CN117603938A - 一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用方法 - Google Patents

一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于2'‑脱氧腺苷的酶催化技术领域，本发明提供了一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用方法，利用突变型脱氧核糖转移酶NDT制备2'‑脱氧腺苷，催化脱氧核糖在嘌呤和嘧啶之间的转移。本发明公开的脱氧核糖转移酶突变体其氨基酸序列由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列，其中，X选自W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K中的任意一种。该脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性，可用于生产2'修饰性脱氧核糖核苷，简化现有的生产步骤，具有成本低、环保、转化率高、工艺操作简单等特点。

Description

一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用 方法
技术领域
本发明涉及2′-脱氧腺苷的酶催化技术领域，具体涉及到一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用方法。
背景技术
脱氧核糖转移酶(Deoxyribose Transferase)是一类酶，它们在生物学中扮演重要的角色，特别是在DNA修复和DNA修饰过程中。这些酶的主要功能是催化脱氧核糖的转移，通常涉及将一个脱氧核糖(2′-脱氧核糖)从一个核苷酸分子转移到另一个核苷酸分子上的特定位置。
不同的脱氧核糖转移酶可能具有不同的底物特异性和催化机制，但它们通常在以下方面发挥作用：
DNA修复：某些脱氧核糖转移酶参与DNA修复机制，例如，它们可以帮助修复DNA中的损伤碱基或单链断裂。
DNA修饰：一些酶可以在DNA上催化脱氧核糖的转移，改变DNA分子的结构或碱基组成，这可能在调控基因表达或其他细胞过程中发挥重要作用。
RNA修饰：脱氧核糖转移酶也可以在RNA分子上进行碱基转移，改变RNA的性质和功能，包括在RNA修饰中发挥作用。
在DNA和RNA中，不同类型的修饰性核苷在细胞中具有不同的生物学功能，它们可以影响DNA和RNA的稳定性、修复、翻译和调控，比如，2′-修饰性脱氧核糖核苷。2′-修饰性脱氧核糖核苷是指脱氧核糖核苷分子中，其2′-位置的脱氧核糖上带有化学修饰或附加基团。这些修饰性核苷可能包括不同的功能性基团，如甲基、磷酸基、碳酰基、糖基或其他化学基团，这些基团可以改变核苷的性质和功能。
2′-修饰性脱氧核糖核苷其中包括有2′-脱氧胸苷、2′-脱氧腺苷。
2′-脱氧腺苷(dAR)是DNA的结构组成部分，它在生物细胞中起着至关重要的角色，包括参与遗传信息传递、蛋白质合成以及多聚糖代谢等生命过程。由于其生物活性，2′-脱氧腺苷被广泛应用于合成寡聚核苷酸和基因工程的研究。
研究发现，经过化学改造的2′-脱氧腺苷类似物具有抗肿瘤活性，其中Fludarabine和Cladribine是代表性药物，用于治疗慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴癌。此外，2′-脱氧腺苷也是合成一些抗HIV病毒药物的重要中间体。
尽管2′-脱氧腺苷在医药领域具有广泛应用，但其合成方法研究尚不够深入。因此，深入研究2′-脱氧腺苷的合成方法具有重要的理论意义，可以为进一步拓展医药领域的应用提供更多可能性。
2′-脱氧腺苷之所以通常只能通过化学合成方式制备，是因为自然界中并没有直接提供2′-脱氧腺苷的可用来源。2′-脱氧腺苷是一种特定的核苷酸，它包括腺嘌呤碱基和2′-脱氧核糖。这个特定的化学结构在自然界中不会独立产生，因此无法从天然生物体或生物过程中直接提取。
在现有技术合成2′-脱氧腺苷的方法中，2′-脱氧胸苷是一个较为简单的分子，它不包含那些复杂的结构。科学家使用2′-脱氧胸苷作为起点去制造2′-脱氧腺苷，因为这更容易合成。简而言之，使用2′-脱氧胸苷来制造2′-脱氧腺苷是为了更容易地制备一种对DNA构建和修复非常重要的分子，这有助于医学研究和治疗的发展。
然而，起到催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移的脱氧核糖转移酶存在如下问题：
脱氧核糖转移酶(Nucleoside 2’deoxyribosyltransferases)，根据底物特异性的不同可以分为两类：
一类为N脱氧核糖转移酶I(Nucleoside 2’deoxyribosyltransferase I，PDT)，只能催化脱氧核糖在嘌呤之间转移；
另一类为N脱氧核糖转移酶II(Nucleoside 2’deoxyribosyltransferase II，NDT)，催化脱氧核糖在嘌呤和嘧啶之间的转移。
