CN117757876A

CN117757876A - 一种2’-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法

Info

Publication number: CN117757876A
Application number: CN202311777873.9A
Authority: CN
Inventors: 胡美荣; 李帅; 刘巧; 杨蓉; 钱瑾
Original assignee: Shanghai Herunyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Herunyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明属于2’‑脱氧‑2‑氟腺苷的酶催化技术领域，提供了一种2'‑脱氧‑2‑氟腺苷的双酶催化制备方法，将EcTP粗酶液、PNP粗酶液、2'‑F‑dUR和腺嘌呤A混合成混合液，再将混合液进行催化反应，得产物，产物即2'‑脱氧‑2‑氟腺苷，2'‑F‑dAR。该制备方法不需要纯化酶，直接用分别表达嘌呤核苷磷酸化酶和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的细胞破碎液，在一个反应器内一步反应即可制备2'‑F‑dAR，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，降低了生产成本，且设备利用率高。

Description

一种2’-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法

技术领域

本发明涉及2’-脱氧-2-氟腺苷的酶催化技术领域，具体涉及到一种2’-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法。

背景技术

2'-脱氧-2-氟腺苷（2'-Deoxy-2'-fluoro-D-adenosine，2'-F-dAR）是一种修饰的核苷酸，其结构特征在于腺嘌呤核苷的2'-碳上取代了氢原子，而且这里是氟原子。这种修饰使得该核苷酸在RNA分子中的应用具有一些独特的性质和优势。

2'-脱氧-2-氟腺苷及其衍生物在抗病毒药物的研发中也有应用。由于RNA在一些病毒的复制中起着关键作用，通过设计能够特异性与目标RNA结合的分子，可以干扰病毒的复制过程，从而具有抗病毒的潜力。比如说，2'-氟-2'-脱氧腺苷可作为有机合成中间体和医药中间体，主要用作实验室研发过程和化工生产过程中。生物活性2′-Deoxy-2′-fluoroadenosine可用于合成可与RNA杂交的2'-脱氧-2'Chemicalbook-氟修饰的寡核苷酸。

经研究得到，2′-Deoxy-2′-fluoroadenosine能被大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)有效地裂解成毒性物2-氟腺嘌呤(FAde)，对表达大肠杆菌PNP的肿瘤表现出良好的体内活性。

上述研究表明2'-F-dAR（2'-脱氧-2'-氟腺苷）在存在大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）时，可以被有效地磷酸化并裂解成毒性物质2-氟腺嘌呤（FAde）。这个过程对表达大肠杆菌PNP的肿瘤显示出良好的体内活性，具体原因如下：

选择性杀伤肿瘤细胞： PNP是一种嘌呤代谢酶，在大肠杆菌中催化嘌呤核苷的磷酸化反应。通过引入2'-F-dAR并表达PNP，可以实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。正常细胞可能没有足够的PNP表达，因此对它们的影响相对较小，而PNP表达丰富的肿瘤细胞则能够有效地将2'-F-dAR转化为毒性的FAde。

活性物质释放： 2'-F-dAR在被磷酸化后被裂解成2-氟腺嘌呤（FAde），这是一种具有毒性的嘌呤类化合物。FAde可能会导致细胞死亡，从而对肿瘤细胞产生毒性效应。这种方式的活性物质释放可以提高药物的局部浓度，增强治疗效果。

生物安全性：大肠杆菌是一种广泛用于生物学研究的微生物，而PNP是其天然的嘌呤代谢酶之一。因此，通过利用大肠杆菌的代谢途径来处理2'-F-dAR，可以提高治疗的生物安全性。这样的方法可能会减少对宿主细胞的不良影响，从而提高治疗的安全性。

传统的2'-F-dAR的生产采用化学合成的方式。通常涉及多个步骤的有机化学合成过程。虽然合成路线可能因研究者、公司或生产者的具体选择而有所不同，但通常会包含以下一般步骤：

腺苷保护基的引入：合成通常从腺苷出发，因此首先需要引入适当的保护基，以防止在合成过程中受到不必要的干扰。这可能涉及在特定官能团上引入临时的化学保护基。

2'-脱氧化反应：下一步通常是通过去氧核糖骨架上的2'-碳，生成2'-脱氧核苷。

2'-氟化反应：在已经得到的2'-脱氧核苷上引入氟原子，从而生成2'-脱氧-2'-氟核苷。

去保护基：在氟原子引入后，需要去除腺苷中的保护基，以还原成活性形式。

其他功能基团修饰：根据具体的设计需求，可能还需要在分子中引入其他功能基团，以满足所需的性质。

这种化学合成方式在一定程度上解决了量产的问题，然而，这种化学合成方式中有些方法会涉及多个中间体的合成和纯化步骤，这可能使合成过程相对繁琐和时间耗费较多，存在收率低、环境污染严重、成本高的问题。

