CN102212567A

CN102212567A - 一种l-2-氨基丁酸的生产方法

Info

Publication number: CN102212567A
Application number: CN2010101392276A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 范文超; 陶荣盛; 朱傅赟; 沈正权; 陆沈高; 陈涛; 潘震华
Original assignee: HUZHOU RESEARCH CENTER OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES CHINESE ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2030-04-02
Also published as: CN102212567B

Abstract

本发明公开了一种L-2-氨基丁酸的生产方法，以L-苏氨酸为原料，通过由苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统构成的酶催化体系催化生产L-2-氨基丁酸。本发明的L-2-氨基丁酸生产方法，原料廉价，性质稳定，大幅度降低了L-2-氨基丁酸的生产成本，转化率和产物浓度高，没有副产物影响，适于工业化应用。

Description

一种L-2-氨基丁酸的生产方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种L-2-氨基丁酸的生产方法。

背景技术

L-2-氨基丁酸，英文名为L(+)-2-Aminobutyric acid，分子式为C4H9NO2，CASNo.为1492-24-6，是一种非天然的手性α-氨基酸，是新型抗癫痫药——左乙拉西坦的主要生产原料。左乙拉西坦是比利时UCB(优时比)公司开发研制的一种新型抗癫痢药，于2000年4月获得FDA批准，在美国和欧盟上市，主要用于治疗局限性及继发性全身性癫痫。目前在全球超过66个国家和地区上市，全球有超过100万人的治疗记录，是目前美国癫痫治疗中应用最多的新型抗癫痫药物。2007年3月10日正式在中国上市。随着左乙拉西坦的推广，L-2-氨基丁酸需求量也在以每年15％的速度递增。据IMS Health(艾美仕市场调研咨询公司)销售数据显示，截至2007年9月份，其片剂全年销售额约为13.58亿美元，是一个重量级的药物。2009年该药物的专利保护到期，市场需求量大幅增加，作为关键中间体的L-2-氨基丁酸的市场需求也随之增加。L-2-氨基丁酸也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体，其作为合成手性药物的手性元，已成为多种手性药物的重要手性中间体。

在对于酶法生产L-2-氨基丁酸的研究中，转氨酶法是目前报道较多的方法。早期，Rozzell等采用各种酮酸和谷氨酸为底物，在氨基酸转氨酶(aromaticaminotransferase)的作用下生成L-2-氨基丁酸，但是由于转氨是一种动态平衡，转化反应的收率只有50％。他们继而对这一工艺进行了改进，引入乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)，提高了收率[Rozzell，J.，Production of L-amino acids bytransamination.1985，US Patent：4518692]。Fotheringham等在Rozzell等人研究的基础上，以L-苏氨酸为原料，建立了三酶体系制备L-2-氨基丁酸的方法，其中，三酶体系为苏氨酸脱氨酶、芳香氨基酸转氨酶、乙酰乳酸合成酶。如图1所示，通过苏氨酸脱氨酶的作用生产丁酮酸，丁酮酸在芳香氨基酸转氨酶的作用下，以天冬氨酸为氨基供体转化为L-2-氨基丁酸，天冬氨酸转化为2-氧代丁二酸，2-氧代丁二酸自发脱羧形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的作用下形成了乙酰乳酸，乙酰乳酸自发脱羧后形成3-羟基-2-丁酮。以该法生产L-2-氨基丁酸，转化率只有54％，浓度只有20多g/L，而且转化时产生一定量的副产物NH₃、L-丙氨酸和3-羟基-2-丁酮，且由于L-2-氨基丁酸与副产物L-丙氨酸性质相似，影响L-2-氨基丁酸进一步纯化[Fotheringham，I.，et al.，Engineering of a novel biochemicalpathway for the biosynthesis of L-2-aminobutyric acid in Escherichia coli K12.Bioorganic & medicinal chemistry，1999.7(10)：p.2209-2213.]。

氨基酸氧化酶法以化学合成的混旋2-氨基丁酸为底物，使用D-氨基酸氧化酶在金属催化剂的作用下制备L-2-氨基丁酸，分离收率可达95％以上[Fotheringham，I.，et al.，Preparative deracemization of unnatural amino acids.Biochemical SocietyTransactions，2006.34：p.287-290.]，由于化学合成混旋2-氨基丁酸的成本较高，特别是金属催化剂的成本高，所以该路线并不适合于工业化生产。

