RU2688422C1 - Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli - Google Patents
Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2688422C1 RU2688422C1 RU2018121083A RU2018121083A RU2688422C1 RU 2688422 C1 RU2688422 C1 RU 2688422C1 RU 2018121083 A RU2018121083 A RU 2018121083A RU 2018121083 A RU2018121083 A RU 2018121083A RU 2688422 C1 RU2688422 C1 RU 2688422C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- internalin
- wounds
- wound
- recombinant
- skin
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 101710148893 Internalin B Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 abstract 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 12
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229910001651 emery Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044405 human PRDX6 Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N nitrofural Chemical compound NC(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 IAIWVQXQOWNYOU-FPYGCLRLSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000554 physical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 1
- 239000006208 topical dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, ветеринарии и фармакологии и касается лечения асептических и свежеинфицированных ран мягких тканей, а именно относится к способам стимуляции регенерации (способности ускорять и/или индуцировать процессы регенерации) кожи и нижележащих мягких тканей, а также к лекарственным средствам, обладающим регенеративным потенциалом, и может быть использовано в дерматологии, косметологии и хирургии для лечения абразивных, полнослойных и скальпированных ран. Целью изобретения является ускорение процесса заживления ран с максимальным восстановлением поврежденных тканевых структур за счет нанесения на раневую поверхность препарата, содержащего белок интерналин В 321. Способ сокращает сроки эпителизации ран за счет активации внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к ускоренной пролиферации и клеточной миграции клеток, участвующих в процессе заживления раны. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного интерналина В 321 и его использования. Целью изобретения является ускорение процесса заживления ран с максимальным восстановлением поврежденных тканевых структур за счет нанесения на раневую поверхность препарата, содержащего рекомбинантный белок интерналин В 321.
Уровень техники
В хирургической практике ведение раневого процесса является неотъемлемой и трудной задачей, так как реорганизация мягких тканей представляет собой многофакторный процесс и зависит от множества параметров. Большинство ран, если только они не являются запланированными - асептическими, являются свежеинфицированными ранами, для разрешения которых отводится от 3 до 7 дней. Если процесс регенерации тканей недостаточен, то свежеинфицированная рана может перейти в разряд гнойных ран, что является обременительным с точки зрения экономики, сопровождается дополнительными страданиями для пациента и представляет угрозу жизни.
Существующие методы ведения ран сводятся к хирургической обработке, физиотерапевтическим процедурам и медикаментозному лечению. При этом способ хирургической обработки или физиотерапевтические процедуры раны имеют недостатки, так как могут быть выполнен только в условиях специализированного учреждения и не могут быть использованы в условиях догоспитального этапа.
В качестве терапевтических препаратов применяют наложение повязок с гипертоническими и антисептическими растворами (фурацилин, хлоргексидин, йодопирон), мазями на жировой или гидрофильной основах (тетрациклиновая мазь, солкосерил, левомеколь, акридерм и др.), однако существенным недостатком данного способа является хронизация процесса за счет удлинение сроков разрешения раны вследствие снижения оксигенации раневой поверхности, а также данный метод затруднителен в случаях ведения ожоговых ран, особенно с большой площадью раневой поверхности или локализации раны в труднодоступных местах. Особым образом стоит отметить мокнущие раны, наблюдаемые у пациентов со снижением метаболической активности или сопровождающиеся сопутствующей этиологией (варикозная болезнь, тромбофлебит или сахарный диабет).
В последние годы для разрешения раневого процесса все чаще применяются бактериальные продукты, а в ряде случаев и целые непатогенные бактерии. Данные методы основаны на стимуляции процессов врожденного иммунитета или синтеза целевого продукта для увеличения темпов регенерации. Так в патенте RU 2447082 применяется гель, содержащий в качестве действующего вещества бактериальные липополисахариды, выделенные из Е. coli или S. typhi, в концентрации до 5 г на 100 г субстанции. Механизм действия бактериальных липополисахаридов проявляется в активации системы врожденного иммунного ответа, что определяет его местное антимикробное воздействие и снижает риск развития гнойных осложнений. Однако к недостаткам данного метода можно отнести потенциальный пирогенный эффект, интенсивность которого сложно прогнозировать ввиду гетерогенности человеческой популяции. Известен способ (патент RU 2539378) использования бактериальных клеток непатогенного штамма Е. coli, продуцирующих рекомбинантный пероксиредоксин 6 человека, аналогичный по последовательности аминокислот естественному белку. Мазь помимо бактериальных клеток (более 330 млн на 1 г препарата) включает в себя ванилин, физиологический раствор, ланолин и фенол как консервирующий агент. К недостатку данного способа следует отнести продукцию клетками сторонних продуктов, способных влиять на процесс заживления.
