JPH09285289A - ポリデオキシリボヌクレオチドの合成方法 - Google Patents
ポリデオキシリボヌクレオチドの合成方法Info
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- JPH09285289A JPH09285289A JP12267396A JP12267396A JPH09285289A JP H09285289 A JPH09285289 A JP H09285289A JP 12267396 A JP12267396 A JP 12267396A JP 12267396 A JP12267396 A JP 12267396A JP H09285289 A JPH09285289 A JP H09285289A
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- polydeoxyribonucleotide
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 鋳型およびプライマーを使用せずに反応系内
のタンパク質の情報に依存してＤＮＡを合成する方法と
得られたＤＮＡおよびその用途を提供する。 【構成】 鋳型およびプライマーの不存在下に、デオキ
シリボヌクレオチドに耐熱性デオキシリボヌクレオチド
ポリメラーゼを作用させるポリデオキシリボヌクレオチ
ドの合成法、かくして得られたポリデオキシリボヌクレ
オチド、それをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングする方法、および生物細胞の遺伝子を含
む二本鎖ＤＮＡの３′−ＯＨ末端に上記の合成法による
ＤＮＡを結合させたのちその細胞にトランスフェクショ
ンし、培養することにより染色体ＤＮＡに挿入し、該遺
伝子由来の蛋白質を発現させる方法。 【効果】 鋳型・プライマーに依存せずに天然には存在
しないＤＮＡを創造し、その遺伝子により新規なタンパ
ク質を創造できるので、新規な生理的、薬理的活性物質
等を提供する手段を提供することができる。
のタンパク質の情報に依存してＤＮＡを合成する方法と
得られたＤＮＡおよびその用途を提供する。 【構成】 鋳型およびプライマーの不存在下に、デオキ
シリボヌクレオチドに耐熱性デオキシリボヌクレオチド
ポリメラーゼを作用させるポリデオキシリボヌクレオチ
ドの合成法、かくして得られたポリデオキシリボヌクレ
オチド、それをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングする方法、および生物細胞の遺伝子を含
む二本鎖ＤＮＡの３′−ＯＨ末端に上記の合成法による
ＤＮＡを結合させたのちその細胞にトランスフェクショ
ンし、培養することにより染色体ＤＮＡに挿入し、該遺
伝子由来の蛋白質を発現させる方法。 【効果】 鋳型・プライマーに依存せずに天然には存在
しないＤＮＡを創造し、その遺伝子により新規なタンパ
ク質を創造できるので、新規な生理的、薬理的活性物質
等を提供する手段を提供することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、鋳型非依存的かつ
プライマー非依存的にポリデオキシリボヌクレオチド
（ＤＮＡ）を合成する方法に関するもので、遺伝情報を
タンパク質の持つ情報のみに依存して創造することを可
能にする。
プライマー非依存的にポリデオキシリボヌクレオチド
（ＤＮＡ）を合成する方法に関するもので、遺伝情報を
タンパク質の持つ情報のみに依存して創造することを可
能にする。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】現在、Ｄ
ＮＡを合成する方法は、少なくとも２種類存在する。そ
れは、ＤＮＡ合成酵素を用いる方法と、化学的に合成す
る方法である。ＤＮＡ合成酵素を用いてＤＮＡを合成す
る方法は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮ
ＡからＤＮＡを合成する方法や、逆転写酵素による鋳型
ＲＮＡからＤＮＡを合成する方法などの、いわゆる「鋳
型依存的ＤＮＡ合成方法」等がある。しかし、これらの
方法はいずれにしてもＤＮＡを合成するためには、短い
一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡからなるプライマー及び一本鎖
の鋳型ＤＮＡが必要であった。最近では、ポリメラーゼ
連鎖反応法又はＰＣＲ法［サイキら、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、第２３９巻、第４８７〜４９１頁、（１
９８８）］という簡単に鋳型ＤＮＡを増幅できる方法も
開発されたが、やはり鋳型ＤＮＡとプライマーが必要で
あることには変わりはない。又、このプライマーは化学
的な合成によってのみ作ることができるので、現在、Ｄ
ＮＡを合成するには、化学的に合成する方法が主に用い
られている。この化学的に合成する方法としては、燐酸
ジエステル法や燐酸トリエステル法等により合成する方
法があるが、これらは、合成過程が複雑で、時間もかか
り、数十塩基程度しか合成できず、その上合成されたＤ
ＮＡの精製が難しい。又、この合成には、装置も市販さ
れているが、高価で特別な試薬を使わなければいけない
という欠点もある。また、現在はまだ試みられていない
が、ＤＮＡを創造するためには化学的合成方法に頼ると
しても、この方法では数千ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ、
塩基対）のＤＮＡを合成することは、事実上不可能であ
り、たとえ合成できたとしても、大変高価なものになる
ことが、当然予想できる。よって、創造されたＤＮＡを
発現させることによりタンパク質を創造することが不可
能なことも当然予想できる。
ＮＡを合成する方法は、少なくとも２種類存在する。そ
れは、ＤＮＡ合成酵素を用いる方法と、化学的に合成す
る方法である。ＤＮＡ合成酵素を用いてＤＮＡを合成す
る方法は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮ
ＡからＤＮＡを合成する方法や、逆転写酵素による鋳型
ＲＮＡからＤＮＡを合成する方法などの、いわゆる「鋳
型依存的ＤＮＡ合成方法」等がある。しかし、これらの
方法はいずれにしてもＤＮＡを合成するためには、短い
一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡからなるプライマー及び一本鎖
の鋳型ＤＮＡが必要であった。最近では、ポリメラーゼ
連鎖反応法又はＰＣＲ法［サイキら、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、第２３９巻、第４８７〜４９１頁、（１
９８８）］という簡単に鋳型ＤＮＡを増幅できる方法も
開発されたが、やはり鋳型ＤＮＡとプライマーが必要で
あることには変わりはない。又、このプライマーは化学
的な合成によってのみ作ることができるので、現在、Ｄ
ＮＡを合成するには、化学的に合成する方法が主に用い
られている。この化学的に合成する方法としては、燐酸
ジエステル法や燐酸トリエステル法等により合成する方
法があるが、これらは、合成過程が複雑で、時間もかか
り、数十塩基程度しか合成できず、その上合成されたＤ
ＮＡの精製が難しい。又、この合成には、装置も市販さ
れているが、高価で特別な試薬を使わなければいけない
という欠点もある。また、現在はまだ試みられていない
が、ＤＮＡを創造するためには化学的合成方法に頼ると
しても、この方法では数千ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ、
塩基対）のＤＮＡを合成することは、事実上不可能であ
り、たとえ合成できたとしても、大変高価なものになる
ことが、当然予想できる。よって、創造されたＤＮＡを
発現させることによりタンパク質を創造することが不可
能なことも当然予想できる。
【０００３】次に、現在、細胞の形質転換技術として
は、プラスミドやウィルス由来のベクターに、形質転換
をおこさせる遺伝子を挿入し、これを宿主細胞内に挿入
する方法が主に用いられてきた。この方法を行うために
は、遺伝子を染色体や各種遺伝子ライブラリーより一旦
単離してきて、次にその遺伝子をベクターに挿入する必
要がある。この操作は、非常に煩雑で時間もかかり骨の
折れる仕事であり、しばしば科学者を悩ませてきた。
は、プラスミドやウィルス由来のベクターに、形質転換
をおこさせる遺伝子を挿入し、これを宿主細胞内に挿入
する方法が主に用いられてきた。この方法を行うために
は、遺伝子を染色体や各種遺伝子ライブラリーより一旦
単離してきて、次にその遺伝子をベクターに挿入する必
要がある。この操作は、非常に煩雑で時間もかかり骨の
折れる仕事であり、しばしば科学者を悩ませてきた。
【０００４】現在の遺伝子工学を支える組み換えＤＮＡ
技術とは、遺伝子を運ぶことができるベクターに、既存
のＤＮＡ（遺伝子）を組み込み、その当該遺伝子を持た
ない宿主細胞の中に導入し、それをタンパク質に発現さ
せることにより、例えば、宿主細胞に環境ストレスに対
する耐性を持たせたり、天然には微量しか存在しないタ
ンパク質を大量に生産することなどの技術をさす。この
技術を用いれば、天然に存在するタンパク質を別の宿主
で利用することや、培養が容易な宿主で大量生産させる
ことなどは可能であるが、天然に全く存在しないタンパ
ク質を新たに創りだす（つまり、創造する）ことはでき
ない。
技術とは、遺伝子を運ぶことができるベクターに、既存
のＤＮＡ（遺伝子）を組み込み、その当該遺伝子を持た
ない宿主細胞の中に導入し、それをタンパク質に発現さ
せることにより、例えば、宿主細胞に環境ストレスに対
する耐性を持たせたり、天然には微量しか存在しないタ
ンパク質を大量に生産することなどの技術をさす。この
技術を用いれば、天然に存在するタンパク質を別の宿主
で利用することや、培養が容易な宿主で大量生産させる
ことなどは可能であるが、天然に全く存在しないタンパ
ク質を新たに創りだす（つまり、創造する）ことはでき
ない。
【０００５】最近の化学的なＤＮＡ合成技術では、長い
ＤＮＡを一回の反応で合成することは不可能に近く、例
え合成できたとしても、多くの複雑な工程と大変な費用
がかかり、合成されたＤＮＡの純度も極めて低いという
欠点がある。又、数回の反応により長い配列のＤＮＡを
合成できる可能性は残されてはいるが、この場合、何ら
かの人の意志が必然的に配列に導入されるという欠点も
存在する。
ＤＮＡを一回の反応で合成することは不可能に近く、例
え合成できたとしても、多くの複雑な工程と大変な費用
がかかり、合成されたＤＮＡの純度も極めて低いという
欠点がある。又、数回の反応により長い配列のＤＮＡを
合成できる可能性は残されてはいるが、この場合、何ら
かの人の意志が必然的に配列に導入されるという欠点も
存在する。
【０００６】しかし、本発明者らは、現在の遺伝子工学
の次世代を考えると、進化の産物である既存の遺伝物質
を越えるより有用で効果的なタンパク質の出現が必要不
可欠であるように考える。そこで、本発明が開示する鋳
型非依存的ＤＮＡ合成方法は、単なる鋳型ＤＮＡの複製
とは異なり、タンパク質が持つ情報のみ（つまり、その
アミノ酸配列や立体構造）に依存してＤＮＡを創造をす
ることにより、天然には存在しない遺伝子を自由に創造
し、この遺伝子から天然には存在しないより有用なタン
パク質を創造することを意図した。
の次世代を考えると、進化の産物である既存の遺伝物質
を越えるより有用で効果的なタンパク質の出現が必要不
可欠であるように考える。そこで、本発明が開示する鋳
型非依存的ＤＮＡ合成方法は、単なる鋳型ＤＮＡの複製
とは異なり、タンパク質が持つ情報のみ（つまり、その
アミノ酸配列や立体構造）に依存してＤＮＡを創造をす
ることにより、天然には存在しない遺伝子を自由に創造
し、この遺伝子から天然には存在しないより有用なタン
パク質を創造することを意図した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＤＮＡ合
成の研究において種々の発見をした。たとえば、セルモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ（ニューイン
グランド・バイオ・レイブス）と緩衝液Ａ［１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２０ｍＭ ト
リス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．１％トリトンＸ−１００（全て最終濃度）］及びデ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］から構
成される反応液を７４℃、３時間反応させ、反応液の一
部をアガロース（１％）ゲルに電気泳動後臭化エチジウ
ムで染色して紫外線ランプ下で観察した。すると図１の
写真のような約１ｋｂｐ（１０００塩基対）から３０ｋ
ｂｐの広い範囲に染色されるＤＮＡバンドを確認でき
た。
成の研究において種々の発見をした。たとえば、セルモ
コッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ（ニューイン
グランド・バイオ・レイブス）と緩衝液Ａ［１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２０ｍＭ ト
リス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．１％トリトンＸ−１００（全て最終濃度）］及びデ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］から構
成される反応液を７４℃、３時間反応させ、反応液の一
部をアガロース（１％）ゲルに電気泳動後臭化エチジウ
ムで染色して紫外線ランプ下で観察した。すると図１の
写真のような約１ｋｂｐ（１０００塩基対）から３０ｋ
ｂｐの広い範囲に染色されるＤＮＡバンドを確認でき
た。
【０００８】次に、デオキシリボヌクレオチド三燐酸を
添加しない反応液を用意し、これにデオキシリボヌクレ
アーゼＩか又はリボヌクレアーゼＡを加えて３７℃で２
時間反応させ、反応液及び酵素内に不純物として存在す
るかもしれないＤＮＡ又はＲＮＡ（これらはプライマー
や鋳型となりうる）を完全に分解した。次いでデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸を加えて上記同様の反応を行っ
た。ここでもしこの反応が鋳型・プライマー依存的なら
ば、もはやＤＮＡ合成がおこらないはずである。しかし
鋳型・プライマー非依存的ならばＤＮＡ合成反応がおこ
り、アガロースゲル電気泳動の結果、ＤＮＡバンドが確
認できるはずである。その結果、アガロースゲル電気泳
動により約１ｋｂｐから３０ｋｂｐの広い範囲に染色さ
れるバンドが確認でき、よってこの反応は鋳型・プライ
マー非依存的であることが確かめられた。つまり、この
反応は、鋳型やプライマーとなりうるＤＮＡやＲＮＡと
は無関係に、ＤＮＡポリメラーゼ自身が持っているＤＮ
Ａを創造する情報にしたがって行われたことがわかっ
た。
添加しない反応液を用意し、これにデオキシリボヌクレ
アーゼＩか又はリボヌクレアーゼＡを加えて３７℃で２
時間反応させ、反応液及び酵素内に不純物として存在す
るかもしれないＤＮＡ又はＲＮＡ（これらはプライマー
や鋳型となりうる）を完全に分解した。次いでデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸を加えて上記同様の反応を行っ
た。ここでもしこの反応が鋳型・プライマー依存的なら
ば、もはやＤＮＡ合成がおこらないはずである。しかし
鋳型・プライマー非依存的ならばＤＮＡ合成反応がおこ
り、アガロースゲル電気泳動の結果、ＤＮＡバンドが確
認できるはずである。その結果、アガロースゲル電気泳
動により約１ｋｂｐから３０ｋｂｐの広い範囲に染色さ
れるバンドが確認でき、よってこの反応は鋳型・プライ
マー非依存的であることが確かめられた。つまり、この
反応は、鋳型やプライマーとなりうるＤＮＡやＲＮＡと
は無関係に、ＤＮＡポリメラーゼ自身が持っているＤＮ
Ａを創造する情報にしたがって行われたことがわかっ
た。
【０００９】次に、このセルモコッカス・リトラリスＤ
ＮＡポリメラーゼによる鋳型・プライマー非依存的ＤＮ
Ａ合成反応において、反応条件を変えてその大きさが約
１ｋｂｐから３０ｋｂｐ以外のＤＮＡが合成できるか否
かを調べてみた。すなわち、通常の反応液にデオキシリ
ボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）を添加し、３７℃で
３０分間反応させ、その後通常の７４℃で３時間反応さ
せると、図５に示したように、１０ｋｂｐ付近に臭化エ
チジウムにより濃く染色されるＤＮＡバンドが出現し
た。この結果より、生成されるＤＮＡの長さを、反応条
件次第で任意に変化させることが可能なことが確認され
た。
ＮＡポリメラーゼによる鋳型・プライマー非依存的ＤＮ
Ａ合成反応において、反応条件を変えてその大きさが約
１ｋｂｐから３０ｋｂｐ以外のＤＮＡが合成できるか否
かを調べてみた。すなわち、通常の反応液にデオキシリ
ボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）を添加し、３７℃で
３０分間反応させ、その後通常の７４℃で３時間反応さ
せると、図５に示したように、１０ｋｂｐ付近に臭化エ
チジウムにより濃く染色されるＤＮＡバンドが出現し
た。この結果より、生成されるＤＮＡの長さを、反応条
件次第で任意に変化させることが可能なことが確認され
た。
【００１０】次に、セルモコッカス・リトラリスＤＮＡ
ポリメラーゼによる鋳型・プライマー非依存的合成反応
の時間的推移を確認した。図６が示すように、反応１時
間後までは反応がおこらずいわゆる遅滞期が観察され、
２時間後より反応が始まった。その後、２時間後から３
時間後までの間に最大反応速度が観察された。この時の
反応速度は０．８８塩基／秒／酵素１分子となり、これ
はセルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼの通
常の鋳型・プライマー依存的ＤＮＡ重合反応速度の７６
分の１［コングら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第
２６８巻、第１９６５〜１９７５、（１９９３）］、大
腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの５７分の１［コーンバー
グ、ＤＮＡレプリケーション 第２版（ＤＮＡ Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ ２ｎｄ ｅｄ）、Ｗ．Ｈ．フリーマ
ン・アンド・カンパニー、サンフランシスコ、ＣＡ、
（１９９２）］であり、通常の鋳型・プライマー依存的
ＤＮＡ合成反応とは異なる全く別の反応であると考えら
れる。
ポリメラーゼによる鋳型・プライマー非依存的合成反応
の時間的推移を確認した。図６が示すように、反応１時
間後までは反応がおこらずいわゆる遅滞期が観察され、
２時間後より反応が始まった。その後、２時間後から３
時間後までの間に最大反応速度が観察された。この時の
反応速度は０．８８塩基／秒／酵素１分子となり、これ
はセルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼの通
常の鋳型・プライマー依存的ＤＮＡ重合反応速度の７６
分の１［コングら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第
２６８巻、第１９６５〜１９７５、（１９９３）］、大
腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの５７分の１［コーンバー
グ、ＤＮＡレプリケーション 第２版（ＤＮＡ Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ ２ｎｄ ｅｄ）、Ｗ．Ｈ．フリーマ
ン・アンド・カンパニー、サンフランシスコ、ＣＡ、
（１９９２）］であり、通常の鋳型・プライマー依存的
ＤＮＡ合成反応とは異なる全く別の反応であると考えら
れる。
【００１１】次に、この鋳型・プライマー非依存的なＤ
ＮＡ合成反応において、基質となるデオキシリボヌクレ
オチド三燐酸に対する特異性（即ち、この反応の基質特
異性）を調べた。４種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸をそれぞれ単独か２、３、４種
類組み合わせた標品を用意し、これを通常の反応にかけ
る。この一部をアガロース（１％）ゲルにて電気泳動
し、その後臭化エチジウムで染色した。図２に示すよう
に、４種類のデオキシリボヌクレオチドを加えたものの
ほか、ｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰの３種類、又はｄ
ＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰの３種類加えた反応液につ
いてＤＮＡバンドが確認された。しかし、４種類すべて
加えた反応と後者２つの３種類のデオキシリボヌクレオ
チド三燐酸を加えた反応からのＤＮＡバンドの分布に違
いが存在した。つまり、前者のＤＮＡのサイズが約１ｋ
ｂｐから３０ｋｂｐの範囲に分布するのに対し、後者は
約１０ｋｂｐ以上の範囲に分布し、それ以上のサイズの
ものはほとんど認められなかった。このため、これらの
鋳型・プライマー非依存的なＤＮＡ合成産物は、別の種
類のものである可能性が示唆された。つまり、この鋳型
・プライマー非依存的なＤＮＡ合成反応には複数の異な
る反応が含まれている可能性が示唆される。
ＮＡ合成反応において、基質となるデオキシリボヌクレ
オチド三燐酸に対する特異性（即ち、この反応の基質特
異性）を調べた。４種類（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸をそれぞれ単独か２、３、４種
類組み合わせた標品を用意し、これを通常の反応にかけ
る。この一部をアガロース（１％）ゲルにて電気泳動
し、その後臭化エチジウムで染色した。図２に示すよう
に、４種類のデオキシリボヌクレオチドを加えたものの
ほか、ｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰの３種類、又はｄ
ＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰの３種類加えた反応液につ
いてＤＮＡバンドが確認された。しかし、４種類すべて
加えた反応と後者２つの３種類のデオキシリボヌクレオ
チド三燐酸を加えた反応からのＤＮＡバンドの分布に違
いが存在した。つまり、前者のＤＮＡのサイズが約１ｋ
ｂｐから３０ｋｂｐの範囲に分布するのに対し、後者は
約１０ｋｂｐ以上の範囲に分布し、それ以上のサイズの
ものはほとんど認められなかった。このため、これらの
鋳型・プライマー非依存的なＤＮＡ合成産物は、別の種
類のものである可能性が示唆された。つまり、この鋳型
・プライマー非依存的なＤＮＡ合成反応には複数の異な
る反応が含まれている可能性が示唆される。
【００１２】次に、本発明の鋳型・プライマー非依存的
合成ＤＮＡ（以下、ｎｔｐ−ＤＮＡと略称）の特徴を調
べるための材料を準備するために、当該ＤＮＡの大量調
整を行った。又、ＤＮＡの精製法として、塩化セシウム
−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法［サムロックら、
モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニ
ュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ））、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９
８９年発行］を用いた。その結果、４７５ｍｌの反応液
より９．５ｍｇのＤＮＡを回収できた。このように調整
した試料を用いて、次に、この鋳型・プライマー非依存
的ＤＮＡ合成産物が果たして一本鎖か二本鎖かを調べる
ために一本鎖特異的ＤＮＡヌクレアーゼであるＳ１ヌク
レアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼによる切断を行
った。その結果、図７に示すように、ｎｔｐ−ＤＮＡは
これら一本鎖特異的ヌクレアーゼにより切断できなかっ
た。これより、この鋳型・プライマー非依存的ＤＮＡは
二本鎖ＤＮＡである可能性が示唆された。
合成ＤＮＡ（以下、ｎｔｐ−ＤＮＡと略称）の特徴を調
べるための材料を準備するために、当該ＤＮＡの大量調
整を行った。又、ＤＮＡの精製法として、塩化セシウム
−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法［サムロックら、
モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニ
ュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ））、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９
８９年発行］を用いた。その結果、４７５ｍｌの反応液
より９．５ｍｇのＤＮＡを回収できた。このように調整
した試料を用いて、次に、この鋳型・プライマー非依存
的ＤＮＡ合成産物が果たして一本鎖か二本鎖かを調べる
ために一本鎖特異的ＤＮＡヌクレアーゼであるＳ１ヌク
レアーゼ又はマングビーンヌクレアーゼによる切断を行
った。その結果、図７に示すように、ｎｔｐ−ＤＮＡは
これら一本鎖特異的ヌクレアーゼにより切断できなかっ
た。これより、この鋳型・プライマー非依存的ＤＮＡは
二本鎖ＤＮＡである可能性が示唆された。
【００１３】次に、ｎｔｐ−ＤＮＡの構造を調べるため
に、円二色性スペクトル分析と透過型電子顕微鏡による
観察を行った。まず初めに、円二色性スペクトル分析に
ついては、図８に示すように対象として用いたプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素により直線状とした典型的なＢ型二
重らせん構造のＤＮＡと比較してもほぼ類似しており、
よってこのｎｔｐ−ＤＮＡはＢ型二重らせん構造のＤＮ
Ａであることが確認できた。次に、透過型電子顕微鏡に
よる観察によれば、図９に示すように、直線状ＤＮＡで
あり、又その直径より二本鎖であることが確認できた。
これらの分析より、本発明者らは、鋳型・プライマー非
依存的合成ＤＮＡを二本鎖直線状ＤＮＡであると確定し
た。
に、円二色性スペクトル分析と透過型電子顕微鏡による
観察を行った。まず初めに、円二色性スペクトル分析に
ついては、図８に示すように対象として用いたプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素により直線状とした典型的なＢ型二
重らせん構造のＤＮＡと比較してもほぼ類似しており、
よってこのｎｔｐ−ＤＮＡはＢ型二重らせん構造のＤＮ
Ａであることが確認できた。次に、透過型電子顕微鏡に
よる観察によれば、図９に示すように、直線状ＤＮＡで
あり、又その直径より二本鎖であることが確認できた。
これらの分析より、本発明者らは、鋳型・プライマー非
依存的合成ＤＮＡを二本鎖直線状ＤＮＡであると確定し
た。
【００１４】次に、ｎｔｐ−ＤＮＡの塩基組成を分析し
た。まず初めに、デオキシリボヌクレアーゼ Ｉとホス
ホジエステラーゼ Ｉ及びアルカリホスファターゼによ
りｎｔｐ−ＤＮＡを切断（加水分解）し、各種デオキシ
リボヌクレオシドまで分解した。これをコスモシル５Ｃ
18逆相カラム（ナカライテスク社製）にてクロマトグラ
フ（高速液体クロマトグラフィー、日本分光社製）し、
各種デオキシリボヌクレオシドを定量した。その結果、
表１のように、塩基組成は、デオキシアデノシンが３
４．４％、デオキシシトシンが１５．６％、デオキシグ
アニンが１７．４％、デオキシチミジンが３２．６％と
なり、よってＧＣ含量は３３％であった。
た。まず初めに、デオキシリボヌクレアーゼ Ｉとホス
ホジエステラーゼ Ｉ及びアルカリホスファターゼによ
りｎｔｐ−ＤＮＡを切断（加水分解）し、各種デオキシ
リボヌクレオシドまで分解した。これをコスモシル５Ｃ
18逆相カラム（ナカライテスク社製）にてクロマトグラ
フ（高速液体クロマトグラフィー、日本分光社製）し、
各種デオキシリボヌクレオシドを定量した。その結果、
表１のように、塩基組成は、デオキシアデノシンが３
４．４％、デオキシシトシンが１５．６％、デオキシグ
アニンが１７．４％、デオキシチミジンが３２．６％と
なり、よってＧＣ含量は３３％であった。
【００１５】次に、ｎｔｐ−ＤＮＡの隣接塩基頻度（ｎ
ｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）
を分析した。通常の反応液に［α−32Ｐ］標識デオキシ
リボヌクレオチド三燐酸を加えて通常の反応を行った。
この反応液を、スーパーロース１２ゲル濾過カラム（フ
ァルマシア社製）に供し、ＤＮＡのピークよりＤＮＡ溶
液を分取した。この溶液を、エタノール沈殿にて精製
し、ＴＥ緩衝液に溶解した。この標識ＤＮＡを、ミクロ
コッカスヌクレアーゼと膵臓ホスホジエステラーゼにて
切断させ、デオキシリボヌクレオシド−３′−一燐酸に
分解した。これを、コスモシル５Ｃ18逆相カラムに供
し、デオキシアデノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デ
オキシシチジン−３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグ
アノシン−３′−一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン
−３′−一燐酸（ｄＴｐ）の各ピークを回収した。その
後、それぞれの32Ｐの放射能を液体シンチレーションカ
ウンター（ベックマン社製）にて測定し、隣接塩基頻度
を分析した。その結果、表２に示すように、ある一定の
規則性がある配列が得られた。つまり、ｄＡの前にはｄ
ＴとｄＧが高頻度で出現し、ｄＣの前にはｄＴが高頻度
で出現し、ｄＧの前にはｄＡが高頻度で出現し、ｄＴの
前にはｄＡとｄＣが高頻度で出現した。このことより、
分析したｎｔｐ−ＤＮＡの配列には、偏りが存在するこ
とが確認された。
ｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）
を分析した。通常の反応液に［α−32Ｐ］標識デオキシ
リボヌクレオチド三燐酸を加えて通常の反応を行った。
この反応液を、スーパーロース１２ゲル濾過カラム（フ
ァルマシア社製）に供し、ＤＮＡのピークよりＤＮＡ溶
液を分取した。この溶液を、エタノール沈殿にて精製
し、ＴＥ緩衝液に溶解した。この標識ＤＮＡを、ミクロ
コッカスヌクレアーゼと膵臓ホスホジエステラーゼにて
切断させ、デオキシリボヌクレオシド−３′−一燐酸に
分解した。これを、コスモシル５Ｃ18逆相カラムに供
し、デオキシアデノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デ
オキシシチジン−３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグ
アノシン−３′−一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン
−３′−一燐酸（ｄＴｐ）の各ピークを回収した。その
後、それぞれの32Ｐの放射能を液体シンチレーションカ
ウンター（ベックマン社製）にて測定し、隣接塩基頻度
を分析した。その結果、表２に示すように、ある一定の
規則性がある配列が得られた。つまり、ｄＡの前にはｄ
ＴとｄＧが高頻度で出現し、ｄＣの前にはｄＴが高頻度