脱氢酶法以丁酮酸为底物，在亮氨酸脱氢酶或者缬氨酸脱氢酶作用下生成L-2-氨基丁酸[Kulaa，M.，Enzymatic reduction of a-keto acids leading to L-aminoacids，D-or L-hydroxy acids.Journal of Biotechnology，1997.53：p.29-39；Hyun，C.，et al.，Valine dehydrogenase from Streptomyces albus：gene cloning，heterologousexpression and identification of active site by site-directed mutagenesis.FEMSmicrobiology letters，2000.182(1)：p.29-34.]。氨基酸脱氢酶以NADH作为辅酶，所以在转化体系需耦合辅酶的再生体系。Degussa使用酶膜反应器使得辅酶可以循环使用[Liese，A.，K.Seelbach，and C.Wandrey，Industrial biotransformations.2006：Vch Verlagsgesellschaft Mbh.]，但是，脱氢酶法生产，需要采用价格昂贵且不稳定的丁酮酸为底物，所以工业生产的成本较高。

氨基酰化酶法生产L-2-氨基丁酸是国内多数生产厂家采用的非天然手性氨基酸生产工艺。一般以化学法生产消旋氨基酸，然后以市售的L-氨基酰化酶进行拆分获得L-氨基酸，一次拆分的收率最高只有50％[Bodalo，A.，et al.，Kineticcalculations in the enzymatic resolution of DL-amino acids.Enzyme and MicrobialTechnology，1999.24(7)：p.381-387；Wakayama，M.，et al.，Production of d-aminoacids by N-acyl-d-amino acid amidohydrolase and its structure and function.Journalof Molecular Catalysis.B，Enzymatic，2003.23(2-6)：p.71-85]。国外也开发了乙酰氨基酸消旋酶/氨基酰化酶法生产工艺[Tokuyama，S.，Discovery and application of anew enzyme N-acylamino acid racemase.Journal of Molecular Catalysis.B.Enzymatic，2001.12(1-6)：p.3-14；Su，S.and C.Lee，Cloning of the N- acylamino acidracemase gene from Amycolatopsis azurea and biochemical characterization of thegene pr

1997年，Galkin和Kulakova等(Galkin，A.，L.Kulakova，et al.(1997).Synthesisof optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coli cellsexpressing heterologous genes.Applied and Environmental Microbiology 63(12)：4651.)构建了共表达L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因工程菌种，这一菌种的细胞内含有的L-亮氨酸脱氢酶能够催化丁酮酸和NH₃生产L-2-氨基丁酸，同时细胞内的甲酸脱氢酶以甲酸铵为底物再生NAD+为NADH，同时放出二氧化碳和NH₃。采用这一细胞进行转化生产L-2-氨基丁酸，浓度达到0.35M(36.1g/L)，转化率可达88％。该工艺采用丁酮酸为原料，由于丁酮酸价格较高，市售5g丁酮酸的价格在百元以上，导致该工艺成本价高，且丁酮酸性质不稳定，限制了该工艺的工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种L-2-氨基丁酸的生产方法。

本发明以L-苏氨酸为底物，通过包括苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统的酶催化体系的催化高效生产L-2-氨基丁酸。

具体的，采用L-苏氨酸为底物，通过L-苏氨酸脱氨酶的作用，将L-苏氨酸转化为丁酮酸和氨；然后丁酮酸和氨在L-氨基酸脱氢酶的作用下被还原为L-2-氨基丁酸；L-氨基酸脱氢酶还原丁酮酸需要NADH作为辅酶，反应后生成NAD+，而NADH价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD+为NADH。

本发明提供的L-2-氨基丁酸的生产方法，所述L-氨基酸脱氨酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、古球菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、嗜热放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。所述苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的苏氨酸脱氨酶、拟南芥来源的苏氨酸脱氨酶。

优选的，本发明提供的L-2-氨基丁酸的生产方法，辅酶再生系统为利用细胞内NADH和NAD+及细胞自身代谢再生NAD+为NADH的细胞自身代谢辅酶再生系统。具体的，所述细胞自身代谢辅酶再生系统为包括表达L-氨基酸脱氢酶的细胞和碳源的细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括表达L-氨基酸脱氢酶的细胞、苏氨酸脱氨酶和碳源的酶催化体系；或者，所述细胞自身代谢辅酶再生系统为包括共表达L-氨基酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶的细胞和碳源的细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括共表达L-氨基酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶的细胞和碳源的酶催化体系。所述碳源为葡萄糖、甲醇或者甘油。且所述细胞选自大肠杆菌活细胞、酿酒酵母活细胞、毕赤酵母活细胞，这些细胞内本身含有NAD+和NADH，同时细胞代谢过程能够将NAD+还原为NADH，特别是酵母活细胞，其细胞自身代谢NAD+和NADH含量高，而且代谢旺盛，能高效地将NAD+还原为NADH。

