CN114432295A - 野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，特别是涉及野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途，野黄芩素通过上调RIPK1表达诱导皮肤成纤维细胞程序性坏死、抑制皮肤成纤维细胞活性及分泌促瘢痕形成的细胞外基质等生物学行为，从而达到预防或治疗皮肤瘢痕增生或其它组织纤维化相关疾病的效果。

Description

野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途。

背景技术

增生性瘢痕是一种皮肤纤维化疾病，是以成纤维细胞增殖失控和胶原等大量细胞外基质过度产生和沉积为特征的皮肤真皮层的纤维代谢性疾病。它是一种影响人生理与心理健康的常见疾病，通常继发于创伤、烧伤与外科手术。有报道表明其在常规手术后病人中的发病率为36～64％，在深度烧伤病人中的发病率可高达91％。病理性瘢痕不仅影响患者容貌，且产生的挛缩可导致不同程度的功能障碍，严重降低了患者的生活质量。这给创面修复与再生医学领域带来了极为严峻的挑战。

目前病理性瘢痕的治疗和预防方法有多种，主要集中在上皮覆盖创面后，在瘢痕形成前和尚未成熟的阶段尽量去除各种造成瘢痕增生的因素，防止瘢痕对机体造成各种畸形和功能障碍。现有的预防和治疗病理性瘢痕方法的局限性主要有：1.手术疗法，治疗过程痛苦、复发率高且无法适用于大面积瘢痕的患者；2.加压治疗及硅胶制品治疗，对大面积烧伤患者效果较好，但患者需长期佩戴弹力加压装置，生活严重不便；3.放射治疗，治疗效果有限，且对患者全身和局部往往造成永久性放射性损伤；4.冷冻治疗，仅适用于面积较小的瘢痕，且治疗可引起皮肤色素加深、皮肤轻度萎缩等并发症；5.糖皮质激素治疗，可产生皮肤萎缩、色素脱失、毛细血管扩张、女性月经失调、注射部位溃烂或钙化等并发症；6.激光疗法，临床有效率较低，易诱发新的瘢痕；7.抗肿瘤药物治疗，对局部及全身正常细胞毒性较大，临床价值尚不确切；8.他克莫司、他汀类药物、他莫昔芬等药物，临床疗效有限，治疗靶点尚不确切。

目前对于瘢痕病理学机制的研究大多表明，增生性瘢痕的形成源自于异常的创面愈合过程，尤其是无法正常终止的愈合过程，而这一过程主要与细胞的死亡信号失调相关。具体来说，创面修复过程分为炎症期、增殖期和重塑期三个阶段，这三个阶段有序出现，且各阶段特异性的细胞迅速而有序地增殖，完成相应的任务后又迅速地死亡退出创面，使下一阶段的修复过程得以启动。最新的研究认为，细胞经由RIPK1激活的程序性坏死(Necroptosis)是瘢痕停止增生，转至重塑期的重要机制。一旦细胞内程序性坏死信号失调，细胞死亡受阻，不能迅速及时地退出创面，就会使增殖期过度延长，重塑期发生延迟，造成成纤维细胞和细胞外基质蛋白大量堆积，胶原的合成与降解失衡，最终导致瘢痕过度增生。因此，如能够找到有效药物靶向RIPK1，将有可能为增生性瘢痕的临床治疗提供精准有效的治疗新方法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供野黄芩素或其衍生物及二者药学上可接受的盐在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途。

所述瘢痕选自表浅性瘢痕、挛缩性瘢痕、蹼状瘢痕、凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕、桥状瘢痕和赘状瘢痕、增生性瘢痕或瘢痕疙瘩中的任一种或多种。