Одним из способов заживления ран посредствам усиления регенерации является применение цитокинов, а именно факторов роста, в частности фактора роста гепатоцитов (HGF) (патент RU 2520817). Фактор роста гепатоцитов - это гликопротеин, который способствует заживлению ран. Его связывание с собственным рецептором, c-Met, приводит к активации сигнальных путей, способствующих регенерации тканей. HGF может применяться в виде гелей, содержащие 1-10 нг действующего вещества на см2 раневой поверхности. Недостатком данного метода является трудность получения целой молекулы HGF, который содержит несколько циклов очистки и включает множество этапов посттрансляционных модификаций, а также необходимость в присутствии ингибиторасериновых протеаз антитромбина III.
Особый интерес с точки зрения использования в качестве средства терапии представляют бактериальные белки - специфические агонисты поверхностных эукариотических рецепторов. Такие белки могут мимикрировать действие естественных лигандов, запуская схожие физиологические процессы, при этом, чаще всего подобные бактериальные белки не обладают структурным сходством с самим цитокином, что в свою очередь расширяет теоретический и практический поиск новых агонистов эукариотических рецепторов с терапевтическим потенциалом и уменьшением развития побочных реакций. Одним из таких белков является интерналин В, который специфически взаимодействует с тирозинкиназным рецептором фактора роста гепатоцитов с-Met (фиг. 1).
Из уровня техники известна публикация WO 2009156171, в которой указывается на потенциальную возможность рекомбинантной формы интерналина В связываться с c-Met и активировать данный рецептор. В публикации описывается изобретение, относящееся к белку интерналину B в форме димера. Образование димера инициировали добавлением Н2О2. Проведен анализ уровня активации рецептора c-Met различными лигандами, в том числе естественным HGF и отличающиеся по конформации InlB241 и InlBB 321: структуры «голова к голове», «хвост-хвост» и антипараллельная «спина к спине». Однако в данной публикации не идет речь об использовании in vitro интерналина В 321 для лечения ран, а также предусматривает дополнительные схемы модификации получения конечного целевого действующего вещества, что усложняет этапы приготовления лекарственного препарата.
Из публикации REIN Т, Quantitative phosphokinome analysis of the Met pathway activated by the invasion internalin В from Listeria monocytogenes, Mol Cell Proteomics, 2009 Dec, 8(12): 2778-95 известна митогенная активность.
Однако в указанных публикациях не раскрыто и не предполагается использование интерналина В 321 для заживления ран.
Осуществление изобретения
Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии для лечения ран кожного покрова и мягких тканей, так как рекомбинантный интерналин В 321 стимулирует регенерацию (способен ускорять и/или индуцировать процессы регенерации) кожи и нижележащих мягких тканей. Рекомбинантный интерналин В321 также может быть использован для получения лекарственных средств, обладающих регенеративным потенциалом, которые могут быть использованы в дерматологии и хирургии, в том числе в косметологии, косметической хирургии, дерматологии для лечения абразивных, полнослойных, скальпированных ран.
Целью изобретения является активизация процессов регенерации тканей на месте повреждения. Поставленная цель достигается тем, что после первичного туалета раны на поврежденную поверхность кожи или мягких тканей наносят однократно лекарственную форму для наружного применения, содержащую агонист эукариотического тирозинкиназного рецептора фактора роста гепатоцитов (c-Met) - интерналин В 321 в диапазоне концентрации от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл.