现有的这两类N脱氧核糖转移酶大部分只能对糖基上未带有修饰的脱氧核糖核苷底物有催化反应活性，但对糖基上带有修饰基团(例如第3位碳原子带有氨基或叠氮基修饰)的脱氧核糖核苷，则不能催化脱氧核糖在不同碱基间的转移。这是由于以下原因：
3D结构特异性：N-脱氧核糖转移酶通常依赖于特定的底物结构，包括糖基的三维构象。带有修饰基团的脱氧核糖核苷可能会改变其空间构象，导致酶无法正确识别和结合。
化学特异性：N-脱氧核糖转移酶通常通过氢键、离子相互作用和疏水相互作用等特定的化学相互作用来与底物结合和催化反应。带有修饰基团的脱氧核糖核苷可能会干扰这些相互作用，从而影响酶的活性。
酶活性位点：N-脱氧核糖转移酶通常具有特定的活性位点，用于催化脱氧核糖的转移反应。带有修饰基团的脱氧核糖核苷可能无法正确与这些活性位点发生相应的反应。
现有技术中，为了实现糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷的脱氧核糖转移需要多个反应步骤，操作繁琐，成本高，因为这个过程涉及到一系列复杂的生物化学和分子生物学反应，需要确保高度精确性和特异性。具体如下：
竞争底物：细胞中存在多种不同的核苷酸，每种核苷酸都有特定的碱基和修饰基团。而脱氧核糖转移酶通常需要特定的底物来执行反应，多步骤反应可以提高底物的选择性，减少竞争底物和副产物的形成。
底物激活和酶激活：在多步骤反应中，一些步骤可能用于激活底物或酶，以确保反应能够进行。
负反馈和控制：多步骤反应提供了更多机会来实现负反馈和控制，以确保反应在合适的时间和条件下进行。这有助于维持反应的平衡和可控性。
中间产物的生成：多步骤反应可能需要生成中间产物，这些中间产物在后续步骤中发挥作用，有助于完成整个反应过程。
活性位点的变化：一些脱氧核糖转移酶可能需要在多个步骤中改变其活性位点的构象，以允许底物的转移和催化。
基于此，本发明提供一种脱氧核糖转移酶突变体，可以直接作为催化剂，用于催化底物即2′修饰性脱氧核糖核苷与碱基的脱氧核糖转移的反应，生产一种新的2′修饰性脱氧核糖核苷。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种脱氧核糖转移酶突变体及其制备方法、应用以及使用方法，具体方案如下：
第一方面，本发明提供一种脱氧核糖转移酶突变体，所述的脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：
由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列；
其中，x选自W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K中的任意一种。
SEQ ID NO：1为现有的脱氧核糖转移酶，其仅能实现对糖基上未带有修饰基团的脱氧核糖核苷的脱氧核糖转移，其对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷则没有催化脱氧核糖转移的活性。
在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K后，得到的脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性。
基于此，本发明提供的脱氧核糖转移酶突变体可以作为催化剂，用于催化底物即2′修饰性脱氧核糖核苷(其自身的碱基类别与底物碱基类别不同)与碱基的脱氧核糖转移的反应，生产一种新的2′修饰性脱氧核糖核苷。
需要说明的是，在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员在不付出创造性的情况下，容易在此基础上进行常规的一个或多个氨基酸替换、增加以及缺失等以得到具有与前述突变序列至少80％以上、优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的同源性，且具有相同的生物活性(即对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性)的衍生序列，这些衍生序列均属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供一种载体，所述载体为核酸分子时，核酸分子是一种分离的核酸分子，能编码所述的脱氧核糖转移酶突变体。
需要说明的是，根据密码子的简并性，本领域技术人员在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，容易得到编码这些突变体的核苷酸序列，无论何种核苷酸序列，只要其编码前述的脱氧核糖转移酶突变体均属于本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明提供的核酸分子的长度并不限于仅具有前述编码脱氧核糖转移酶突变体的核酸序列长度。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在核酸分子的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，这种情形的核酸分子也是属于本发明的保护范围。
