CN104357495A - 一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的方法是在重组细胞共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同时表达多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因中的任意一个或两个。本发明所提供的方法在重组细胞内构建了一种新的合成间苯三酚的途径，大大提高了间苯三酚的产量，相对于对照组，间苯三酚产量提高幅度达到68.9％。同时本发明所提供的方法还降低了间苯三酚合成过程中二氧化碳的排放，具有良好的环境效益。

Description

一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯、均苯三酚，是重要的精细化工产品，可以用作药物合成的中间体、燃料耦合剂、轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料，在纺织品及皮革染色工艺、生产塑料胶囊、替代碘化银用于人工降雨等方面有广泛应用。除此之外，间苯三酚本身还是一种优良的医药产品，性能优越的抗养护剂，早已广泛用于抗菌、防腐等。
早在20世纪50年代，间苯三酚的化学合成工艺就已经建立起来并应用到工业生产中，包括2,4,6-三硝基甲苯(TNT)途径、1,3,5-三异丙基苯途径等。但传统的化学合成工艺后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患，同时副产物的存在使得间苯三酚的分离精制比较困难。
近年来，生物法合成间苯三酚已成为国内外的研究热点。目前，咸漠等已利用葡萄糖为原料，生物合成出间苯三酚，并通过基因工程改造提高了间苯三酚的产量。间苯三酚的生物合成途径可划分为两个阶段，第一阶段1分子葡萄糖经过糖酵解过程，形成2分子乙酰辅酶A和2分子二氧化碳；第二阶段3分子的乙酰辅酶A合成1分子的间苯三酚。所以，总体而言，该合成途径存在碳损失，造成间苯三酚产量偏低。
如果能避免糖酵解过程中碳的损失，将有效提高生物法合成间苯三酚的产率，使该过程更加具有经济性。I.W.,Bogorad等人(2013)提出细胞除了在有氧的条件存在糖酵解途径(MEP途径)以外，在厌氧条件下还存在一条非氧化的糖酵解途径(NOG途径)，该途径可将1分子葡萄糖转化为3分子乙酰磷酸，进而合成3分子乙酰辅酶A。该研究在体外构建了NOG途径，并证明以葡萄糖6磷酸为底物，利用NOG途径可提高乙酸(乙酰磷酸的下游产物)的产量，同时，在细胞体内，以木糖为原料，通过过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷酸酶基因(fbp)并敲除乳酸脱氢酶(ldhA)、frdBC、adhE、pflB和frdBC后，可以使乙酸的摩尔产率达到2.2接近利用NOG途径的乙酸理论摩尔产率2.5。虽然该研究证明了NOG途径的可行性，然而，该研究并没有以葡萄糖为底物，在体内利用NOG途径合成乙酸的研究。葡萄糖降解所需的磷酸葡萄糖转移酶系统(PTS)涉及到复杂的调控机制，NOG途径是否适合以葡萄糖为原料的体内代谢无法得知。此外，该研究仅报道了乙酸的变化，乙酰磷酸合成乙酸仅为一步反应，而从乙酰磷酸合成乙酰辅酶A，再由乙酰辅酶A为底物合成间苯三酚却需要经过7步的酶反应，过表达磷酸转酮酶基因(fxpk)和果糖1,6二磷酸酶基因(fbp)是否适用于如此复杂的代谢途径，是否能提高这种间苯三酚的产量和产率均无法获知。
发明内容
为解决现有技术通过糖酵解途径合成间苯三酚产量偏低的问题，本发明提供了一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法，所采取的技术方案如下：
本发明的一个目的在于提供一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法，该方法是使重组细胞共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同时表达多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因中的任意一个或两个。
优选地，所述方法中重组细胞同时共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因。
所述重组细胞为大肠杆菌。
所述磷酸转酮酶fxpk基因的GeneBank的登录号为AY518212.1或Gene ID：11174923或17696722；所述果糖1,6-二磷酸酶fbp基因的GeneBank登录号为：ACT45889.1、AAA34603.1、AEE79180.1或NCBI参考序列编号：WP_003243329.1；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因的GeneBank登录号为EU554263；所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因的GeneBank登录号为：6062185、6058890、6058863或6059083。
所述共表达，是通过一个、两个或更多个用于共表达所述基因的表达质粒来实现的。
所述磷酸转酮酶fxpk基因，来源于青春双歧杆菌；所述果糖1,6-二磷酸酶fbp基因，来源于大肠杆菌；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因，来源于荧光假单胞菌；所述多重抗性因子MarA基因，来源于大肠杆菌；所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因，来源于大肠杆菌。
所述方法用于生产间苯三酚。
本发明的另一目的是提供一种利用所述方法生产间苯三酚的方法，该方法的步骤如下：
1)将乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因克隆到质粒pACYCDuet-1，构建重组质粒pA-accADBC；