В результате обработки поверхности интерналином В 321 происходит активация рецептора с последующей димеризацией последнего, что приводит к аутофосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1234 и 1235 (RODRIGUES G., PARK М. Autophosphorylation modulates the kinase activity and oncogenic potential of the Met receptor tyrosine kinase, Oncogene, 1994. Vol. 9, №7, p. 2019-2027). Это способствует последующему фосфорилированию тирозиновых остатков в положениях 1349 и 1356 и, как следствие, к активации различных сигнальных эффекторов, опосредуя запуск внутриклеточных сигнальных каскадов, среди которых можно выделить: MAPK-каскад, PI3K/Akt-путь и STAT-путь. Активация данных путей приводит к клеточной пролиферации, выживаемости и миграции клеток. Способствуя процессам ангиогенеза и эпителизации раневой поверхности. Кроме того, из FREIBERGA, Folding and stability of the leucine-rich repeat domain of internalin В from Listerimonocytogenes, J Mol Biol. 2004 Mar 19; 337(2), реферат, известно, что интерналин В 321 участвует в фагоцитозе бактерий.
Предлагаемый способ лечения ран включает в себя применения интерналина В 321, который является укороченным фрагментом интерналина В, но при этом содержит все необходимые участки для связывания и активации рецептора, не требует дополнительных процессов модификации или приготовления, а процесс получения очищенного препарата относится к микробиологическому синтезу с использованием уникальных штаммов продуцентов, защищенных патентом RU 2634416. Получение интерналина В 321 в качестве действующего вещества экономически целесообразно, легко осуществимо, так как не требует дополнительных этапов превращения интерналина В 321 в активную форму, а способ применения для лечения ран прост в обращении.
Задачи настоящего изобретения: повышение качества лечения путем стимуляции физиологических процессов пролиферации, выживаемости и усиление миграции клеток в область поврежденных тканей, нормализация раневого процесса, сокращение сроков лечения, улучшение функциональных результатов, а также создание высокоэффективного с точки зрения биологической доступности лекарственного средства, обладающего многофакторным терапевтическим действием на регенеративные процессы раневых дефектов.
Указанные задачи достигаются тем, что в способе лечения ран, включающем местную обработку раневой поверхности однократным применением лекарственного препарата, содержащего агонист рецептора фактора роста гепатоцитов - бактериальный белок интерналин В 321, а также отсутствует необходимость дополнительных многократных обработок раневой поверхности и/или наложения повязок. А также продукция очищенного белкового препарата осуществляется уникальными штаммами продуцентами Е. Coli BL21: штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, защищенными патентом RU 2634416.
Изобретение относится к рекомбинантному интерналину В 321, имеющему молекулярную массу от 36718.61 до 36762,67, pI от 7,25 до 8 и заряд белка при рН 7,2-7,4 от 0,746 до 0,748.
Изобретение также относится к способу лечения ран, включающему использование лекарственных средств для наружного применения, отличающемуся тем, что в качестве действующего вещества используется очищенный рекомбинантный белок интерналин В 321, в том числе рекомбинантный интерналин В 321 по п. 1, лекарственное средство с концентрацией действующего вещества в диапазоне от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл однократно наносят тонким слоем на всю площадь поврежденной поверхности кожи или мягких тканей после первичного туалета раны.
Концентрация действующего вещества от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл зависит от глубины раны.
Примеры
Пример 1. Получение очищенного белкового препарата
Культуры штаммов-продуцентов: Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, выращенные в течение ночи в питательной среде LB (Amresco, США) с добавлением антибиотика канамицина (50 мкг/мл) разводят аналогичной свежей питательно средой в соотношении 1:100, растят до оптической плотности 0,6 D, после чего добавляют 1 мМ IPTG для индукции экспрессии фаговой РНК-полимеразы, и продолжают растить культуру еще 3 часа. Далее культуру центрифугируют и обрабатывают ультразвуковой волной. Для очистки белка используют магнитные наночастицы Dynabeads (Invitrogen, США), конъюгированные с антителами к гистидиновым повторам, согласно инструкции производителя. После этапов очистки проводят оценку стерильности полученного препарата за счет высевов случайно выбранных белковых препаратов на твердых питательных средах и проводят оценку стабильности очищенных белковых препаратов. Очищенные белковые препараты сохраняют структурную целостность на протяжении месяца при температуре хранения +4°С.