值得注意的是，为了提高合成效率和产率，有时候会采用新型的有机合成方法或生物酶法，以简化步骤或提高产物纯度。尽管如此，合成2'-F-dAR仍然通常是一个相对复杂的有机合成过程。

生物酶法具有如下特点：

催化剂：使用生物酶作为催化剂，如酶（enzyme）。

选择性：酶通常对底物非常具有选择性，可以催化特定的反应，而不产生不需要的副产物。

反应条件：通常在相对温和的条件下进行，通常在生物体温范围内。pH值和温度条件相对温和，有助于维持催化活性。

环境友好性：生物酶法通常对环境友好，减少了对有毒溶剂和高温高压反应条件的依赖。

底物范围：生物酶对底物的适应性较强，但有时候可能会受到特定的酶底物范围的限制。

对此，本发明提出一种2’-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法。

发明内容

针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种2’-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，具体方案如下：

一种2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，所述制备方法为：

将 EcTP粗酶液、PNP粗酶液、 2'-F-dUR和腺嘌呤A混合成混合液，再将混合液进行催化反应，得产物，产物即 2'-脱氧-2-氟腺苷。

进一步的， PNP粗酶液采用ExPNP粗酶液、BhPNP粗酶液或者AhDEOD粗酶液。

进一步的，所述EcTP粗酶液的制备过程包括如下步骤：

EcTP基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体EcTP；

重组载体EcTP经限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后，得酶切片段EcTP；

酶切片段EcTP与表达载体pBAD-hisB在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，得连接液EcTP；

连接液EcTP转化Top10感受态细胞，得到阳性重组质粒pBAD-EcTP；

将阳性重组质粒pBAD-EcTP转化表达宿主菌大肠杆菌BW25113，得到原核表达菌株pBAD-EcTP- BW25113；

原核表达菌株pBAD-EcTP-BW25113在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基中振荡培养过夜后，按体积比1%比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL2YT液体培养基中振荡培养，得到培养液EcTP；

待培养液EcTP的OD600为0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂阿拉伯糖诱导过夜得诱导菌体EcTP；

诱导菌体EcTP离心后，收集菌体，悬浮于50mM Tris-HCl pH7.0缓冲液中，超声破碎，得到EcTP粗酶液。

进一步的，所述AhDEOD粗酶液的制备过程包括如下步骤：

AhDEOD基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体AhDEOD；

重组载体AhDEOD经限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ双酶切后，酶切片段AhDEOD；

酶切片段AhDEOD与表达载体pBAD-hisB在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，得连接液AhDEOD；

连接液AhDEOD转化Top10感受态细胞，得到阳性重组质粒pBAD-AhDEOD；

将阳性重组质粒pBAD-AhDEOD转化表达宿主菌大肠杆菌BW25113，得到原核表达菌株pBAD-AhDEOD- BW25113；

原核表达菌株pBAD-AhDEOD-BW25113在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基中振荡培养过夜后，按体积比1%比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL2YT液体培养基中振荡培养，得到培养液AhDEOD；

待培养液AhDEOD的OD600为0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂阿拉伯糖诱导过夜得诱导菌体AhDEOD；

诱导菌体AhDEOD离心后，收集菌体，悬浮于50mM Tris-HCl pH7.0缓冲液中，超声破碎，得到AhDEOD粗酶液。

进一步的，所述ExPNP粗酶液和BhPNP粗酶液的制备过程与AhDEOD粗酶液的制备过程一致。

进一步的，所述EcTP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述AhDEOD基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述ExPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述BhPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

进一步的，进行连接过夜时，温度设为16℃。

进一步的，振荡培养时，培养条件设为37℃、220rpm；

进行诱导过夜时，温度设为30℃。

进一步的，进行催化反应时，反应条件设为50℃，220rpm，10小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）采用本发明的方法，不需要纯化酶，直接用分别表达嘌呤核苷磷酸化酶和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的细胞破碎液，在一个反应器内一步反应即可制备2'-F-dAR，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，降低了生产成本，且设备利用率高。