优选的，本发明提供的L-2-氨基丁酸的生产方法，辅酶再生系统为非细胞自身代谢辅酶再生系统，所述非细胞自身代谢辅酶再生系统为包括辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶、辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的酶催化体系；或者为包括辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的细胞的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括苏氨酸脱氨酶、辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的细胞的酶催化体系；或者为包括辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和辅酶再生酶的细胞的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括了辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和辅酶再生酶的细胞的酶催化体系。所述包括辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的非细胞自身代谢辅酶再生系统选自选自：包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、和NAD+或NADH的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；包括甲酸脱氢酶、甲酸盐、和NAD+或NADH的甲酸脱氢酶辅酶再生系统和亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统；包括亚磷酸盐、亚磷酸脱氢酶和NAD+或NADH的亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统。

根据本发明的一个优选实施方式，酶催化体系包括苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和非细胞自身代谢辅酶再生系统，其中非细胞自身代谢辅酶再生系统包括催化NAD+为NADH的辅酶再生酶、辅酶再生底物和微量的NAD+或NADH，如由葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+组成的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统，或由甲酸脱氢酶、甲酸盐和NAD+组成甲酸脱氢酶辅酶再生系统。向该酶反应体系中加入L-苏氨酸，在控制PH和温度的条件下，该酶反应体系可以高效地将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酸。

根据本发明的一个优选实施方式，将L-氨基酸脱氢酶基因和辅酶再生酶基因克隆至表达载体，导入到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、或者酵母细胞中，实现共表达，共表达L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的活细胞与苏氨酸脱氨酶和辅酶再生底物组合成酶催化体系。向该酶催化体系中加入L-苏氨酸，在控制PH和温度的条件下，该酶催化体系可以高效地将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酸。

根据本发明的一个优选实施方式，将苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因和辅酶再生酶基因克隆至表达载体，导入到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、或者酵母细胞中，实现共表达，共表达苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的活细胞与辅酶再生底物组合成一个酶反应体系。向该酶反应体系中加入L-苏氨酸，在控制PH和温度的条件下，该酶反应体系可以高效地将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酸。

根据本发明的一个优选实施方式，将L-氨基酸脱氢酶基因克隆至表达载体，导入到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、或者酵母细胞中，优选酵母细胞，实现外源表达，表达L-氨基酸脱氢酶的活细胞与苏氨酸脱氨酶和葡萄糖、甲醇或者甘油等碳源共同组成酶催化体系。向该酶催化体系中加入L-苏氨酸，在控制PH和温度的条件下，该酶催化体系可以高效地将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酸。

根据本发明的一个优选实施方式，将苏氨酸脱氨酶基因和L-氨基酸脱氢酶基因克隆至表达载体，导入到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、或者酵母细胞中，优选酵母细胞，实现共表达，表达L-氨基酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶的活细胞与葡萄糖或者甘油等碳源共同组成酶催化体系。向该酶催化体系中加入L-苏氨酸，在控制PH和温度的条件下，该酶催化体系可以将L-苏氨酸转化为L-2-氨基丁酸。

本发明提供的L-2-氨基丁酸的生产方法，以市售价格为每公斤20元左右的L-苏氨酸为主要原料，通过由苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统构成的酶催化体系的催化生产L-2-氨基丁酸，工艺成本低，转化率和产物浓度高，没有副产物影响，该工艺方法适合工业应用。

附图说明

图1为转氨酶法制备L-2-氨基丁酸的反应原理图。

图2为本发明的L-2-氨基丁酸的生产方法的反应原理图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

如图2所示，本发明的L-2-氨基丁酸的生产方法，以L-苏氨酸为底物，通过由苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统构成的酶催化体系催化生产L-2-氨基丁酸。具体的，通过L-苏氨酸脱氨酶的作用，将L-苏氨酸转化为丁酮酸和氨；然后丁酮酸和氨在L-氨基酸脱氢酶的作用下被还原为L-2-氨基丁酸，在L-氨基酸脱氢酶还原丁酮酸的过程中需要NADH作为辅酶，反应后生成酶促因子NAD+。因NADH价格昂贵，所以需要辅酶再生系统再生NAD+为NADH。