Пример 2. Оценка активности предлагаемого способа in vitro, Митотический индекс
Оценку эффективности очищенного белкового препарата интерналин В 321 на пролиферацию клеток НЕр-2 и HUVEC проводили путем оценки митотического индекса через 6 часов после обработки клеточных линий интерналином В 321. Для оценки числа делящихся клеток в полях зрения, клетки линии НЕр-2 и HUVEC наносили на покровные стекла в количестве 20000 клеток/стекло и инкубировали 18 ч в среде DMEM с 2% фетальной бычьей сывороткой (Gibco, USA) без антибиотиков в лунках 12-луночного планшета. Далее культуральную жидкость отбирали и в каждую лунку вносили по 500 мкл среды с очищенным белковым препаратом интерналином В 321 в концентрациях от 250 нг/мл до 1 мкг/мл, в качестве положительного контроля использовался HGF в концентрации 100 нг/мл, в отрицательном контроле проводили замену среды. Клетки инкубировали 6 часов, после чего проводили окраску ядер витальным красителем Hoechst (1 мкг/мл) путем смены среды на среду, содержащую краситель, с последующей инкубацией в течение 30 мин в СО2 инкубаторе. Митотический индекс клеток, обработанных очищенным белковым препаратом интерналином В 321 в концентрации 1 мкг/мл, был достоверно (р<0,05) выше, чем в отрицательном и положительном контроле и составил для интерналина В 321 - 20,8%, для фактора роста HGF - 14,10%, для отрицательно контроля - 1,2% (фиг. 2).
Пример 3. Оценка активности предлагаемого способа in vitro. Клеточная миграция
Клеточные культуры выращивали до достижения 70-80% монослоя в 24-луночном планшете. Затем, в центральной части лунки проводили царапину с использование одноразового наконечника для автоматического дозатора объемом 200 мкл. После этого клетки дважды промывали средой для удаления планктонных клеток. Затем в лунки вносили очищенный белковый препарат интерналина В 321 в концентрациях от 250 нг/мл до 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Отрицательный контроль - клетки в культуральной среде без добавления ростовых факторов. Далее отмечали зону, за которой осуществлялось последующее наблюдение с временными интервалами через 3, 12 и 24 часа. В образцах, обработанных очищенным белковым препаратом интерналином В 321 наблюдалось заметное краевое наползание клеток. В отрицательном и положительном контролях ширина зоны «царапины» была заметно шире (фиг. 3).
Пример 4. Оценка биологической безопасности предлагаемого способа
Постановка кератоконъюктивальной пробы
Конъюктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случае позволят выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах.
Аллергопробы проводили с использованием мышей линии C57BI/6 с массой тела 18-20 г. До начала исследований здоровые половозрелые животные, проходили карантин не менее 14 дней. В целях стандартизации животных не кормили в течение суток перед началом эксперимента.
Для постановки пробы 1 капля раствора препарата вводилась глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко подопытным и контрольным мышам, во второй глаз вводят по 1 капле раствора, в котором разведен аллерген. Результат оценивали через 15 минут и 24-48 ч. Из 9 подопытных мышей у одной наблюдалось легкое покраснение слезного протока. Концентрация аллергена в пробе была 10 мкг/мл.
Эпикутанная сенсибилизация
Для определения развития неаллергического контактного дерматита на выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища мышей линии BALB-c, ближе к середине туловища, наносили по 3 капли испытуемого раствора, приготовленного на глицерине. Концентрация вещества составляла 300 мкг/мл. Вещество наносили на протяжении 2 недель по 5 раз в неделю. Реакцию кожи учитывали ежедневно по шкале оценки кожных проб.
Исследование сенсибилизирующего действия вещества проводили путем 20 накожных аппликация на площади 2×2 см боковой поверхности тела по 5 раз в неделю. Первое тестирование по развитию аллергии проводили через 10 аппликаций. Повторное тестирование осуществлялось после 20 аппликаций, для установления слабой аллергизирующей способности.
Если число сенсибилизированных животных в группе по одному из испытанных тестов составляет менее 50%, то наблюдаемые эффекты рассматриваются как проявления индивидуальной чувствительности, если же более 50%, то вещество является потенциальным аллергеном.