附图说明

图1为本发明的2'-脱氧-2-氟尿苷合成2'-脱氧-2-氟腺苷的反应流程图；

图2为2'-2'-F-dAR（2'-脱氧-2-氟腺苷）标准品的HPLC检测图谱；

图3为A（腺嘌呤）标准品的HPLC检测图谱；

图4为2'-F-dUR（2'-脱氧-2-氟尿苷）标准品的HPLC检测图谱；

图5为U（尿嘧啶）标准品的HPLC检测图谱；

图6为转化产物的HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。

本发明提出一种2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，该种制备方法属于生物酶制备法。其中，2'-F-dAR的生物酶法制备是以2'-脱氧-2-氟尿苷（2'-Deoxy-2'-fluorouridine，2'-F-dUR）和腺嘌呤（AdenIne，A）为起始原料，在胸苷磷酸化酶(ThymidinePhosphorylsae,TP)和嘌呤核苷磷酸化酶 (Purine Nucleoside Phosphorylase,PNP)的作用下，经过水解和合成两步反应得到2'-F-dAR，底物转化率可观，产品纯度高，有望成为2'-F-dAR的主流生产方法。

具体制备时，将EcTP粗酶液、 PNP粗酶液、2'-F-dUR和腺嘌呤A混合成混合液，再将混合液进行催化反应，得产物，产物即 2'-脱氧-2-氟腺苷。进行催化反应时，反应条件设为50℃，220rpm，10小时。这种制备方法具备如下优点：

高特异性：生物酶通常表现出较高的特异性，能够选择性地催化底物的特定部位，从而形成目标产物2'-F-dAR，这有助于减少副反应和提高产品纯度。

底物选择性：生物酶法在催化反应中通常具有较好的底物选择性，从而有助于避免一些化学合成方法中可能发生的多步骤反应，减少副产物的生成。

绿色化学：通常在较温和的反应条件下进行，相较于一些化学合成方法，它们可能需要较低的温度、较温和的溶剂和反应条件。这有助于减少能源消耗、废弃物生成和环境影响，符合绿色化学的理念。

其中，PNP粗酶液采用ExPNP粗酶液、BhPNP粗酶液或者AhDEOD粗酶液。

需要说明的是，EcTP粗酶液、PNP粗酶液均是通过构建对应的重组菌后基于重组菌生产出对应的粗酶液。

EcTP粗酶液的制备过程包括如下步骤：

EcTP基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体EcTP；

连接液EcTP转化Top10感受态细胞，得到阳性重组质粒pBAD-EcTP；

其中，AhDEOD粗酶液的制备过程包括如下步骤：

AhDEOD基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体AhDEOD；

酶切片段AhDEOD与表达载体pBAD-hisB在T4 DNA连接酶作用下连接过夜，得连接液AhDEOD，进行连接过夜时，温度设为16℃；

原核表达菌株pBAD-AhDEOD-BW25113在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基中振荡培养过夜后，按体积比1%比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL2YT液体培养基中振荡培养，得到培养液AhDEOD，振荡培养时，培养条件设为37℃、220rpm；

待培养液AhDEOD的OD600为0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂阿拉伯糖诱导过夜得诱导菌体AhDEOD，进行诱导过夜时，温度设为30℃；

需要说明的是，ExPNP粗酶液和BhPNP粗酶液的制备过程与AhDEOD粗酶液的制备过程一致。

需要说明的是，EcTP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；AhDEOD基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；ExPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；BhPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