で出現し、ｄＧの前にはｄＡが高頻度で出現し、ｄＴの
前にはｄＡとｄＣが高頻度で出現した。このことより、
分析したｎｔｐ−ＤＮＡの配列には、偏りが存在するこ
とが確認された。
【００１６】次に、このｎｔｐ−ＤＮＡの分子クローニ
ングを行った。クローニングベクターとしては、ｐＵＣ
１９を制限酵素Ｓｍａ１（東洋紡績社製）により切断し
たものを用いた。挿入ＤＮＡとしては、ｎｔｐ−ＤＮＡ
をＤＮａｓｅＩにより平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ，
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）をもつように切断し、アルカリホ
スファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化し、続い
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）にて
再びリン酸化し、最後にクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片
にて修復したものを用いた。この挿入ＤＮＡを上述のク
ローニングベクターに連結（ライゲーション）し、クロ
ーニングされたプラスミドの確認として、制限酵素によ
る切断を行い、電気泳動により挿入ＤＮＡの有無を確認
した。その結果、目的のＤＮＡ断片が組み込まれたクロ
ーンを選択でき、本発明者らはプラスミドｐＴＬ３４、
ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
ングを行った。クローニングベクターとしては、ｐＵＣ
１９を制限酵素Ｓｍａ１（東洋紡績社製）により切断し
たものを用いた。挿入ＤＮＡとしては、ｎｔｐ−ＤＮＡ
をＤＮａｓｅＩにより平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ，
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）をもつように切断し、アルカリホ
スファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化し、続い
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）にて
再びリン酸化し、最後にクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片
にて修復したものを用いた。この挿入ＤＮＡを上述のク
ローニングベクターに連結（ライゲーション）し、クロ
ーニングされたプラスミドの確認として、制限酵素によ
る切断を行い、電気泳動により挿入ＤＮＡの有無を確認
した。その結果、目的のＤＮＡ断片が組み込まれたクロ
ーンを選択でき、本発明者らはプラスミドｐＴＬ３４、
ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
【００１７】次に、プラスミドｐＴＬ３４、ｐＴＬ５７
およびｐＴＬ８５の挿入ＤＮＡ部分の塩基配列決定を行
った。塩基配列は、ジデオキシターミネーター法［サン
ガーら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、
第７４巻、第５４６３〜５４６７、（１９７７）］で決
定することができる。決定された塩基配列は、配列表の
配列番号１、２と３に示す（表３）。次に、このＤＮＡ
配列が既存のＤＮＡに対しての相同性があるかどうかを
検索した。その結果は表４、表５と表６（同順）に開示
した。これより、ヒトを含め多くの生物の染色体にこの
ＤＮＡ配列が保存されていることがわかる。又、この配
列は面白いことに、セントロメア付近に存在するミクロ
サテライトＤＮＡなどの遺伝子調節部位にも含まれてい
ることがわかる。
およびｐＴＬ８５の挿入ＤＮＡ部分の塩基配列決定を行
った。塩基配列は、ジデオキシターミネーター法［サン
ガーら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、
第７４巻、第５４６３〜５４６７、（１９７７）］で決
定することができる。決定された塩基配列は、配列表の
配列番号１、２と３に示す（表３）。次に、このＤＮＡ
配列が既存のＤＮＡに対しての相同性があるかどうかを
検索した。その結果は表４、表５と表６（同順）に開示
した。これより、ヒトを含め多くの生物の染色体にこの
ＤＮＡ配列が保存されていることがわかる。又、この配
列は面白いことに、セントロメア付近に存在するミクロ
サテライトＤＮＡなどの遺伝子調節部位にも含まれてい
ることがわかる。
【００１８】次に、このｎｔｐ−ＤＮＡが、例えば、ト
マト染色体ライブラリーから、このＤＮＡの塩基配列と
相同若しくは類似の配列を持つものを検索するプローブ
となりえるか否かを確認するために、例えば、このｎｔ
ｐ−ＤＮＡの５′末端の燐酸残基を［γ−32Ｐ］ＡＴＰ
にて標識して、検索のためのプローブを作成した。標識
プローブとしては、各種蛍光標識プローブ等を使用する
こともできる。このプローブを用いてトマト染色体ｃＤ
ＮＡλファージライブラリーからプラークハイブリダイ
ゼーションによりスクリーニングを実施した結果、多く
の陽性信号が検出された。この陽性信号が検出されたプ
ラークよりλファージを単離し、塩基配列を決定した結
果、予想したとおりｎｔｐ−ＤＮＡの配列が含まれてい
ることが確認できた。このことよりこのｎｔｐ−ＤＮＡ
は、各種ｃＤＮＡライブラリー中に存在する相同若しく
は類似な配列を簡単にスクリーニングできるプローブと
なり得ることが確認できた。
マト染色体ライブラリーから、このＤＮＡの塩基配列と
相同若しくは類似の配列を持つものを検索するプローブ
となりえるか否かを確認するために、例えば、このｎｔ
ｐ−ＤＮＡの５′末端の燐酸残基を［γ−32Ｐ］ＡＴＰ
にて標識して、検索のためのプローブを作成した。標識
プローブとしては、各種蛍光標識プローブ等を使用する
こともできる。このプローブを用いてトマト染色体ｃＤ
ＮＡλファージライブラリーからプラークハイブリダイ
ゼーションによりスクリーニングを実施した結果、多く
の陽性信号が検出された。この陽性信号が検出されたプ
ラークよりλファージを単離し、塩基配列を決定した結
果、予想したとおりｎｔｐ−ＤＮＡの配列が含まれてい
ることが確認できた。このことよりこのｎｔｐ−ＤＮＡ
は、各種ｃＤＮＡライブラリー中に存在する相同若しく
は類似な配列を簡単にスクリーニングできるプローブと
なり得ることが確認できた。
【００１９】次に、ｎｔｐ−ＤＮＡが、高頻度組み換え
活性を有することを確認するために、以下の実験を実施
した。又、実験に用いた酵母の遺伝子操作法は、ローズ
ら［メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（ア
・ラボラトリー・コース・マニュアル）（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｎｕａｌ））、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、（１９９０）］の方法に従いおこなった。まず、プ
ラスミドｐＣＨ１１０（ファルマシア製）よりβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子をＰＣＲ法により増幅する。但し、
上流プライマーの５′末端側にはパン酵母（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１
プロモーター配列を加え、下流プライマーの５′末端側
にはパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣ１のアンチセン
ス配列を加え、いずれもβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
コドンとフレームをあわせておく。この操作により、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子が酵母内で発現できることと
なる。次に、このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む二
本鎖ＤＮＡの３′ＯＨ末端に、例えば、セルモコッカス
・リトラリスＤＮＡポリメラーゼにより、ｎｔｐ−ＤＮ
Ａを合成させる。この操作は、ＤＮＡリガーゼを用い
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の両端にｎｔｐ−ＤＮ
Ａを連結することによっても代用できる。その後これを
パン酵母にトランスフェクションし、酵母細胞を平板培
地に培養する。この平板より、酵母をそれぞれ分離培養
し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。もし、β−
ガラクトシダーゼ活性が確認されると、本来酵母が持っ
ていないβ−ガラクトシダーゼが発現されていることと
なる。トランスフェクションしたＤＮＡには、酵母複製
起点が存在しないために、酵母細胞内で複製することが
できない。よって、酵母細胞内のβ−ガラクトシダーゼ
は、当該遺伝子が酵母染色体に組み込まれ、発現された
ものだと思われる。酵母のβ−ガラクトシダーゼ活性を
測定した結果、確かにβ−ガラクトシダーゼ活性が検出
でき、当該遺伝子が酵母染色体に組み込まれたことが確
認された（表７）。これらのことから、このｎｔｐ−Ｄ
ＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる作用があり、
特別な発現ベクターを必要とせずに挿入遺伝子よりタン
パク質を発現させることができることが証明された。本
発明により発現ベクターの構築という煩雑な作業を必要
とせず、目的のタンパク質を発現できることが可能とな
った。又この方法は、酵母以外の他の生物（例えば大腸
菌その他の原核生物ならびに真核生物）にも利用でき
る。
活性を有することを確認するために、以下の実験を実施
した。又、実験に用いた酵母の遺伝子操作法は、ローズ
ら［メソッズ・イン・イースト・ジェネティックス（ア
・ラボラトリー・コース・マニュアル）（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｎｕａｌ））、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ
ス、（１９９０）］の方法に従いおこなった。まず、プ
ラスミドｐＣＨ１１０（ファルマシア製）よりβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子をＰＣＲ法により増幅する。但し、
上流プライマーの５′末端側にはパン酵母（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１
プロモーター配列を加え、下流プライマーの５′末端側
にはパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣ１のアンチセン
ス配列を加え、いずれもβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
コドンとフレームをあわせておく。この操作により、β
−ガラクトシダーゼ遺伝子が酵母内で発現できることと
なる。次に、このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む二
本鎖ＤＮＡの３′ＯＨ末端に、例えば、セルモコッカス
・リトラリスＤＮＡポリメラーゼにより、ｎｔｐ−ＤＮ
Ａを合成させる。この操作は、ＤＮＡリガーゼを用い
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の両端にｎｔｐ−ＤＮ
Ａを連結することによっても代用できる。その後これを
パン酵母にトランスフェクションし、酵母細胞を平板培
地に培養する。この平板より、酵母をそれぞれ分離培養
し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。もし、β−
ガラクトシダーゼ活性が確認されると、本来酵母が持っ
ていないβ−ガラクトシダーゼが発現されていることと
なる。トランスフェクションしたＤＮＡには、酵母複製
起点が存在しないために、酵母細胞内で複製することが
できない。よって、酵母細胞内のβ−ガラクトシダーゼ
は、当該遺伝子が酵母染色体に組み込まれ、発現された
ものだと思われる。酵母のβ−ガラクトシダーゼ活性を
測定した結果、確かにβ−ガラクトシダーゼ活性が検出
でき、当該遺伝子が酵母染色体に組み込まれたことが確
認された（表７）。これらのことから、このｎｔｐ−Ｄ
ＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる作用があり、
特別な発現ベクターを必要とせずに挿入遺伝子よりタン
パク質を発現させることができることが証明された。本
発明により発現ベクターの構築という煩雑な作業を必要
とせず、目的のタンパク質を発現できることが可能とな
った。又この方法は、酵母以外の他の生物（例えば大腸
菌その他の原核生物ならびに真核生物）にも利用でき
る。
【００２０】本発明は上記の知見を含む多くの新発見に
基くもので、鋳型およびプライマーの不存在下、タンパ
ク質の存在下に、デオキシリボヌクレオチドを重合させ
ることを特徴とするポリデオキシリボヌクレオチドの合
成法、その方法により合成されたポリデオキシリボヌク
レオチド、そのポリデオキシリボヌクレオチドをトラン
スフェクションした細胞を培養することにより新規なＤ
ＮＡを創造する方法、そのＤＮＡおよびその用途に関す
る。
基くもので、鋳型およびプライマーの不存在下、タンパ
ク質の存在下に、デオキシリボヌクレオチドを重合させ
ることを特徴とするポリデオキシリボヌクレオチドの合
成法、その方法により合成されたポリデオキシリボヌク
レオチド、そのポリデオキシリボヌクレオチドをトラン
スフェクションした細胞を培養することにより新規なＤ
ＮＡを創造する方法、そのＤＮＡおよびその用途に関す
る。
【００２１】本発明のｎｐｔ−ＤＮＡの合成方法は鋳型
およびプライマーの不存在下、タンパク質の存在下に行
われる。重合反応はデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼによって進行するが、該ポリメラーゼ自体をタンパ
ク質として用いてもよく、ポリメラーゼとは別のタンパ
ク質を用いてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは約６０℃以
上、好ましくは約７０℃以上の温度で失活しないものが
好ましく、その例としてはセルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｒｉｓ）な
どのセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィル
ス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属
に属する細菌のデオキシリボヌクレオチドポリメラーゼ
が挙げられる。
およびプライマーの不存在下、タンパク質の存在下に行
われる。重合反応はデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼによって進行するが、該ポリメラーゼ自体をタンパ
ク質として用いてもよく、ポリメラーゼとは別のタンパ
ク質を用いてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは約６０℃以
上、好ましくは約７０℃以上の温度で失活しないものが
好ましく、その例としてはセルモコッカス・リトラリス
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｒｉｓ）な
どのセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフィル
ス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマス属
に属する細菌のデオキシリボヌクレオチドポリメラーゼ
が挙げられる。
【００２２】デオキシリボヌクレオチドとしてはｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰが用いられ、そ
れらの４種類または３種類を反応系に存在させれば反応
は進行する。デオキシリボヌクレオチドとデオキシリボ
ヌクレオチドポリメラーゼとの反応はｐＨ約７または１
０以下の弱アルカリ性で行うのが好ましい。反応温度と
時間はポリメラーゼが失活しない範囲で選ぶことがで
き、約６０℃以上でポリメラーゼ活性を示す範囲の昇温
下で反応させることにより、反応を速やかに進行させる
ことができる。たとえば７４℃で数時間反応させてもよ
く、又は通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９
５℃で１分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）
７４℃で３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応
は初期に若干の遅延時間を経たのちに開始され、やがて
最大速度に達する。本発明の方法により合成されるｎｔ
ｐ−ＤＮＡは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡやＲＮ
Ａに依存せずに、反応系に存在するタンパク質（ポリメ
ラーゼ）の情報に依存して合成されると考えられる。
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰが用いられ、そ
れらの４種類または３種類を反応系に存在させれば反応
は進行する。デオキシリボヌクレオチドとデオキシリボ
ヌクレオチドポリメラーゼとの反応はｐＨ約７または１
０以下の弱アルカリ性で行うのが好ましい。反応温度と
時間はポリメラーゼが失活しない範囲で選ぶことがで
き、約６０℃以上でポリメラーゼ活性を示す範囲の昇温
下で反応させることにより、反応を速やかに進行させる
ことができる。たとえば７４℃で数時間反応させてもよ
く、又は通常のＰＣＲ反応の条件、たとえば、（１）９
５℃で１分間保持、（２）４５℃で２分間保持、（３）
７４℃で３分間保持のサイクルを反復してもよい。反応
は初期に若干の遅延時間を経たのちに開始され、やがて
最大速度に達する。本発明の方法により合成されるｎｔ
ｐ−ＤＮＡは鋳型やプライマーとなるべきＤＮＡやＲＮ
Ａに依存せずに、反応系に存在するタンパク質（ポリメ
ラーゼ）の情報に依存して合成されると考えられる。
【００２３】合成されるＤＮＡのサイズは一般に１ｋｂ
ｐから３０ｋｂｐに分布するが、反応の条件によってそ
のサイズは変化させることができる。たとえば、基質Ｄ
ＮＡとしてｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの
４種類を用いれば１〜３０ｋｂｐのＤＮＡを得ることが
でき、４種類のうち１種類を欠く３種類、たとえばｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを基質とすれば、約１０ｋｂ
ｐのＤＮＡを得ることができ、また、４種類のＤＮＡを
基質とする反応系にデオキシリボヌクレアーゼＩを添加
して約１０ｋｂｐのＤＮＡを得ることができる。
ｐから３０ｋｂｐに分布するが、反応の条件によってそ
のサイズは変化させることができる。たとえば、基質Ｄ
ＮＡとしてｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの
４種類を用いれば１〜３０ｋｂｐのＤＮＡを得ることが
でき、４種類のうち１種類を欠く３種類、たとえばｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを基質とすれば、約１０ｋｂ
ｐのＤＮＡを得ることができ、また、４種類のＤＮＡを
基質とする反応系にデオキシリボヌクレアーゼＩを添加
して約１０ｋｂｐのＤＮＡを得ることができる。
【００２４】かくして得られるｎｔｐ−ＤＮＡ生成物は
二本鎖ＤＮＡであり、その塩基組成は、その一例（実施
例１２）によればデオキシアデニン（ｄＡ）３４．４
％、デオキシシチジン（ｄＣ）１５．６％、デオキシグ
アニン（ｄＧ）１７．４％、デオキシチミジン３２．６
％で、ｄＧとｄＣの合計は３３％である。また一例（実
施例１４）におけるＤＮＡの塩基配列において、ｄＴｄ
Ａ、ｄＴｄＣ、ｄＡｄＧ、ｄＡｄＴ、ｄＣｄｄＴの配列
の頻度が高い（実施例１３、表２）。
二本鎖ＤＮＡであり、その塩基組成は、その一例（実施
例１２）によればデオキシアデニン（ｄＡ）３４．４
％、デオキシシチジン（ｄＣ）１５．６％、デオキシグ
アニン（ｄＧ）１７．４％、デオキシチミジン３２．６
％で、ｄＧとｄＣの合計は３３％である。また一例（実
施例１４）におけるＤＮＡの塩基配列において、ｄＴｄ
Ａ、ｄＴｄＣ、ｄＡｄＧ、ｄＡｄＴ、ｄＣｄｄＴの配列
の頻度が高い（実施例１３、表２）。
【００２５】合成されたｎｐｔ−ＤＮＡは高頻度組み換
え活性を有するので発現ベクターを用いることなく、た
とえば酵母、大腸菌その他の原核生物や真核生物にトラ
ンスフェクションしてｎｐｔ−ＤＮＡによるタンパク質
を発現させることができる。
え活性を有するので発現ベクターを用いることなく、た
とえば酵母、大腸菌その他の原核生物や真核生物にトラ
ンスフェクションしてｎｐｔ−ＤＮＡによるタンパク質
を発現させることができる。
【００２６】また、ｎｔｐ−ＤＮＡを、たとえば、放射
性同位元素、蛍光色素などで標識して、ヒト染色体ライ
ブラリーやトマト染色体ライブラリーその他のｃＤＮＡ
ライブラリーからｎｔｐ−ＤＮＡと相同若しくは類似の
配列を有するものをスクリーニングするためのプローブ
として使用できる。スクリーニングはプラーグハイブリ
ブリダイゼーションとサザン・ブロッティングなどを用
いる公知の手法で行うことができる。
性同位元素、蛍光色素などで標識して、ヒト染色体ライ
ブラリーやトマト染色体ライブラリーその他のｃＤＮＡ
ライブラリーからｎｔｐ−ＤＮＡと相同若しくは類似の
配列を有するものをスクリーニングするためのプローブ
として使用できる。スクリーニングはプラーグハイブリ
ブリダイゼーションとサザン・ブロッティングなどを用
いる公知の手法で行うことができる。
【００２７】
【実施例】以下に実施例の形で本発明をさらに説明する
が、これによって本発明が限定されるものではない。
が、これによって本発明が限定されるものではない。
【００２８】実施例１ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼによる
ｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６
ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％トリトン Ｘ−１００（全
て最終濃度）］、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度
２００μＭ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌの反
応液に等量のミネラルオイル（シグマ社製）を加え、７
４℃で３時間反応させる。その後、反応液２０μｌを１
％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用［サ
ムロック・Ｔ等、モレキュラー・クローニング（ア・ラ
ボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、１９８９年発行］し、電気泳動後０．５μ
ｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。そ
の結果、図１の写真のような約１ｋｂｐから３０ｋｂｐ
の広い範囲に染色されるＤＮＡバンドを確認できた。
ｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６
ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％トリトン Ｘ−１００（全
て最終濃度）］、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度
２００μＭ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リ
トラリスＤＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌの反
応液に等量のミネラルオイル（シグマ社製）を加え、７
４℃で３時間反応させる。その後、反応液２０μｌを１
％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用［サ
ムロック・Ｔ等、モレキュラー・クローニング（ア・ラ
ボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス、１９８９年発行］し、電気泳動後０．５μ
ｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。そ
の結果、図１の写真のような約１ｋｂｐから３０ｋｂｐ
の広い範囲に染色されるＤＮＡバンドを確認できた。
【００２９】実施例２ リボヌクレオチドを用いてのセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼによるｎｔｐ−ＲＮＡの合成 緩衝液Ａ、リボヌクレオチド［ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、及びＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単
位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオ
イルを加え、７４℃で３時間反応させる。その後、反応
液２０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡ
ゲルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチ
ジウムにて染色し写真撮影した。その結果、染色される
ＲＮＡバンドは出現せず、よって、この鋳型・プライマ
ー非依存的合成反応において、リボヌクレオチドは、基
質とはなりえないことが確認された。
スＤＮＡポリメラーゼによるｎｔｐ−ＲＮＡの合成 緩衝液Ａ、リボヌクレオチド［ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、及びＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単
位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオ
イルを加え、７４℃で３時間反応させる。その後、反応
液２０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡ
ゲルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチ
ジウムにて染色し写真撮影した。その結果、染色される
ＲＮＡバンドは出現せず、よって、この鋳型・プライマ
ー非依存的合成反応において、リボヌクレオチドは、基
質とはなりえないことが確認された。
【００３０】実施例３ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼによる
ｎｔｐ−ＤＮＡの合成におけるデオキシリボヌクレオチ
ドの影響 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうちどれか１、２、３及び
４種類（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位／ｍｌ
セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼを含
有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイルを加
え、７４℃で３時間反応させる。その後、各反応液から
１０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲ
ルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジ
ウムにて染色し写真撮影した。その結果、図２に示すよ
うに、全て４種類及びｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰの
３種類及びｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰの３種類を用
いた時は、鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡバンド
が確認されたが、それ以外の１、２、３種類のデオキシ
リボヌクレオチドを用いた時はｎｔｐ−ＤＮＡバンドは
確認できなかった。よって、このｎｔｐ−ＤＮＡ合成反
応において、基質となるデオキシリボヌクレオチド三燐
酸に対する特異性（即ち、この反応の基質特異性）が存
在することが、確認された。その上、４種類のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸すべて加えた反応では、合成さ
れたＤＮＡのサイズが約１ｋｂｐから３０ｋｂｐの範囲
に分布するのに対し、３種類のデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸を加えた反応においては、約１０ｋｂｐ以上の
範囲に分布し、それ以上のサイズのものはほとんど認め
られなかった。これらのＤＮＡバンドの分布に違いよ
り、これらのｎｔｐ−ＤＮＡ合成産物は、別の種類のも
のである可能性が示唆された。つまり、この鋳型・プラ
イマー非依存的なＤＮＡ合成反応には複数の異なる反応
が含まれている可能性が示唆された。
ｎｔｐ−ＤＮＡの合成におけるデオキシリボヌクレオチ
ドの影響 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうちどれか１、２、３及び
４種類（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位／ｍｌ
セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼを含
有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイルを加
え、７４℃で３時間反応させる。その後、各反応液から
１０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲ
ルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジ
ウムにて染色し写真撮影した。その結果、図２に示すよ
うに、全て４種類及びｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰの
３種類及びｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰの３種類を用
いた時は、鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡバンド
が確認されたが、それ以外の１、２、３種類のデオキシ
リボヌクレオチドを用いた時はｎｔｐ−ＤＮＡバンドは
確認できなかった。よって、このｎｔｐ−ＤＮＡ合成反
応において、基質となるデオキシリボヌクレオチド三燐