第三方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有前述所述的载体。
需要说明的是，适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BW25113细胞。无论何种形式的宿主细胞，只要其含有前述的核酸分子、表达盒、或者其他载体，其均属于本发明的保护范围。
第四方面，本发明提供一种细胞培养物，其含有前述所述的宿主细胞。
第五方面，本发明提供一种脱氧核糖转移酶突变体的制备方法，所述制备方法为：
选用氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变的脱氧核糖转移酶NDT，以脱氧核糖转移酶NDT、表达载体pBAD-hisB以及大肠杆菌BW25113配合反应得到pBAD-NDT-BW25113，重组pBAD-NDT-BW25113-wt作为DNA模板，以SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：39的序列为引物，利用定点突变手段，以pBAD-hisB为表达载体，获得带有突变基因的突变质粒，将得到的不同突变质粒分别化转大肠杆菌BW25113中，得到对应的不同突变体。
需要说明的是，在本发明公开了前述脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易想到通过基因工程技术手段(例如培养前述所述的宿主细胞，从所述的细胞培养物中分离纯化得到前述的脱氧核糖转移酶突变体)或其他手段(如化学合成手段)等制备或生产得到本发明的脱氧核糖转移酶突变体，无论以何种方法制备或生产本发明的脱氧核糖转移酶突变体，其均属于本发明的保护范围。
第六方面，本发明提供一种脱氧核糖转移酶突变体的应用，所述的脱氧核糖转移酶突变体来自前述实施方式所述的载体、前述实施方式所述的宿主细胞或者前述实施方式所述的细胞培养物；
脱氧核糖转移酶突变体作为催化剂，用于催化2′修饰性脱氧核糖核苷上的脱氧核糖发生碱基上的转移。
换句话说，本发明也是提供了一种前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体、前述实施方式所述的宿主细胞、前述实施方式所述的载体、或者该宿主细胞的细胞培养物在制备2′修饰性脱氧核糖核苷中的应用。
需要说明的是，基于前述的脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到将含有脱氧核糖转移酶突变体的混合物(例如含有该脱氧核糖转移酶突变体的载体、宿主细胞、或细胞培养物)用于制备2′修饰性脱氧核糖核苷，也就是说，只要是利用前述脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性来制备2′修饰性脱氧核糖核苷，无论以何种形式将脱氧核糖转移酶突变体添加到反应体系中，均属于本发明的保护范围。
第七方面，本发明提供一种所述的脱氧核糖转移酶突变体的使用方法，所述的脱氧核糖转移酶突变体、载体、宿主细胞或者细胞培养物，与底物接触进行催化反应，所述底物包括2′修饰性脱氧核糖核苷和碱基。
上述的使用方法为一种催化2′修饰性脱氧核糖核苷的2′修饰性脱氧核糖转移至碱基的方法，本发明提供的催化方法利用前述脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性，将其催化2′修饰性脱氧核糖核苷和碱基的反应，一步即可完成脱氧核糖糖基在碱基与碱基间的转移，该脱氧核糖转移反应实质上是进行了碱基的交换，生成另一种2′修饰性脱氧核糖核苷。
相比于现有的需要多步骤化学反应完成的脱氧核糖转移步骤，大大地节约了反应步骤，也节省了相应的原料成本。
在可选的实施方式中，所述2′修饰性脱氧核糖核苷为2′-脱氧胸苷，所述碱基为腺嘌呤。在这两种底物存在的条件下，生成的物质是2′-脱氧腺苷和胸腺嘧啶。正是因为本发明的脱氧核糖转移酶突变体，进行催化，可以快速将一种2′修饰性脱氧核糖核苷(2′-脱氧胸苷)转化成另一种2′修饰性脱氧核糖核苷(2′-脱氧腺苷)。
在可选的实施方式中，在pH4.34.7、4555℃条件下进行所述催化反应。在pH4.34.7和4555℃条件下，前述的脱氧核糖转移酶突变体具有较好的催化活性，产物的产率较高。
需要说明的是，进行催化反应的pH和温度并不限于上述条件，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到在其他pH和温度下进行反应，无论何种条件，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，进行所述催化反应时，反应体系含有4852mM 2′-脱氧胸苷和4555mM腺嘌呤。
