CN104531746A - 一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先获得新金色分枝杆菌中3-甾酮-△¹-脱氢酶(KSDD)的基因扩增，然后利用pXMJ19质粒，实现了该基因在模式菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5中的过量表达,首次成功的纯化出有活性的来源于金色分枝杆菌中的KSDD酶，并首次对其酶学性质进行了研究。本发明构建以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-△¹-脱氢酶的活力较出发菌株有了明显提高，以1％(w/v)4-AD为底物，全细胞转化12h，底物摩尔转化率达到83.87％,是出发菌株相对转化率的23倍。

Description

一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法

技术领域

一种利用重组Corynebacterium crenatum全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。

技术背景

目前，虽然甾体药物在国际市场上仅占药物价值的2.5％，但是世界各地的制药工业需要超过2000吨的甾体原材料。天然的甾体化合物也变得越来越重要了。长时间以来，谷甾醇被人们视为在豆甾醇的生产中的废物。由于豆甾醇结构中的24，25位的双键促进了甾体结构边链的化学降解，所以豆甾醇在工业上大规模的用于孕甾烷衍生物的合成。与此同时，产生了大量的谷甾醇废物。而现在，谷甾醇作为一种最便宜的合成甾体化合物最便宜的原材料。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6％。

甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。

甾体化合物微生物转化是指利用微生物细胞对甾体化合物某一特定部位(基团)的作用，使其转化成与其结构上相类似的更有价值的新化合物。微生物对甾体化合物的转化反应主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构化、卤化、A环开环、边链降解等。目前在甾体激素药物的生产中，一种非常重要的微生物转化反应就是甾体母核A环的C1,2位脱氢，用于C1,2位脱氢的微生物主要分枝杆菌(Mycobacter sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、有节杆菌(Arthrobactersp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)以及诺卡氏菌属(Nocardia sp.)等。

微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到AD和ADD后，再进一步制备。

3-甾酮-△¹-脱氢酶(3-ketosteroid-△¹-dehydrogenase,KSDD或KSTD)也称C1,2位脱氢酶，它是甾体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在甾体母核C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在甾体药物开发上发挥着重要作用。同时，KSDD是诱导酶，只有当培养基中添加了具有C_1，2位饱和键的3-甾酮化合物时，该酶才能表达。对3-甾酮-△¹-脱氢酶(KSDD)的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。

分枝杆菌是一株能同时转化植物甾醇生成雄甾二酮AD和ADD的基因工程菌，有一定的应用前景。但AD和ADD结构相似，在工业生产中很难进行分离，这成为该菌的缺陷。目前国内对甾体药物生产的研究主要集中在菌种筛选和发酵优化上，对机理方面的研究还比较欠缺；而欧美等发达国家更加注重对发酵过程中各种物质功能机理的分析与研究。近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的KSDD的外源表达。不同来源的KSDD在大肠杆菌系统中表达时，主要以无活性的包涵体形式存在，检测不到KSDD酶活或者酶活水平较低。本实验室前期实现了分枝杆菌的KSDD在大肠杆菌体系中的表达，以无活性的包涵体形式存在，未检测到酶活与相关报道的一致。虽然在枯草芽孢杆菌中成功表达了KSDD酶，同时也检测到酶活，但是却未能成功的纯化出有活性的KSDD酶，因此对该酶的酶学性质了解很少，从而阻碍了对AD到ADD的全细胞转化的条件优化。

本发明通过质粒pXMJ19，实现了分枝杆菌KSDD在钝齿棒杆菌SYPA5-5中的可溶性过量表达以及成功纯化出KSDD并对该酶的酶学性质进行了研究，最终酶活达2.58U/mg，全细胞转化AD 12h后转化率达83.78％。这是首次成功纯化出有活性的分枝杆菌KSDD，也是首次将钝齿棒杆菌表达系统应用于AD的合成，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。钝齿棒杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物甾醇发酵工业潜在生产菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供：通过基因工程手段来获得能纯化出具有KSDD的纯酶，研究该酶的酶学性质，从而优化全细胞转化生产ADD能力的微生物的条件。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-△¹-脱氢酶活力为出发菌的6倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株全细胞转化AD生成ADD重组枯草芽孢杆菌，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的钝齿棒杆菌工程菌株，其3-甾酮-△¹-脱氢酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。

主要试剂：AD,ADD购自美国SIGMA公司

重组菌株构建方法：

(1)3-甾酮-△¹-脱氢酶(KSDD)基因全序列的克隆

根据GENBANK网站公布的Mycobacterium neoaurum strain NWIBL-01 ksdD基因序列(GQ228843.1)，以及pXMJ19质粒上的酶切位点设计ksdD基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，以ksdD F、ksdD R为引物，通过PCR扩增出ksdD全序列。