本发明还提供野黄芩素在制备RIPK1上调剂中的用途。

本发明还提供野黄芩素在制备以下产品中的用途：

1)抑制皮肤成纤维细胞的活性；

2)抑制皮肤成纤维细胞的增殖；

3)诱导皮肤成纤维细胞程序性坏死；

4)降低Col1a1、Col3a1或α-SMA表达水平。

如上所述，本发明的野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途，具有以下有益效果：

(1)本发明系通过野黄芩靶向激活RIPK1以抑制皮肤增生性瘢痕的形成，诱导皮肤成纤维细胞程序性坏死、抑制皮肤成纤维细胞过度增殖及分泌大量细胞外基质等生物学行为，从而达到治疗增生性瘢痕与纤维化相关疾病的效果；

(2)本发明涉及的药物相对于他克莫司、他汀类药物、他莫昔芬等药物而言，治疗靶点明确，规避了治疗机制不明、效率低、易引起副作用等缺点；

(3)相对于糖皮质激素类药物，本发明涉及的药物规避了激素可能带来的一系列副作用；

(4)相对于抗肿瘤类药物和放射疗法，本发明涉及的药物规避了损伤人体正常细胞的可能；

(5)相对于激光治疗，本发明规避了治疗深度浅的缺点以及诱发新瘢痕形成的可能性；

(6)相对于手术治疗和冷冻疗法，本发明涉及的药物可治疗大面积的病理性瘢痕，规避了治疗范围小这一缺陷；

(7)本发明涉及的药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势，合成成本较低。

附图说明

图1显示为野黄芩素上调人增生性瘢痕原代成纤维细胞中RIPK1表达图，其中A为野黄芩素的结构式，B为采用Western Blot对RIPK1蛋白水平的检测图。

图2显示为野黄芩素抑制人增生性瘢痕成纤维细胞中瘢痕相关分子标记物表达图，A为瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的mRNA水平；B为瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的蛋白水平。

图3显示为野黄芩素抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的活性图。

图4显示为野黄芩素抑制小鼠增生性瘢痕形成图。

图5显示为野黄芩素抑制小鼠皮肤瘢痕相关分子标记物表达图，A为瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的mRNA水平；B为瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的蛋白水平。

具体实施方式

本发明提供野黄芩素或其衍生物及二者药学上可接受的盐在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途。

所述野黄芩素(Scutellarein)的结构式如图1A所示，分子量286.24。野黄芩素和黄芩素(Baicalein)是结构相似的两种不同的黄酮类化合物，前者主要存在菊科植物灯盏花(Erigeron karvinskianus)中，后者主要从唇形科多年生草本中药植物黄芩(Scutellariabaicalensis Georgi)的干燥根中提取获得。野黄芩素溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水、乙醇溶液；味很苦。

所述野黄芩素衍生物的结构式如下所示：

其中，R选自

R1选自苯基、单取代或多取代苯基、含1-2个N的5-6元杂环基团；

R2选自含1-2个N的5-6元杂环基团；

R3选自C1-C6烷基、苯基、单取代或多取代苯基；

R4、R5选自C1-C6烷基；

其中，含1-2个N的5-6元杂环基团选自吡咯烷基、吗啉基、4-羟基哌啶基或取代哌嗪基；

所述单取代或多取代苯基的取代基选自C1-C6烷基、甲氧基、卤素、硝基、三氟甲基；

所述取代哌嗪基的取代基选自C1-C6烷基、苯基、卤素取代苯基、吡啶基、嘧啶基。

本发明中，术语“盐”应当被理解为由本发明使用的任何形式的活性化合物，其中所述活性化合物可以为离子形式或带电荷或被偶联到反离子(阳离子或阴离子)或在溶液中。这个定义还可以包括活性分子与其它分子和离子的季铵盐和络合物，特别是通过离子相互作用的络合物。该定义尤其包括生理上可接受的盐，该术语可以被理解为与“药理学上可接受的盐”等同。

