CN103789247B - 一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法，属于发酵工程领域。本发明首先构建了一株异源表达氨基酸脱氨酶基因的基因工程菌，再以亮氨酸为底物，通过重组菌全细胞催化生产α-酮异己酸。具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、工艺步骤简单、生产操作安全等优点。采用本发明生产的α-酮异己酸产量高，每升转化液含有12.69gα-酮异己酸，L-亮氨酸的转化率达到97.49%。
Description
技术领域
本发明涉及一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
α-酮异己酸（KIC），又称α-氧代异戊酸，是支链氨基酸-亮氨酸的中间代谢产物，是一类生物体内有着重要作用的支链α-酮酸，是重要的有机合成、药物合成及生物合成中间体，在医药、食品、饲料等行业有着重要的应用前景。目前KIC的生产方法主要是化学合成法，主要包括二乙基草酰胺与格氏试剂加成产物的水解反应、双羰基化法、海因法等等。这些方法反应条件苛刻，都需要特殊结构作为起始物，或者价格昂贵的催化剂（如八羟基二钴与零价钯的络合物），并且都需要经过多步反应作为起始物，较难用于生产实践和工业化大规模生产。
L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2，L-AAD)是依赖FAD为辅酶的黄素蛋白，可以催化氨基酸氧化脱氨生成相应的酮酸、过氧化氢和氨基。催化过程可以分为两步：第一步是从氨基酸脱下来的氢传递给辅酶FAD生成氨基酸的中间形式，然后立即水解生成酮酸和氨基。第二步是FAD的氢原子将O2还原成过氧化氢，通常在亚氨基酸分解前完成。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。细菌和真菌来源的游离L-氨基酸脱氨酶，由于反应过程产生过氧化氢，对细菌有毒害作用，异源表达时会产生包含体，酶活较低。而来源于P.vulgaris的氨基酸脱氨酶，表达在细胞膜上，为异源表达氨基酸脱氨酶提供了可能。
本发明旨在开发一种新的KIC生产模式：全细胞蛋白转化。这种生产方法对设备要求较低，反应条件温和，操作简单，一步反应，易于控制。而且反应过程中，不需要加入有毒化学原料，底物和培养基对环境不会造成污染。反应对底物的专一性高，能选择性利用底物，而且产生具有立体专一性，光学专一性的产品。全细胞转化法生产的α-酮异己酸，产物纯度高，易于分离和纯化，有利于大规模的工业化应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，使得合适来源的氨基酸脱氨酶在异源宿主中高效表达，进而通过全细胞转化亮氨酸生产α-酮异己酸。
为此，本发明首先构建了一株以L-亮氨酸为底物转化生产α-酮异己酸的基因工程菌，是表达了源于奇异变形杆菌（Proteus vulgaris）的脱氨酶，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
所述基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
所述基因工程菌的构建方法是以P.vulgaris的基因组为模板，PCR扩增获得氨基酸脱氨酶基因，连接到表达载体pET-28a(+)中，将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)，筛选得到阳性转化子。
应用所述基因工程菌全细胞转化生产α-酮异己酸的方法，是将种子培养液按2%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600为0.6，添加终浓度0.4mM的IPTG，37℃诱导5h，收集细胞；以0.4-2.4g/L细胞、25-150mM/L底物L-亮氨酸，在25-45℃条件下，转化0.5-24h。
所述底物L-亮氨酸浓度优选100mM/L。所述细胞浓度优选0.8g/L。所述转化优选37℃下转化16h。
所述种子培养基（/L）：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，蒸馏水定容。
所述发酵培养基（/L）：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，加水900mL溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。
有益效果：本发明成功实现了P.vulgaris中L-氨基酸脱氨酶在大肠杆菌中异源表达，并以此重组细胞一步转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸。与现有技术相比，本发明的全细胞转化L-亮氨酸制取α-酮异己酸的方法，反应条件温和，对环境污染少，而且底物选择性高，目的产物专一，反应速率快，产物得率高，而且生产周期短，只需16h，就能利用97.49%的底物。本发明技术方案缩短了生产周期，降低了α-酮异己酸的生产成本，使大规模生产α-酮异己酸成为可能，从而解决了工业化α-酮异己酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。目前尚未有利用全细胞转化法生产α-酮异己酸的报道，此方法有利于解决化学合成法中的污染严重，步骤繁琐等问题，而且工艺简单，易于控制，方便推广应用。
附图说明
图1重组质粒的构建图。
