,0.25mg/mlAGEs能显著促进大鼠肾小球系膜细胞增殖,而低、中、高剂量组黄芪总黄酮均能显著抑制AGEs诱导的大鼠系膜细胞的增殖,低剂量的黄芪总黄酮(0.01mg/L)的效果与黄芪水提组的效果接近,中高剂量组的效果明显优于黄芪水提液组。
表2黄芪总黄酮对AGEs培养下的鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
和AGEs组比较:*p<0.05,**p<0.01;和黄芪水提组比较:#p<0.05
肾小球系膜细胞是肾小球中最活跃的反应性细胞,其病理变化在糖尿病肾病的发生和发展中居于中心地位,是糖尿病肾病的靶细胞。实验结果表明,高浓度葡萄糖、AGEs均能显著促进大鼠肾小球系膜细胞增殖,不同浓度的黄芪总黄酮(包括黄芪水提液)均能抑制高糖和AGEs诱导的系膜细胞增殖,且中高浓度的黄芪总黄酮的效果优于黄芪水提液。这些表明黄芪总黄酮可以在糖尿病肾病早期治疗中发挥一定作用。
实施例7黄芪总黄酮对肾小球系膜细胞基质增生的影响
1.材料与试剂
采用实施例1制备得到的黄芪总黄酮。大鼠肾小球系膜细胞株HBZY21,武汉细胞生物研究所提供;DMEM培养基,GIBCO;新生牛血清,杭州四季青血清厂;胶原IV,Canta Cruz产品;二抗,晶美生物工程有限公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒,博士德公司产品;DAB显色系统,Gene Tech Biotechnology Company Limited。
CO2培养箱,NAPC05410,PERCISION SCIENTIFIC;XSZ-D2倒置显微镜,重庆光学仪器厂;超净工作台,苏州市洁净技术研究所;医用离心机,LDZ5-2,北京医用离心机厂;免疫组化湿盒,福州迈新生物技术开发公司。
2.实验方法
细胞培养,药物干预分组、对照组设置均同实施例6中2.2项。
系膜细胞胶原IV表达:应用预先在24孔板孔内放置盖玻片,让细胞贴附。细胞铺满玻片后,吸出细胞上清,作羟脯氨酸含量检测;取出细胞爬片,固定,留作细胞免疫组化。
胶原IV染色流程如下:4%多聚甲醛固定细胞爬片30min;新配含3%H2O2的甲醇溶液灭活内源性辣根过氧化物酶10min,蒸馏水洗3次;5%BSA封闭非特异性抗原20分钟;滴加胶原IV一抗(1∶500),4℃过夜,PBS(pH7.4)洗2min×3次;滴加生物素化山羊抗小鼠抗体(二抗),37℃30min,PBS(PH 7.4)洗2min×3次;滴加HRP标记的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,37℃30min,PBS(PH 7.4)洗5min×4次;滴加50μlDAB染色液,室温显色15min,蒸馏水充分洗涤;苏木素轻度复染1min,水洗;酒精梯度脱水、二甲苯透明,中性树胶封片。
统计与分析:测定各组中大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸含量,测定结果用
表示,采用组间t检验进行统计学分析;同时显微镜下观测大鼠肾小球系膜细胞胶原IV的表达。
3.实验结果
3.1对高糖诱发大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸的影响
实验结果表明,25mM的葡萄糖能显著提高大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸的含量,不同浓度的黄芪总黄酮和黄芪水提液均能减少高糖诱导的系膜细胞培养液中羟脯氨酸的含量;本发明的黄芪总黄酮组效果优于黄芪水提液组。
表3黄芪总黄酮对高糖培养下的鼠肾小球系膜细胞上清液中羟脯氨酸含量的影响
和葡萄糖组比较:*p<0.05,**p<0.01
3.2对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞胶原IV表达的影响