序列表SEQ ID NO.1：Met Phe Leu Ala Gln Glu Ile Ile Arg Lys Lys Arg AspGly His Ala Leu Ser Asp Glu GluIle Arg Phe Phe Ile Asn Gly Ile Arg Asp AsnThr Ile Ser Glu Gly Gln Ile Ala Ala Leu Ala Met Thr Ile Phe Phe His Asp MetThr Met Pro Glu Arg Val Ser Leu Thr MetAla Met Arg Asp Ser Gly Thr Val LeuAsp Trp Lys Ser Leu His Leu Asn Gly Pro Ile Val Asp Lys His Ser Thr Gly GlyVal Gly Asp Val Thr Ser Leu Met Leu Gly Pro MetVal Ala Ala Cys Gly Gly TyrIle Pro Met Ile Ser Gly Arg Gly Leu Gly His Thr Gly Gly Thr Leu Asp Lys LeuGlu Ser Ile Pro Gly Phe Asp Ile Phe Pro Asp Asp Asn ArgPhe Arg Glu Ile IleLys Asp Val Gly Val Ala Ile Ile Gly Gln Thr Ser Ser Leu Ala Pro Ala Asp LysArg Phe Tyr Ala Thr Arg Asp Ile Thr Ala Thr Val Asp Ser Ile ProLeu Ile ThrAla Ser Ile Leu Ala Lys Lys Leu Ala Glu Gly Leu Asp Ala Leu Val Met Asp ValLys Val Gly Ser Gly Ala Phe Met Pro Thr Tyr Glu Leu Ser Glu Ala Leu AlaGluAla Ile Val Gly Val Ala Asn Gly Ala Gly Val Arg Thr Thr Ala Leu Leu Thr AspMet Asn Gln Val Leu Ala Ser Ser Ala Gly Asn Ala Val Glu Val Arg Glu Ala ValGlnPhe Leu Thr Gly Glu Tyr Arg Asn Pro Arg Leu Phe Asp Val Thr Met Ala LeuCys Val Glu Met Leu Ile Ser Gly Lys Leu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Ala Arg AlaLys Leu GlnAla Val Leu Asp Asn Gly Lys Ala Ala Glu Val Phe Gly Arg Met ValAla Ala Gln Lys Gly Pro Thr Asp Phe Val Glu Asn Tyr Ala Lys Tyr Leu Pro ThrAla Met Leu Thr LysAla Val Tyr Ala Asp Thr Glu Gly Phe Val Ser Glu Met AspThr Arg Ala Leu Gly Met Ala Val Val Ala Met Gly Gly Gly Arg Arg Gln Ala SerAsp Thr Ile Asp Tyr Ser ValGly Phe Thr Asp Met Ala Arg Leu Gly Asp Gln ValAsp Gly Gln Arg Pro Leu Ala Val Ile His Ala Lys Asp Glu Asn Asn Trp Gln GluAla Ala Lys Ala Val Lys Ala Ala IleLys Leu Ala Asp Lys Ala Pro Glu Ser ThrPro Thr Val Tyr Arg Arg Ile Ser Glu

需要说明的是，上述SEQ ID NO.1序列中的氨基酸一共440个，比如，Met –为蛋氨酸的缩写，其对应的一字母缩写为M。

序列表SEQ ID NO.2：Leu Glu Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Lys Asp GlyAla Phe Ala Asp Thr Val Leu MetPro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile AlaGlu Thr Phe Leu Glu Asn Val Glu Gln Val Cys Asp Val Arg Asn Met Phe Gly PheThr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Arg Ile SerIle Met Gly His Gly Met Gly Ile ProSer Cys Ser Ile Tyr Ala Lys Glu Leu Ile Thr Asp Tyr Gly Val Lys Thr Leu IleArg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Arg Glu Asp ValLys Leu Arg Asp Val Val IleGly Met Gly Ala Cys Thr Asp Ser Lys Val Asn Arg Leu Arg Phe Lys Asp His AspPhe Ala Ala Ile Ala Asp Phe Asp Leu Val Ala Asn Ala ValGln Ala Ala Lys AsnLys Gly Val Ala Val Arg Val Gly Asn Ile Phe Ser Ala Asp Leu Phe Tyr Thr ProAsp Pro Ser Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile Leu Gly ValGlu Met GluAla Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu Tyr Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile CysThr Val Ser Asp His Ile Arg Thr Gly Glu Gln Thr Thr Ser Glu Glu Arg GlnLeuThr Phe Asn Asp Met Ile Glu Ile Ala Leu Asp Ser Val Leu Leu Gly Asp Asn