酸に対する特異性（即ち、この反応の基質特異性）が存
在することが、確認された。その上、４種類のデオキシ
リボヌクレオチド三燐酸すべて加えた反応では、合成さ
れたＤＮＡのサイズが約１ｋｂｐから３０ｋｂｐの範囲
に分布するのに対し、３種類のデオキシリボヌクレオチ
ド三燐酸を加えた反応においては、約１０ｋｂｐ以上の
範囲に分布し、それ以上のサイズのものはほとんど認め
られなかった。これらのＤＮＡバンドの分布に違いよ
り、これらのｎｔｐ−ＤＮＡ合成産物は、別の種類のも
のである可能性が示唆された。つまり、この鋳型・プラ
イマー非依存的なＤＮＡ合成反応には複数の異なる反応
が含まれている可能性が示唆された。
【００３１】実施例４ 各種ＤＮＡポリメラーゼによるｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、各種ＤＮＡポリメラーゼ［２０単位／ｍｌ セ
ルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼか又は、
２５単位／ｍｌ天然ピロコッカス・フリオーサスＤＮＡ
ポリメラーゼか又は、２５単位／ｍｌ組み換えピロコッ
カス・フリオーサスＤＮＡポリメラーゼか又は、５０単
位／ｍｌ セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラー
ゼか又は、４０単位／ｍｌセルマス・セルモフィルスＤ
ＮＡポリメラーゼ（全て最終濃度）］を含有する１００
μｌの反応液に等量のミネラルオイルを加え、７４℃で
３時間反応させる。又、別に、緩衝液Ｂ［６０ｍＭ 燐
酸緩衝液（ｐＨ７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ］、デオ
キシリボヌクレオチド［３００μＭ ｄＡＴＰとｄＴＴ
Ｐ及び１．５ｍＭ ｄＧＴＰとｄＣＴＰ（全て最終濃
度）］、２．５単位／ｍｌ 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３時間反応させる。その後、各反応
液から１０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤ
ＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化
エチジウムにて染色し写真撮影した。その結果、図３に
示すように、セルモコッカス・リトラリスと近縁種の古
細菌ピロコッカス・フリオーサスからの天然ＤＮＡポリ
メラーゼと組み換えＤＮＡポリメラーゼにおいては、鋳
型・プライマー非依存的合成ＤＮＡのバンドは確認でき
ず、一方、原核好熱性細菌セルマス・アクアティクスと
セルマス・セルモフィルスからのＤＮＡポリメラーゼに
おいては、それぞれ数ｂｐから１０ｋｂｐと数ｂｐから
７ｋｂｐ（同順）のＤＮＡバンドが確認された。ところ
が、同じ原核細菌の大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼ
は、ＤＮＡバンドが確認されなかった。このことより、
この鋳型・プライマー非依存的ＤＮＡの合成反応は、ポ
リメラーゼの種類により大きく異なることが確認され
た。又、セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにおいても、ｎｔｐ−ＤＮ
Ａの合成反応が起こりえることが証明され、この反応が
かなり普遍的な現象であることが示された。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、各種ＤＮＡポリメラーゼ［２０単位／ｍｌ セ
ルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼか又は、
２５単位／ｍｌ天然ピロコッカス・フリオーサスＤＮＡ
ポリメラーゼか又は、２５単位／ｍｌ組み換えピロコッ
カス・フリオーサスＤＮＡポリメラーゼか又は、５０単
位／ｍｌ セルマス・アクアティクスＤＮＡポリメラー
ゼか又は、４０単位／ｍｌセルマス・セルモフィルスＤ
ＮＡポリメラーゼ（全て最終濃度）］を含有する１００
μｌの反応液に等量のミネラルオイルを加え、７４℃で
３時間反応させる。又、別に、緩衝液Ｂ［６０ｍＭ 燐
酸緩衝液（ｐＨ７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2 ］、デオ
キシリボヌクレオチド［３００μＭ ｄＡＴＰとｄＴＴ
Ｐ及び１．５ｍＭ ｄＧＴＰとｄＣＴＰ（全て最終濃
度）］、２．５単位／ｍｌ 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３時間反応させる。その後、各反応
液から１０μｌを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤ
ＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化
エチジウムにて染色し写真撮影した。その結果、図３に
示すように、セルモコッカス・リトラリスと近縁種の古
細菌ピロコッカス・フリオーサスからの天然ＤＮＡポリ
メラーゼと組み換えＤＮＡポリメラーゼにおいては、鋳
型・プライマー非依存的合成ＤＮＡのバンドは確認でき
ず、一方、原核好熱性細菌セルマス・アクアティクスと
セルマス・セルモフィルスからのＤＮＡポリメラーゼに
おいては、それぞれ数ｂｐから１０ｋｂｐと数ｂｐから
７ｋｂｐ（同順）のＤＮＡバンドが確認された。ところ
が、同じ原核細菌の大腸菌からのＤＮＡポリメラーゼ
は、ＤＮＡバンドが確認されなかった。このことより、
この鋳型・プライマー非依存的ＤＮＡの合成反応は、ポ
リメラーゼの種類により大きく異なることが確認され
た。又、セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにおいても、ｎｔｐ−ＤＮ
Ａの合成反応が起こりえることが証明され、この反応が
かなり普遍的な現象であることが示された。
【００３２】実施例５ ｎｔｐ−ＤＮＡ合成反応における酵素中に混在している
かもしれないＤＮＡやＲＮＡの存在有無の確認 緩衝液Ａ、１μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａ
ｓｅＡ ワシントン社製）か又は１．２５μｇ／ｍｌ
デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ、ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカル社製）、２０単位／
ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
を含有する９２μｌの反応液に等量のミネラルオイルを
加え、３７℃で２時間反応させる。つづいて、２．５ｍ
Ｍのデオキシリボヌクレオチド８μｌ［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］を加えて、７４℃で３時間反応させる。その後、
反応液２０μｌに５００ｍＭ ＥＤＴＡを１μｌ加え、
これを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに
適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウム
にて染色し写真撮影した。又別に、各ヌクレアーゼの陽
性反応を見るために対象実験として、緩衝液Ａ、１μｇ
／ｍｌ ＲＮａｓｅＡか又は１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮ
ａｓｅＩ、０．３ｍｇ／ｍｌ 転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、
シグマ社製）か又は３０μｇ／ｍｌ ＨｉｎｄIII 切断
λＤＮＡ（λ／ＨｉｎｄIII 、東洋紡績社製）を含有す
る９２μｌの反応液を調整し、上記と同様の反応及び電
気泳動を行う。その結果、図４に示すように、ＲＮａｓ
ｅＡ及びＤＮａｓｅＩは、当該緩衝液中で確かにそれぞ
れＲＮＡ及びＤＮＡ（同順）を切断できることが確認さ
れた。よって、反応液をＲＮａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩ
で処理し、混在するかもしれないＲＮＡやＤＮＡを分解
したものについても鋳型・プライマー非依存的合成は起
こることから、この反応にはＲＮＡやＤＮＡプライマー
が確かに不要なことが確認された。
かもしれないＤＮＡやＲＮＡの存在有無の確認 緩衝液Ａ、１μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａ
ｓｅＡ ワシントン社製）か又は１．２５μｇ／ｍｌ
デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ、ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカル社製）、２０単位／
ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
を含有する９２μｌの反応液に等量のミネラルオイルを
加え、３７℃で２時間反応させる。つづいて、２．５ｍ
Ｍのデオキシリボヌクレオチド８μｌ［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］を加えて、７４℃で３時間反応させる。その後、
反応液２０μｌに５００ｍＭ ＥＤＴＡを１μｌ加え、
これを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに
適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウム
にて染色し写真撮影した。又別に、各ヌクレアーゼの陽
性反応を見るために対象実験として、緩衝液Ａ、１μｇ
／ｍｌ ＲＮａｓｅＡか又は１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮ
ａｓｅＩ、０．３ｍｇ／ｍｌ 転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、
シグマ社製）か又は３０μｇ／ｍｌ ＨｉｎｄIII 切断
λＤＮＡ（λ／ＨｉｎｄIII 、東洋紡績社製）を含有す
る９２μｌの反応液を調整し、上記と同様の反応及び電
気泳動を行う。その結果、図４に示すように、ＲＮａｓ
ｅＡ及びＤＮａｓｅＩは、当該緩衝液中で確かにそれぞ
れＲＮＡ及びＤＮＡ（同順）を切断できることが確認さ
れた。よって、反応液をＲＮａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩ
で処理し、混在するかもしれないＲＮＡやＤＮＡを分解
したものについても鋳型・プライマー非依存的合成は起
こることから、この反応にはＲＮＡやＤＮＡプライマー
が確かに不要なことが確認された。
【００３３】実施例６ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼによる
１０ｋｂｐｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ、１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、デオキ
シリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位
／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３０分間反応させる。続いて、７４
℃で３時間反応後、この２０μｌを１％アガロース、ト
リス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５
μｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。
その結果、図５に示すように、１０ｋｂｐ付近に濃いバ
ンドが出現した。この結果より、生成されるＤＮＡの長
さを、反応条件次第で任意に変化させることが可能なこ
とが確認された。
１０ｋｂｐｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ、１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、デオキ
シリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位
／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３０分間反応させる。続いて、７４
℃で３時間反応後、この２０μｌを１％アガロース、ト
リス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５
μｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。
その結果、図５に示すように、１０ｋｂｐ付近に濃いバ
ンドが出現した。この結果より、生成されるＤＮＡの長
さを、反応条件次第で任意に変化させることが可能なこ
とが確認された。
【００３４】実施例７ ｎｔｐ−ＤＮＡ合成反応の時間的推移 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド ［ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００
μＭ）］、［α−32Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全
て最終濃度１００ｎＭ、３．３×１０6 Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃でそれぞれ０、１、
２、３及び４時間反応させる。その後５００ｍＭ ＥＤ
ＴＡを２μｌ加えて反応を停止させ、この反応液の４μ
ｌを仔牛胸腺ＤＮＡの９６μｌに加え、酸不溶性画分の
32Ｐの放射能を液体シンチレーションカウンターにて測
定した。その結果、図６に示すように、反応後１時間ま
では、デオキシリボヌクレオチドの取り込みはなく、２
時間後で初めて取り込みが現れた。その後４時間まで
に、添加したデオキシリボヌクレオチドの約９％を取り
込んだ。又、１時間後から２時間後までの反応より最大
反応速度を計算したところ、タンパク質１分子、１秒あ
たり０．８８塩基取り込んだ。これはセルモコッカス・
リトラリスＤＮＡポリメラーゼの通常の鋳型・プライマ
ー依存的ＤＮＡ重合反応速度の７６分の１、大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩの５７分の１であり、通常の鋳型・
プライマー依存的ＤＮＡ合成反応とは異なる全く別の反
応であると考えられる。
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００
μＭ）］、［α−32Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全
て最終濃度１００ｎＭ、３．３×１０6 Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃でそれぞれ０、１、
２、３及び４時間反応させる。その後５００ｍＭ ＥＤ
ＴＡを２μｌ加えて反応を停止させ、この反応液の４μ
ｌを仔牛胸腺ＤＮＡの９６μｌに加え、酸不溶性画分の
32Ｐの放射能を液体シンチレーションカウンターにて測
定した。その結果、図６に示すように、反応後１時間ま
では、デオキシリボヌクレオチドの取り込みはなく、２
時間後で初めて取り込みが現れた。その後４時間まで
に、添加したデオキシリボヌクレオチドの約９％を取り
込んだ。又、１時間後から２時間後までの反応より最大
反応速度を計算したところ、タンパク質１分子、１秒あ
たり０．８８塩基取り込んだ。これはセルモコッカス・
リトラリスＤＮＡポリメラーゼの通常の鋳型・プライマ
ー依存的ＤＮＡ重合反応速度の７６分の１、大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩの５７分の１であり、通常の鋳型・
プライマー依存的ＤＮＡ合成反応とは異なる全く別の反
応であると考えられる。
【００３５】実施例８ ｎｔｐ−ＤＮＡ合成産物の精製 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する４７５ｍｌの反応液に等
量のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させ
る。次に、反応液にミネラルオイルと等量のクロロホル
ムを加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、上層溶液を
別の容器に移す。この操作により、反応液よりミネラル
オイルを取り除いた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム液を０．
１倍量とエタノールを２．５倍量を加え、−８５℃で２
時間保存する。これを遠心分離してＤＮＡを回収し、５
ｍｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解する。この粗精製ＤＮ
Ａ溶液を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠
心法［サムロックら、モレキュラー・クローニング（ア
・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、１９８９年発行］にて精製した。その結
果、９．５ｍｇのｎｔｐ−ＤＮＡが得られた。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する４７５ｍｌの反応液に等
量のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させ
る。次に、反応液にミネラルオイルと等量のクロロホル
ムを加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、上層溶液を
別の容器に移す。この操作により、反応液よりミネラル
オイルを取り除いた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム液を０．
１倍量とエタノールを２．５倍量を加え、−８５℃で２
時間保存する。これを遠心分離してＤＮＡを回収し、５
ｍｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解する。この粗精製ＤＮ
Ａ溶液を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠
心法［サムロックら、モレキュラー・クローニング（ア
・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、１９８９年発行］にて精製した。その結
果、９．５ｍｇのｎｔｐ−ＤＮＡが得られた。
【００３６】実施例９ ｎｔｐ−ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ特異的ヌクレアーゼによ
る切断 Ｓ１緩衝液［５０ｍＭ 酢酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、２６
単位／ｍｌ Ｓ１ヌクレアーゼ（寶酒造社製）］か又
は、ＭＢ緩衝液［３０ｍＭ 酢酸／ＮａＯＨ（ｐＨ４．
６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、４
３単位／ｍｌ マングビーンヌクレアーゼ（東洋紡績社
製）］、５８．５μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡか又は、
２０μｇ／ｍｌＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを含む１０
μｌの反応液を３７℃で５分間反応させる。その後、反
応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μ
ｌ加え、１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲル
に適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウ
ムにて染色して写真撮影をした。その結果、図７に示す
ように、一本鎖ＤＮＡは切断されてバンドが消滅した
が、ｎｔｐ−ＤＮＡは反応前後で変化がなく、これらの
ヌクレアーゼでは切断されなかった。このことより、ｎ
ｔｐ−ＤＮＡは一本鎖以外のＤＮＡ、例えば、二本鎖Ｄ
ＮＡである可能性が示唆された。
る切断 Ｓ１緩衝液［５０ｍＭ 酢酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、２６
単位／ｍｌ Ｓ１ヌクレアーゼ（寶酒造社製）］か又
は、ＭＢ緩衝液［３０ｍＭ 酢酸／ＮａＯＨ（ｐＨ４．
６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、４
３単位／ｍｌ マングビーンヌクレアーゼ（東洋紡績社
製）］、５８．５μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡか又は、
２０μｇ／ｍｌＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを含む１０
μｌの反応液を３７℃で５分間反応させる。その後、反
応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を１μ
ｌ加え、１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲル
に適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウ
ムにて染色して写真撮影をした。その結果、図７に示す
ように、一本鎖ＤＮＡは切断されてバンドが消滅した
が、ｎｔｐ−ＤＮＡは反応前後で変化がなく、これらの
ヌクレアーゼでは切断されなかった。このことより、ｎ
ｔｐ−ＤＮＡは一本鎖以外のＤＮＡ、例えば、二本鎖Ｄ
ＮＡである可能性が示唆された。
【００３７】実施例１０ ｎｔｐ−ＤＮＡの円二色性によるＤＮＡ二重らせん構造
の解析 実施例８にて調整した鋳型・プライマー非依存的合成Ｄ
ＮＡ７００μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］０．５ｍｌに溶
解し、円二色性分散計 Ｊ−５００Ａ（日本分光株式会
社）を用いて、室温にて円二色性スペクトルを測定し
た。この測定の結果、図８の実線で示したｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、破線で示した典型的な二本鎖Ｂ形ＤＮＡの代表と
なる直線状プラスミドＤＮＡｐＰＴ１の円二色性スペク
トルとほとんど類似したスペクトルを示した。つまり、
このことは、このＤＮＡ単位濃度あたり、同じ「密度」
の右巻き螺旋が存在することを示唆し、よって、このｎ
ｔｐ−ＤＮＡは、二本鎖Ｂ形ＤＮＡであると結論した。
の解析 実施例８にて調整した鋳型・プライマー非依存的合成Ｄ
ＮＡ７００μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］０．５ｍｌに溶
解し、円二色性分散計 Ｊ−５００Ａ（日本分光株式会
社）を用いて、室温にて円二色性スペクトルを測定し
た。この測定の結果、図８の実線で示したｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、破線で示した典型的な二本鎖Ｂ形ＤＮＡの代表と
なる直線状プラスミドＤＮＡｐＰＴ１の円二色性スペク
トルとほとんど類似したスペクトルを示した。つまり、
このことは、このＤＮＡ単位濃度あたり、同じ「密度」
の右巻き螺旋が存在することを示唆し、よって、このｎ
ｔｐ−ＤＮＡは、二本鎖Ｂ形ＤＮＡであると結論した。
【００３８】実施例１１ ｎｔｐ−ＤＮＡの電子顕微鏡による観察 実施例７にて調整した鋳型・プライマー非依存的合成Ｄ
ＮＡ０．０５μｇを用いて、サッセンバッハ［ジャーナ
ル・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第１２
巻、第１１３１〜１１３８頁（１９７３）］が開示する
方法により透過型電子顕微鏡を用いて観察した。その結
果、図９に示すように直線状ＤＮＡであることが確認さ
れた。
ＮＡ０．０５μｇを用いて、サッセンバッハ［ジャーナ
ル・オブ・ビロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第１２
巻、第１１３１〜１１３８頁（１９７３）］が開示する
方法により透過型電子顕微鏡を用いて観察した。その結
果、図９に示すように直線状ＤＮＡであることが確認さ
れた。
【００３９】実施例１２ ｎｔｐ−ＤＮＡの塩基組成 緩衝液Ｃ［２５ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2］、１．５ｍｇ／ｍｌ ｎｔｐ−
ＤＮＡ、５０単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、５単位／ｍｌ
ホスホジエステラーゼＩ、２．３単位／ｍｌ アルカ
リホスファターゼ（寶酒造社製）を含む２０μｌの反応
液を３７℃で２時間反応させる。その後この全量を、Ｐ
Ａ溶媒（１０ｍＭ 燐酸二水素ナトリウム：アセトニト
リル＝９８：２）にて平衡化した４ｍｌのコスモシル５
Ｃ18（ナカライテスク社製）カラムに供し、ＰＡ溶媒に
て溶出させ、デオキシアデニン（ｄＡ）、デオキシシチ
ジン（ｄＣ）、デオキシグアニン（ｄＧ）、デオキシチ
ミジン（ｄＴ）の各ピーク面積より、それぞれの重量を
定量し、塩基組成の比率を計算する。その結果、表１の
ように、ｄＡが３４．４％、ｄＣが１５．６％、ｄＧが
１７．４％、ｄＴが３２．６％となり、よってＧＣ含量
は３３％であった。
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2］、１．５ｍｇ／ｍｌ ｎｔｐ−
ＤＮＡ、５０単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、５単位／ｍｌ
ホスホジエステラーゼＩ、２．３単位／ｍｌ アルカ
リホスファターゼ（寶酒造社製）を含む２０μｌの反応
液を３７℃で２時間反応させる。その後この全量を、Ｐ
Ａ溶媒（１０ｍＭ 燐酸二水素ナトリウム：アセトニト
リル＝９８：２）にて平衡化した４ｍｌのコスモシル５
Ｃ18（ナカライテスク社製）カラムに供し、ＰＡ溶媒に
て溶出させ、デオキシアデニン（ｄＡ）、デオキシシチ
ジン（ｄＣ）、デオキシグアニン（ｄＧ）、デオキシチ
ミジン（ｄＴ）の各ピーク面積より、それぞれの重量を
定量し、塩基組成の比率を計算する。その結果、表１の
ように、ｄＡが３４．４％、ｄＣが１５．６％、ｄＧが
１７．４％、ｄＴが３２．６％となり、よってＧＣ含量
は３３％であった。
【００４０】実施例１３ ｎｔｐ−ＤＮＡの隣接塩基頻度分析 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、［α−32Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ （全
て最終濃度１００ｎＭ、３．３×１０6 Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させる。
その後、反応停止のために最終濃度２０ｍＭ ＥＤＴＡ
を加える。これに、フェノール：クロロホルム（１：
１）を加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、この上層
溶液４０μｌを２４ｍｌのスーパーロース１２ゲル濾過
カラム（ファルマシア社製）に供し、ＴＥ緩衝液にて溶
出させた。これに、５５０μｇ／ｍｌ 仔牛胸線ＤＮＡ
を３μｌ加え、３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を０．１倍
量、エタノールを２．５倍量加え、混合後、−８５℃で
一晩放置する。２１６００×ｇ、４０分、４℃にて遠心
後、沈殿を７０％エタノールにて洗浄し乾燥後ＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解する。このサンプルに、緩衝液ＭＰ
［２０ｍＭ コハク酸／ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１０
ｍＭ ＣａＣｌ2、１９単位／ｍｌ ミクロコッカスヌ
クレアーゼ、０．５単位／ｍｌ 膵臓ホスホジエステラ
ーゼ（全て最終濃度）］を含む反応液８４０μｌを３７
℃で３時間反応させる。その後この全量を、４ｍｌのコ
スモシル５Ｃ18（ナカライテスク社製）カラムに供し、
５０ｍＭ 蟻酸カルシウムにて溶出させ、デオキシアデ
ノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デオキシシチジン−
３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグアノシン−３′−
一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン−３′−一燐酸
（ｄＴｐ）の各ピークを回収する。この溶液の容積を
１．５ｍｌに合わせ、その各２００μｌをレディーキャ
ップ（ベックマン社製）に移し、乾燥後、32Ｐの放射能
を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その
結果、表２に示すように、塩基配列に偏りが存在した。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、［α−32Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ （全
て最終濃度１００ｎＭ、３．３×１０6 Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させる。
その後、反応停止のために最終濃度２０ｍＭ ＥＤＴＡ
を加える。これに、フェノール：クロロホルム（１：
１）を加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、この上層
溶液４０μｌを２４ｍｌのスーパーロース１２ゲル濾過
カラム（ファルマシア社製）に供し、ＴＥ緩衝液にて溶
出させた。これに、５５０μｇ／ｍｌ 仔牛胸線ＤＮＡ
を３μｌ加え、３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を０．１倍
量、エタノールを２．５倍量加え、混合後、−８５℃で
一晩放置する。２１６００×ｇ、４０分、４℃にて遠心
後、沈殿を７０％エタノールにて洗浄し乾燥後ＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解する。このサンプルに、緩衝液ＭＰ
［２０ｍＭ コハク酸／ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１０
ｍＭ ＣａＣｌ2、１９単位／ｍｌ ミクロコッカスヌ
クレアーゼ、０．５単位／ｍｌ 膵臓ホスホジエステラ
ーゼ（全て最終濃度）］を含む反応液８４０μｌを３７
℃で３時間反応させる。その後この全量を、４ｍｌのコ
スモシル５Ｃ18（ナカライテスク社製）カラムに供し、
５０ｍＭ 蟻酸カルシウムにて溶出させ、デオキシアデ
ノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デオキシシチジン−
３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグアノシン−３′−