由图2可见(A正常;B葡萄糖(25mM);C阴性对照(未加胶原IV抗体)),高糖(25mM)培养72h,系膜细胞的胶原IV表达明显增加(图2B),而黄芪总黄酮0.01mg/L(图2D),黄芪总黄酮0.1mg/L(图2E),黄芪总黄酮1mg/L(图2F),黄芪水提液50mg生药/ml(图2G)都显示黄芪总黄酮对系膜细胞的胶原IV表达有抑制作用,说明黄芪总黄酮能降低高糖培养引起的肾小球系膜细胞胶原IV表达的增加,本发明提供的黄芪总黄酮的效果尤为显著,优于黄芪水提液。
肾小球系膜细胞细胞外基质增生,是糖尿病肾病等慢性肾病主要病理特征,也是糖尿病肾病的治疗靶点之一。实验结果证明,黄芪总黄酮能够显著抑制高糖诱导的系膜细胞细胞外基质增生与胶原IV表达,表明本发明的黄芪总黄酮具有治疗糖尿病肾病的药理基础。
实施例8本发明药物对db|db糖尿病肾病小鼠的治疗作用
1.材料与试剂
黄芪总黄酮按实施例2制备得到。db|db小鼠,B6小鼠由南方医科大学实验动物中心提供;Accu-Chek Advantage血糖仪,美国罗氏诊断公司;Microplate Spectrophotometer,SPECTRA max 190,美国AD公司。尿素氮测定试剂盒,肌酐测定试剂盒,考马斯亮兰测定试剂盒等,均由南京建成生物工程研究所提供。
2.实验方法
实验期间,db|db和B6小鼠在层流柜中饲养,自由进食、进水,每日更换水,垫料,保持笼内清洁干燥,并固定水、饲料、垫料重,12h交替照明。所有器具及食物均每日消毒。
将48只八周龄db|db小鼠随机分为6组:模型组、氨基胍组(100mg/kg)、黄芪总黄酮5、10、20mg/kg组、黄芪水提物组(5g生药/kg),另取8周龄B6小鼠8只作为正常对照组。各组同体积不同浓度灌胃给予相应药物或生理盐水0.4ml,连续5周。各组每日测定进食量、饮水量;每周称体重1次;取血测定血糖值,每周一次。给药结束后,收集24小时尿液,测定尿量及尿总蛋白、微白蛋白、肌酐含量。取血,测定血清尿素氮、胆固醇、低密度脂蛋白、MDA、SOD、血肌酐、AGEs含量。
统计与分析:所有测定结果用
表示,采用组间t检验进行统计学分析。
3.实验结果
3.1对db|db糖尿病肾病小鼠尿蛋白及肌酐等的影响
实验结果见表4,结果表明,模型组动物24小时尿量、总蛋白排出量、微白蛋白排出量增加,尿液中肌酐排出明显减少;施用黄芪总黄酮可明显对抗模型动物的上述病理变化:减少糖尿病肾病动物24小时尿量,降低24小时总蛋白、微白蛋白排出量,增加尿肌酐排出量;同时本发明的黄芪总黄酮在降低尿蛋白、尿肌酐含量等重要肾病指标方面明显优于黄芪水提液组,在总蛋白、尿肌酐含量方面明显优于氨基胍的效果。
表4黄芪总黄酮对db|db鼠24h尿量、尿液中微白蛋白、总蛋白、尿肌酐的影响
与模型组比,*p<0.05,**p<0.01;和黄芪水提组比较:#p<0.05,##p<0.01
3.2对db|db糖尿病肾病小鼠血清生化指标的影响
实验结果见表5,结果表明,黄芪总黄酮可明显降低糖尿病肾病模型动物血清中总胆固醇、丙二醛、血肌酐、血尿素氮、AGEs、低密度脂蛋白(LDL)水平,显著提高血清SOD的活性,效果与氨基胍接近或优于氨基胍。
与模型组比,*p<0.05,**p<0.01,SOD为超氧化物歧化酶,AGEs为糖基化蛋白,LDL低密度脂蛋白
显然,黄芪总黄酮作为治疗药物能对抗糖尿病肾病发生、发展细胞病理环节,对db|db糖尿病肾病模型小鼠有保护作用;还有降低肾脏氧化应激程度、减少糖基化终末产物引起的纤维化等作用,且效果优于黄芪水提液。
实施例8本发明药物SD大鼠30天喂养试验
1.材料与试剂
黄芪总黄酮按实施例1制备得到。SD大鼠,由南方医科大学实验动物中心提供;Accu-Chek Advantage血糖仪,美国罗氏诊断公司;CELL-DYN1700全自动全血细胞计数仪,美国雅培;AU-600大型生化分析仪,日本奥林巴斯。尿素氮测定试剂盒,肌酐测定试剂盒,考马斯亮兰测定试剂盒等,均由南京建成生物工程研究所提供。
2.实验方法
选用清洁级SD大鼠80只,体重70-90g,随机分成4组,每组20只,雌雄各半,单笼喂养。黄芪总黄酮设3个试验剂量,分别为33.3mg/kg,100mg/kg和300mg/kg,另设1个正常对照组。黄芪总黄酮各组各鼠每天灌胃给予相应受试物2ml,对照组给予相同体积的蒸馏水。动物自由摄食及饮水,连续喂养30天。