需要说明的是，进行催化反应时，底物的含量可以根据情况调整，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到采用合适浓度的底物和脱氧核糖转移酶突变体，这些物质无论以何种浓度进行催化反应，均属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明中，在N脱氧核糖转移酶II氨基酸序列的一些特定位点上的突变获得的一系列突变体，所述突变体的转糖基活性发生显著的提高，作为催化剂时，催化底物即2′修饰性脱氧核糖核苷与碱基的脱氧核糖转移的反应，生产一种新的2′修饰性脱氧核糖核苷，使得2′-脱氧胸苷可以以较高的转化率合成得到2′-脱氧腺苷，有助于医学研究和治疗的发展。
附图说明
图1为本发明的2′-脱氧胸苷合成2′-脱氧腺苷的反应流程图；
图2为2′-脱氧腺苷标准品的HPLC检测图谱；
图3为2′-脱氧胸苷标准品的HPLC检测图谱；
图4为腺嘌呤标准品的HPLC检测图谱；
图5为胸腺嘧啶标准品的HPLC检测图谱；
图6为转化产物的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。
针对2′-修饰性脱氧核糖核苷由酶催化发生碱基转移的反应，第一方面，本发明提供一种脱氧核糖转移酶突变体，该种脱氧核糖转移酶突变体作为催化剂，用于催化底物即2′修饰性脱氧核糖核苷与碱基的脱氧核糖转移的反应，生产一种新的2′修饰性脱氧核糖核苷。
所述的脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：
由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列；
其中，X选自W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K中的任意一种。
SEQ ID NO：1为现有的脱氧核糖转移酶，其仅能实现对糖基上未带有修饰基团的脱氧核糖核苷的脱氧核糖转移，其对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷则没有催化脱氧核糖转移的活性。
在本发明中，将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K后，得到的脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性。
需要说明的是，在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员在不付出创造性的情况下，容易在此基础上进行常规的一个或多个氨基酸替换、增加以及缺失等以得到具有与前述突变序列至少80％以上、优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的同源性，且具有相同的生物活性(即对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性)的衍生序列，这些衍生序列均属于本发明的保护范围。
该种脱氧核糖转移酶突变体在具体使用时，存在多种使用形式，本发明不做限制，本领域技术人员在不付出创造性的情况下，可以进行实验，对此，这些衍生出来的使用形式均属于本发明的保护范围。
在可实施的方式一中，本发明提供一种载体，载体为核酸分子时，核酸分子是一种分离的核酸分子，能编码所述的脱氧核糖转移酶突变体。
需要说明的是，根据密码子的简并性，本领域技术人员在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，容易得到编码这些突变体的核苷酸序列，无论何种核苷酸序列，只要其编码前述的脱氧核糖转移酶突变体均属于本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明提供的核酸分子的长度并不限于仅具有前述编码脱氧核糖转移酶突变体的核酸序列长度。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在核酸分子的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，这种情形的核酸分子也是属于本发明的保护范围。
在可实施的方式二中，本发明提供一种宿主细胞，其含有前述所述的载体。
需要说明的是，适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BW25113细胞。无论何种形式的宿主细胞，只要其含有前述的核酸分子、表达盒、或者其他载体，其均属于本发明的保护范围。
在可实施的方式三中，本发明提供一种细胞培养物，其含有前述所述的宿主细胞。
另外，本发明还提供一种脱氧核糖转移酶突变体的制备方法，制备方法为：