一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン−３′−一燐酸
（ｄＴｐ）の各ピークを回収する。この溶液の容積を
１．５ｍｌに合わせ、その各２００μｌをレディーキャ
ップ（ベックマン社製）に移し、乾燥後、32Ｐの放射能
を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その
結果、表２に示すように、塩基配列に偏りが存在した。
【００４１】実施例１４ 鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡのクローニング 緩衝液Ｄ［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）］、４００μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ、０．０８単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含む０．５
ｍｌの反応液を１５℃で２０分間反応させる。その後、
反応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２
０μｌ加え、つづいて等量のフェノール：クロロホルム
（１：１）を加え混合する。９６００×ｇ、５分間遠心
し、上層を別の容器に移す。（以上フェノール処理と略
す。）この上層に等量のクロロホルムを加え混合後、上
述の遠心分離をおこない上層を別の容器に移す。この上
層を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法
にて精製し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］４０μｌに
溶かす（ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述
のＤＮＡの脱燐酸化をおこなった。脱燐酸化緩衝液［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ］、６０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１００単位／ｍｌ アルカリフォスファターゼ
（寶酒造社製）を含む１００μｌの反応液を６５℃、１
時間反応させる。フェノール処理をおこない、反応液に
０．１倍量の３Ｍ酸酸ナトリウム液を加え混合後２．５
倍量のエタノールを加える。−２０℃で一晩放置し、２
１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心をおこなう（以下
エタノール沈殿と略す）。沈殿を７０％エタノールにて
洗浄し、乾燥後、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（脱燐
酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述のＤ
ＮＡのリン酸化をおこなった。リン酸化緩衝液［５０ｍ
Ｍ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％ポリエチレングリ
コール＃８０００、１５０μＭ ＡＴＰ、１２０μｇ／
ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１．５単
位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社
製）を含む反応液４０μｌを３７℃、１時間反応させ
る。つづいてフェノール処理とエタノール沈殿にてＤＮ
Ａを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（燐酸化ｎ
ｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。燐酸化ｎｔｐ−
ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの所々が一本
鎖となっているギャップ構造が存在する可能性があるの
で、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこなった。修復
緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリボヌクレオ
チド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ
（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍｌ燐酸化
ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／ｍｌ ク
レノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液を
２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡをフェノ
ール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩衝液１０
μｌに溶解する（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩと
する）。上述のＤＮＡのリン酸化をおこなつた。リン酸
化緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣＩ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％
ポリエチレングリコール＃８０００、１５０μＭ ＡＴ
Ｐ、１２０μｇ／ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１．５単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（東洋紡績社製）を含む反応液４０μｌを３７℃、
１時間反応させる。つづいてフェノール処理とエタノー
ル沈澱にてＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液１０μ１に溶解
する（燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。
燐酸ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの
所々が一本鎖となつているギャップ構造が存在する可能
性があるので、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこな
った。修復緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣ１（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭ ジチオ
スレイトール、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリ
ボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び
ｄＴＴＰ（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍ
ｌ燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／
ｍｌ クレノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの
反応液を２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡ
をフェノール処理をエタノール沈澱にて精製し、ＴＥ緩
衝液１０μｌに溶解する。（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮ
ａｓｅＩとする。）
１０ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）］、４００μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ、０．０８単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含む０．５
ｍｌの反応液を１５℃で２０分間反応させる。その後、
反応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２
０μｌ加え、つづいて等量のフェノール：クロロホルム
（１：１）を加え混合する。９６００×ｇ、５分間遠心
し、上層を別の容器に移す。（以上フェノール処理と略
す。）この上層に等量のクロロホルムを加え混合後、上
述の遠心分離をおこない上層を別の容器に移す。この上
層を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法
にて精製し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］４０μｌに
溶かす（ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述
のＤＮＡの脱燐酸化をおこなった。脱燐酸化緩衝液［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 ］、６０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１００単位／ｍｌ アルカリフォスファターゼ
（寶酒造社製）を含む１００μｌの反応液を６５℃、１
時間反応させる。フェノール処理をおこない、反応液に
０．１倍量の３Ｍ酸酸ナトリウム液を加え混合後２．５
倍量のエタノールを加える。−２０℃で一晩放置し、２
１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心をおこなう（以下
エタノール沈殿と略す）。沈殿を７０％エタノールにて
洗浄し、乾燥後、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（脱燐
酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述のＤ
ＮＡのリン酸化をおこなった。リン酸化緩衝液［５０ｍ
Ｍ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％ポリエチレングリ
コール＃８０００、１５０μＭ ＡＴＰ、１２０μｇ／
ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１．５単
位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社
製）を含む反応液４０μｌを３７℃、１時間反応させ
る。つづいてフェノール処理とエタノール沈殿にてＤＮ
Ａを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（燐酸化ｎ
ｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。燐酸化ｎｔｐ−
ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの所々が一本
鎖となっているギャップ構造が存在する可能性があるの
で、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこなった。修復
緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリボヌクレオ
チド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ
（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍｌ燐酸化
ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／ｍｌ ク
レノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液を
２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡをフェノ
ール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩衝液１０
μｌに溶解する（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩと
する）。上述のＤＮＡのリン酸化をおこなつた。リン酸
化緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣＩ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％
ポリエチレングリコール＃８０００、１５０μＭ ＡＴ
Ｐ、１２０μｇ／ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１．５単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（東洋紡績社製）を含む反応液４０μｌを３７℃、
１時間反応させる。つづいてフェノール処理とエタノー
ル沈澱にてＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液１０μ１に溶解
する（燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。
燐酸ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの
所々が一本鎖となつているギャップ構造が存在する可能
性があるので、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこな
った。修復緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣ１（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭ ジチオ
スレイトール、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリ
ボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び
ｄＴＴＰ（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍ
ｌ燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／
ｍｌ クレノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの
反応液を２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡ
をフェノール処理をエタノール沈澱にて精製し、ＴＥ緩
衝液１０μｌに溶解する。（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮ
ａｓｅＩとする。）
【００４２】つづいてクローニングベクターの調整をお
こなった。ＳｍａＩ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＫＣ
ｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール］、１２５μｇ
／ｍｌ ｐＵＣ１９、１．６単位／μｌ ＳｍａＩ（東
洋紡績社製）を含む２００μｌの反応液を３０℃で２時
間反応させる。その後フェノール処理、エタノール沈殿
にてＤＮＡを精製し、８０μｌの蒸留水に溶解させる。
これに１０倍脱燐酸化緩衝液を１０μｌ、０．４単位／
μｌ アルカリフォスファターゼを１０μｌ加え全量１
００μｌとし、６５℃で３０分間反応をおこなった。そ
の後フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを精製
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した（ｐＵＣ１９／Ｓｍ
ａＩとする）。次にＤＮＡのライゲーション反応をおこ
なった。ライゲーション緩衝液［３０ｍＭ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ］、１０μｇ／ｍｌ ｐＵＣ１９／ＳｍａＩ、６０μ
ｇ／ｍｌ 修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、６００
単位／ｍｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）を含
む１０μｌの反応液を１６℃で２４時間反応する。その
後６５℃で１０分間酵素を失活させた。このライゲーシ
ョン反応液の一部を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
にトランスフェクションし、ＬＢアンピシリン平板［１
％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、
４０μｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、１．５％
寒天末］にて形質転換体の選別をおこなった。上述の選
別においてポジティブコロニーを分離し、プラスミドの
調整をおこなった［サムロックら、モレキュラークロー
ニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）参照］。その
結果３種類のｎｔｐ−ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片がクロー
ニングされたプラスミドＤＮＡを分離でき、それぞれｐ
ＴＬ３４、ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
こなった。ＳｍａＩ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＫＣ
ｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール］、１２５μｇ
／ｍｌ ｐＵＣ１９、１．６単位／μｌ ＳｍａＩ（東
洋紡績社製）を含む２００μｌの反応液を３０℃で２時
間反応させる。その後フェノール処理、エタノール沈殿
にてＤＮＡを精製し、８０μｌの蒸留水に溶解させる。
これに１０倍脱燐酸化緩衝液を１０μｌ、０．４単位／
μｌ アルカリフォスファターゼを１０μｌ加え全量１
００μｌとし、６５℃で３０分間反応をおこなった。そ
の後フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを精製
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した（ｐＵＣ１９／Ｓｍ
ａＩとする）。次にＤＮＡのライゲーション反応をおこ
なった。ライゲーション緩衝液［３０ｍＭ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ］、１０μｇ／ｍｌ ｐＵＣ１９／ＳｍａＩ、６０μ
ｇ／ｍｌ 修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、６００
単位／ｍｌ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）を含
む１０μｌの反応液を１６℃で２４時間反応する。その
後６５℃で１０分間酵素を失活させた。このライゲーシ
ョン反応液の一部を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
にトランスフェクションし、ＬＢアンピシリン平板［１
％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、５
０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、
４０μｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）、１．５％
寒天末］にて形質転換体の選別をおこなった。上述の選
別においてポジティブコロニーを分離し、プラスミドの
調整をおこなった［サムロックら、モレキュラークロー
ニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）参照］。その
結果３種類のｎｔｐ−ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片がクロー
ニングされたプラスミドＤＮＡを分離でき、それぞれｐ
ＴＬ３４、ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
【００４３】実施例１５ 鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡの塩基配列の決定 ｐＴＬ３４、ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５に挿入されて
いるｎｔｐＤＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列をジデオキシ
ターミネーター法にて決定した。得られた配列をそれぞ
れ配列表の配列番号１、２及び３に示した（表３）。こ
の結果よりｐＴＬ３４にクローニングされたｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ産物は８塩基の繰り返し配列であることが確認で
き、またｐＴＬ５７にクローニングされたものは１２塩
基の繰り返し配列であることが確認され、ｐＴＬ８５に
クローニングされたものは繰り返し配列に類似した配列
であることが確認された。次に配列表の配列番号１、２
及び３に示した塩基配列についての相同性検索をＧｅｎ
ｂａｎｋデータベースをもちいておこなった。その結
果、表４、表５及び表６（同順）にて示すように、これ
らの配列は下等から高等生物に至るまで多く保存されて
いることがわかる。またその中にはセントロメア付近に
存在するミクロサテライトＤＮＡにこれらの配列が存在
することがわかり、遺伝的に重要な可能性を潜めている
ことが推測できた。
いるｎｔｐＤＮＡ由来のＤＮＡの塩基配列をジデオキシ
ターミネーター法にて決定した。得られた配列をそれぞ
れ配列表の配列番号１、２及び３に示した（表３）。こ
の結果よりｐＴＬ３４にクローニングされたｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ産物は８塩基の繰り返し配列であることが確認で
き、またｐＴＬ５７にクローニングされたものは１２塩
基の繰り返し配列であることが確認され、ｐＴＬ８５に
クローニングされたものは繰り返し配列に類似した配列
であることが確認された。次に配列表の配列番号１、２
及び３に示した塩基配列についての相同性検索をＧｅｎ
ｂａｎｋデータベースをもちいておこなった。その結
果、表４、表５及び表６（同順）にて示すように、これ
らの配列は下等から高等生物に至るまで多く保存されて
いることがわかる。またその中にはセントロメア付近に
存在するミクロサテライトＤＮＡにこれらの配列が存在
することがわかり、遺伝的に重要な可能性を潜めている
ことが推測できた。
【００４４】実施例１６ ｎｔｐ−ＤＮＡをプローブとして用いた繰り返し配列の
スクリーニング ２０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡに、交換緩衝液［５０
ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ジスレイトール、０．１ｍＭ
スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ］と０．１
ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μＭ ［γ−32Ｐ］
ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、４．８％ポリエチ
レングリコール８０００、４００単位／ｍｌ Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃、３０分間培養
し、最終２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを加え、反応を停
止させる。フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収し、これをハイブリダイゼーションプローブとす
る。次に繰り返し配列のスクリーニングとして、プラー
クハイブリダイゼーションを行った。まず大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ｒ−）を２
０％マルトース添加ＮＺＣＹＭ培地［１％カゼイン（酵
素水解物）、０．５％ＮａＣｌ、０．５％イーストエキ
ストラクト、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ，ｐＨ７．０］５０ｍｌに接種し、３７℃、
５時間培養する。４０００×ｇ１０分間遠心分離により
集菌し、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ4 に懸濁する。これを菌
懸濁液とし、適当にＳＭ［０．５８％ＮａＣｌ、０．２
％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］にて希釈したト
マトｃＤＮＡライブラリーλファージ液（クローンテッ
ク社ＣＬＦＬ１０８３ｂ）と混合し、３７℃、２０分間
培養する。これをＮＺＣＹＭ低寒天培地に加え、その後
ＮＺＣＹＭ寒天培地に重層し、３７℃一晩培養する。こ
の培養プレートの寒天上にニトロセルロースフィルター
（ミリポア社製）を１分間置き、静かに剥がし室温で２
０分間乾燥させた。その後、変性液（０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙（ワットマン３
ＭＭ、ワットマン社製）上に５分間置き、つぎに中和液
［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸３ナトリウム２
水和物（２０×ＳＳＣ）、２Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）］に浸した３ＭＭろ紙上に５分間置く。フィル
ターを中和液中に１分間、２×ＳＳＣ中に５分間浸した
後、３ＭＭろ紙上で乾燥させる。フィルターを３ＭＭろ
紙間に挾み、バキューム・オーブンにて８０℃２時間吸
引乾燥させる。つぎにハイブリダイゼーション液［５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．２％
ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール４００、
０．２％仔牛血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌ 変性
サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド］に乾燥後のフィ
ルターを十分湿らし、つづいてハイブリダイゼーション
液を５０ｍｌ加え、密封し４２℃一晩放置する。その
後、ハイブリダイゼーション液を抜き取り、１００℃、
５分間加熱後氷冷したハイブリダイゼーションプローブ
を加えたハイブリダイゼーション液を１０ｍｌ加え、再
び密封し４２℃一晩培養する。その後、フィルターを洗
浄液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に１時間浸し、
つづいて洗浄液２（０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）
に浸し５０℃で２時間洗浄する。このフィルターを３Ｍ
Ｍろ紙上で乾燥後、オートラジオグラフィーにて陽性プ
ラークの確認を行う。その結果、陽性プラークが確認さ
れ、よって鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡが例え
ば、ミクロサテライトＤＮＡのスクリーニングにおい
て、プローブとなりえることが確認された。この陽性プ
ラークをパスツールピペットをもちいて１ｍｌのＳＭに
移しクロロホルムを１滴添加して室温１時間放置する。
これを適当にＳＭにて希釈し、１００μｌの菌懸濁液と
共に５００ｍｌのＮＺＣＹＭ培地に添加し３７℃、一晩
培養する。これにクロロホルム１０μｌを加えて、７８
７０×ｇ、１０分間遠心分離により集菌し、上清を回収
する。この上清に緩衝液Ｌ１（２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａ
ｓｅＡ、６ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、０．２ｍｇ／ｍ
ｌ 仔牛血清アルブミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＭ トリス／ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．５）を３０μｌ加えて、３７℃、３０分間培養す
る。続いて、氷冷緩衝液Ｌ２（３０％ポリエチレングリ
コール６０００、３Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌを加えて、氷
中１時間放置する。その後１７７００×ｇ、１５分間、
４℃にて遠心分離し、沈殿を回収する。この沈殿を緩衝
液Ｌ３（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１ｍｌに懸
濁し、続いて溶液Ｌ４（４％ＳＤＳ）を１ｍｌ加え、７
０℃、１０分間培養する。氷中で冷却後溶液Ｌ５（２．
２５Ｍ 酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ４．８）１ｍｌを添
加し混合後２１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心分離
し、上清を回収する。予め、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、
ｐＨ７．０、０．１５％トリトンＸ−１００）にて平衡
化したＱＩＡＧＥＮ ＴＩＰ−２０カラム（キアゲン社
製）に上記回収上清を加え、カラムクロマトグラフィー
する。その後緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０）２ｍｌにて
カラムを洗浄し、緩衝液ＱＦ（１．２５Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１５％エタノール、ｐＨ
８．５）１．５ｍｌにてＤＮＡを溶出させる。これにイ
ソプロパノールを０．８倍量添加し、−２０℃、２０分
間放置し、２１６００×ｇ、３０分間、４℃の遠心によ
りＤＮＡを回収する。このＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルにて洗浄後乾燥させ、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌ
に溶かす。本発明者らはこのλファージＤＮＡをλＴＬ
２ＤＮＡと命名した。次にこのλＴＬ２ＤＮＡの塩基配
列決定を行った。方法は前述のジデオキシターミネータ