2)将聚烯酮酐合成酶phlD基因、多重抗性因子MarA基因、磷酸转酮酶fxpk基因和果糖1,6-二磷酸酶fbp基因克隆到质粒pET中，得到重组质粒pET-phlD-MarA-fxpk-fbp；
3)将步骤1)和步骤2)所得的两个质粒导入到大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌；
4)发酵步骤3)所得重组大肠杆菌，再分离提取发酵产物中的间苯三酚。
上述方法步骤3)所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法步骤4)所述发酵，是按体积比1％的接种量将重组大肠杆菌接种到含有卡那霉素和氯霉素的M9发酵培养基中，在30℃，搅拌速度400rpm，pH6.0的条件下培养至OD600为8-15，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol/L，关闭通气，补加质量浓度为40％-50％重量的葡萄糖，继续发酵12h。
本发明获得的有益效果如下：
1.本发明通过在重组细胞中共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，以及多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因，在重组菌中建立了一种新的合成间苯三酚的途径；
2.本发明所提供的方法，极大的提高了重组细胞合成间苯三酚的能力。同时，降低了细胞合成间苯三酚过程中二氧化碳的生成和排放。
附图说明
图1为间苯三酚的核磁共振碳谱。
图2为间苯三酚的核磁共振氢谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中材料、试剂和仪器，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂和仪器，均可通过商业渠道获取。
以下实施例中所用的方法，未经特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例1
将基因多重抗性因子基因MarA(GenBank登录号：6060688)、聚烯酮酐合成酶基因PhlD(GenBank登录号：EU554263)，果糖1,6-二磷酸酶基因fbp(GenBank:ACT45889.1)，以及磷酸转酮酶基因fxpk(GenBank:AY518212.1)用overlap extension PCR的方法连接在一起，然后以同源重组的方法被克隆在pET30a上，构建重组质粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp。同时，构建质粒pA-accADBC，具体方法同专利CN 102787135B。
实施例2
将实施例1中构建得到的重组质粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和pA-accADBC采用热击转化法共转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后涂布于带有卡那霉素和氯霉素两种抗性的LB固体培养基平板上筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌LWNOGPG1。对照菌的构建为将重组质粒pET-phlD-marA和pA-accADBC采用热击转化法共转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌LWNOGPG0(所有实施例均以此为对照菌)。
实施例3
采用实施例2中构建得到的重组大肠杆菌发酵生产间苯三酚，其步骤如下：
将重组细胞按体积比1％的接种量接种到添加50μg·mL-1卡那霉素和30μg·mL-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度30℃、搅拌速度400rpm、pH 6.0的条件下培养至OD600为8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，关闭通气，继续补料40重量％的葡萄糖发酵12小时；
将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1次；合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末，溶于去离子水后经氢谱碳谱(图1和图2)鉴定为间苯三酚，每升培养基的产量达到6.5克，产率达15％，对照菌产量达3.5g/L，产率为4％。
实施例4
采用实施例2中构建得到的重组大肠杆菌发酵生产间苯三酚，其步骤如下：
将重组细胞按体积比3％的接种量接种到添加50μg·mL-1卡那霉素和30μg·mL-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度33℃、搅拌速度600rpm、pH 7.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD600为10，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L-1，关闭通气，继续补料60重量％的葡萄糖发酵18小时；
将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取2次；合并萃取产物，减压蒸馏浓缩，所得固体粉末即为间苯三酚，每升培养基的产量达到7.6，产率达16％，对照菌产量达4.5g/L，产率为6％。
实施例5