选用氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变的脱氧核糖转移酶NDT，以脱氧核糖转移酶NDT、表达载体pBAD-hisB以及大肠杆菌BW25113配合反应得到pBAD-NDT-BW25113，重组pBAD-NDT-BW25113-wt作为DNA模板，以SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：39的序列为引物，利用定点突变手段，以pBAD-hisB为表达载体，获得带有突变基因的突变质粒，将得到的不同突变质粒分别化转大肠杆菌BW25113中，得到对应的不同突变体。
需要说明的是，在本发明公开了前述脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易想到通过基因工程技术手段(例如培养前述所述的宿主细胞，从所述的细胞培养物中分离纯化得到前述的脱氧核糖转移酶突变体)或其他手段(如化学合成手段)等制备或生产得到本发明的脱氧核糖转移酶突变体，无论以何种方法制备或生产本发明的脱氧核糖转移酶突变体，其均属于本发明的保护范围。
另外，本发明还提供一种脱氧核糖转移酶突变体的应用，所述的脱氧核糖转移酶突变体来自前述实施方式所述的载体、前述实施方式所述的宿主细胞或者前述实施方式所述的细胞培养物；
脱氧核糖转移酶突变体作为催化剂，用于催化2′修饰性脱氧核糖核苷上的脱氧核糖发生碱基上的转移。
换句话说，本发明也是提供了一种前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体、前述实施方式所述的宿主细胞、前述实施方式所述的载体、或者该宿主细胞的细胞培养物在制备2′修饰性脱氧核糖核苷中的应用。
需要说明的是，基于前述的脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到将含有脱氧核糖转移酶突变体的混合物(例如含有该脱氧核糖转移酶突变体的载体、宿主细胞、或细胞培养物)用于制备2′修饰性脱氧核糖核苷，也就是说，只要是利用前述脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性来制备2′修饰性脱氧核糖核苷，无论以何种形式将脱氧核糖转移酶突变体添加到反应体系中，均属于本发明的保护范围。
另外，本发明还提供一种所述的脱氧核糖转移酶突变体的使用方法，所述的脱氧核糖转移酶突变体、载体、宿主细胞或者细胞培养物，与底物接触进行催化反应，所述底物包括2′修饰性脱氧核糖核苷和碱基。
上述的使用方法为一种催化2′修饰性脱氧核糖核苷的2′修饰性脱氧核糖转移至碱基的方法，本发明提供的催化方法利用前述脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性，将其催化2′修饰性脱氧核糖核苷和碱基的反应，一步即可完成脱氧核糖糖基在碱基与碱基间的转移，该脱氧核糖转移反应实质上是进行了碱基的交换，生成另一种2′修饰性脱氧核糖核苷。
相比于现有的需要多步骤化学反应完成的脱氧核糖转移步骤，大大地节约了反应步骤，也节省了相应的原料成本。
在可选的实施方式中，如图1，所述2′修饰性脱氧核糖核苷为2′-脱氧胸苷，所述碱基为腺嘌呤。在这两种底物存在的条件下，生成的物质是2′-脱氧腺苷和胸腺嘧啶。
在可选的实施方式中，在pH4.34.7、4555℃条件下进行所述催化反应。在pH4.34.7和4555℃条件下，前述的脱氧核糖转移酶突变体具有较好的催化活性，产物的产率较高。
需要说明的是，进行催化反应的pH和温度并不限于上述条件，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到在其他pH和温度下进行反应，无论何种条件，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，进行所述催化反应时，反应体系含有4852mM 2′-脱氧胸苷和4555mM腺嘌呤。
需要说明的是，进行催化反应时，底物的含量可以根据情况调整，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到采用合适浓度的底物和脱氧核糖转移酶突变体，这些物质无论以何种浓度进行催化反应，均属于本发明的保护范围。
针对上述内容，本发明提出如下实施例。
以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
载体pBAD/HisB：购自Invitrogen公司，产品目录号：V430-01。
大肠杆菌BW25113：购自Biovector NTCC INC，货号为355297。
2′-脱氧胸苷：购自Macklin，货号为T807542。
2′-脱氧腺苷标准品：购自Boer，货号为B641770。
腺嘌呤标准品：购自Macklin，货号为A800684。
胸腺嘧啶标准品：购自Macklin，货号为T819296。
实施例1
构建重组菌以及构建突变体文库