Пример 5. Оценка активности предлагаемого способа in vivo
В эксперименте использованы мыши инбредной линии C57BI/6 с массой тела 18-20 г. До начала исследований здоровые половозрелые животные, проходили карантин не менее 14 дней. На спинной стороне предварительно проводили процесс удаления шерсти с помощью механической депиляции триммером. Операционное поле было обработано 70% этанолом. Затем на спине животных вдоль линии хребта верхний слой кожи удаляли путем абразивной обработки с помощью наждачной бумаги. Даная операция проводилась под ингаляционным наркозом, выполненным изофлураном открытой каплей. Затем на раневую поверхность наносили по 50 мкл белкового очищенного препарата интерналина В 321 в концентрации 150 мкг/мл разведенный в глицерине и в отсутствии формообразующего вещества. В качестве отрицательного контроля использовали стерильный глицерин. Фотографии ран и измерения площади поверхности раны делались ежедневно в течение 3 недель до полного выздоровления мышей из всех групп (фиг. 4, фиг. 5).
При экспериментальной проверке эффективности препарата при лечении свежеинфицированных абразивных ран тела получены положительные результаты.
Заключение:
Описанный в патенте способ лечения ран, с применением однократной обработки раневой поверхности лекарственной формой, содержащей интерналин В 321, способствует более быстрому заживлению раневых поверхностей и может быть использован в медицине, ветеринарии и фармакологии в качестве терапевтического средства, использован для разработки новой тактики ведения раневого процесса, а также для разработки лекарственных средств, ускоряющих регенерацию мягких и эпителиальных тканей, отличающихся композитным формообразующим веществом. При этом обработка ран экспериментальных животных очищенными препаратами интерналина В сокращала процесс заживления на 4 дня.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - Структура InlB. Интерналиновый домен выделен цветом.
Фиг. 2 - Активация пролиферации клеток НЕр-2 в присутствии очищенного белкового препарата интерналин В 321 в концентрации 1 мкг мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Делящиеся клетки наблюдали через 6 часов после добавления белков. Показан митотический индекс (отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток в поле зрения). Данные получены усреднением по минимум 10 полям зрения в трех независимых экспериментах.
Фиг. 3 - Результаты скрейч-теста, проведенного с использованием клеточной линии HUVEC, с добавлением очищенного белкового препарата интерналин В 321 в концентрации 1 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали HGF в концентрации 100 нг/мл. Отрицательным контролем служили интактные клетки.
Фиг. 4 - Изменение площади ран у мышей с использованием глицерина, содержащего очищенный белковый препарат интерналин В 321 в концентрации 150 мкг/мл и контрольных мышей, обработанных только стерильным глицерином.
Фиг. 5 - Кривая, отражающая изменение площади ран у мышей с использованием глицерина, содержащего idInlB9 и контрольных мышей, обработанных только стерильным глицерином.
Claims (2)
1. Рекомбинантный интерналин В 321, предназначенный для стимуляции рекомбинации, имеющий молекулярную массу от 36718,61 до 36762,67, pI от 7,25 до 8 и заряд белка при рН 7,2-7,4 от 0,746 до 0,748.
2. Способ лечения ран, включающий использование лекарственных средств для наружного применения, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества используется очищенный рекомбинантный белок интерналин В 321 по п. 1, при этом лекарственное средство с концентрацией действующего вещества в диапазоне от 75 мкг/мл до 300 мкг/мл однократно наносят тонким слоем на всю площадь поврежденной поверхности кожи или мягких тканей после первичного туалета кожи.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121083A RU2688422C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018121083A RU2688422C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2688422C1 true RU2688422C1 (ru) | 2019-05-21 |
Family
ID=66636761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018121083A RU2688422C1 (ru) | 2018-06-07 | 2018-06-07 | Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2688422C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015109264A1 (en) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Cedars-Sinai Medical Center | Receptor targeting constructs and uses thereof |