需要说明的是，上述SEQ ID NO.1序列中的氨基酸一共240个，比如，Asn为天冬氨酸（Asparagine）的缩写，其对应的一字母缩写为N。

序列表SEQ ID NO.3：Met Thr Val Asn Trp Asn Glu Thr Arg Ser Phe Leu GluSer Lys Met Gln Ala Lys Pro GluIle Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly ValLeu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Ile Ala Ile Pro Tyr His Glu Ile Pro Asn PhePro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala GlyGln Leu Val Phe Gly Thr Leu Glu GlyLys Gln Val Val Ala Met Gln Gly Arg Phe His Phe Tyr Glu Gly Tyr Ser Met AspMet Val Thr Phe Pro Val Arg Val Met Lys Ala IleGly Val Glu Thr Leu Ile ValThr Asn Ala Ala Gly Ala Cys Asn Glu Ala Phe Glu Pro Gly Asp Leu Met Leu IleThr Asp His Ile Asn Phe Phe Gly Thr Asn Pro Leu Ile GlyLys Asn Val Asp GluMet Gly Pro Arg Phe Pro Asp Met Ser Lys Pro Tyr Asp Ala Glu Leu Leu Arg LeuAla Gln Glu Thr Ala Asp Glu Leu Gly Ile Arg Val Arg Gln Gly ValTyr Phe GlyAsn Thr Gly Pro Thr Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Val Lys Met Ala Arg Met Leu GlyGly Asp Val Val Gly Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Arg His SerAspMet Arg Val Leu Gly Ile Ser Cys Val Ser Asn Met Ala Ala Gly Ile Leu Asp GlnPro Leu His His Asp Glu Val Ile Glu Thr Thr Glu Arg Val Arg Ala His Phe LeuSerLeu Val Arg Gly Ser Ile Lys Lys Met

需要说明的是，上述SEQ ID NO.3序列中的氨基酸一共270个，比如，Ile为异亮氨酸（Isoleucine）的缩写，其对应的一字母缩写为I。

序列表SEQ ID NO.4：Met Leu Asn Val Thr Gln Leu Gln Glu Ala Thr Thr PheIle Gln Gln Gln Ile Glu Thr LysPro Thr Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly LeuGly Ile Leu Ala Asp Glu Ile Glu Gln Pro Val Lys Val Pro Tyr Ser Asp Ile ProHis Phe Pro Val Ser Thr Val Gln Gly HisAla Gly Gln Leu Val Ile Gly Met LeuGlu Gly Lys Gln Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe His Phe Tyr Glu Gly Tyr SerLeu Glu Val Val Thr Phe Pro Val Arg Val Met LysAla Leu Gly Val Glu Gln IleIle Val Thr Asn Ala Ala Gly Gly Val Asn Glu Ser Phe Glu Ala Gly Asp Leu MetIle Ile Arg Asp His Ile Asn Asn Met Ala Gln Asn Pro LeuIle Gly Pro Asn AspGlu Ala Phe Gly Val Arg Phe Pro Asp Met Ser Asn Ala Tyr Ser Glu Arg Leu ArgThr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Asn Thr Leu Asn Leu Lys Leu Gln GluGly Val TyrVal Ala Asn Thr Gly Pro Val Tyr Glu Thr Pro Ala Glu Val Arg Met Ile Arg LysLeu Gly Gly Asp Ala Val Gly Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala ArgHisAla Gly Leu Glu Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Met Ala Ala Gly Ile LeuPro Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Ile Glu Thr Thr Glu Arg Val Arg Gln AspPheLeu Asn Leu Val Lys Ala Ile Val Lys Asp Met

需要说明的是，上述SEQ ID NO.4序列中的氨基酸一共272个，比如，Leu为亮氨酸的缩写，其对应的一字母缩写为L。

基于上述内容，针对上述内容，本发明提出如下实施例。

以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

载体pBAD/HisB：购自Invitrogen公司，产品目录号：V430-01。

大肠杆菌BW25113：购自Biovector NTCC INC，货号为355297。

2'-F-dAR：购自阿拉丁，货号为D337695。

A标准品：购自阿拉丁，货号为A108805。

2'-F-dUR标准品：购自迈瑞尔，货号为784-71-4。

U标准品：购自阿拉丁，货号为U102087。

实施例1

构建重组菌

本发明实施例中的嘌呤核苷磷酸化酶PNP来源于不同的嗜热属菌，分别为AhDEOD（来源于Aeromonas hydrophila）、ExPNP（来源于Exiguobacterium）、BhPNP（来源于Halalkalibacterium halodurans）。所述嘌呤核苷磷酸化酶AhDEOD的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，ExPNP的氨基酸序列如序列表SEQID NO.3所示，BhPNP的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

"嗜热属菌" 通常指的是一类能够在高温环境中生存和繁衍的微生物。这类微生物被称为嗜热生物或嗜热微生物，它们能够在高温的生态环境中存活，例如在温泉、热液喷口、深海热泉等地。

具有以下一些特点使其适合制备PNP：

高温稳定性：嗜热属菌通常生存在高温的环境中，其内部的生物分子和酶具有较高的热稳定性。由于PNP酶在高温环境下仍然能够保持较高的活性，因此选择嗜热属菌可能能够获得更稳定的酶制备。