本发明实施例1中的脱氧核糖转移酶NDT来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，下文简写为NDT。所述脱氧核糖转移酶NDT的氨基酸序列如序列SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：Met Ile Asn Gln Lys Ser Lys Thr Val Tyr Phe Cys Ala GlyTrp Phe Thr Asp Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Glu Asp Ala Met Asn Ala Ile Lys AlaAsn Pro Thr Val Asp Val Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Gln His Gln Tyr Lys GlyLeu Arg Val Asp Glu His Pro Glu Leu Ile Gln Asp Arg Glu Trp Ser Thr Ala ThrTyr Asn Gly Asp Arg Val Gly Val Ser Thr Ser Asp Met Leu Leu Ala Val TyrIlePro Glu Glu Glu Asp Val Gly Met Gly Val Glu Leu Gly Met Ala Arg Ala Leu GlyLys TyrIle Met Val Val Ile Pro Asp Glu Asp Phe Gly Lys Pro Ile Asn Leu MetSer Trp Gly Ile Ala Asp Asn Phe Ile Lys Met Ser Glu Leu Pro Asn Tyr Asp PheAsn Vys Pro Ser Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly GlyVal Tyr
需要说明的是，上述SEQ ID NO.1序列中的氨基酸一共160个，比如，Asn为天冬氨酸(Asparagine)的缩写，其对应的一字母缩写为N。
脱氧核糖转移酶NDT为N脱氧核糖转移酶II，所述脱氧核糖转移酶NDT的氨基酸突变序列SEQ ID NO：1存在选自下组的任一突变：
第12位C→W；
第12位C→H；
第12位C→I；
第12位C→P；
第12位C→N；
第12位C→V；
第12位C→A；
第12位C→L；
第12位C→Q；
第12位C→S；
第12位C→T；
第12位C→D；
第12位C→Y；
第12位C→F；
第12位C→E；
第12位C→G；
第12位C→M；
第12位C→R；
第12位C→K；
构建重组菌的具体过程如下：
脱氧核糖转移酶NDT所对应的NDT基因片段由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上，得到重组载体PUC57-NDT。
重组载体PUC57-NDT经限制性内切酶Xho I和Spe I(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切2h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到酶切片段NDT。
随后，酶切片段NDT经过同样双酶切的表达载体pBAD-hisB(购买自Invitrogen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下于16℃连接过夜，得到连接液NDT。连接液NDT转化T1感受态细胞(购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，并进行测序验证，从而得到阳性重组质粒pBAD-NDT。将阳性重组质粒pBAD-NDT转化表达宿主菌大肠杆菌BW25113(购自Biovector NTCC)，得到原核表达菌株pBAD-NDT-BW25113，其表达的酶为LRNDT。
以重组pBAD-NDT-BW25113 wt为DNA模板，以下表1中序列为引物，利用定点突变手段，以pBAD-hisB为表达载体，获得带有突变基因的突变质粒，其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除以及点突变等。
表1
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构建突变体文库的具体过程如下：
PCR的体系以及条件如下，采用ApexHFHSDNA聚合酶进行：
单个PCR反应液体积：50μL；其含有如下组分：
ApexHFHSDNA 2x：25μL；
正反向(10pm)/反向引物(10pm)：1.5μL+1.5μL；
野生型质粒(含有SEQ ID NO：1的pBAD-NDT-BW25113wt质粒10ng/μL)：1μL；
水：22μL。
PCR反应条件：98℃10min，98℃10s、55℃30s、72℃4min，35cycles，72℃10mins，4℃forever。
PCR结束后，往上述PCR反应液加入1.5μL Dpn I(20U/μL)，37℃，3h。
将得到的不同突变质粒分别化转大肠杆菌BW25113中，得到不同的突变体，所有的突变体构成突变体文库。