本发明中，术语“药学上可接受的盐”通常指当以适当的方式用于治疗时(特别是在人类和/或哺乳动物中应用或使用时)在生理学上可耐受的任何盐(通常来说，这意味着它是无毒的，特别是作为抗衡离子的结果是无毒的)。这些生理上可耐受的盐可以是与阳离子或碱形成的，并且在本发明的上下文中，尤其是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常为酸(去质子化的)，如阴离子和至少一种生理学上耐受的阳离子(优选无机阳离子)形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括与碱金属和碱土金属形成的盐、以及与铵阳离子(NH4+)形成的盐，具体可以是包括但不限于与(单)或(二)钠、(单)或(二)钾、镁或钙形成的盐。这些生理上可接受的盐也可以是与阴离子或酸形成的，并且在本发明的上下文中，特别是在人类和/或哺乳动物中施用时，它们应该被理解为由按照本发明所提供的至少一种化合物，通常质子化的(例如在氮上)，如阳离子和至少一种生理上可耐受的阴离子形成的盐。在本发明的上下文中，具体地可以包括由生理上可耐受的酸形成的盐，即特定的活性化合物与生理上可耐受的有机或无机酸形成的盐，具体可以是包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸或柠檬酸形成的盐。

所述瘢痕选自表浅性瘢痕、挛缩性瘢痕、蹼状瘢痕、凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕、桥状瘢痕和赘状瘢痕、增生性瘢痕或瘢痕疙瘩中的任一种或多种。

优选的，所述瘢痕为增生性瘢痕。

增生性瘢痕是一种皮肤纤维化疾病，是以成纤维细胞增殖失控和胶原等大量细胞外基质过度产生和沉积为特征的皮肤真皮层的纤维代谢性疾病。

所述治疗增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕的体积。

所述野黄芩素通过上调RIPK1治疗或预防瘢痕。

在一种实施方式中，所述野黄芩素通过上调皮肤成纤维细胞中RIPK1表达从而治疗或预防瘢痕。

本发明还提供野黄芩素在制备RIPK1上调剂中的用途。

在一种实施方式中，所述用途为野黄芩素在制备用于皮肤成纤维细胞中RIPK1上调剂中的用途。

本发明还提供野黄芩素在制备以下产品中的用途：

1)抑制皮肤成纤维细胞的活性；

2)抑制皮肤成纤维细胞的增殖；

3)诱导皮肤成纤维细胞程序性坏死；

4)降低Col1a1、Col3a1或α-SMA表达水平。

在一种实施方式中，所述皮肤成纤维细胞为瘢痕皮肤成纤维细胞。

更进一步的，所述皮肤成纤维细胞为增生性瘢痕皮肤成纤维细胞。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

以下实施例中所用的野黄芩素分子理化性质如下：

实验所用野黄芩素(CAS 529-53-3)分子购自Selleck公司(S9120)。

野黄芩化学式C₁₅H₁₀O₆，分子量286.24，结构式如图1，注射入瘢痕组织后，由于其良好的脂溶性，不会被亲水性组织吸收扩散到毛细血管进入体循环，因此可以达到局部作用的效果，而不会作用于除瘢痕组织以外的其他组织器官。

实施例

1.人瘢痕来源成纤维细胞的提取和培养

取人增生性瘢痕临床标本(病人已签署知情同意书)用Dispase II(2mg/ml,LifeTechnologies,ThermoFisher)浸泡，4℃过夜，并剥离、去除表皮。无菌环境下切碎组织，用4mg/ml胶原酶浸泡，摇床37℃消化2-4小时，滤网过滤细胞悬液，1500rpm离心5min，去除上清，并用培养基重悬细胞沉淀，接种至DMEM培养基。每2天换液一次。

2.小鼠增生性瘢痕模型的建立

小鼠增生性瘢痕模型参考Geoffrey C Gurtner，Faseb J,2007。简单来说，将12周龄的C57/BL6小鼠麻醉，背部备皮。第一天，在小鼠的背中线切开一个2厘米的切口，然后重新贴近用6-0尼龙线缝合。待鼠皮愈合后，将机械拉伸装置缝合在切口部位，通过调整螺丝旋钮，对切口的瘢痕产生机械负荷，每隔一天保持4mm的拉力并保持伸展。受力2周后，安乐死小鼠，并取材。