| RU2634416C1 (ru) * | 2017-05-05 | 2017-10-26 | Светлана Александровна Ермолаева | Штаммы-продуценты вариантов рекомбинантного белка Интерналин 321, агониста рецептора фактора роста |
-
2018
- 2018-06-07 RU RU2018121083A patent/RU2688422C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015109264A1 (en) * | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Cedars-Sinai Medical Center | Receptor targeting constructs and uses thereof |
| RU2634416C1 (ru) * | 2017-05-05 | 2017-10-26 | Светлана Александровна Ермолаева | Штаммы-продуценты вариантов рекомбинантного белка Интерналин 321, агониста рецептора фактора роста |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KOLDITZ F. et al. Wound healing potential of a dimeric InlB variant analyzed by in vitro experiments on re-epithelialization of human skin models, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 2014, v. 86, N. 2, p.277-283, весь текст, с.280-282. * |
| ЧАЛЕНКО Я.М. и др. ПРИРОДНЫЕ ВАРИАНТЫ БЕЛКА ИНТЕРНАЛИНА В LISTERIA MONOCYTOGENES С ОТЛИЧАЮЩИМСЯ ПОТЕНЦИАЛОМ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ПЕРЕСТРОЕК ЦИТОСКЕЛЕТА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК HEP-2, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2017, v. 35, N. 2, p.53-58, весь текст, с.54-55. * |
| ЧАЛЕНКО Я.М. и др. ПРИРОДНЫЕ ВАРИАНТЫ БЕЛКА ИНТЕРНАЛИНА В LISTERIA MONOCYTOGENES С ОТЛИЧАЮЩИМСЯ ПОТЕНЦИАЛОМ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ПЕРЕСТРОЕК ЦИТОСКЕЛЕТА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК HEP-2, Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2017, v. 35, N. 2, p.53-58, весь текст, с.54-55. KOLDITZ F. et al. Wound healing potential of a dimeric InlB variant analyzed by in vitro experiments on re-epithelialization of human skin models, European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 2014, v. 86, N. 2, p.277-283, весь текст, с.280-282. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5616562A (en) | Methods and compositions using substance P to promote wound healing | |
| JPS63502985A (ja) | 角膜基質創傷の治療のための組成物 | |
| US20200138899A1 (en) | Topical compositions comprising ob-fold variants | |
| PT1779862E (pt) | Eritropoietina em doses sub-policitémicas para o tratamento de diabetes | |
| KR101830926B1 (ko) | 피부 노화를 방지 및/또는 개선하기 위해 사용되는 pedf-유도 폴리펩티드의 용도 | |
| CN111840311B (zh) | siRNA分子组合物在制备针对HDAC5抑制瘢痕形成的药物中的用途 | |
| Wu et al. | Neuroprotective effect of upregulated sonic Hedgehog in retinal ganglion cells following chronic ocular hypertension | |
| Yang et al. | Bioelectric fields coordinate wound contraction and re-epithelialization process to accelerate wound healing via promoting myofibroblast transformation | |
| US11622964B2 (en) | Method for destroying cellular mechanical homeostasis and promoting regeneration and repair of tissues and organs, and use thereof | |
| Xu et al. | Recombinant ciliary neurotrophic factor promotes nerve regeneration and induces gene expression in silicon tube-bridged transected sciatic nerves in adult rats | |
| ES2404669T3 (es) | Péptidos bioactivos cortos para modulación celular e inmunológica | |
| Wu et al. | Peptide RL‐QN15 promotes regeneration of epidermal nerve fibers and recovery of sensory function in diabetic skin wounds | |
| RU2688422C1 (ru) | Рекомбинантный интерналин В 321, полученный с помощью штамма Escherichia coli | |
| CN110755450B (zh) | 间充质干细胞来源的细胞外囊泡在治疗蛛网膜下腔出血中的应用 | |
| CN111686097A (zh) | Lmk235在抑制瘢痕形成的药物中的应用 | |
| WO2011148200A1 (en) | Treatment of pain | |
| CN114432295A (zh) | 野黄芩素在制备预防或治疗瘢痕的药物中的用途 | |
| CN110711244B (zh) | 一种神经导向因子Sema在制备治疗骨关节炎搽剂中的应用 | |
| Wu et al. | P75NTR regulates autophagy through the YAP-mTOR pathway to increase the proliferation of interfollicular epidermal cells and promote wound healing in diabetic mice | |
| WO2016174269A1 (en) | A novel skin medical and cosmetic care product | |
| Trofimova | Molecular Mechanisms of Retina Pathology and Ways of Its Correction | |
| JP2008214195A (ja) | 皮膚熱傷治療剤および表皮再生促進剤 | |
| JP7442624B2 (ja) | 肢虚血を治療するための活性化間葉系幹細胞 | |
| RU2704621C1 (ru) | Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения ожоговых поражений кожи | |
| Altukhova et al. | Biochemical mechanisms of skin radiation burns inhibition and healing by the volumetric autotransplantation of fibroblasts and of keratinocytes with fibroblasts composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200608 |