每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒症状及死亡情况,每周记录一次体重和两次食物摄入量,计算每周的平均食物利用率。实验结束时,采血检测血液学指标,包括血红蛋白含量、红细胞计数、白细胞计数及分类;检测生化指标,包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、血清白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG);同时剖开大鼠腹部,取出肝、肾、脾、睾丸(卵巢)称重,计算脏/体比值,并对高剂量组和对照组动物肝、肾、脾、胃肠、睾丸及卵巢等组织进行病理学检查。
统计与分析:所有测定结果用表示,采用组间t检验进行统计学分析。
3.实验结果
3.1一般状况观察
在整个过程中,各组动物一般状况良好,行为正常,未见任何中毒表现,亦无动物死亡。
在30天喂养过程中,黄芪总黄酮对大鼠体重增长的影响见表6。结果差异均无显著性(P>0.05),说明黄芪总黄酮对大鼠体重的增长无明显的影响。黄芪总黄酮对大鼠食物总利用率的影响见表7。结果显示各组间差异均无显著性(P>0.05),说明黄芪总黄酮对大鼠的食物利用率无明显影响。
与正常组比,*p<0.05**p<0.01
与正常组比,*p<0.05**p<0.01
3.2血液学指标检查
大鼠红细胞、血红蛋白和白细胞的检测结果见表8。从表8可见,红细胞计数、血红蛋白含量和白细胞计数均在正常值范围内,且各剂量受试物组与正常对照组相比,差异均无显著性(P>0.05)。说明黄芪总黄酮对大鼠红细胞总数、血红蛋白含量和白细胞总数无明显影响。
黄芪总黄酮对大鼠白细胞分类的影响检测结果见表9。从表9可见,SD大鼠的嗜酸性、中性、淋巴、单核等细胞均在正常值范围内,且各剂量受试物组与正常对照组相比,差异均无显著性(P>0.05),说明黄芪总黄酮对各型白细胞均无影响。
与正常组比,*p<0.05**p<0.01
与正常组比,*p<0.05**p<0.01
3.3血液化学指标检验
试验结束后处死动物,分离大鼠血清,进行血清生化指标的检测,结果见表10。结果表明,各项指标均在正常值范围内,与正常对照组相比,差异无显著性。说明黄芪总黄酮对大鼠血生化指标无明显影响。
与正常组比,*p<0.05**p<0.01
3.4病理学检查
用黄芪总黄酮对大鼠染毒30天后,大体解剖检查,各组动物重要脏器未见明显病理改变的异常。大鼠脏体比的结果见表11。结果表明,和正常对照组相比,各组主要脏器的脏/体比差异均无显著性(P>0.05)。
组织病理学检查结果:实验组动物与对照组动物各20只,雌雄各半。每只检查肝、肾、脾、胃肠、卵巢或睾丸。结果肝脏被膜完整,肝小叶结构清楚,肝细胞索排列整齐。肝细胞偶见轻度变性,个别动物汇管区可见少量炎细胞浸润。其中对照组1只,高剂量组2只,动物可见肝细胞空泡变性,两组比较无明显差异。肾脏被膜完整、肾小球、肾小管结构正常,肾间质无异常。两组动物的胃肠壁各层结构清楚,黏膜上层完整,黏膜下各层未见充血、水肿、炎性细胞浸润。脾脏被膜完整,脾小梁结构正常,红、白髓比例正常,无炎性细胞浸润及色素沉着。卵巢上皮与白膜正常,各级卵泡发育良好,间质未见淤血、炎性细胞浸润。睾丸的曲细精管内各级生精细胞发育良好,间质未见水肿、出血、炎性细胞浸润。总之,肝、脾、肾、胃、肠、睾丸(卵巢)均未见有关的病理组织学变化。
与正常组比,*p<0.05**p<0.0
总之,本研究结果表明黄芪总黄酮对实验动物的体重、食物利用率、血液学检查(红细胞计数,血红蛋白,白细胞计数及分类)、血液生化学各项指标的检查(AST、ALT、Glu、BUN、TP、Alb、TC、TG、CRE)结果均与阴性对照组(正常动物)无显著差异。黄芪总黄酮对实验动物的肝、脾、肾、睾丸、胃肠、卵巢从大体解剖学上看均未检出与阴性对照组的明显差异,亦未发现与实验因素有关的病理组织学变化。30天喂养试验未见其对受试动物有明显毒性损害作用。说明黄芪总黄酮可在0-300mg/kg/天的剂量下安全使用。