在本发明的上下文中，L-氨基酸脱氢酶是指在丁酮酸、氨以及NAD+或NADH存在的条件下，能够将丁酮酸还原为L-2-氨基丁酸的L-氨基酸脱氢酶。辅酶再生系统是指能够将辅酶NAD+还原为NADH的辅酶再生系统。

实施例1 大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶、蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

配制液体培养基TB(pH7.0-7.5)，含有12g/L蛋白胨、24g/L进口酵母抽提物、5g/L甘油、2.13g/L KH₂PO₄、16.43g/L K₂HPO₄·3H₂O。培养基TB分装于1L三角摇瓶，装液量200mL，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌20min。

分别从蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶表达菌种(参考Kula MR，Stoyan T，Recktenwald A.Cloning，sequencing and overexpression of the leucine dehydrogenasegene from Bacillus cereus.Journal of Biotechnology.1997，54：77-80所述方法构建)、枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶表达菌种(参考Lampel KA，et al.Characterization of the developmentally regulated Bacillus subtilis glucosedehydrogenase gene.J Bacteriol.1986，166(1)：238-43所述方法构建)和大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶表达菌种(参考Abrescia P，et al.Threonine Deaminase：Autogenous Regulator of the ilv Genes in Escherichia coil K-12.Molec.gen.Genet.1979，171：261-275所述方法构建)的平板上用接种环挑数环菌体接种于TB摇瓶中，接种前在TB培养基中加入100μg/mL卡那霉素，于37℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝5-6，加入15g/L乳糖诱导24h左右。离心后收集菌体备用。

大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶酶活检测方法为：用0.1M Tris-HCl(pH7.5)重悬苏氨酸脱氨酶表达菌种的发酵菌体至终浓度为10g/L。超声破碎(功率400W，工作5s，间隔8s，30次)，破胞液即为粗酶液。用0.1M Tris-HCl配制0.4M L-苏氨酸，调pH至7.5，取1mL加入试管，30℃预热5min，加入1ml的上述粗酶液，反应10min，用10％盐酸终止反应，HPLC检测检测0分钟和10min的L-苏氨酸含量，根据减少量或通过检测丁酮酸的含量计算酶活。

蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶酶活检测方法为：取1mL亮氨酸脱氢酶表达菌种的发酵液于4℃、12000rpm离心1min后弃上清，加入等体积0.2M、pH7.5的NH₃-NH₄Cl缓冲液重悬菌体超声破碎：功率400W，工作5s，间隔8s，30次。破胞液于4℃、12000rpm离心3min，上清液即为粗酶液。亮氨酸脱氢酶反应体系包括50mM丁酮酸、0.5mM NADH、0.2M NH₃-NH₄Cl缓冲液(pH7.5)、2.5％粗酶液。底物和缓冲液在30℃下温浴10分钟，加入粗酶液和NADH开始反应，使用分光光度计测定OD₃₄₀的下降值。1U酶活定义为30℃下每分钟催化消耗1umolNADH所需的酶量。

枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶酶活检测方法为：取1mL葡萄糖脱氢酶表达菌种的发酵液于4℃、12000rpm离心1min后弃上清，加入等体积0.2M、pH7.5的NH₃-NH₄Cl缓冲液重悬菌体超声破碎：功率400W，工作5s，间隔8s，30次。破胞液于4℃、12000rpm离心3min，上清液即为粗酶液。葡萄糖脱氢酶反应体系包括100mM葡萄糖、1mM NAD+、0.2M NH₃-NH₄Cl缓冲液(pH7.5)、2.5％粗酶液。底物和缓冲液在30℃下温浴10分钟，加入粗酶液和NAD+开始反应，使用分光光度计测定OD₃₄₀的上升值。1U酶活定义为30℃下每分钟催化产生1umolNADH所需的酶量。

将含有1.5M的L-苏氨酸，1.5M葡萄糖的溶液于30℃温浴，用氨水调pH至7.6。依次加入葡萄糖脱氢酶粗酶液(20000U/L)、亮氨酸脱氢酶粗酶液(7000U/L)、NAD+(0.02g/L)和苏氨酸脱氨酶粗酶液(2400U/L)开始反应，用氢氧化钠控制pH至7.6，反应24小时，液相检测L-2-氨基丁酸的含量为148.5g/L，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达95％以上。