ー法を用いた。またプライマーとしては市販のλｇｔ１
１プライマーを用いた。その結果、ｎｔｐ−ＤＮＡ由来
の繰り返し配列が存在した。よって、このｎｔｐ−ＤＮ
Ａがこの繰り返し配列をスクリーニングするためのプロ
ーブとなりえることが確認された。
スクリーニング ２０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡに、交換緩衝液［５０
ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ジスレイトール、０．１ｍＭ
スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ］と０．１
ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μＭ ［γ−32Ｐ］
ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、４．８％ポリエチ
レングリコール８０００、４００単位／ｍｌ Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃、３０分間培養
し、最終２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを加え、反応を停
止させる。フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収し、これをハイブリダイゼーションプローブとす
る。次に繰り返し配列のスクリーニングとして、プラー
クハイブリダイゼーションを行った。まず大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ｒ−）を２
０％マルトース添加ＮＺＣＹＭ培地［１％カゼイン（酵
素水解物）、０．５％ＮａＣｌ、０．５％イーストエキ
ストラクト、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2 Ｏ，ｐＨ７．０］５０ｍｌに接種し、３７℃、
５時間培養する。４０００×ｇ１０分間遠心分離により
集菌し、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ4 に懸濁する。これを菌
懸濁液とし、適当にＳＭ［０．５８％ＮａＣｌ、０．２
％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］にて希釈したト
マトｃＤＮＡライブラリーλファージ液（クローンテッ
ク社ＣＬＦＬ１０８３ｂ）と混合し、３７℃、２０分間
培養する。これをＮＺＣＹＭ低寒天培地に加え、その後
ＮＺＣＹＭ寒天培地に重層し、３７℃一晩培養する。こ
の培養プレートの寒天上にニトロセルロースフィルター
（ミリポア社製）を１分間置き、静かに剥がし室温で２
０分間乾燥させた。その後、変性液（０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙（ワットマン３
ＭＭ、ワットマン社製）上に５分間置き、つぎに中和液
［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸３ナトリウム２
水和物（２０×ＳＳＣ）、２Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）］に浸した３ＭＭろ紙上に５分間置く。フィル
ターを中和液中に１分間、２×ＳＳＣ中に５分間浸した
後、３ＭＭろ紙上で乾燥させる。フィルターを３ＭＭろ
紙間に挾み、バキューム・オーブンにて８０℃２時間吸
引乾燥させる。つぎにハイブリダイゼーション液［５０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．２％
ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール４００、
０．２％仔牛血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌ 変性
サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド］に乾燥後のフィ
ルターを十分湿らし、つづいてハイブリダイゼーション
液を５０ｍｌ加え、密封し４２℃一晩放置する。その
後、ハイブリダイゼーション液を抜き取り、１００℃、
５分間加熱後氷冷したハイブリダイゼーションプローブ
を加えたハイブリダイゼーション液を１０ｍｌ加え、再
び密封し４２℃一晩培養する。その後、フィルターを洗
浄液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に１時間浸し、
つづいて洗浄液２（０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）
に浸し５０℃で２時間洗浄する。このフィルターを３Ｍ
Ｍろ紙上で乾燥後、オートラジオグラフィーにて陽性プ
ラークの確認を行う。その結果、陽性プラークが確認さ
れ、よって鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡが例え
ば、ミクロサテライトＤＮＡのスクリーニングにおい
て、プローブとなりえることが確認された。この陽性プ
ラークをパスツールピペットをもちいて１ｍｌのＳＭに
移しクロロホルムを１滴添加して室温１時間放置する。
これを適当にＳＭにて希釈し、１００μｌの菌懸濁液と
共に５００ｍｌのＮＺＣＹＭ培地に添加し３７℃、一晩
培養する。これにクロロホルム１０μｌを加えて、７８
７０×ｇ、１０分間遠心分離により集菌し、上清を回収
する。この上清に緩衝液Ｌ１（２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａ
ｓｅＡ、６ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、０．２ｍｇ／ｍ
ｌ 仔牛血清アルブミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＭ トリス／ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．５）を３０μｌ加えて、３７℃、３０分間培養す
る。続いて、氷冷緩衝液Ｌ２（３０％ポリエチレングリ
コール６０００、３Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌを加えて、氷
中１時間放置する。その後１７７００×ｇ、１５分間、
４℃にて遠心分離し、沈殿を回収する。この沈殿を緩衝
液Ｌ３（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１ｍｌに懸
濁し、続いて溶液Ｌ４（４％ＳＤＳ）を１ｍｌ加え、７
０℃、１０分間培養する。氷中で冷却後溶液Ｌ５（２．
２５Ｍ 酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ４．８）１ｍｌを添
加し混合後２１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心分離
し、上清を回収する。予め、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、
ｐＨ７．０、０．１５％トリトンＸ−１００）にて平衡
化したＱＩＡＧＥＮ ＴＩＰ−２０カラム（キアゲン社
製）に上記回収上清を加え、カラムクロマトグラフィー
する。その後緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０）２ｍｌにて
カラムを洗浄し、緩衝液ＱＦ（１．２５Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１５％エタノール、ｐＨ
８．５）１．５ｍｌにてＤＮＡを溶出させる。これにイ
ソプロパノールを０．８倍量添加し、−２０℃、２０分
間放置し、２１６００×ｇ、３０分間、４℃の遠心によ
りＤＮＡを回収する。このＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルにて洗浄後乾燥させ、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌ
に溶かす。本発明者らはこのλファージＤＮＡをλＴＬ
２ＤＮＡと命名した。次にこのλＴＬ２ＤＮＡの塩基配
列決定を行った。方法は前述のジデオキシターミネータ
ー法を用いた。またプライマーとしては市販のλｇｔ１
１プライマーを用いた。その結果、ｎｔｐ−ＤＮＡ由来
の繰り返し配列が存在した。よって、このｎｔｐ−ＤＮ
Ａがこの繰り返し配列をスクリーニングするためのプロ
ーブとなりえることが確認された。
【００４５】実施例１７ ｎｔｐ−ＤＮＡによる高頻度組み換え法 プラスミドｐＣＨ１１０ ２５μｇに、緩衝液ＢＭ［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジスレイト
ール］、２０００単位／ｍｌ ＢａｍＨＩ（東洋紡績社
製）を加え、全量１００μｌとした反応液を３７℃で２
時間反応させる。その後、フェノール処理、エタノール
沈殿にてＤＮＡを回収する。これをＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］２５μｌに溶解する。このＤＮＡ溶液２５μｌに、
ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．００１％ゼラチン］、デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て
最終濃度２００μＭ）］、１ｎＭ Ｇ１プライマー、１
ｎＭ Ｇ２プライマー、２５単位／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２．５ｍｌの反応
液を準備する。この上層に等量のミネラルオイル（シグ
マ社製）を加え、９５℃で１分間、５０℃で２分間、７
２℃で３分間の温度サイクルを合計３０回繰り返す。そ
の後、等量のクロロホルムにてミネラルオイルを取り除
き、フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解する。この粗精製ＤＮＡ
溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配遠心法にて精製した。その結果、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の上流にパン酵母のＧＡＬ１プロモーター配列
と下流にパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣ１ターミネ
ーター配列を含むＤＮＡが２０μｇ得られた。このＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、その全量に緩衝液Ａ
［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、
２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、０．１％Ｘ−１００（全て最終濃度）］、デ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０
単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼを加え２ｍｌとした反応液を、７４℃で３時間反
応させる。その後、フェノール処理、エタノール沈殿に
てＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。こ
の粗精製ＤＮＡ溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジ
ウム平衡密度勾配遠心法にて精製し、ＴＥ緩衝液２０μ
ｌに溶解した。２０ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエ
キストラクト、２％ペプトン、２％ブドウ糖）にパン酵
母を接種し、３０℃で一晩培養する。次に、この培養液
の２ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地へ移し、再び３０℃
で一晩培養する。この培養液を４００×ｇ、５分間遠心
し、酵母細胞を集める。この沈殿に２０ｍｌのＳＥＤ溶
液（１Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ ジスレイトール）を加え、懸濁し、３０℃で１０分
間培養する。再び同様の遠心にて酵母細胞を集め、２０
ｍｌの１Ｍ ソルビトールに懸濁する。再度遠心して酵
母細胞を集め、２０ｍｌのＳＣＥ溶液［１Ｍ ソルビト
ール、１００ｍＭ クエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁する。これに、０．
２ｍｌのグルスラーゼを添加し、３０℃で１時間培養す
る。この溶液を、３００×ｇ、５分間遠心し、酵母スフ
ェロプラスト細胞を集める。この沈殿を、２０ｍｌの１
Ｍ ソルビトールにて２回洗浄し、最後に２０ｍｌのＳ
ＴＣ溶液［１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］にて
洗浄する。沈殿をＳＴＣ溶液１ｍｌに懸濁し、１００μ
ｌづつ分ける。これに、上記ＤＮＡ溶液を５μｌ加え、
室温１０分間放置する。続いて、ＰＥＧ溶液［２０％ポ
リエチレングリコール３３００、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を１
ｍｌ加え、室温で１０分間放置する。３００×ｇ、５分
間遠心後、沈殿を１５０μｌのＳＯＳ培地（２Ｍ ソル
ビトールを１０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ、
ＹＰＤ培地を６．７ｍｌ、１％ロイシン溶液を２７μ
ｌ、蒸留水を３．１７ｍｌ）に懸濁する。これを、３０
℃で２０分間培養し、予め４５℃で融解しておいた６ｍ
ｌのＳＹＧ寒天培地［１８．２％ソルビトール、２％寒
天、０．６７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸無
し）、２％ぶどう糖、０．００１％アデニン、０．００
４％ウラシル］に加え、ＳＹＧ寒天平板培地に重層し、
３０℃で３日間培養する。培養平板培地より、コロニー
を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で一晩培養す
る。４００×ｇ、５分間遠心し、沈殿を２５０μｌのＢ
Ｋ緩衝液［１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ジスレイトール、２０％グリセリン］に
懸濁する。これに、ＰＭＳＦ溶液（４０ｍＭ フッ化フ
ェニルメチルスルホニル）を１２．５μｌ加え、強く撹
拌する。再びＢＫ緩衝液を２５０μｌ加え、よく撹拌す
る。１７７００×ｇ、１５分間遠心し、上清を別の容器
に移す。この上清５０μｌに、ＢＫ緩衝液５０μｌとＺ
緩衝液（１．６１％Ｎａ2 ＨＰＯ4・７Ｈ2 Ｏ、０．５
５％ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０７５％ＫＣｌ、０．０２４
６％ＭｇＳＯ4 、０．２７％β−メルカプトフェノー
ル）０．９ｍｌを加え、２８℃で５分間培養する。その
後、ＯＮＰＧ溶液（４ｍｇ／ｍｌ ο−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．２ｍＬ加えるこ
とにより反応を開始させ、２８℃で培養する。３０分後
に１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液を０．５ｍｌ加え、反応を停
止させる。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定する。
又、タンパク質の量をブラットフォード色素結合法［ブ
ラットフォード、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第７２巻、第２４８
〜２５４頁（１９７６）］にて定量した。この吸光度及
びタンパク質の量より菌抽出液中のβ−ガラクシダーゼ
比活性を計算した。その結果、２０検体のうち４検体に
ついて、β−ガラクシダーゼ活性が確認できた（表
６）。このことは、β−ガラクシダーゼ遺伝子が末端に
付加されたｎｔｐ−ＤＮＡを介して酵母染色体中に導入
されたことを証明する結果となった。よって、ｎｔｐ−
ＤＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる活性が存在
することが確認された。
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジスレイト
ール］、２０００単位／ｍｌ ＢａｍＨＩ（東洋紡績社
製）を加え、全量１００μｌとした反応液を３７℃で２
時間反応させる。その後、フェノール処理、エタノール
沈殿にてＤＮＡを回収する。これをＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］２５μｌに溶解する。このＤＮＡ溶液２５μｌに、
ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
０．００１％ゼラチン］、デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て
最終濃度２００μＭ）］、１ｎＭ Ｇ１プライマー、１
ｎＭ Ｇ２プライマー、２５単位／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２．５ｍｌの反応
液を準備する。この上層に等量のミネラルオイル（シグ
マ社製）を加え、９５℃で１分間、５０℃で２分間、７
２℃で３分間の温度サイクルを合計３０回繰り返す。そ
の後、等量のクロロホルムにてミネラルオイルを取り除
き、フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解する。この粗精製ＤＮＡ
溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配遠心法にて精製した。その結果、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の上流にパン酵母のＧＡＬ１プロモーター配列
と下流にパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣ１ターミネ
ーター配列を含むＤＮＡが２０μｇ得られた。このＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、その全量に緩衝液Ａ
［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、
２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、０．１％Ｘ−１００（全て最終濃度）］、デ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０
単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメ
ラーゼを加え２ｍｌとした反応液を、７４℃で３時間反
応させる。その後、フェノール処理、エタノール沈殿に
てＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。こ
の粗精製ＤＮＡ溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジ
ウム平衡密度勾配遠心法にて精製し、ＴＥ緩衝液２０μ
ｌに溶解した。２０ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエ
キストラクト、２％ペプトン、２％ブドウ糖）にパン酵
母を接種し、３０℃で一晩培養する。次に、この培養液
の２ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地へ移し、再び３０℃
で一晩培養する。この培養液を４００×ｇ、５分間遠心
し、酵母細胞を集める。この沈殿に２０ｍｌのＳＥＤ溶
液（１Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ ジスレイトール）を加え、懸濁し、３０℃で１０分
間培養する。再び同様の遠心にて酵母細胞を集め、２０
ｍｌの１Ｍ ソルビトールに懸濁する。再度遠心して酵
母細胞を集め、２０ｍｌのＳＣＥ溶液［１Ｍ ソルビト
ール、１００ｍＭ クエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁する。これに、０．
２ｍｌのグルスラーゼを添加し、３０℃で１時間培養す
る。この溶液を、３００×ｇ、５分間遠心し、酵母スフ
ェロプラスト細胞を集める。この沈殿を、２０ｍｌの１
Ｍ ソルビトールにて２回洗浄し、最後に２０ｍｌのＳ
ＴＣ溶液［１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］にて
洗浄する。沈殿をＳＴＣ溶液１ｍｌに懸濁し、１００μ
ｌづつ分ける。これに、上記ＤＮＡ溶液を５μｌ加え、
室温１０分間放置する。続いて、ＰＥＧ溶液［２０％ポ
リエチレングリコール３３００、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ2 、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を１
ｍｌ加え、室温で１０分間放置する。３００×ｇ、５分
間遠心後、沈殿を１５０μｌのＳＯＳ培地（２Ｍ ソル
ビトールを１０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ、
ＹＰＤ培地を６．７ｍｌ、１％ロイシン溶液を２７μ
ｌ、蒸留水を３．１７ｍｌ）に懸濁する。これを、３０
℃で２０分間培養し、予め４５℃で融解しておいた６ｍ
ｌのＳＹＧ寒天培地［１８．２％ソルビトール、２％寒
天、０．６７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸無
し）、２％ぶどう糖、０．００１％アデニン、０．００
４％ウラシル］に加え、ＳＹＧ寒天平板培地に重層し、
３０℃で３日間培養する。培養平板培地より、コロニー
を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で一晩培養す
る。４００×ｇ、５分間遠心し、沈殿を２５０μｌのＢ
Ｋ緩衝液［１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ジスレイトール、２０％グリセリン］に
懸濁する。これに、ＰＭＳＦ溶液（４０ｍＭ フッ化フ
ェニルメチルスルホニル）を１２．５μｌ加え、強く撹
拌する。再びＢＫ緩衝液を２５０μｌ加え、よく撹拌す
る。１７７００×ｇ、１５分間遠心し、上清を別の容器
に移す。この上清５０μｌに、ＢＫ緩衝液５０μｌとＺ
緩衝液（１．６１％Ｎａ2 ＨＰＯ4・７Ｈ2 Ｏ、０．５
５％ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０７５％ＫＣｌ、０．０２４
６％ＭｇＳＯ4 、０．２７％β−メルカプトフェノー
ル）０．９ｍｌを加え、２８℃で５分間培養する。その
後、ＯＮＰＧ溶液（４ｍｇ／ｍｌ ο−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．２ｍＬ加えるこ
とにより反応を開始させ、２８℃で培養する。３０分後
に１Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液を０．５ｍｌ加え、反応を停
止させる。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定する。
又、タンパク質の量をブラットフォード色素結合法［ブ
ラットフォード、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第７２巻、第２４８
〜２５４頁（１９７６）］にて定量した。この吸光度及
びタンパク質の量より菌抽出液中のβ−ガラクシダーゼ
比活性を計算した。その結果、２０検体のうち４検体に
ついて、β−ガラクシダーゼ活性が確認できた（表
６）。このことは、β−ガラクシダーゼ遺伝子が末端に
付加されたｎｔｐ−ＤＮＡを介して酵母染色体中に導入
されたことを証明する結果となった。よって、ｎｔｐ−
ＤＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる活性が存在
することが確認された。
【００４６】
【発明の効果】本発明は、鋳型・プライマー非依存的
に、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡつまり遺伝情報を
創造的に作り出すことを目的とし、この創造されたＤＮ
Ａが、遺伝子工学の分野で重要な働きを伴う。それは、
天然には存在しないＤＮＡを創造することにより遺伝子
の創造ができ、この遺伝子よりタンパク質を創造するこ
とが可能になる。このため、例えば、天然に存在しない
生理活性物質、酵素、受容体、信号伝達物質、ホルモ
ン、抗癌物質、抗ウィルス物質、免疫抑制物質、膜輸送
タンパク質、発生関連物質、細胞骨格物質、脳神経関連
物質等を創造することが可能となる。その上、このＤＮ
Ａの創造は、生物進化の過程における遺伝情報の創造を
断片的であるにせよ垣間見ることができ、それを再現
し、当然、有用な突然変異体などを産むことに利用でき
る可能性もある。又、例えば、この創造されたＤＮＡの
構成要素の一部に存在すると思われる繰り返し配列ＤＮ
Ａについては、遺伝子の複製、転写、発現等の調節を解
明する効果や、既存の遺伝子よりこの調節部位をスクリ
ーニングするプローブとなりうる効果も含まれる。又、
他には、このｎｔｐ−ＤＮＡを既存の遺伝子の末端に付
加し、これを宿主細胞に挿入することにより、宿主染色
体と高頻度に相同組み換えをおこさせ、当該遺伝子由来
のタンパク質を発現させることができる効果も含まれ
る。本発明は、実施が簡単且つ安価であり、特別な装置
を必要としないことにおいても、将来の遺伝子工学の分
野で大きな役割を担うことが期待できる。
に、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡつまり遺伝情報を
創造的に作り出すことを目的とし、この創造されたＤＮ
Ａが、遺伝子工学の分野で重要な働きを伴う。それは、
天然には存在しないＤＮＡを創造することにより遺伝子
の創造ができ、この遺伝子よりタンパク質を創造するこ
とが可能になる。このため、例えば、天然に存在しない
生理活性物質、酵素、受容体、信号伝達物質、ホルモ
ン、抗癌物質、抗ウィルス物質、免疫抑制物質、膜輸送
タンパク質、発生関連物質、細胞骨格物質、脳神経関連
物質等を創造することが可能となる。その上、このＤＮ
Ａの創造は、生物進化の過程における遺伝情報の創造を
断片的であるにせよ垣間見ることができ、それを再現
し、当然、有用な突然変異体などを産むことに利用でき
る可能性もある。又、例えば、この創造されたＤＮＡの
構成要素の一部に存在すると思われる繰り返し配列ＤＮ
Ａについては、遺伝子の複製、転写、発現等の調節を解
明する効果や、既存の遺伝子よりこの調節部位をスクリ
ーニングするプローブとなりうる効果も含まれる。又、
他には、このｎｔｐ−ＤＮＡを既存の遺伝子の末端に付
加し、これを宿主細胞に挿入することにより、宿主染色
体と高頻度に相同組み換えをおこさせ、当該遺伝子由来
のタンパク質を発現させることができる効果も含まれ
る。本発明は、実施が簡単且つ安価であり、特別な装置
を必要としないことにおいても、将来の遺伝子工学の分
野で大きな役割を担うことが期待できる。
【図１】実施例１で合成された鋳型・プライマー非依存
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
【図２】実施例４のｎｔｐＤＮＡ合成におけるデオキシ
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡ
の合成である。
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡ
の合成である。
【図３】実施例５で示した各種ＤＮＡポリメラーゼによ
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
【図４】実施例６に示した酵素中に混在するＤＮＡやＲ
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のデ・ノボＤＮＡ合成。ライン２
はＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン
４はＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５は
ＲＮａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄIII 。ライン６はＲ
ＮａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄIII 。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄIII 。
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のデ・ノボＤＮＡ合成。ライン２
はＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン
４はＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５は
ＲＮａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄIII 。ライン６はＲ
ＮａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄIII 。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄIII 。
【図５】実施例７に示したデ・ノボ１０ｋｂｐＤＮＡの
合成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ラ
イン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は
通常のｎｔｐＤＮＡである。
合成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ラ
イン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は
通常のｎｔｐＤＮＡである。
【図６】実施例８のｎｔｐＤＮＡ合成の時間的推移を表
わすグラフである。
わすグラフである。
【図７】実施例１０に示したｎｔｐＤＮＡの一本鎖特異
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄIIIである。ライン３はＳ１ヌクレ
アーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン４
はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡであ
る。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ／
ＨｉｎｄIII である。ライン６はマングビーンヌクレア
ーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。ライ
ン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理
していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄIII 、Ｍ１３ｍ
ｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄIIIである。ライン３はＳ１ヌクレ
アーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン４
はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡであ
る。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ／
ＨｉｎｄIII である。ライン６はマングビーンヌクレア
ーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。ライ
ン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ処理
していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄIII 、Ｍ１３ｍ
ｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
【図８】実施例１１のデ・ノボＤＮＡの円二色性スペク
トルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波
線がｎｔｐＤＮＡである。
トルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波
線がｎｔｐＤＮＡである。
【図９】実施例１２のｎｔｐＤＮＡの電子顕微鏡写真で
ある。
ある。
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年４月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】次に、このｎｔｐ−ＤＮＡの分子クローニ
ングを行った。クローニングベクターとしては、ｐＵＣ
１９を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡績社製）により切断し
たものを用いた。挿入ＤＮＡとしては、ｎｔｐ−ＤＮＡ
をＤＮａｓｅＩにより平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ，
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）をもつように切断し、アルカリホ
スファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化し、続い
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）にて
再びリン酸化し、最後にクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片
にて修復したものを用いた。この挿入ＤＮＡを上述のク
ローニングベクターに連結（ライゲーション）し、クロ
ーニングされたプラスミドの確認として、制限酵素によ
る切断を行い、電気泳動により挿入ＤＮＡの有無を確認
した。その結果、目的のＤＮＡ断片が組み込まれたクロ
ーンを選択でき、本発明者らはプラスミドｐＴＬ３４、
ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
ングを行った。クローニングベクターとしては、ｐＵＣ
１９を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡績社製）により切断し
たものを用いた。挿入ＤＮＡとしては、ｎｔｐ−ＤＮＡ
をＤＮａｓｅＩにより平滑末端（ｆｌｕｓｈ ｅｎｄ，
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）をもつように切断し、アルカリホ
スファターゼ（宝酒造社製）により脱リン酸化し、続い
てＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）にて
再びリン酸化し、最後にクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）断片
にて修復したものを用いた。この挿入ＤＮＡを上述のク
ローニングベクターに連結（ライゲーション）し、クロ
ーニングされたプラスミドの確認として、制限酵素によ
る切断を行い、電気泳動により挿入ＤＮＡの有無を確認
した。その結果、目的のＤＮＡ断片が組み込まれたクロ
ーンを選択でき、本発明者らはプラスミドｐＴＬ３４、
ｐＴＬ５７およびｐＴＬ８５と命名した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】次に、このｎｔｐ−ＤＮＡが、例えば、ト
マト染色体ライブラリーから、このＤＮＡの塩基配列と
相同若しくは類似の配列を持つものを検索するプローブ
となりえるか否かを確認するために、例えば、このｎｔ
ｐ−ＤＮＡの５′末端の燐酸残基を［γ−３２Ｐ］ＡＴ
Ｐにて標識して、検索のためのプローブを作成した。標
識プローブとしては、各種蛍光標識ブローブ等を使用す
ることもできる。このプローブを用いてトマト染色体ｃ
ＤＮＡλファージライブラリーからプラークハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングを実施した結果、多
くの陽性信号が検出された。この陽性信号が検出された
プラークよりλファージを単離し、塩基配列を決定した
結果、予想したとおりｎｔｐ−ＤＮＡの配列が含まれて
いることが確認できた。このことよりこのｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、各種ｃＤＮＡライブラリー中に存在する相同若し
くは類似な配列を簡単にスクリーニングできるプローブ
となり得ることが確認できた。
マト染色体ライブラリーから、このＤＮＡの塩基配列と
相同若しくは類似の配列を持つものを検索するプローブ
となりえるか否かを確認するために、例えば、このｎｔ
ｐ−ＤＮＡの５′末端の燐酸残基を［γ−３２Ｐ］ＡＴ
Ｐにて標識して、検索のためのプローブを作成した。標
識プローブとしては、各種蛍光標識ブローブ等を使用す
ることもできる。このプローブを用いてトマト染色体ｃ
ＤＮＡλファージライブラリーからプラークハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングを実施した結果、多
くの陽性信号が検出された。この陽性信号が検出された
プラークよりλファージを単離し、塩基配列を決定した
結果、予想したとおりｎｔｐ−ＤＮＡの配列が含まれて
いることが確認できた。このことよりこのｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、各種ｃＤＮＡライブラリー中に存在する相同若し
くは類似な配列を簡単にスクリーニングできるプローブ
となり得ることが確認できた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】本発明のｎｐｔ−ＤＮＡの合成方法は鋳型
およびプライマーの不存在下、タンパク質の存在下に行
われる。重合反応はデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼによって進行するが、該ポリメラーゼ自体をタンパ
ク質として用いてもよく、ポリメラーゼとは別のタンパ
ク質を用いてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは約６０℃Ｃ
以上、好ましくは約７０℃以上の温度で失活しないもの
が好ましく、その例としてはセルモコッカス・リトラリ
ス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｒｉｓ）
などのセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフ
ィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマ
ス属に属する細菌のデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼが挙げられる。
およびプライマーの不存在下、タンパク質の存在下に行
われる。重合反応はデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼによって進行するが、該ポリメラーゼ自体をタンパ
ク質として用いてもよく、ポリメラーゼとは別のタンパ
ク質を用いてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは約６０℃Ｃ
以上、好ましくは約７０℃以上の温度で失活しないもの
が好ましく、その例としてはセルモコッカス・リトラリ
ス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｒｉｓ）
などのセルモコッカス属、セルマス・アクアティクス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、同セルモフ
ィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などのセルマ
ス属に属する細菌のデオキシリボヌクレオチドポリメラ
ーゼが挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】かくして得られるｎｔｐ−ＤＮＡ生成物は
二本鎖ＤＮＡであり、その塩基組成は、その一例（実施
例１２）によればデオキシアデニン（ｄＡ）３４．４
％、デオキシシチジン（ｄＣ）１５．６％、デオキシグ
アニン（ｄＧ）１７．４％、デオキシチミジン３２．６
％で、ｄＧとｄＣの合計は３３％である。また一例（実
施例１４）におけるＤＮＡの塩基配列において、ｄＴｄ
Ａ、ｄＴｄＣ、ｄＡｄＧ、ｄＡｄＴ、ｄＣｄＴの配列の
頻度が高い（実施例１３、表２）。
二本鎖ＤＮＡであり、その塩基組成は、その一例（実施
例１２）によればデオキシアデニン（ｄＡ）３４．４
％、デオキシシチジン（ｄＣ）１５．６％、デオキシグ
アニン（ｄＧ）１７．４％、デオキシチミジン３２．６
％で、ｄＧとｄＣの合計は３３％である。また一例（実
施例１４）におけるＤＮＡの塩基配列において、ｄＴｄ
Ａ、ｄＴｄＣ、ｄＡｄＧ、ｄＡｄＴ、ｄＣｄＴの配列の
頻度が高い（実施例１３、表２）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】実施例５ ｎｔｐ−ＤＮＡ合成反応における酵素中に混在している
かもしれないＤＮＡやＲＮＡの存在有無の確認 緩衝液Ａ、１μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａ
ｓｅＡ ワシントン社製）か又は１．２５μｇ／ｍｌ
デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ、ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカル社製）、２０単位／
ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
を含有する９２μｌの反応液に等量のミネラルオイルを
加え、３７℃で２時間反応させる。つづいて、２．５ｍ
Ｍのデオキシリボヌクレオチド８μｌ［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］を加えて、７４℃で３時間反応させる。その後、
反応液２０μｌに５００ｍＭ ＥＤＴＡを１μｌ加え、
これを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに
適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウム
にて染色し写真撮影した。又別に、各ヌクレアーゼの陽
性反応を見るために対象実験として、緩衝液Ａ，１μｇ
／ｍｌ ＲＮａｓｅＡか又は１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮ
ａｓｅＩ、０．３ｍｇ／ｍｌ 転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、
シグマ社製）か又は３０μｇ／ｍｌ ＨｉｎｄＩＩＩ切
断λＤＮＡ（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ）東洋紡績社製）を含
有する９２μｌの反応液を調整し、上記と同様の反応及
び電気泳動を行う。その結果、図４に示すように、ＲＮ
ａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩは、当該緩衝液中で確かにそ
れぞれＲＮＡ及びＤＮＡ（同順）を切断できることが確
認された。よって、反応液をＲＮａｓｅＡ及びＤＮａｓ
ｅＩで処理し、混在するかもしれないＲＮＡやＤＮＡを
分解したものについても鋳型・プライマー非依存的合成
は起こることから、この反応にはＲＮＡやＤＮＡプライ
マーが確かに不要なことが確認された。
かもしれないＤＮＡやＲＮＡの存在有無の確認 緩衝液Ａ、１μｇ／ｍｌ リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａ
ｓｅＡ ワシントン社製）か又は１．２５μｇ／ｍｌ
デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ、ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカル社製）、２０単位／
ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ
を含有する９２μｌの反応液に等量のミネラルオイルを
加え、３７℃で２時間反応させる。つづいて、２．５ｍ
Ｍのデオキシリボヌクレオチド８μｌ［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］を加えて、７４℃で３時間反応させる。その後、
反応液２０μｌに５００ｍＭ ＥＤＴＡを１μｌ加え、
これを１％アガロース、トリス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに
適用し、電気泳動後０．５μｇ／ｍｌ 臭化エチジウム
にて染色し写真撮影した。又別に、各ヌクレアーゼの陽
性反応を見るために対象実験として、緩衝液Ａ，１μｇ
／ｍｌ ＲＮａｓｅＡか又は１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮ
ａｓｅＩ、０．３ｍｇ／ｍｌ 転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、
シグマ社製）か又は３０μｇ／ｍｌ ＨｉｎｄＩＩＩ切
断λＤＮＡ（λ／ＨｉｎｄＩＩＩ）東洋紡績社製）を含
有する９２μｌの反応液を調整し、上記と同様の反応及
び電気泳動を行う。その結果、図４に示すように、ＲＮ
ａｓｅＡ及びＤＮａｓｅＩは、当該緩衝液中で確かにそ
れぞれＲＮＡ及びＤＮＡ（同順）を切断できることが確
認された。よって、反応液をＲＮａｓｅＡ及びＤＮａｓ
ｅＩで処理し、混在するかもしれないＲＮＡやＤＮＡを
分解したものについても鋳型・プライマー非依存的合成
は起こることから、この反応にはＲＮＡやＤＮＡプライ
マーが確かに不要なことが確認された。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】実施例６ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼによる
１０ｋｂｐ ｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ、１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、デオキ
シリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位
／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３０分間反応させる。続いて、７４
℃で３時間反応後、この２０μｌを１％アガロース、ト
リス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５
μｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。
その結果、図５に示すように、１０ｋｂｐ付近に濃いバ
ンドが出現した。この結果より、生成されるＤＮＡの長
さを、反応条件次第で任意に変化させることが可能なこ
とが確認された。
１０ｋｂｐ ｎｔｐ−ＤＮＡの合成 緩衝液Ａ、１．２５μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、デオキ
シリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０単位
／ｍｌ セルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラー
ゼを含有する１００μｌの反応液に等量のミネラルオイ
ルを加え、３７℃で３０分間反応させる。続いて、７４
℃で３時間反応後、この２０μｌを１％アガロース、ト
リス／酢酸／ＥＤＴＡゲルに適用し、電気泳動後０．５
μｇ／ｍｌ 臭化エチジウムにて染色し写真撮影した。
その結果、図５に示すように、１０ｋｂｐ付近に濃いバ
ンドが出現した。この結果より、生成されるＤＮＡの長
さを、反応条件次第で任意に変化させることが可能なこ
とが確認された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】実施例８ ｎｔｐ−ＤＮＡ合成産物の精製 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する４７５ｍｌの反応液に等
量のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させ
る。次に、反応液にミネラルオイルと等量のクロロホル
ムを加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、上層溶液を
別の容器に移す。この操作により、反応液よりミネラル
オイルを取り除いた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム液を０．
１倍量とエタノールを２．５倍量を加え、−８５℃で２
時間保存する。これを遠心分離してＤＮＡを回収し、５
ｍｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解する。この粗精製ＤＮ
Ａ溶液を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠
心法［サムロックら、モレキュラー・クローニング（ア
・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、１９８９年発行］にて精製した。その結
果、９．５ｍｇのｎｔｐ−ＤＮＡが得られた。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する４７５ｍｌの反応液に等
量のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させ
る。次に、反応液にミネラルオイルと等量のクロロホル
ムを加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、上層溶液を
別の容器に移す。この操作により、反応液よりミネラル
オイルを取り除いた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム液を０．
１倍量とエタノールを２．５倍量を加え、−８５℃で２
時間保存する。これを遠心分離してＤＮＡを回収し、５
ｍｌのＴＥ緩衝液［１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解する。この粗精製ＤＮ
Ａ溶液を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠
心法［サムロックら、モレキュラー・クローニング（ア
・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ））、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス、１９８９年発行］にて精製した。その結
果、９．５ｍｇのｎｔｐ−ＤＮＡが得られた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】実施例１０ ｎｔｐ−ＤＮＡの円二色性によるＤＮＡ二重らせん構造
の解析 実施例８にて調整した鋳型・プライマー非依存的合成Ｄ
ＮＡ７００μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］０．５ｍｌに溶
解し、円二色性分散計 Ｊ−５００Ａ（日本分光株式会
社）を用いて、室温にて円二色性スペクトルを測定し
た。この測定の結果、図８の実線で示したｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、破線で示した典型的な二本鎖Ｂ形ＤＮＡの代表と
なる直線状ｐＰＴｌプラスミドＤＮＡの円二色性スペク
トルとほとんど類似したスペクトルを示した。つまり、
このことは、このＤＮＡ単位濃度あたり、同じ「密度」
の右巻き螺旋が存在することを示唆し、よって、このｎ
ｔｐ−ＤＮＡは、二本鎖Ｂ形ＤＮＡであると結論した。
の解析 実施例８にて調整した鋳型・プライマー非依存的合成Ｄ
ＮＡ７００μｇをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］０．５ｍｌに溶
解し、円二色性分散計 Ｊ−５００Ａ（日本分光株式会
社）を用いて、室温にて円二色性スペクトルを測定し
た。この測定の結果、図８の実線で示したｎｔｐ−ＤＮ
Ａは、破線で示した典型的な二本鎖Ｂ形ＤＮＡの代表と
なる直線状ｐＰＴｌプラスミドＤＮＡの円二色性スペク
トルとほとんど類似したスペクトルを示した。つまり、
このことは、このＤＮＡ単位濃度あたり、同じ「密度」
の右巻き螺旋が存在することを示唆し、よって、このｎ
ｔｐ−ＤＮＡは、二本鎖Ｂ形ＤＮＡであると結論した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】実施例１３ ｎｔｐ−ＤＮＡの隣接塩基頻度分析 緩衝液Ａ、デオキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、［α−３２Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ （全
て最終濃度１００ｎＭ）３．３×１０６Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させる。
その後、反応停止のために最終濃度２０ｍＭ ＥＤＴＡ
を加える。これに、フェノール：クロロホルム（１：
１）を加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、この上層
溶液４０μｌを２４ｍｌのスーパーロース１２ゲル濾過
カラム（ファルマシア社製）に供し、ＴＥ緩衝液にて溶
出させた。これに、５５０μｇ／ｍｌ 仔牛胸線ＤＮＡ
を３μｌ加え、３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を０．１倍
量、エタノールを２．５倍量加え、混合後、−８５℃で
一晩放置する。２１６００×ｇ、４０分、４℃にて遠心
後、沈殿を７０％エタノールにて洗浄し乾燥後ＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解する。このサンプルに、緩衝液ＭＰ
［２０ｍＭ コハク酸／ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１０
ｍＭ ＣａＣｌ２、１９単位／ｍｌ ミクロコッカスヌ
クレアーゼ、０．５単位／ｍｌ 膵臓ホスホジエステラ
ーゼ（全て最終濃度）］を含む反応液８４０μｌを３７
℃で３時間反応させる。その後この全量を、４ｍｌのコ
スモシル５Ｃ１８（ナカライテスク社製）カラムに供
し、５０ｍＭ 蟻酸カルシウムにて溶出させ、デオキシ
アデノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デオキシシチジ
ン−３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグアノシン−
３′−一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン−３′−一
燐酸（ｄＴｐ）の各ピークを回収する。この溶液の容積
を１．５ｍｌに合わせ、その各２００μｌをレディーキ
ャップ（ベックマン社製）に移し、乾燥後、３２Ｐの放
射能を液体シンチレーションカウンターにて測定した。
その結果、表２に示すように、塩基配列に偏りが存在し
た。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μ
Ｍ）］、［α−３２Ｐ］標識デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ （全
て最終濃度１００ｎＭ）３．３×１０６Ｂｑ／ｐｍｏ
ｌ）］、２０単位／ｍｌ セルモコッカス・リトラリス
ＤＮＡポリメラーゼを含有する５０μｌの反応液に等量
のミネラルオイルを加え、７４℃で３時間反応させる。
その後、反応停止のために最終濃度２０ｍＭ ＥＤＴＡ
を加える。これに、フェノール：クロロホルム（１：
１）を加え、１７７００×ｇ、２分間遠心し、この上層
溶液４０μｌを２４ｍｌのスーパーロース１２ゲル濾過
カラム（ファルマシア社製）に供し、ＴＥ緩衝液にて溶
出させた。これに、５５０μｇ／ｍｌ 仔牛胸線ＤＮＡ
を３μｌ加え、３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を０．１倍
量、エタノールを２．５倍量加え、混合後、−８５℃で
一晩放置する。２１６００×ｇ、４０分、４℃にて遠心
後、沈殿を７０％エタノールにて洗浄し乾燥後ＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解する。このサンプルに、緩衝液ＭＰ
［２０ｍＭ コハク酸／ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１０
ｍＭ ＣａＣｌ２、１９単位／ｍｌ ミクロコッカスヌ
クレアーゼ、０．５単位／ｍｌ 膵臓ホスホジエステラ
ーゼ（全て最終濃度）］を含む反応液８４０μｌを３７
℃で３時間反応させる。その後この全量を、４ｍｌのコ
スモシル５Ｃ１８（ナカライテスク社製）カラムに供
し、５０ｍＭ 蟻酸カルシウムにて溶出させ、デオキシ
アデノシン−３′−一燐酸（ｄＡｐ）、デオキシシチジ
ン−３′−一燐酸（ｄＣｐ）、デオキシグアノシン−
３′−一燐酸（ｄＧｐ）、デオキシチミジン−３′−一
燐酸（ｄＴｐ）の各ピークを回収する。この溶液の容積
を１．５ｍｌに合わせ、その各２００μｌをレディーキ
ャップ（ベックマン社製）に移し、乾燥後、３２Ｐの放
射能を液体シンチレーションカウンターにて測定した。
その結果、表２に示すように、塩基配列に偏りが存在し
た。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】実施例１４ 鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡのクローニング 緩衝液Ｄ［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）］、４００μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ、０．０８単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含む０．５
ｍｌの反応液を１５℃で２０分間反応させる。その後、
反応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２
０μｌ加え、つづいて等量のフェノール：クロロホルム
（１：１）を加え混合する。９６００×ｇ、５分間遠心
し、上層を別の容器に移す。（以上フェノール処理と略
す。）この上層に等量のクロロホルムを加え混合後、上
述の遠心分離をおこない上層を別の容器に移す。この上
層を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法
にて精製し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］４０μｌに
溶かす（ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述
のＤＮＡの脱燐酸化をおこなった。脱燐酸化緩衝液［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２］、６０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１００単位／ｍｌ アルカリフォスファターゼ
（寶酒造社製）を含む１００μｌの反応液を６５℃、１
時間反応させる。フェノール処理をおこない、反応液に
０．１倍量の３Ｍ酸酸ナトリウム液を加え混合後２．５
倍量のエタノールを加える。−２０℃で一晩放置し、２
１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心をおこなう（以下
エタノール沈殿と略す）。沈殿を７０％エタノールにて
洗浄し、乾燥後、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（脱燐
酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述のＤ
ＮＡのリン酸化をおこなった。リン酸化緩衝液［５０ｍ
Ｍ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％ポリエチレングリ
コール＃８０００、１５０μＭ ＡＴＰ、１２０μｇ／
ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１．５単
位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社
製）を含む反応液４０μｌを３７℃、１時間反応させ
る。つづいてフェノール処理とエタノール沈殿にてＤＮ
Ａを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（燐酸化ｎ
ｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。燐酸化ｎｔｐ−
ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの所々が一本
鎖となっているギャップ構造が存在する可能性があるの
で、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこなった。修復
緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリボヌクレオ
チド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ
（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍｌ燐酸化
ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／ｍｌ ク
レノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液を
２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡをフェノ
ール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩衝液１０
μｌに溶解する（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩと
する）。上述のＤＮＡのリン酸化をおこなつた。リン酸
化緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣＩ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％
ポリエチレングリコール＃８０００、１５０μＭ ＡＴ
Ｐ、１２０μｇ／ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１．５単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（束洋紡績社製）を含む反応液４０μｌを３７℃、
１時間反応させる。つづいてフェノール処理とエタノー
ル沈殿にてＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解
する（燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。
燐酸ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡ
の所々が一本鎖となつているギャップ構造が存在する可
能性があるので、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこ
なった。修復緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ジチオ
スレイトール、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリ
ボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び
ｄＴＴＰ（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０ｐｇ／ｍ
ｌ燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／
ｍｌ クレノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの
反応液を２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡ
をフェノール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩
衝液１０μｌに溶解する。（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮ
ａｓｅＩとする。）
１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）］、４００μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−Ｄ
ＮＡ、０．０８単位／ｍｌ ＤＮａｓｅＩを含む０．５
ｍｌの反応液を１５℃で２０分間反応させる。その後、
反応を停止させるために５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を２
０μｌ加え、つづいて等量のフェノール：クロロホルム
（１：１）を加え混合する。９６００×ｇ、５分間遠心
し、上層を別の容器に移す。（以上フェノール処理と略
す。）この上層に等量のクロロホルムを加え混合後、上
述の遠心分離をおこない上層を別の容器に移す。この上
層を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法
にて精製し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］４０μｌに
溶かす（ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述
のＤＮＡの脱燐酸化をおこなった。脱燐酸化緩衝液［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２］、６０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１００単位／ｍｌ アルカリフォスファターゼ
（寶酒造社製）を含む１００μｌの反応液を６５℃、１
時間反応させる。フェノール処理をおこない、反応液に
０．１倍量の３Ｍ酸酸ナトリウム液を加え混合後２．５
倍量のエタノールを加える。−２０℃で一晩放置し、２
１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心をおこなう（以下
エタノール沈殿と略す）。沈殿を７０％エタノールにて
洗浄し、乾燥後、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（脱燐
酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。上述のＤ
ＮＡのリン酸化をおこなった。リン酸化緩衝液［５０ｍ
Ｍ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％ポリエチレングリ
コール＃８０００、１５０μＭ ＡＴＰ、１２０μｇ／
ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１．５単
位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社
製）を含む反応液４０μｌを３７℃、１時間反応させ
る。つづいてフェノール処理とエタノール沈殿にてＤＮ
Ａを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解する（燐酸化ｎ
ｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。燐酸化ｎｔｐ−
ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡの所々が一本
鎖となっているギャップ構造が存在する可能性があるの
で、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこなった。修復
緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ジチオスレイトー
ル、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリボヌクレオ
チド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ
（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０μｇ／ｍｌ燐酸化
ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／ｍｌ ク
レノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの反応液を
２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡをフェノ
ール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩衝液１０
μｌに溶解する（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩと
する）。上述のＤＮＡのリン酸化をおこなつた。リン酸
化緩衝液［５０ｍＭ イミダゾール／ＨＣＩ（ｐＨ６．
４）、１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ］、６％
ポリエチレングリコール＃８０００、１５０μＭ ＡＴ
Ｐ、１２０μｇ／ｍｌ脱燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａ
ｓｅＩ、１．５単位／μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（束洋紡績社製）を含む反応液４０μｌを３７℃、
１時間反応させる。つづいてフェノール処理とエタノー
ル沈殿にてＤＮＡを精製し、ＴＥ緩衝液１０μｌに溶解
する（燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩとする）。
燐酸ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩには、二本鎖ＤＮＡ
の所々が一本鎖となつているギャップ構造が存在する可
能性があるので、ＤＮＡポリメラーゼによる修復をおこ
なった。修復緩衝液［５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ジチオ
スレイトール、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、デオキシリ
ボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び
ｄＴＴＰ（全て最終濃度２５μＭ）］、１２０ｐｇ／ｍ
ｌ燐酸化ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮａｓｅＩ、１６６単位／
ｍｌ クレノウ断片（東洋紡績社製）を含む５０μｌの
反応液を２５℃、１５分間反応させる。つづいてＤＮＡ
をフェノール処理をエタノール沈殿にて精製し、ＴＥ緩
衝液１０μｌに溶解する。（修復ｎｔｐ−ＤＮＡ／ＤＮ
ａｓｅＩとする。）
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】実施例１６ ｎｔｐ−ＤＮＡをプローブとして用いた繰り返し配列の
スクリーニング ２０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡに、交換緩衝液［５０
ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ジスレイトール、０．１ｍＭ
スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ］と０．１
ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μＭ［γ−３２Ｐ］
ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、４．８％ポリエチ
レングリコール８０００、４００単位／ｍｌ Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃、３０分間培養
し、最終２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを加え、反応を停
止させる。フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収し、これをハイブリダイゼーションプローブとす
る。次に繰り返し配列のスクリーニングとして、プラー
クハイブリダイゼーションを行った。まず大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ｒ−）を
２０％マルトース添加ＮＺＣＹＭ培地［１％カゼイン
（酵素水解物）、０．５％ＮａＣｌ、０．５％イースト
エキストラクト、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０］５０ｍｌに接種し、３７
℃、５時間培養する。４０００×ｇ１０分間遠心分離に
より集菌し、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ４に懸濁する。これ
を菌懸濁液とし、適当にＳＭ［０．５８％ＮａＣｌ、
０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］にて希釈し
たトマトｃＤＮＡライブラリーλファージ液（クローン
テック社ＣＬＦＬ１０８３ｂ）と混合し、３７℃、２０
分間培養する。これをＮＺＣＹＭ低寒天培地に加え、そ
の後ＮＺＣＹＭ寒天培地に重層し、３７℃一晩培養す
る。この培養プレートの寒天上にニトロセルロースフィ
ルター（ミリポア社製）を１分間置き、静かに剥がし室
温で２０分間乾燥させた。その後、変性液（０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙（ワット
マン３ＭＭ、ワットマン社製）上に５分間置き、つぎに
中和液［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸３ナトリ
ウム２水和物（２０×ＳＳＣ）、２Ｍ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）］に浸した３ＭＭろ紙上に５分間置く。
フィルターを中和液中に１分間、２×ＳＳＣ中に５分間
浸した後、３ＭＭろ紙上で乾燥させる。フィルターを３
ＭＭろ紙間に挟み、バキューム・オーブンにて８０℃２
時間吸引乾燥させる。つぎにハイブリダイゼーション液
［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、
０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール４
００、０．２％仔牛血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド］に乾燥後
のフィルターを十分湿らし、つづいてハイブリダイゼー
ション液を５０ｍｌ加え、密封し４２℃一晩放置する。
その後、ハイブリダイゼーション液を抜き取り、１００
℃、５分間加熱後氷冷したハイブリダイゼーションプロ
ーブを加えたハイブリダイゼーション液を１０ｍｌ加
え、再び密封し４２℃一晩培養する。その後、フィルタ
ーを洗浄液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に１時間
浸し、つづいて洗浄液２（０．５×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ）に浸し５０℃で２時間洗浄する。このフィルター
を３ＭＭろ紙上で乾燥後、オートラジオグラフィーにて
陽性プラークの確認を行う。その結果、陽性プラークが
確認され、よって鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡ
が例えば、ミクロサテライトＤＮＡのスクリーニングに
おいて、プローブとなりえることが確認された。この陽
性プラークをパスツールピペットをもちいて１ｍｌのＳ
Ｍに移しクロロホルムを１滴添加して室温１時間放置す
る。これを適当にＳＭにて希釈し、１００μｌの菌懸濁
液と共に５００ｍｌのＮＺＣＹＭ培地に添加し３７℃、
一晩培養する。これにクロロホルム１０μｌを加えて、
７８７０×ｇ、１０分間遠心分離により集菌し、上清を
回収する。この上清に緩衝液Ｌ１（２０ｍｇ／ｍｌ Ｒ
ＮａｓｅＡ、６ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、０．２ｍｇ
／ｍｌ 仔牛血清アルブミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１
００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．５）を３０μｌ加えて、３７℃、３０分間培養す
る。続いて、氷冷緩衝液Ｌ２（３０％ポリエチレングリ
コール６０００、３Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌを加えて、氷
中１時間放置する。その後１７７００×ｇ、１５分間、
４℃にて遠心分離し、沈殿を回収する。この沈殿を緩衝
液Ｌ３（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１ｍｌに懸
濁し、続いて溶液Ｌ４（４％ＳＤＳ）を１ｍｌ加え、７
０℃、１０分間培養する。氷中で冷却後溶液Ｌ５（２．
２５Ｍ 酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ４．８）１ｍｌを添
加し混合後２１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心分離
し、上清を回収する。予め、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、
ｐＨ７．０、０．１５％トリトンＸ−１００）にて平衡
化したＱＩＡＧＥＮ ＴＩＰ−２０カラム（キアゲン社
製）に上記回収上清を加え、カラムクロマトグラフィー
する。その後緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０）２ｍｌにて
カラムを洗浄し、緩衝液ＱＦ（１．２５Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１５％エタノール、ｐＨ
８．５）１．５ｍｌにてＤＮＡを溶出させる。これにイ
ソプロパノールを０．８倍量添加し、−２０℃、２０分
間放置し、２１６００×ｇ、３０分間、４℃の遠心によ
りＤＮＡを回収する。このＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルにて洗浄後乾燥させ、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌ
に溶かす。本発明者らはこのλファージＤＮＡをλＴＬ
２ＤＮＡと命名した。次にこのλＴＬ２ＤＮＡの塩基配
列決定を行った。方法は前述のジデオキシターミネータ
ー法を用いた。またプライマーとしては市販のλｇｔ１
１プライマーを用いた。その結果、ｎｔｐ−ＤＮＡ由来
の繰り返し配列が存在した。よって、このｎｔｐ−ＤＮ
Ａがこの繰り返し配列をスクリーニングするためのプロ
ーブとなりえることが確認された。
スクリーニング ２０μｇ／ｍｌ ｎｔｐ−ＤＮＡに、交換緩衝液［５０
ｍＭ イミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ６．４）、１８ｍＭ
ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ジスレイトール、０．１ｍＭ
スペルミジンＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ］と０．１
ｍＭ ＡＤＰ、１ｎＭ ＡＴＰ、１μＭ［γ−３２Ｐ］
ＡＴＰ（１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）、４．８％ポリエチ
レングリコール８０００、４００単位／ｍｌ Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃、３０分間培養
し、最終２０ｍＭとなるようＥＤＴＡを加え、反応を停
止させる。フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡ
を回収し、これをハイブリダイゼーションプローブとす
る。次に繰り返し配列のスクリーニングとして、プラー
クハイブリダイゼーションを行った。まず大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｙ１０９０（ｒ−）を
２０％マルトース添加ＮＺＣＹＭ培地［１％カゼイン
（酵素水解物）、０．５％ＮａＣｌ、０．５％イースト
エキストラクト、０．１％カザミノ酸、０．２％ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．０］５０ｍｌに接種し、３７
℃、５時間培養する。４０００×ｇ１０分間遠心分離に
より集菌し、０．０１Ｍ ＭｇＳＯ４に懸濁する。これ
を菌懸濁液とし、適当にＳＭ［０．５８％ＮａＣｌ、
０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ゼラチン］にて希釈し
たトマトｃＤＮＡライブラリーλファージ液（クローン
テック社ＣＬＦＬ１０８３ｂ）と混合し、３７℃、２０
分間培養する。これをＮＺＣＹＭ低寒天培地に加え、そ
の後ＮＺＣＹＭ寒天培地に重層し、３７℃一晩培養す
る。この培養プレートの寒天上にニトロセルロースフィ
ルター（ミリポア社製）を１分間置き、静かに剥がし室
温で２０分間乾燥させた。その後、変性液（０．２Ｎ
ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸したろ紙（ワット
マン３ＭＭ、ワットマン社製）上に５分間置き、つぎに
中和液［３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸３ナトリ
ウム２水和物（２０×ＳＳＣ）、２Ｍ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）］に浸した３ＭＭろ紙上に５分間置く。
フィルターを中和液中に１分間、２×ＳＳＣ中に５分間
浸した後、３ＭＭろ紙上で乾燥させる。フィルターを３
ＭＭろ紙間に挟み、バキューム・オーブンにて８０℃２
時間吸引乾燥させる。つぎにハイブリダイゼーション液
［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、
０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール４
００、０．２％仔牛血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌ
変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド］に乾燥後
のフィルターを十分湿らし、つづいてハイブリダイゼー
ション液を５０ｍｌ加え、密封し４２℃一晩放置する。
その後、ハイブリダイゼーション液を抜き取り、１００
℃、５分間加熱後氷冷したハイブリダイゼーションプロ
ーブを加えたハイブリダイゼーション液を１０ｍｌ加
え、再び密封し４２℃一晩培養する。その後、フィルタ
ーを洗浄液１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）に１時間
浸し、つづいて洗浄液２（０．５×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ）に浸し５０℃で２時間洗浄する。このフィルター
を３ＭＭろ紙上で乾燥後、オートラジオグラフィーにて
陽性プラークの確認を行う。その結果、陽性プラークが
確認され、よって鋳型・プライマー非依存的合成ＤＮＡ
が例えば、ミクロサテライトＤＮＡのスクリーニングに
おいて、プローブとなりえることが確認された。この陽
性プラークをパスツールピペットをもちいて１ｍｌのＳ
Ｍに移しクロロホルムを１滴添加して室温１時間放置す
る。これを適当にＳＭにて希釈し、１００μｌの菌懸濁
液と共に５００ｍｌのＮＺＣＹＭ培地に添加し３７℃、
一晩培養する。これにクロロホルム１０μｌを加えて、
７８７０×ｇ、１０分間遠心分離により集菌し、上清を
回収する。この上清に緩衝液Ｌ１（２０ｍｇ／ｍｌ Ｒ
ＮａｓｅＡ、６ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、０．２ｍｇ
／ｍｌ 仔牛血清アルブミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１
００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．５）を３０μｌ加えて、３７℃、３０分間培養す
る。続いて、氷冷緩衝液Ｌ２（３０％ポリエチレングリ
コール６０００、３Ｍ ＮａＣｌ）２ｍｌを加えて、氷
中１時間放置する。その後１７７００×ｇ、１５分間、
４℃にて遠心分離し、沈殿を回収する。この沈殿を緩衝
液Ｌ３（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）１ｍｌに懸
濁し、続いて溶液Ｌ４（４％ＳＤＳ）を１ｍｌ加え、７
０℃、１０分間培養する。氷中で冷却後溶液Ｌ５（２．
２５Ｍ 酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ４．８）１ｍｌを添
加し混合後２１６００×ｇ、３０分、４℃にて遠心分離
し、上清を回収する。予め、緩衝液ＱＢＴ（７５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１５％エタノール、
ｐＨ７．０、０．１５％トリトンＸ−１００）にて平衡
化したＱＩＡＧＥＮ ＴＩＰ−２０カラム（キアゲン社
製）に上記回収上清を加え、カラムクロマトグラフィー
する。その後緩衝液ＱＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
ＭＯＰＳ、１５％エタノール、ｐＨ７．０）２ｍｌにて
カラムを洗浄し、緩衝液ＱＦ（１．２５Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、１５％エタノール、ｐＨ
８．５）１．５ｍｌにてＤＮＡを溶出させる。これにイ
ソプロパノールを０．８倍量添加し、−２０℃、２０分
間放置し、２１６００×ｇ、３０分間、４℃の遠心によ
りＤＮＡを回収する。このＤＮＡ沈殿を７０％エタノー
ルにて洗浄後乾燥させ、ＴＥ緩衝液［１０ｍＭ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］１０μｌ
に溶かす。本発明者らはこのλファージＤＮＡをλＴＬ
２ＤＮＡと命名した。次にこのλＴＬ２ＤＮＡの塩基配
列決定を行った。方法は前述のジデオキシターミネータ
ー法を用いた。またプライマーとしては市販のλｇｔ１
１プライマーを用いた。その結果、ｎｔｐ−ＤＮＡ由来
の繰り返し配列が存在した。よって、このｎｔｐ−ＤＮ
Ａがこの繰り返し配列をスクリーニングするためのプロ
ーブとなりえることが確認された。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４５】実施例１７ ｎｔｐ−ＤＮＡによる高頻度組み換え法 プラスミドｐＣＨ１１０ ２５μｇに、緩衝液ＢＭ［５
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジスレイトー
ル］、２０００単位／ｍｌ ＢａｍＨＩ（東洋紡績社
製）を加え、全量１００μｌとした反応液を３７℃で２
時間反応させる。その後、フェノール処理、エタノール
沈殿にてＤＮＡを回収する。これをＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］２５μｌに溶解する。このＤＮＡ溶液２５μｌに、
ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．００１％ゼラチン］、デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て
最終濃度２００μＭ）］、１ｎＭ Ｇ１プライマー、１
ｎＭ Ｇ２プライマー、２５単位／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２．５ｍｌの反応
液を準備する。この上層に等量のミネラルオイル（シグ
マ社製）を加え、９５℃で１分間、５０℃で２分間、７
２℃で３分間の温度サイクルを合計３０回繰り返す。そ
の後、等量のクロロホルムにてミネラルオイルを取り除
き、フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解する。この粗精製ＤＮＡ
溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配遠心法にて精製した。その結果、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の上流にパン酵母のＧＡＬ１プロモーター配列
と下流にパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣｌターミネ
ーター配列を含むＤＮＡが２０μｇ得られた。このＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、その全量に緩衝液Ａ
［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、
２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、０．１％Ｘ−１００（全て最終濃度）］、デ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０
単位／ｍｌセルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼを加え２ｍｌとした反応液を、７４℃で３時間反応
させる。その後、フェノール処理、エタノール沈殿にて
ＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。この
粗精製ＤＮＡ溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウ
ム平衡密度勾配遠心法にて精製し、ＴＥ緩衝液２０μｌ
に溶解した。２０ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエキ
ストラクト、２％ペプトン、２％ブドウ糖）にパン酵母
を接種し、３０℃で一晩培養する。次に、この培養液の
２ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地へ移し、再び３０℃で
一晩培養する。この培養液を４００×ｇ、５分間遠心
し、酵母細胞を集める。この沈殿に２０ｍｌのＳＥＤ溶
液（１Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ ジスレイトール）を加え、懸濁し、３０℃で１０分
間培養する。再び同様の遠心にて酵母細胞を集め、２０
ｍｌの１Ｍ ソルビトールに懸濁する。再度遠心して酵
母細胞を集め、２０ｍｌのＳＣＥ溶液［１Ｍ ソルビト
ール、１００ｍＭ クエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁する。これに、０．
２ｍｌのグルスラーゼを添加し、３０℃で１時間培養す
る。この溶液を、３００×ｇ、５分間遠心し、酵母スフ
ェロプラスト細胞を集める。この沈殿を、２０ｍｌの１
Ｍ ソルビトールにて２回洗浄し、最後に２０ｍｌのＳ
ＴＣ溶液［１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］にて
洗浄する。沈殿をＳＴＣ溶液１ｍｌに懸濁し、１００μ
ｌづつ分ける。これに、上記ＤＮＡ溶液を５μｌ加え、
室温１０分間放置する。続いて、ＰＥＧ溶液［２０％ポ
リエチレングリコール３３００、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を１
ｍｌ加え、室温で１０分間放置する。３００×ｇ、５分