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP 2μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O补齐至总体积25μL。PCR反应条件：94℃4min，94℃90s，59℃90s，72℃120s，循环30次，72℃10min，15℃10min。

(2)重组表达载体pXMJ19-ksdD的构建

参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamH I/Hind III酶切释放出大小为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-ksdD。

提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-ksdD和pXMJ19，质粒pMD18-T-ksdD和pXMJ19经BamH I/Hind III双酶切，胶回收纯化，T₄ DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/Hind III双酶切后释放出大小为6.6kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-ksdD。

(3)重组质粒pXMJ19-ksdD化学转化法转化模式菌株Corynebacterium crenatum SYPA 5-5中将经验证构建成功的重组质粒pXMJ19-ksdD用化学转化法转化至模式菌株Corynebacterium crenatum SYPA 5-5中表达。

(4)重组菌株Corynebacterium crenatum阳性转化子的筛选；

挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵,提取质粒进行酶切验证。

(5)重组Corynebacterium crenatum酶活测定，TLC及HPLC分析

酶活测定方法：采用PMS-DCPIP的方法。具体方法如下：取培养24h的菌液50mL,4℃，8,000r/min离心5min收集菌体，用50mL pH 7.0的Tris-HCL缓冲液洗涤二次，重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作3s间歇7s，工作时间15min。10,000r/min离心30min获得上清液，取0.1mL上清液，加入含50mM的Tris-HCL(PH7.0)、40μM的2，6-二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、300μM AD(溶于2％的甲醇)总反应体系达1mL。30℃反应50min,检测600nm波长下吸光值变化情况。将每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。

TLC分析(如附图所示)：重组Corynebacterium crenatum以2％接种量接种于50ml发酵液，培养24h，按0.1％(w/v)投4-AD和0.3％(w/v)β-环糊精，继续培养8h取样，进行TLC分析；TLC展开剂：石油醚/乙酸乙酯(6:4)；TLC显色：显色剂20％硫酸溶液，均匀喷洒，100℃烘烤五分钟标准曲线对产物进行定量分析。色谱条件：色谱柱：dimosoilC₁₈(5μl,250mm×4.6mm)，流动相：甲醇-水(V/V＝70:30)，检测器：UV Detector，检测波长：254nm，柱温：30℃，进样量：10μL。

HPLC分析：AD与ADD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法进样10μL，流速：1.0ml/min。

LBG培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCL10g/L，葡萄糖5g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)

转化条件：将重组钝齿棒杆菌以1％接种量接种于50mL LBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7.0)缓冲液复溶，按1％(w/v)投4-AD和3％(w/v)β-环糊精，继续在30℃,160rpm培养。

本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有3-甾酮-△¹-脱氢酶能力的新金色分枝杆菌的该酶基因，借助本实验室有的钝齿棒杆菌表达体系，实现了3-甾酮-△¹-脱氢酶基因在模式菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5中的过量表达。本发明首次探索了新金色分枝杆菌来源的KSDD酶的酶学性质，为利用钝齿棒杆菌全细胞转化AD为ADD提供了一定的理论价值。在其酶学性质的基础上，我们将该菌株接种于以1％接种量接种于50mL LBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(PH7.0)缓冲液复溶，加入1％(w/v)4-AD和3％(w/v)β-环糊精，继续在30℃,160rpm培养10h。最终底物摩尔转化率达到83.87％，比原始菌提高了约23倍。

将底物4-AD一步转化成具有更高附加价值的ADD，其是重要医药中间体；同时用微生物法生产ADD，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

附图说明

重组菌株全细胞转化液TLC分析图

Lane1,标样AD；

Lane2,标样ADD；

Lane3,C.crenatum SYPA 5-5全细胞转化液；

Lane4,C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19全细胞转化液；

Lane5,C.crenatum SYPA 5-5/pXMJ19-ksdD全细胞转化液；

具体实施方法

实施例1：重组Corynebacterium crenatum株的构建

以实验室具有3-甾酮-△¹-脱氢酶活力的新金色分枝杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板，利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的KSDD基因片段，纯化后连接到pXMJ19载体上，验证成功后，转化模式菌株钝齿棒杆菌SYPA5-5。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用TLC和HPLC检测发酵液中产物ADD。检测到有产物ADD的为构建成功的具有转化AD为ADD能力的重组菌株。本发明最终得到具有转化AD产ADD的重组钝齿棒杆菌。