液相检测方法如下：在EP管中依次加入PH＝9.5的硼酸缓冲液300ul，转化液样品250ul，衍生剂200ul(取0.3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0.1472gN-乙酰-L半胱氨酸，用0.1mol/L硼砂缓冲液(PH＝9.5)定溶到25ml，避光备用)，混匀后等待2分钟，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。所需的化合物用0.05mol/L醋酸钠缓冲液∶甲醇＝63∶35进行洗脱，流速1.0ml/min，采集时间为10min。色谱条件为XDB-C8(150mm)中性柱，柱温30℃，检测波长334nm。

实施例2 大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶、蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

菌种发酵、粗酶液的制备和液相检测方法同实施例1，其中，博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶表达菌种参考Sakai Y，et al.Regulation of the formatedehydrogenase gene，FDH1，in the methylotrophic yeast Candida boidinii and growthcharacteristics of an FDH1-disrupted strain on methanol，methylamine，and choline.JBacteriol.1997，179(14)：4480-5所述方法构建。

大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶和蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶的酶活检测方法同实施例1。

博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶酶活检测方法为：取1mL甲酸脱氢酶表达菌种的发酵液于4℃、12000rpm离心1min后弃上清，加入等体积0.2MNH₃-NH₄Cl(pH7.5)缓冲液重悬菌体超声破碎(功率400W，工作5s，间隔8s，30次)，破胞液于4℃、12000rpm离心3min，上清液即为粗酶液。甲酸脱氢酶反应体系包括100mM甲酸铵、1mMNAD+、0.2MNH₃-NH₄Cl缓冲液(pH7.5)、2.5％粗酶液。底物和缓冲液在30℃下温浴10分钟，加入粗酶液和NAD+开始反应，使用分光光度计测定OD₃₄₀的上升值。1U酶活定义为30℃下每分钟催化产生1μmolNADH所需的酶量。

将含有1.5M的L-苏氨酸，1.5M甲酸铵的溶液于30℃温浴，用氨水调pH至7.6。依次加入甲酸脱氢酶粗酶液(3000U/L)、亮氨酸脱氢酶粗酶液(5000U/L)、酶促因子NAD+(0.02g/L)和苏氨酸脱氨酶粗酶液(2400U/L)开始反应，控制pH至7.6，反应24小时，液相检测L-2-氨基丁酸的含量为147.3g/L，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达95％以上。

实施例3 白色链霉菌来源的缬氨酸脱氢酶、大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

菌种发酵、粗酶液的制备和液相检测方法同实施例1，其中，白色链霉菌来源的缬氨酸脱氢酶表达菌种参考Hyuu CG，Kim SS et al.Valine dehydrogenasefrom Streptomyces albus gene cloning heterologous expression and identification ofactive site by site-directed mutagenesis.FEMS Microbiology Letters.2000，182：29-34所述方法构建。

大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶的酶活检测方法同实施例1。

白色链霉菌来源来源的缬氨酸脱氢酶酶活检测方法为：取1mL缬氨酸脱氢酶表达菌种的发酵液于4℃、12000rpm离心1min后弃上清，加入等体积0.2MNH₃-NH₄Cl(pH7.5)缓冲液重悬菌体超声破碎(功率400W，工作5s，间隔8s，30次)，破胞液于4℃、12000rpm离心3min，上清液即为粗酶液。缬氨酸脱氢酶反应体系包括50mM丁酮酸、0.5mM NADH、0.2M NH₃-NH₄Cl缓冲液(pH7.5)、2.5％粗酶液。底物和缓冲液在30℃下温浴10分钟，加入粗酶液和NADH开始反应，使用分光光度计测定OD₃₄₀的下降值。1U酶活定义为30℃下每分钟催化消耗1μmolNADH所需的酶量。

将含有1.0M的L-苏氨酸，1.0M葡萄糖，0.05M硫酸铵的溶液于30℃温浴，用氨水调pH至7.6。依次加入葡萄糖脱氢酶粗酶液(20000U/L)、缬氨酸脱氢酶粗酶液(6000U/L)、酶促因子NAD+(0.02g/L)和苏氨酸脱氨酶粗酶液(2400U/L)开始反应，用氢氧化钠控制pH至7.6，反应24小时，液相检测L-2-氨基丁酸的含量为99.4g/L，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达96％以上。

实施例4 蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶共表达菌种细胞与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶组成酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