高产量：一些嗜热属菌可能具有较高的生物合成能力，能够高效产生目标蛋白。这对于制备PNP酶来说是一个重要的因素，因为高产量的酶可以更容易地被提取和纯化。

表达系统的适应性：嗜热属菌的表达系统可能对PNP的表达和折叠提供了适当的条件，从而使其能够在这个宿主中以高效的方式产生。

酶的特殊催化特性： PNP是一种催化嘌呤核苷和磷酸之间的转化的酶，其特殊的催化机制可能使得一些嗜热属菌的PNP对高温环境更为适应。

胸腺嘧啶核苷磷酸化酶TP来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，下文简写为EcTP。所述胸腺嘧啶核苷磷酸化酶TP的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

大肠杆菌是一种常见的细菌模型，对于遗传工程和蛋白表达有着广泛的应用，具有以下一些特点使其适合制备TP：

表达系统：大肠杆菌的表达系统相对成熟，有许多表达载体和工程工具可供选择。科学家可以将目标基因导入大肠杆菌，并使用适当的启动子和调控元件实现对TP基因的高效表达。

高表达水平：大肠杆菌通常能够提供较高的蛋白表达水平，这对于获得足够的TP蛋白量是至关重要的，特别是在一些实验室应用中。

简便培养：大肠杆菌易于在实验室中培养，其培养条件简单、成本较低。

遗传工程工具：大肠杆菌的基因组工程工具相对完善，科学家能够通过插入、改造、删除基因等手段来实现对TP基因的精确控制和调节。

可溶性蛋白：大肠杆菌通常能够产生相对可溶性的蛋白，这对于蛋白的纯化和功能研究非常重要。

AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP基因片段由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上，分别得到重组载体AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP。

重组载体AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP分别经限制性内切酶XhoⅠ和SpeⅠ（购自NewEngland Biolabs公司，NEB）在37℃双酶切2h后，1%琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收（胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司），分别得酶切片段AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP。

随后酶切片段AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP分别与经过同样双酶切的表达载体pBAD-hisB（购买自Invitrogen公司），在T4 DNA连接酶（购自Takara公司）作用下于16℃连接过夜，分别得连接液AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP。

连接液AhDEOD、ExPNP、BhPNP和EcTP分别转化入Top10感受态细胞（购自天根生化科技（北京）有限公司），并进行测序验证，从而分别得到阳性重组质粒pBAD-AhDEOD、pBAD-ExPNP、pBAD-BhPNP和pBAD-EcTP。

将阳性重组质粒pBAD-AhDEOD、pBAD-ExPNP、pBAD-BhPNP和pBAD-EcTP分别转化表达宿主菌大肠杆菌BW25113（购自Biovector NTCC），分别得到原核表达菌株pBAD-AhDEOD、pBAD-ExPNP、pBAD-BhPNP和pBAD-EcTP。

实施例2

制备2'-F-dAR生产用粗酶液

上述构建重组菌构建的原核表达菌株pBAD-AhDEOD-BW25113、pBAD-ExPNP-BW25113、pBAD-BhPNP-BW25113和pBAD-EcTP-BW25113分别在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基（0.5%NaCl、1%酵母提取物、1.6%胰蛋白胨）中，37℃、220rpm振荡培养过夜后，按1%（V/V）比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL 2YT液体培养基中，于37℃、220rpm振荡培养，分别得到培养液ExPNP、BhPNP、AhDEOD和EcTP。

待培养液ExPNP、BhPNP、AhDEOD和EcTP的OD600为0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.2 g/L的诱导剂阿拉伯糖诱导，30℃诱导过夜，分别得诱导菌体ExPNP、BhPNP、AhDEOD和EcTP。

诱导菌体ExPNP、BhPNP、AhDEOD和EcTP分别在4℃、8000rpm条件下离心10min，收集菌体，悬浮于50mM Tris-HCl pH7.0缓冲液中，超声破碎（200W，5s/7s，20min），即分别得到ExPNP、BhPNP、AhDEOD和EcTP的粗酶液。

实施例3

2'-F-dAR的制备和检测

向实施例2制备的粗酶液中加入2'-F-dUR和腺嘌呤A。

其中，EcTP粗酶液的浓度为10 OD/ml、不同来源PNP（ExPNP、BhPNP和AhDEOD）粗酶液的浓度为5 OD/ml、2'-F-dUR的浓度为50mM、腺嘌呤A的浓度为50mM将混合液在50℃，220rpm催化反应10小时，得到转化液。