需要说明的是，从构建突变体文库的过程可知，上述野生型质粒通过人为操作在特定区域引入所需的突变，形成了突变质粒。
实施例2
NDT突变体粗酶液的制备
上述实施例1构建的NDT突变体菌株在加有终浓度为50μg/ml链霉素的5mL2YT液体培养基(0.5％NaCl、1％酵母提取物、1.6％胰蛋白胨)中，37℃、220rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为50μg/ml链霉素的100mL2YT液体培养基中，于37℃、220rpm振荡培养，得到NDT突变体培养液。
待NDT突变体培养液的OD600为0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.2mM的诱导剂阿拉伯糖诱导，25℃诱导过夜，分别得诱导后的NDT突变体菌液。
诱导后的NDT突变体菌液在4℃、8000rpm条件下离心10min，收集菌体，悬浮于50mM柠檬酸-柠檬酸钠pH4.5缓冲液中，超声破碎(200W，5s/7s，20min)，即得到NDT突变体粗酶液。
实施例3
野生型脱氧核糖转移酶和突变脱氧核糖转移酶的催化活性检测
向实施例2制备的多种NDT突变体粗酶液中分别加入2′-脱氧胸苷和腺嘌呤。其中，在50mM柠檬酸-柠檬酸钠pH4.5的反应体系中，NDT粗酶液的浓度为1OD/ml、2′-脱氧胸苷的浓度为50mM、腺嘌呤的浓度为50mM、将混合液在50℃，220rpm催化反应4小时，得到转化液。
催化反应结束后，将上述得到的转化液于100℃沸水浴中热处理10min，热处理结束后于4℃，12000rpm，离心5min，取上清。
用0.22μM的滤膜过滤上述得到的上清，收集滤液进行HPLC检测2′-脱氧腺苷的产量。HPLC采用YMC Triart C18柱，流动相：10％甲醇+90％25mM磷酸钾缓冲液(K2HPO4-KH2PO4，pH6.8)，流速为0.55ml/min，柱温40℃，进样10μl，检测波长260nm。
同时，以野生型LRNDT的酶液采用上述同样的过程进行转化、HPLC检测。
需要说明的是，HPLC(高效液相色谱法)是一种常用的分离和分析方法，可以用于检测和测量2′-脱氧腺苷的产量。
要测量2′-脱氧腺苷的产量，可以在HPLC实验中收集分离后的2′-脱氧腺苷组分，并使用适当的标准品进行对比和定量。标准品的制备可以参考相关的文献或使用已知浓度的标准品进行制备。本实施例3中，采用的是2′-脱氧腺苷标准品、2′-脱氧胸苷标准品、腺嘌呤标准品、胸腺嘧啶标准品。
在具体进行HPLC实验中，可以使用单标准品或多个标准品来建立标准曲线，以更准确地测量样品中目标化合物的含量。本实施例3中，将四种标准品和转化液样品一起注入色谱柱中，通过比较它们之间的保留时间和峰面积或峰高进行对比和定量。
结果，以C12G对应的突变位点为例，如图2所示，2′-脱氧腺苷标准品的保留时间为34.981min。
如图3所示，2′-脱氧胸苷标准品的保留时间为20.506min。
如图4所示，腺嘌呤标准品的保留时间为15.186min。
如图5所示，胸腺嘧啶标准品的保留时间为12.139min。
如图6所示，转化液中也有保留时间为35.021min的峰值。
需要说明的是，保留时间是指化合物在色谱柱中从进样点到峰顶的时间。保留时间是一种常用的色谱参数，用于鉴定和定量分析化合物。
保留时间的不同可以用于鉴别和区分不同的物质。在色谱图中，每个峰都代表一个特定的物质，而不同的物质峰将出现在不同的时间点。通过比较标准品和样品的保留时间，可以确定样品中是否存在与标准品相同的化合物。如果保留时间基本一致，则可以认为样品中存在与标准品相同的化合物，如果保留时间不同，则可以认为样品中与标准品所代表的化合物不同。
结合图2-图6可知，图6的转化液的保留时间与图2中的2′-脱氧腺苷标准品基本一致，与图2-图5所对应的标准品的保留时间相差较大，可以表明采用2′-脱氧胸苷和腺嘌呤为底物生成了2′-脱氧腺苷。
在分析过程中，还可以通过测定保留时间来辅助判断反应的进行情况，用于定量分析。通过建立标准曲线，可以确定样品中目标化合物的含量。标准曲线的制作需要使用已知浓度的标准品，测量它们的保留时间和峰面积，然后根据这些数据拟合出一条曲线。通过比较样品中目标化合物的保留时间和峰面积与标准曲线，可以确定样品中目标化合物的含量，从而计算得到转化率。
例如，在2′-脱氧胸苷合成2′-脱氧腺苷的反应中，如果2′-脱氧胸苷和2′-脱氧腺苷具有不同的保留时间，则可以通过测定保留时间的变化来确定反应是否已经发生，并进一步计算转化率。
在本实施例3中，实验设置三次重复，取平均值。经过筛选验证，野生型和突变体的突变情况、转化率和突变位点如下表2。
表2
菌株(突变位点) dAR(含量) 转化率
LRNDT 24.20 48.40％
C12W 6.37 12.73％
C12H 5.38 10.76％
C12I 18.05 36.10％
C12P 6.44 12.88％
C12N 13.93 27.85％
C12V 31.36 62.72％
C12A 21.01 42.01％
C12L 6.95 13.91％
C12Q 10.12 20.24％