实施例2：重组菌株的酶活力测定

菌株在LBG培养基中过夜培养，8000rpm离心10min,pH7.0的50mM Tris-HCL缓冲液清洗3次，悬浮在该缓冲液中，超声波破碎处理制备粗酶液。1ml反应混合物由100μL粗酶液、50mM的Tris-HCL(PH7.0)、40μM的2，6-二氯酚靛酚、1.5mM的吩嗪硫酸甲酯、500μMAD(溶于2％的甲醇)所组成，30℃反应50min,检测600nm波长下吸光值变化情况。将每分钟内能引起0.01个吸光度单位变化的酶量定义为一个单位U。测得重组菌株酶活为2.58U/mg。

粗酶液经Ni-NTA柱纯化后得到纯的KSDD，纯化后的纯酶液的比酶活是12.96U/mg，BDH方向比酶活为112.56U/g，纯化倍数达5.02倍，回收率为7.37％。

(1)最适pH的研究

配制不同pH梯度的缓冲液(pH 3.0-6.0：50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6.0-9.0：50mMTris-HCL缓冲液；pH 9.0-10.0：50mM硼砂-氢氧化钠缓冲液，每1.0pH为一个梯度)，在酶活反应体系中，测定不同pH条件下的酶相对活力，并进行比较。结果表明，在pH 7.0时此酶的活性最强。

(2)酶的pH稳定性的研究

配制不同pH梯度的缓冲液(pH 3.0-6.0：50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6.0-9.0：50mMTris-HCL缓冲液；pH 9.0-10.0：50mM硼砂-氢氧化钠缓冲液，每1.0pH为一个梯度)。将酶存放于不同pH环境中2h，测定该酶的pH稳定性。结果表明，在中性pH环境范围(pH 6.0-8.0)，KSDD酶较为稳定。

(3)最适温度的研究

设置反应温度(0℃-60℃，每10℃为一个梯度)测定不同温度条件下酶活力，确定该酶反应最适温度。结果表明，随着温度的升高，酶的活性也逐步增强，在30℃时酶活性是最高的，随后随着温度的继续上升，酶活力急剧下降。

(4)热稳定性研究

将酶液分别存放在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃环境下2h，测定不同温度下酶的剩余活力，从而研究该酶在不同温度下的热稳定性。结果表明，在0℃环境下该酶最稳定，随着温度的升高，酶的稳定性逐步减弱，到60℃时相对酶活力已经小于10％。

(5)不同金属离子以及EDTA对酶活的影响

以不加金属离子的反应体系为对照，分别在反应体系中加入终浓度为1mM的K⁺,Na⁺,Ag⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺离子以及EDTA，研究各金属离子及EDTA对酶活力的影响。结果表明，Mn²⁺,Cu²⁺,Ag⁺,Fe³⁺离子对酶活力有明显的抑制作用，K⁺,Na⁺,Ca²⁺,EDTA离子对酶活力有明显的促进作用。

(6)酶的动力学参数

在pH7.0，30℃条件下，通过改变酶活反应体系中底物的终浓度，测定酶活力，考察酶反应速率。以Lineweaver-Burk双倒数法作图，求得KSDD酶的K_m和V_max。结果表明，K_m为8.9μM，V_max为6.43mM/min。

实施例3：重组菌株全细胞转化性能检测

将重组钝齿棒杆菌以1％接种量接种于50ml LBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCL(pH7.0)缓冲液复溶，加入1％(w/v)4-AD和3％(w/v)β-环糊精，继续在30℃,160rpm培养12h。经HPLC检测分析后，最终底物摩尔转化率达到83.87％，比出发菌提高了约23倍。

Claims (3)

1.一种重组表达载体pXMJ19-ksdD，其特征是：

通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的KSDD编码基因ksdD，将其与表达载体pXMJ19连接获得。

2.一种重组钝齿棒杆菌，其特征是：

将权利要求1中构建的重组载体pXMJ19-ksd D用化学转化法转化至菌株Corynebacteriumcrenatum SYPA5-5中。

3.将权利要求2所述的重组钝齿棒杆菌全细胞转化4-AD产ADD的方法，其特征是：将该菌株以1％接种量接种于50mL LBG培养基中，培养24h，离心回收菌体，洗涤两次，用适当的50mM的Tris-HCl pH7.0缓冲液复溶，加入1％(w/v)4-AD和3％(v/v)β-环糊精继续在30℃，160rpm培养12h；最终底物摩尔转化率达到83.87％，比原始菌新金色分枝杆菌的转化率提高了约23倍。