4.1蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶共表达菌种构建

以实施例1中构建的亮氨酸脱氢酶重组质粒为模板合成正义引物和反义引物。引物的核苷酸序列分别记录于SEQ ID NO：1(LeuDH-NcoI-F)和SEQ ID NO：2(LeuDH-BamHI-R)。

SEQ ID NO：1 LeuDH-NcoI-F

CATGCCATGGGAACATTAGAAATCTTC

SEQ ID NO：2 LeuDH-BamHI-R

CGGGATCCTTAGCGACGGCTAAT

对反应溶液进行PCR扩增，反应溶液中含有上述一对引物，其中，每一个引物为50pmol，0.2mM dNTP，50ng载体DNA，25mM MgCl₂，1X KOD plusbuffer(TOYOBO)，KOD plus 2U(TOYOBO)。PCR的条件如下：95℃预变性5min，后按如下参数循环30次94℃变性45秒，55℃退火45秒，68℃延伸90秒，最后一个循环68℃延伸10min。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约1000bp的特异条带，为所需。用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收PCR扩增产物，TA克隆到pMD18-T载体(TAKARA pMD18-T simple vector)上转化DH5α，涂布于含Amp的LB平板上，挑选阳性克隆。抽质粒鉴定重组体后经限制性内切酶NcoI/BamHI(MBI)双酶切，与同样酶切处理得表达载体pET28b(Novagen)用T4DNA连接酶(MBI)连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含Kan的LB平板上。酶切验证所需后转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将该重组质粒标记为pET28b-Leudh。

以实施例1中构建的葡萄糖重组质粒为模板合成正义引物和反义引物。引物的核苷酸序列分别记录于SEQ ID NO：3(rbsGDH-SacI-F)和SEQ ID NO：4(rbsGDH-XhoI-R)。

SEQ ID NO：3 rbsGDH-SacI-F

CGAGCTCAATAATTTTGTTTAACTT

SEQ ID NO：4 rbsGDH-XhoI-R

CCTCGAGTTAACCGCGGCCTG

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约800bp的特异条带，为所需。用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收PCR扩增产物，TA克隆到pMD18-T载体上(TAKARA pMD18-T simple vector)转化DH5α，涂布于含Amp的LB平板上，挑选阳性克隆。抽质粒鉴定重组体后经限制性内切酶SacI/XhoI(MBI)双酶切，与同样酶切处理的表达载体pET28b-Leudh用T4DNA连接酶(MBI)连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，涂布于含Kan的LB平板上。酶切验证所需后转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。该重组质粒即为亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达质粒。

4.2蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶共表达菌种细胞与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶组成酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

菌种发酵、粗酶液的制备、三种酶的酶活检测方法和液相检测方法同实施例1，采用4.1中的方法得到亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达菌种细胞，经测定共表达细胞中亮氨酸脱氢酶的酶活为151U/g湿菌体，甲酸脱氢酶的酶活为1100U/g。

将含有0.5M的L-苏氨酸，0.5M葡萄糖的溶液于30℃温浴，用氨水调pH至7.6。依次加入共表达L-亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的细胞40g/L和苏氨酸脱氨酶粗酶液(2400U/L)开始反应，用氢氧化钠控制pH至7.6，反应24小时，液相检测L-2-氨基丁酸的含量为48.3g/L，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达93％以上。

实施例5 蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶共表达菌种细胞与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶组成酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶共表达菌种参考Groger H，et al.From enzymes to“Designer Bugs”in reductiveamination：a new process for the synthesis of L-tert-Leucine using a wholecell-catalyst.Eng.Life Sci.2004，4，No.6所述方法构建。菌种发酵、粗酶液的制备及酶活检测方法、液相检测方法参考实施例1和实施例2，经测定共表达细胞中亮氨酸脱氢酶的酶活为148U/g湿菌体，甲酸脱氢酶的酶活为25U/g。

将含有0.4M的L-苏氨酸，0.45M甲酸铵的溶液于30℃温浴，用氨水调pH至7.6。依次加入亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌种细胞80g/L和苏氨酸脱氨酶粗酶液(2400U/L)开始反应，控制pH至7.6，反应24小时，液相检测L-2-氨基丁酸的含量为49.1g/L，L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达95％以上。

实施例6 高表达蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶基因工程毕赤酵母细胞与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶组成酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

6.1高表达蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶基因工程毕赤酵母构建

以实施例1中构建的亮氨酸脱氢酶重组质粒为模板合成正义引物和反义引物。引物的核苷酸序列分别记录于SEQ ID NO：5(LeuDH-BamHI-F)和SEQ ID NO：6(LeuDH-NotI-R)。