图2全细胞转化优化结果图：a，底物浓度对产量的影响；b，生物催化剂浓度对产量的影响；c，温度对产量的影响；d，转化时间对产量的影响。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的含有17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
样品制备：取1mL转化后的溶液，在10,000rpm下离心10min，取上清液稀释后，经过0.45μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。
α-酮异己酸的含量测定：Agilent1100高效液相色谱仪（配紫外可见检测器）采用ZORBAXSB-Aq（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流动相为0.01mol/L的磷酸氢二铵溶液（pH2.50）-甲醇溶液（90:10，v/v），流速为0.8mL/min，柱温为35℃，在紫外检测波长为203nm下检测。
实施例1L-氨基酸脱氨酶重组质粒构建
以Proteus vulgaris的基因组为模板，以
5’CGCGGATCCATGGCGATATCTAGAAGAAAATTTA3’为正向引物，以
5’CCGCTCGAGTTAGAATCTGTAAAGACTAAATGGTTT3’为反向引物，（划线部分分别为BamH I和Xho I酶切位点）扩增获得目的基因，所得目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR产物经过纯化、酶切后，与载体pET28a(+)连接，构建重组质粒pET28a-lad（如图1）。
实施例2重组大肠杆菌构建
将实施例1重组质粒Pet28a-lad转化克隆宿主E.coli JM109，挑取在LB氨苄抗性平板上生长的单菌落，PCR扩增，挑选到阳性转化子提取质粒，双酶切验证，条带正确并进行测序，序列正确的转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。
实施例3全细胞转化L-亮氨酸的条件优化
将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)从平板上挑取单菌落，接种到种子培养基中，过夜培养，以2%（v/v）的接种量接种到50mL发酵培养基中，37℃、200r/min培养到OD600为0.4～1.5之间，加入0.4mM IPTG诱导，37℃培养5h后离心收集菌体进行全细胞转化。以水为反应介质，转化条件：
细胞浓度为1.0g/L时，分别在不同浓度L-亮氨酸（25mM、50mM、75mM、100mM、125mM、150mM）条件下，37℃转化12h，考察底物浓度对产量的影响，最优L-亮氨酸浓度为100mM时，产量最大达到11.84g/L，转化率达到90.95%。
当L-亮氨酸浓度为100mM时，加入不同浓度的菌体（0.4g/L、0.8g/L、1.2g/L、1.6g/L、2.0g/L、2.4g/L细胞干重），37℃，培养12h，研究细胞浓度对转化的影响，最优细胞浓度为0.8g/L，产量达到12.48g/L，转化率为95.61%。
在最优底物浓度和最优细胞浓度条件下，考察不同温度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）对转化的影响，最优转化温度为35℃，产量为12.33g/L，转化率为94.71%。在上述基础上，研究转化时间（0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h）对转化率的影响，发现转化时间为16h时，产量最大达到12.69g/L，转化率达到97.49%。随后，产量不再增加，所以从经济的角度考虑，转化16h为最佳。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种应用基因工程菌全细胞转化亮氨酸生产α-酮异己酸的方法，其特征在于，首先培养制备游离的活性细胞，再利用所得活性细胞进行全细胞催化生产α-酮异己酸；所述基因工程菌是表达了来源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的脱氨酶的大肠杆菌，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a(+)为表达载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是将种子培养液按2％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD600为0.6，添加终浓度0.4mM的IPTG，37℃诱导5h，收集细胞；以0.4-2.4g/L细胞、25-150mM底物L-亮氨酸，在25-45℃条件下，转化0.5-24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物L-亮氨酸浓度为100mM。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞浓度为0.8g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转化是在37℃下转化16h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL/L，加占培养基体积9/10的水溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加占培养基体积1/10的灭菌的含17mmol/L KH2PO4和72mmol/LK2HPO4的溶液。
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