3.野黄芩素针剂注射

小鼠瘢痕模型建立开始的当天，即开始野黄芩素针剂注射，注射方法为皮内注射。随机分为对照组(溶剂组)、与实验组(野黄芩素给药组)两组小鼠。每天注射一次，8个点注射，每个点注射液体浓度为20μM至模型建立取材为止。配制注射针剂中野黄芩素终浓度为20μM。

4.体外培养细胞的野黄芩素处理

待细胞密度至约70％时，对细胞进行换液，并加入对照溶剂/野黄芩素溶液(浓度梯度：5/10/20μM)，mRNA表达在培养3天后进行检测，蛋白表达在培养5天后进行检测。

5.实时定量PCR

用Trizol(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)提取组织或细胞的总RNA，通过紫外分光光度法对RNA浓度和纯度进行测量(ND-1000,Thermo,Rockford,IL,USA)。用RT-PCR试剂盒(TaKaRa,Shiga,Japan)及ABI HT7900PCR仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)对提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。以上述cDNA为模板进行实时定量PCR，20μl反应体系。

6.CCK-8细胞活性检测

对于体外培养的细胞，采用CCK-8法对细胞的增殖活性进行检测。CCK-8试剂盒购自Dojindo(Tokyo,Japan)实验步骤按照试剂盒说明书严格进行。

7.组织切片及HE染色

临床标本、动物组织取材后常规固定、脱水、石蜡包埋，并制备6μm切片。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，染色。

HE染色:将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。酸水及氨水中分色，各数秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。入70％和90％酒精中脱水各10分钟。入酒精伊红染色液染色2-3分钟。脱水透明:染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，树胶封片。拍照。

8.细胞总蛋白提取及定量：

总蛋白提取：

(1)吸去细胞培养液，用预冷PBS洗两遍；

(2)加入RIPA裂解液(含1％PMSF)适量，在冰上裂解15分钟；

(3)用细胞刮刀将细胞刮下，转移进预冷的EP管，4℃，12,000rpm离心15分钟；

(4)取上清即为总蛋白，分装-80℃保存。

定量(BCA法)：

(1)将BCA的A液与B液分别以50:1混合后，以每空加200μL至96孔酶标板；

(2)加入细胞(或组织)裂解液10μL/孔，RIPA为空白对照，37℃孵育30min；

(3)于562nm处测定吸光值，并根据BCA标准曲线计算样品中蛋白含量。

9.Western blot

(1)样品制备：取20μg蛋白，加入4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，混匀，95℃加热10min，将蛋白变性，并将二硫键打开；

(2)配制分离胶：按下表中体系(10％凝胶)混匀后加入洗净的胶板中间，立即加入异丙醇液封；

(3)配制浓缩胶：待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，按下表中体系混匀后加入胶板中，迅速插入梳子；

(4)电泳：在电泳槽内加入适量电泳缓冲液，将蛋白标记物8μL及变性的蛋白，加入上样孔，80V电泳约30min，至溴酚兰进入分离胶，改为120V电压，电泳约1小时左右；

(5)转膜：小心取下SDS-PAGE凝胶，将PVDF膜(需预先浸泡于甲醇内30秒激活)，定性滤纸以及纤维垫放在电泳槽转膜缓冲液中，以三明治方式(由负极至正极依次是纤维垫、定性滤纸、凝胶、PVDF膜、定性滤纸、纤维垫)夹牢，彻底清除气泡，放入装有转膜缓冲液的转移槽内，放入冰盒，以300mA恒流转膜1.5小时；