SEQ ID NO：5 LeuDH-BamHI-F

CGCGGATCCACCATGGGAACATTAGAAATCTTCG

SEQ ID NO：6 LeuDH-NotI-R

GTTAGCCAGCGGCCGCTTAGCGACGGCTAATAATATC

对反应溶液进行PCR扩增，反应溶液中含有上述一对引物，其中，每一个引物为50pmol，0.2mM dNTP，50ng载体DNA，25mM MgCl₂，1X KOD plus buffer(TOYOBO)，KOD plus 2U(TOYOBO)。PCR的条件如下：95℃预变性5min，后按如下参数循环30次94℃变性45秒，54℃退火45秒，68℃延伸1分钟，最后一个循环68℃延伸10min。

产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化PCR产物。分别用BamH I及Not I双酶切亮氨酸脱氢酶LeuDH基因的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，并与同样经BamH I及Not I双酶切的pPIC3.5K载体(Invitrogen)用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上过夜，挑选阳性克隆子，LB培养过夜抽提重组质粒pPIC3.5K-LeuDH，并通过琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒，并进一步通过限制性内切酶BamH I和Not I双酶切鉴定，验证为所需。

酵母感受态细胞GS115的制备。在10mL试管内放2mLYEPD培养基，其组成为：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。接种酵母宿主菌GS115单菌落，30℃，200r/min培养过夜；按1％接种量转接后，继续培养过夜至OD₆₀₀＝1.0。4℃，3000r/min离心5min，分别用100mL及50mL预冷的无菌水洗涤2次，用25mL预冷的1M山梨醇溶液洗涤1次，尽可能去除溶液，用200μL预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，获得酵母感受态细胞。

将获得的阳性重组质粒pPIC3.5K-LeuDH用SacI酶切线性化过夜，约20μl质粒DNA与80μl冷的酵毕赤母GS115感受态细胞混合，转入预冷的0.2cm电转移杯，冰浴5min，于1500V、25μF、200Ω条件下电击，迅速加入1mL冷的1M山梨醇溶液，混匀，涂布于MD选择平板上，30℃培养2～3d，至转化子(pPIC3.5K-LeuDH/GS115)长出，挑选转化单菌落进行阳性克隆鉴定，采用亮氨酸脱氢酶配对引物PCR扩增LeuDH基因，PCR产物电泳检测。验证为正确的重组转化子，进行诱导表达，用于测定生物活性。取发酵液1ml，12000rpm离心5min离心，弃上清。加入1ml Tris-HCl(pH 8.0，内加0.2ml蛋白破碎液)悬浮，超声破碎(时间3S，间隔时间8S，工作次数30S，电压400W)，破碎后12000rpm离心10min，上清液既为粗酶液。亮氨酸脱氢酶反应体系包括50mM丁酮酸、0.5mMNADH、0.2M NH₃-NH₄Cl缓冲液(pH7.5)、2.5％粗酶液。底物和缓冲液在30℃下温浴10分钟，加入粗酶液和NADH开始反应，使用分光光度计测定OD₃₄₀的下降值。1U酶活定义为30℃下每分钟催化消耗1μmolNADH所需的酶量。经检测，粗酶液中亮氨酸脱氢酶的酶活为3U/mL，该重组克隆验证为所需。

6.2高表达蜡状芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶基因工程毕赤酵母细胞与大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶组成酶反应体系催化生产L-2-氨基丁酸

用接种环从亮氨酸脱氢酶基因工程毕赤酵母平板上挑取一环菌体接种到20mLBMGY培养基(1％酵母浸出物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾PH6.0、1.34％YNB、0.04mg/L生物素、1％甘油)中，30℃、200rpm振荡培养24h至OD₆₀₀约为1.0，离心收集菌体，用100mL含0.5％甲醇的BMMY培养基(1％酵母浸出物、2％蛋白胨、100mM磷酸钾PH6.0、1.34％YNB、0.04mg/L生物素、0.5％甲醇)重悬培养，诱导LeuDH蛋白的表达，每12h补加0.5％的甲醇，共诱导3-4天，离心后收集细胞，取一部分用于酶活鉴定，亮氨酸脱氢酶的酶活检测方法同实施例1，其余菌体细胞直接用于转化反应。