将基因MarA(GenBank登录号：6060688)聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank登录号：EU554263)，拟南芥的果糖1,6-二磷酸酶(GenBank:AEE79180.1)，以及凝结芽孢杆菌(GeneID:11174923)的磷酸转酮酶用overlap extension PCR的方法连接在一起，然后以同源重组的方法被克隆在pET30a上，将质粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和质粒pA-accADBC共转入BL21(DE3)。将重组细胞按体积比1％的接种量接种到添加50μg·mL-1卡那霉素和30μg·mL-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度30℃、搅拌速度400rpm、pH 6.0的条件下培养至OD600为15，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，关闭通气，继续补料40重量％的葡萄糖发酵12小时；
将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1次；间苯三酚产量达到5.4克，产率达11％，对照菌产量达3.2g/L，产率为3.8％。
实施例6
将基因MarA(GenBank登录号：6060688)聚烯酮酐合成酶(PhlD)(GenBank登录号：EU554263)，酿酒酵母的果糖1,6-二磷酸酶(GenBank:AAA34603.1)，以及蒙氏肠球菌的磷酸转酮酶(Gene ID:17696722)用overlap extension PCR的方法连接在一起，然后以同源重组的方法被克隆在pET30a上，将质粒pET-phlD-marA-fxpk-fbp和质粒pA-accADBC共转入BL21(DE3)。将重组细胞按体积比1％的接种量接种到添加50μg·mL-1卡那霉素和30μg·mL-1氯霉素的M9发酵培养基中进行发酵，在培养温度30℃、搅拌速度400rpm、pH 6.0的条件下培养至OD600为12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，关闭通气，继续补料40重量％的葡萄糖发酵12小时；
将培养液进行离心，分离细胞和上清，上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1次；间苯三酚产量达到6.1克，产率达14％，对照菌产量达3.4g/L，产率为3.8％。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法，其特征在于，重组细胞共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，同时表达多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因中的任意一个或两个。
2.权利要求1所述方法，其特征在于，重组细胞同时共表达磷酸转酮酶fxpk基因、果糖1,6-二磷酸酶fbp基因和聚烯酮酐合成酶phlD基因，多重抗性因子MarA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因。
3.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌。
4.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述磷酸转酮酶fxpk基因的GeneBank的登录号为AY518212.1或者Gene ID：11174923或17696722；所述果糖1,6-二磷酸酶fbp基因的GeneBank登录号为：ACT45889.1、AAA34603.1、AEE79180.1或NCBI参考序列编号：WP_003243329.1；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因的GeneBank登录号为EU554263；所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因的GeneBank登录号为：6062185、6058890、6058863或6059083。
5.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述共表达，是通过一个、两个或更多个用于共表达基因的表达质粒来实现。
6.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述磷酸转酮酶fxpk基因，来源于青春双歧杆菌；所述果糖1,6-二磷酸酶fbp基因，来源于大肠杆菌；所述聚烯酮酐合成酶phlD基因，来源于荧光假单胞菌；所述多重抗性因子MarA基因，来源于大肠杆菌；所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因，来源于大肠杆菌。
7.权利要求1-6所述方法，其特征在于，用于生产间苯三酚。
8.一种利用权利要求1所述方法生产间苯三酚的方法，其特征在于，步骤如下：
1)将乙酰辅酶A羧化酶ACCase基因克隆到质粒pACYCDuet-1，构建重组质粒pA-accADBC；
2)将聚烯酮酐合成酶phlD基因、多重抗性因子MarA基因、磷酸转酮酶fxpk基因和果糖1,6-二磷酸酶fbp基因克隆到质粒pET中，得到重组质粒pET-phlD-MarA-fxpk-fbp；
3)将步骤1)和步骤2)所得的两个质粒导入到大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌；
4)发酵步骤3)所得重组大肠杆菌，再分离提取发酵产物中的间苯三酚。
9.权利要求8所述方法，其特征在于，步骤3)所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
10.权利要求8所述方法，其特征在于，步骤4)所述发酵，是按体积比1％的接种量将重组大肠杆菌接种到含有卡那霉素和氯霉素的M9发酵培养基中，在30℃，搅拌速度400rpm，pH6.0的条件下培养至OD600为8-15，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol/L，关闭通气，补加质量浓度为40％的葡萄糖，继续发酵12-48h。
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