(6)封闭：将转有蛋白的PVDF膜取出，浸入新鲜的封闭液(5％BSA)，摇床上室温孵育1小时以封闭非特异性蛋白结合位点；

(7)一抗：将PVDF膜依照所需蛋白的分子量剪开，加入一抗，在摇床上缓慢摇晃，4℃孵育过夜；

(8)洗膜：吸去一抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次10分钟；

(9)二抗：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，摇床上缓慢摇晃，室温下孵育1小时；

(10)洗膜：吸去二抗，用TBST于摇床上洗膜3次，每次10分钟；

(11)显影：将显影液1:1混合后，滴到膜上，打开化学发光成像分析系统(Tanon5200S)，曝光显影，观察蛋白条带；

(12)分析：使用Image J软件分析条带。

实验结果

1.应用野黄芩素可上调人增生性瘢痕原代成纤维细胞中RIPK1表达

分离并培养人增生性瘢痕成纤维细胞。应用野黄芩素(图1A)处理5天后，采用Western Blot对RIPK1的蛋白水平进行检测；结果显示，应用野黄芩素处理可显著增加人增生性瘢痕原代成纤维细胞中RIPK1表达(图1B)。

2.应用野黄芩素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞中瘢痕相关分子标记物表达

分离并培养人增生性瘢痕成纤维细胞。应用野黄芩素处理3天后，采用实时定量PCR(q-PCR)对瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的mRNA水平进行检测；应用野黄芩素处理5天后，采用Western Blot对瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1、α-SMA的蛋白水平进行检测；结果显示，应用野黄芩素处理可显著降低纤瘢痕相关分子标记物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达(图2)。

3.应用野黄芩素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的活性

分离并培养人增生性瘢痕成纤维细胞，应用野黄芩素处理24/48/72小时后，采用CCK-8法对人增生性瘢痕成纤维细胞的活性进行检测。结果显示，应用野黄芩素处理后的细胞，其活性在干预后显著低于对照组。(图3)。

4.应用野黄芩素可抑制小鼠增生性瘢痕形成

建立经典的小鼠增生性瘢痕模型，来模拟人增生性瘢痕的病理学改变(图4)。对取材后的小鼠瘢痕进行了HE染色。结果显示，应用野黄芩素治疗后，皮肤增生性瘢痕的横截面积显著降低(p＜0.001)，小鼠增生性瘢痕被抑制。

5.应用野黄芩素可抑制小鼠皮肤瘢痕相关分子标记物表达

应用对溶剂/野黄芩素干预小鼠增生性瘢痕，将所得瘢痕样本进行q-PCR检测和Western Blot检测。结果显示，应用野黄芩素可显著降低Col1a1、Col3a1和α-SMA在mRNA和蛋白层面上的表达(p＜0.001)(图5)。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.野黄芩素或其衍生物及二者药学上可接受的盐在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述野黄芩素衍生物的结构式如下所示：

其中，R选自

R1选自苯基、单取代或多取代苯基、含1-2个N的5-6元杂环基团；

R2选自含1-2个N的5-6元杂环基团；

R3选自C1-C6烷基、苯基、单取代或多取代苯基；

R4、R5选自C1-C6烷基。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，还包括以下任一项或多项特征：

1)含1-2个N的5-6元杂环基团选自吡咯烷基、吗啉基、4-羟基哌啶基或取代哌嗪基；

2)所述单取代或多取代苯基的取代基选自C1-C6烷基、甲氧基、卤素、硝基、三氟甲基。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述瘢痕选自表浅性瘢痕、挛缩性瘢痕、蹼状瘢痕、凹陷性瘢痕、萎缩性瘢痕、桥状瘢痕和赘状瘢痕、增生性瘢痕或瘢痕疙瘩中的任一种或多种。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述野黄芩素或其衍生物及二者药学上可接受的盐通过上调RIPK1从而预防或治疗瘢痕。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述野黄芩素通过上调皮肤成纤维细胞中RIPK1表达从而治疗或预防瘢痕。

7.野黄芩素在制备以下任一产品中的用途：

1)RIPK1上调剂中的用途；

2)抑制皮肤成纤维细胞的活性；

3)抑制皮肤成纤维细胞的增殖；

4)诱导皮肤成纤维细胞程序性坏死；

5)降低Col1a1、Col3a1或α-SMA表达水平。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述RIPK1上调剂为用于皮肤成纤维细胞的RIPK1上调剂。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述皮肤成纤维细胞为瘢痕皮肤成纤维细胞。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述皮肤成纤维细胞为增生性瘢痕皮肤成纤维细胞。

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