苏氨酸脱氨酶的菌种发酵、粗酶液的制备和液相检测方法同实施例1。

将含有0.4M的L-苏氨酸、5g/L甲醇的0.1M的磷酸缓冲液(PH7.0)50ml放入250ml三角瓶中，然后加入毕赤酵母细胞5g，苏氨酸脱氨酶(2400U/L)开始反应，温度控制30℃，转速200rpm，每12h后补加甲醇5g/L，反应36h后经液相检测L-2-氨基丁酸的光学纯度ee为99％，转化率可达80％以上。

以上仅以L-亮氨酸脱氢酶、L-缬氨酸脱氢酶为例，详细描述本发明的技术方案及技术效果，本领域技术人员可知，对上述L-氨基酸脱氢酶可以作出等同替换，如采用L-丙氨酸脱氢酶、L-苯丙氨酸脱氢酶等，且来源不限于芽孢杆菌、链霉菌，如采用古球菌来源、嗜热放线菌来源等，均可完成本发明的技术方案，在丁酮酸、氨以及NAD+或NADH存在的条件下，将丁酮酸还原为L-2-氨基丁酸。且本领域技术人员可知，L-苏氨酸脱氨酶也可采用，但不限于鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、拟南芥来源的L-苏氨酸脱氨酶。

本发明提供的L-2-氨基丁酸的生产方法，在L-氨基酸脱氢酶的作用下，将在L-苏氨酸脱氨酶的作用下由L-苏氨酸转化的丁酮酸和氨直接还原为L-2-氨基丁酸，充分利用反应过程中生成的氨，没有副产物的影响。且与现有的方法相比，本方法的生产成本低，产物浓度显著提高，且具有高的转化率，可以大规模生产，适合工业应用。

虽然已参考优选实施例对本发明进行了描述，应当理解，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围内。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心

<120>一种L-2-氨基丁酸的生产方法

<130>20101013

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>1

catgccatgg gaacattaga aatcttc 27

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>2

cgggatcctt agcgacggct aat 23

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>3

cgagctcaat aattttgttt aactt 25

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>4

cctcgagtta accgcggcct g 21

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>引物

<400>5

cgcggatcca ccatgggaac attagaaatc ttcg 34

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gttagccagc ggccgcttag cgacggctaa taatatc 37

Claims

1.一种L-2-氨基丁酸的生产方法，其特征在于，所述方法以L-苏氨酸为原料，通过包括苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统的酶催化体系催化生产L-2-氨基丁酸。

2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶选自：但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、古球菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、嗜热放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶选自：但不限于，大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的苏氨酸脱氨酶、拟南芥来源的苏氨酸脱氨酶。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为利用细胞内NADH和NAD+及细胞自身代谢再生NAD+为NADH的细胞自身代谢辅酶再生系统。

5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述细胞自身代谢辅酶再生系统为包括表达L-氨基酸脱氢酶的细胞和碳源的细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括表达L-氨基酸脱氢酶的细胞、苏氨酸脱氨酶和碳源的酶催化体系；或所述细胞自身代谢辅酶再生系统为包括共表达L-氨基酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶的细胞和碳源的细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括共表达L-氨基酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶的细胞和碳源的酶催化体系。

6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述细胞选自大肠杆菌活细胞、酿酒酵母活细胞、毕赤酵母活细胞。

7.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、甲醇或甘油。

8.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述辅酶再生系统为非细胞自身代谢辅酶再生系统，所述非细胞自身代谢辅酶再生系统为包括辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括苏氨酸脱氨酶、L-氨基酸脱氢酶、辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的酶催化体系；或为包括辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的细胞的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括苏氨酸脱氨酶、辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶的细胞的酶催化体系；或者为包括辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和辅酶再生酶的细胞的非细胞自身代谢辅酶再生系统，相应的，所述酶催化体系为包括了辅酶再生底物和共表达L-氨基酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和辅酶再生酶的细胞的酶催化体系。

9.如权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述包括辅酶再生酶、辅酶再生底物、和NAD+或NADH的非细胞自身代谢辅酶再生系统选自选自：包括葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、和NAD+或NADH的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；包括甲酸脱氢酶、甲酸盐、和NAD+或NADH的甲酸脱氢酶辅酶再生系统和亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统；包括亚磷酸盐、亚磷酸脱氢酶和NAD+或NADH的亚磷酸脱氢酶辅酶再生系统。

10.如权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶为芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶；所述甲酸脱氢酶为酵母菌来源的甲酸脱氢酶。