C12S 12.27 24.54％
C12T 19.67 39.34％
C12D 17.90 35.81％
C12Y 7.53 15.06％
C12F 6.80 13.59％
C12E 14.00 28.00％
C12G 32.08 64.16％
C12M 23.65 47.30％
C12R 3.87 7.75％
C12K 6.75 13.49％
从表2中可知，LRNDT代表现有技术中野生型的脱氧核糖转移酶，C12W、C12H、C12I、C12P、C12N、C12V、C12A、C12L、C12Q、C12S、C12T、C12D、C12Y、C12F、C12E、C12G、C12M、C12R以及C12K分别代表对应十九种不同突变位点的突变型的脱氧核糖转移酶，可知，采用不同的突变脱氧核糖转移酶催化2′-脱氧胸苷和腺嘌呤时，得到的2′-脱氧腺苷的转化率不同。
以突变位点在C12G的突变脱氧核糖转移酶对应的转化率最高，以突变位点在C12V的突变脱氧核糖转移酶对应的转化率次之，且均远远高于野生型的脱氧核糖转移酶。
也就是说，C12G和C12V相比野生型活力明显提高，野生型的转化率只有48.4％，C12G和C12V的转化率分别达64.16％和62.72％。其余突变体的活力明显降低。其他17种的突变脱氧核糖转移酶对应的转化率虽然小于或者接近于野生型的脱氧核糖转移酶，但是不可否认的是，这些突变脱氧核糖转移酶均对2′-脱氧胸苷和腺嘌呤具有一定的催化活性。
需要说明的是，本发明的突变脱氧核糖转移酶是为了解决现有的脱氧核糖转移酶不能催化糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷(2′-脱氧胸苷)的脱氧核糖转移，而表2中19种的突变脱氧核糖转移酶明显对2′-脱氧胸苷和腺嘌呤具有一定的催化活性，才能生成2′-脱氧腺苷。至于转化率存在不同，在实际使用时，可以根据需求选定不同突变位点的突变脱氧核糖转移酶。
另外，在作者为刘国生等人所提出的固定化细胞转化脱氧胸苷合成2′-脱氧腺苷的一文中，虽然提出了采用载体包埋固定化AEM0957细胞酶促催化脱氧胸苷和腺嘌呤合成脱氧腺苷，方法分别用琼脂、聚丙烯酰胺等6种材料包埋固定细菌AEM0957细胞，以此为催化剂转化脱氧胸苷合成脱氧腺苷，结果通过优化反应条件，聚丙烯酰胺固定化细胞催化脱氧胸苷的转化率可达57％。
然而，本发明中，以突变位点在C12G、C12V的突变脱氧核糖转移酶对应的转化率还高于57％，可知，本发明的脱氧核糖转移酶突变体具有较好的催化活性，产物的产率较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种脱氧核糖转移酶突变体，其特征在于，所述的脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：
由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列；
其中，X选自W、H、I、P、V、N、A、L、Q、S、T、D、Y、F、E、G、M、R和K中的任意一种。
2.一种载体，其特征在于，所述载体为核酸分子时，所述核酸分子的核苷酸序列可编码所述权利要求1中的脱氧核糖转移酶突变体。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含所述权利要求2中的载体。
4.一种细胞培养物，其特征在于，所述细胞培养物包含所述权利要求3中的宿主细胞。
5.一种根据所述权利要求1的脱氧核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
选用氨基酸序列的第12位氨基酸残基突变的脱氧核糖转移酶NDT，以脱氧核糖转移酶NDT、表达载体pBAD-hisB以及大肠杆菌BW25113配合反应得到pBAD-NDT-BW25113，重组pBAD-NDT-BW25113-wt作为DNA模板，以SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：39的序列为引物，利用定点突变手段，以pBAD-hisB为表达载体，获得带有突变基因的突变质粒，将得到的不同突变质粒分别化转大肠杆菌BW25113中，得到对应的不同突变体。
6.一种脱氧核糖转移酶突变体的应用，其特征在于，所述的脱氧核糖转移酶突变体来自权利要求2的载体、权利要求3的宿主细胞或者权利要求4中的细胞培养物；
脱氧核糖转移酶突变体作为催化剂，用于催化2′修饰性脱氧核糖核苷上的脱氧核糖发生碱基上的转移。
7.一种根据权利要求6所述的脱氧核糖转移酶突变体的使用方法，其特征在于，所述使用方法为：
所述的脱氧核糖转移酶突变体、载体、宿主细胞或者细胞培养物，与底物接触进行催化反应，所述底物包括2′修饰性脱氧核糖核苷和碱基。
8.根据权利要求7所述的脱氧核糖转移酶突变体的使用方法，其特征在于，所述催化反应的反应条件为：pH4.3-4.7、4555℃。
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