間遠心後、沈殿を１５０μｌのＳＯＳ培地（２Ｍ ソル
ビトールを１０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ２を０．１ｍｌ、
ＹＰＤ培地を６．７ｍｌ、１％ロイシン溶液を２７μ
ｌ、蒸留水を３．１７ｍｌ）に懸濁する。これを、３０
℃で２０分間培養し、予め４５℃で融解しておいた６ｍ
ｌのＳＹＧ寒天培地［１８．２％ソルビトール、２％寒
天、０．６７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸無
し）、２％ぶどう糖、０．００１％アデニン、０．００
４％ウラシル］に加え、ＳＹＧ寒天平板培地に重層し、
３０℃で３日間培養する。培養平板培地より、コロニー
を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で一晩培養す
る。４００×ｇ、５分間遠心し、沈殿を２５０μｌのＢ
Ｋ緩衝液［１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ジスレイトール、２０％グリセリン］に
懸濁する。これに、ＰＭＳＦ溶液（４０ｍＭ フッ化フ
ェニルメチルスルホニル）を１２．５μｌ加え、強く撹
拌する。再びＢＫ緩衝液を２５０μｌ加え、よく撹拌す
る。１７７００×ｇ、１５分間遠心し、上清を別の容器
に移す。この上清５０μｌに、ＢＫ緩衝液５０μｌとＺ
緩衝液（１．６１％Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５
５％ＮａＨ２ＰＯ４、０．０７５％ＫＣｌ、０．０２４
６％ＭｇＳＯ４、０．２７％β−メルカプトフェノー
ル）０．９ｍｌを加え、２８℃で５分間培養する。その
後、ＯＮＰＧ溶液（４ｍｇ／ｍｌ ο−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．２ｍＬ加えるこ
とにより反応を開始させ、２８℃で培養する。３０分後
に１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３溶液を０．５ｍｌ加え、反応を停
止させる。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定する。
又、タンパク質の量をブラットフォード色素結合法［ブ
ラットフォード、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第７２巻、第２４８
〜２５４頁（１９７６）］にて定量した。この吸光度及
びタンパク質の量より菌抽出液中のβ−ガラクシダーゼ
比活性を計算した。その結果、２０検体のうち４検体に
ついて、β−ガラクシダーゼ活性が確認できた（表
６）。このことは、β−ガラクシダーゼ遺伝子が末端に
付加されたｎｔｐ−ＤＮＡを介して酵母染色体中に導入
されたことを証明する結果となった。よって、ｎｔｐ−
ＤＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる活性が存在
することが確認された。
０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジスレイトー
ル］、２０００単位／ｍｌ ＢａｍＨＩ（東洋紡績社
製）を加え、全量１００μｌとした反応液を３７℃で２
時間反応させる。その後、フェノール処理、エタノール
沈殿にてＤＮＡを回収する。これをＴＥ緩衝液［１０ｍ
Ｍ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ］２５μｌに溶解する。このＤＮＡ溶液２５μｌに、
ＰＣＲ緩衝液［１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．００１％ゼラチン］、デオキシリボヌクレオチド
［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（全て
最終濃度２００μＭ）］、１ｎＭ Ｇ１プライマー、１
ｎＭ Ｇ２プライマー、２５単位／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２．５ｍｌの反応
液を準備する。この上層に等量のミネラルオイル（シグ
マ社製）を加え、９５℃で１分間、５０℃で２分間、７
２℃で３分間の温度サイクルを合計３０回繰り返す。そ
の後、等量のクロロホルムにてミネラルオイルを取り除
き、フェノール処理、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収
し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解する。この粗精製ＤＮＡ
溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配遠心法にて精製した。その結果、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の上流にパン酵母のＧＡＬ１プロモーター配列
と下流にパン酵母の転写終了シグナルＣＹＣｌターミネ
ーター配列を含むＤＮＡが２０μｇ得られた。このＤＮ
ＡをＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、その全量に緩衝液Ａ
［１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、
２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、０．１％Ｘ−１００（全て最終濃度）］、デ
オキシリボヌクレオチド［ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及びｄＴＴＰ（全て最終濃度２００μＭ）］、２０
単位／ｍｌセルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラ
ーゼを加え２ｍｌとした反応液を、７４℃で３時間反応
させる。その後、フェノール処理、エタノール沈殿にて
ＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。この
粗精製ＤＮＡ溶液を前述の塩化セシウム−臭化エチジウ
ム平衡密度勾配遠心法にて精製し、ＴＥ緩衝液２０μｌ
に溶解した。２０ｍｌのＹＰＤ培地（１％イーストエキ
ストラクト、２％ペプトン、２％ブドウ糖）にパン酵母
を接種し、３０℃で一晩培養する。次に、この培養液の
２ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地へ移し、再び３０℃で
一晩培養する。この培養液を４００×ｇ、５分間遠心
し、酵母細胞を集める。この沈殿に２０ｍｌのＳＥＤ溶
液（１Ｍ ソルビトール、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍ
Ｍ ジスレイトール）を加え、懸濁し、３０℃で１０分
間培養する。再び同様の遠心にて酵母細胞を集め、２０
ｍｌの１Ｍ ソルビトールに懸濁する。再度遠心して酵
母細胞を集め、２０ｍｌのＳＣＥ溶液［１Ｍ ソルビト
ール、１００ｍＭ クエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ５．
８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁する。これに、０．
２ｍｌのグルスラーゼを添加し、３０℃で１時間培養す
る。この溶液を、３００×ｇ、５分間遠心し、酵母スフ
ェロプラスト細胞を集める。この沈殿を、２０ｍｌの１
Ｍ ソルビトールにて２回洗浄し、最後に２０ｍｌのＳ
ＴＣ溶液［１Ｍ ソルビトール、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］にて
洗浄する。沈殿をＳＴＣ溶液１ｍｌに懸濁し、１００μ
ｌづつ分ける。これに、上記ＤＮＡ溶液を５μｌ加え、
室温１０分間放置する。続いて、ＰＥＧ溶液［２０％ポ
リエチレングリコール３３００、１０ｍＭ ＣａＣ
ｌ２、１０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］を１
ｍｌ加え、室温で１０分間放置する。３００×ｇ、５分
間遠心後、沈殿を１５０μｌのＳＯＳ培地（２Ｍ ソル
ビトールを１０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ２を０．１ｍｌ、
ＹＰＤ培地を６．７ｍｌ、１％ロイシン溶液を２７μ
ｌ、蒸留水を３．１７ｍｌ）に懸濁する。これを、３０
℃で２０分間培養し、予め４５℃で融解しておいた６ｍ
ｌのＳＹＧ寒天培地［１８．２％ソルビトール、２％寒
天、０．６７％イーストニトロゲンベース（アミノ酸無
し）、２％ぶどう糖、０．００１％アデニン、０．００
４％ウラシル］に加え、ＳＹＧ寒天平板培地に重層し、
３０℃で３日間培養する。培養平板培地より、コロニー
を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で一晩培養す
る。４００×ｇ、５分間遠心し、沈殿を２５０μｌのＢ
Ｋ緩衝液［１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ジスレイトール、２０％グリセリン］に
懸濁する。これに、ＰＭＳＦ溶液（４０ｍＭ フッ化フ
ェニルメチルスルホニル）を１２．５μｌ加え、強く撹
拌する。再びＢＫ緩衝液を２５０μｌ加え、よく撹拌す
る。１７７００×ｇ、１５分間遠心し、上清を別の容器
に移す。この上清５０μｌに、ＢＫ緩衝液５０μｌとＺ
緩衝液（１．６１％Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５
５％ＮａＨ２ＰＯ４、０．０７５％ＫＣｌ、０．０２４
６％ＭｇＳＯ４、０．２７％β−メルカプトフェノー
ル）０．９ｍｌを加え、２８℃で５分間培養する。その
後、ＯＮＰＧ溶液（４ｍｇ／ｍｌ ο−ニトロフェニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を０．２ｍＬ加えるこ
とにより反応を開始させ、２８℃で培養する。３０分後
に１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３溶液を０．５ｍｌ加え、反応を停
止させる。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定する。
又、タンパク質の量をブラットフォード色素結合法［ブ
ラットフォード、アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第７２巻、第２４８
〜２５４頁（１９７６）］にて定量した。この吸光度及
びタンパク質の量より菌抽出液中のβ−ガラクシダーゼ
比活性を計算した。その結果、２０検体のうち４検体に
ついて、β−ガラクシダーゼ活性が確認できた（表
６）。このことは、β−ガラクシダーゼ遺伝子が末端に
付加されたｎｔｐ−ＤＮＡを介して酵母染色体中に導入
されたことを証明する結果となった。よって、ｎｔｐ−
ＤＮＡには、高頻度に組み換えを起こさせる活性が存在
することが確認された。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成された鋳型・プライマー非依存
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
【図２】実施例４のｎｔｐＤＮＡ合成におけるデオキシ
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＴＴＰとｄＧＴＰｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡの
合成である。
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＴＴＰとｄＧＴＰｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡの
合成である。
【図３】実施例５で示した各種ＤＮＡポリメラーゼによ
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
【図４】実施例６に示した酵素中に混在するＤＮＡやＲ
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のｎｔｐＤＮＡ合成。ライン２は
ＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ。
ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン４は
ＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５はＲＮ
ａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン６はＲＮ
ａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のｎｔｐＤＮＡ合成。ライン２は
ＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ。
ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン４は
ＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５はＲＮ
ａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン６はＲＮ
ａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。
【図５】実施例７に示したｎｔｐ１０ｋｂｐＤＮＡの合
成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ライ
ン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は通
常のｎｔｐＤＮＡである。
成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ライ
ン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は通
常のｎｔｐＤＮＡである。
【図６】実施例８のｎｔｐＤＮＡ合成の時間的推移を表
わすグラフである。
わすグラフである。
【図７】実施例１０に示したｎｔｐＤＮＡの一本鎖特異
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン３はＳ１ヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン
４はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡで
ある。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ
／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン６はマングビーンヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
ライン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ
処理していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ
１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン３はＳ１ヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン
４はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡで
ある。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ
／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン６はマングビーンヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
ライン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ
処理していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ
１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
【図８】実施例１１のｎｔｐＤＮＡの円二色性スペクト
ルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波線
がｎｔｐＤＮＡである。
ルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波線
がｎｔｐＤＮＡである。
【図９】実施例１２のｎｔｐＤＮＡの電子顕微鏡写真で
ある。
ある。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】表３
【補正方法】変更
【補正内容】
【表３】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年５月２日
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で合成された鋳型・プライマー非依存
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
的ＤＮＡ（ｎｔｐＤＮＡ）の臭化エチジウムで染色した
アガロースゲル電気泳動の写真である。
【図２】実施例４のｎｔｐＤＮＡ合成におけるデオキシ
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡ
の合成である。
リボヌクレオチドの影響を説明するアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄ
ＴＴＰ、ライン２はｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰ、ラ
イン３はｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰ、ライン４はｄ
ＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰ、ライン５はｄＡＴＰとｄ
ＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰをもちいてのｎｔｐＤＮＡ
の合成である。
【図３】実施例５で示した各種ＤＮＡポリメラーゼによ
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
るｎｔｐＤＮＡの合成を説明するアガロースゲル電気泳
動の写真である。ライン１はピロコッカス・フリオーサ
スからの天然ＤＮＡポリメラーゼ。ライン２はピロコッ
カス・フリオーサスからの組み換えＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン３は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡポ
リメラーゼＩ）。ライン４はセルモコッカス・リトラリ
スＤＮＡポリメラーゼ（ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ）。
ライン５はセルマス・セルモフィルスＤＮＡポリメラー
ゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）。ライン６はセルマス
・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ）。
【図４】実施例６に示した酵素中に混在するＤＮＡやＲ
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のｎｔｐＤＮＡ合成。ライン２は
ＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ。
ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン４は
ＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５はＲＮ
ａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン６はＲＮ
ａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴ１ｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。
ＮＡの有無を確認するアガロースゲル電気泳動の写真で
ある。ライン１は通常のｎｔｐＤＮＡ合成。ライン２は
ＲＮａｓｅＡで前処理したＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ。
ライン３はＲＮａｓｅＡ処理したｔＲＮＡ。ライン４は
ＲＮａｓｅＡ処理していないｔＲＮＡ。ライン５はＲＮ
ａｓｅＡ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン６はＲＮ
ａｓｅＡ処理していないλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。ライン７
はＤＮａｓｅＩで前処理したＴ１ｉＤＮＡポリメラー
ゼ。ライン８はＤＮａｓｅＩ処理したｔＲＮＡ。ライン
９はＤＮａｓｅＩ処理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩ。
【図５】実施例７に示したｎｔｐ１０ｋｂｐＤＮＡの合
成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ライ
ン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は通
常のｎｔｐＤＮＡである。
成を表わすアガロースゲル電気泳動の写真である。ライ
ン１は１０ｋｂｐ ｎｔｐＤＮＡである。ライン２は通
常のｎｔｐＤＮＡである。
【図６】実施例８のｎｔｐＤＮＡ合成の時間的推移を表
わすグラフである。
わすグラフである。
【図７】実施例１０に示したｎｔｐＤＮＡの一本鎖特異
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン３はＳ１ヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン
４はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡで
ある。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ
／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン６はマングビーンヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
ライン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ
処理していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ
１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
的ヌクレアーゼによる切断を表わすアガロースゲル電気
泳動の写真である。ライン１はＳ１ヌクレアーゼ処理し
たｎｔｐＤＮＡである。ライン２はＳ１ヌクレアーゼ処
理したλ／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン３はＳ１ヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖である。ライン
４はマングビーンヌクレアーゼ処理したｎｔｐＤＮＡで
ある。ライン５はマングビーンヌクレアーゼ処理したλ
／ＨｉｎｄＩＩＩである。ライン６はマングビーンヌク
レアーゼ処理したＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
ライン７、８、９はそれぞれ一本鎖特異的ヌクレアーゼ
処理していないｎｔｐＤＮＡ、λ／ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ
１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡである。
【図８】実施例１１のｎｔｐＤＮＡの円二色性スペクト
ルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波線
がｎｔｐＤＮＡである。
ルグラムである。実線がｐＰＴ１／ＥｃｏＲＩで、波線
がｎｔｐＤＮＡである。
【図９】実施例１２のｎｔｐＤＮＡの電子顕微鏡写真で
ある。
ある。
Claims (12)
- 【請求項１】 鋳型およびプライマーの不存在下、タン
パク質の存在下にデオキシリボヌクレオチドを重合させ
ることを特徴とするポリデオキシリボヌクレオチドの合
成方法。 - 【請求項２】 タンパク質が耐熱性デオキシリボヌクレ
オチドポリメラーゼである請求項１記載の合成方法。 - 【請求項３】 耐熱性デオキシリボヌクレオチドポリメ
ラーゼがセルモコッカス属、セルマス属またはピロコッ
カス属に属する細菌のデオキシリボヌクレオチドポリメ
ラーゼである請求項２記載の合成方法。 - 【請求項４】 約６０°〜約９０℃の昇温下に行う請求
項１、２または３記載の合成方法。 - 【請求項５】 中性ないし弱アルカリ性の条件下に行う
請求項１、２、３または４記載の合成方法。 - 【請求項６】 鋳型およびプライマーの不存在下に、デ
オキシリボヌクレオチドに耐熱性デオキシリボヌクレオ
チドポリメラーゼを作用させることにより得られる二本
鎖ポリデオキシリボヌクレオチド。 - 【請求項７】 塩配列中にＴＡＴＣＴＡＧＡの繰返し単
位を有する請求項５記載のポリデオキシリボヌクレオチ
ド。 - 【請求項８】 塩基配列中にＣＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴ
の繰返し単位を有する請求項５記載のポリデオキシリボ
ヌクレオチド。 - 【請求項９】 塩基配列中に次の配列 ＴＡＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＴＡＴ
ＣＴＡＧＡＴＡＴＣ を有する請求項５記載のポリデオキシリボヌクレオチ
ド。 - 【請求項１０】 請求項６のポリデオキシリボヌクレオ
チドを標識し、それをプローブとして用いることを特徴
とするプラークハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡ
ライブラリーから上記ポリデオキシリボヌクレオチドと
相同若しくは類似のポリデオキシリボヌクレオチドをス
クリーニングする方法。 - 【請求項１１】 生物細胞の遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ
の末端に請求項６のポリデオキシリボヌクレオチドを連
結するかまたは末端に上記のポリデオキシリボヌクレオ
チドを合成し、得られたＤＮＡを生物細胞にトランスフ
ェクションし、その細胞を培養することにより、染色体
ＤＮＡに挿入し、該遺伝子由来の蛋白質を発現させる方
法。 - 【請求項１２】 生物細胞の二本鎖ＤＮＡを含む遺伝子
の末端に請求項６のポリデオキシリボヌクレオチドを連
結するかまた末端に上記のポリデオキシリボヌクレオチ
ドを合成し、得られたＤＮＡを生物細胞にトランスフェ
クションして培養することを特徴とする該遺伝子による
形質転換方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12267396A JP3391629B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | ポリデオキシリボヌクレオチドの合成方法 |
| US08/839,608 US5917031A (en) | 1996-04-19 | 1997-04-15 | Method of synthesizing polydeoxyribonucleotides |
| EP97106471A EP0802258A3 (en) | 1996-04-19 | 1997-04-18 | Method of synthesizing polydeoxyribonucleotides, method of synthesizing chromosomal DNA and method of producing chromosomes |
| CNB971109141A CN1209464C (zh) | 1996-04-19 | 1997-04-18 | 多脱氧核苷酸的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12267396A JP3391629B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | ポリデオキシリボヌクレオチドの合成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09285289A true JPH09285289A (ja) | 1997-11-04 |
| JP3391629B2 JP3391629B2 (ja) | 2003-03-31 |
Family
ID=14841810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12267396A Expired - Fee Related JP3391629B2 (ja) | 1996-04-19 | 1996-04-19 | ポリデオキシリボヌクレオチドの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3391629B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112315836A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-05 | 润辉生物技术（威海）有限公司 | 一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用 |
| JP2022554037A (ja) * | 2019-12-23 | 2022-12-27 | 呈堯 陳 | テンプレート非依存性核酸合成の方法およびキット |
-
1996
- 1996-04-19 JP JP12267396A patent/JP3391629B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022554037A (ja) * | 2019-12-23 | 2022-12-27 | 呈堯 陳 | テンプレート非依存性核酸合成の方法およびキット |
| CN112315836A (zh) * | 2020-10-30 | 2021-02-05 | 润辉生物技术（威海）有限公司 | 一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3391629B2 (ja) | 2003-03-31 |
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