将上述得到的转化液于4℃，12000rpm，离心5min，取上清。

用0.22μM的滤膜过滤上清，收集滤液进行HPLC检测2'-F-dAR的产量。HPLC采用YMCTriart C18柱，流动相：80% 25mM K₂HPO₄-KH₂PO₄（pH6.8）和20%甲醇，流速为0.6ml/min，柱温40℃，进样10μl，检测波长260nm。

结果如图2所示，2'-F-dAR标准品的保留时间为14.095 min。

如图3所示，A标准品的保留时间为7.994 min。

如图4所示，2'-F-dUR标准品的保留时间为7.171 min。

如图5所示，U标准品的保留时间为5.389 min。

如图6所示，转化液中也有保留时间为14.087 min的峰值。

需要说明的是，保留时间是指化合物在色谱柱中从进样点到峰顶的时间。保留时间是一种常用的色谱参数，用于鉴定和定量分析化合物。

保留时间的不同可以用于鉴别和区分不同的物质。在色谱图中，每个峰都代表一个特定的物质，而不同的物质峰将出现在不同的时间点。通过比较标准品和样品的保留时间，可以确定样品中是否存在与标准品相同的化合物。如果保留时间基本一致，则可以认为样品中存在与标准品相同的化合物，如果保留时间不同，则可以认为样品中与标准品所代表的化合物不同。

结合图2-图6可知，图6的转化液的保留时间与图2中的2'-F-dAR标准品基本一致，与图2-图5所对应的标准品的保留时间相差较大，可以表明转化液中存在2'-F-dAR，即表明采用2'-F-dUR和A为底物生成了2'-F-dAR，即2'-脱氧-2-氟腺苷。

在分析过程中，还可以通过测定保留时间来辅助判断反应的进行情况，用于定量分析。通过建立标准曲线，可以确定样品中目标化合物的含量。标准曲线的制作需要使用已知浓度的标准品，测量它们的保留时间和峰面积，然后根据这些数据拟合出一条曲线。通过比较样品中目标化合物的保留时间和峰面积与标准曲线，可以确定样品中目标化合物的含量，从而计算得到转化率。

采用上述制备方法制备得到2'-F-dAR，可催化50mM 2'-F-dUR生成2'-F-dAR1.76mM。转化率是以产物和底物的比值，可知，转化率3.52%。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述制备方法为：

将EcTP粗酶液、PNP粗酶液、2'-F-dUR和腺嘌呤A混合成混合液，再将混合液进行催化反应，得产物，产物即 2'-脱氧-2-氟腺苷。

2.依据权利要求1所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于， PNP粗酶液采用ExPNP粗酶液、BhPNP粗酶液或者AhDEOD粗酶液。

3.依据权利要求1所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述EcTP粗酶液的制备过程包括如下步骤：

EcTP基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体EcTP；

连接液EcTP转化Top10感受态细胞，得到阳性重组质粒pBAD-EcTP；

原核表达菌株pBAD-EcTP-BW25113在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基中振荡培养过夜后，按体积比1%比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL 2YT液体培养基中振荡培养，得到培养液EcTP；

4.依据权利要求2所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述AhDEOD粗酶液的制备过程包括如下步骤：

AhDEOD基因片段重组到PUC57载体上，得到重组载体AhDEOD；

原核表达菌株pBAD-AhDEOD-BW25113在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL 2YT液体培养基中振荡培养过夜后，按体积比1%比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL 2YT液体培养基中振荡培养，得到培养液AhDEOD；

5.依据权利要求4所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述ExPNP粗酶液和BhPNP粗酶液的制备过程与AhDEOD粗酶液的制备过程一致。

6.依据权利要求3所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述EcTP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

7.依据权利要求5所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，所述AhDEOD基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述ExPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述BhPNP基因片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

8.依据权利要求3或4所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，进行连接过夜时，温度设为16℃。

9.依据权利要求3或4所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，振荡培养时，培养条件设为37℃、220rpm；

进行诱导过夜时，温度设为30℃。

10.依据权利要求1所述2'-脱氧-2-氟腺苷的双酶催化制备方法，其特征在于，进行催化反应时，反应条件设为50℃，220rpm，10小时。