CN109722442A - 7β-羟基胆酸脱氢酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于Clostridium sp.Marseille的新型7β‑羟基胆酸脱氢酶(7β‑HSDHCM)及其编码基因，并利用该酶作为生物催化剂催化底物7‑氧代胆酸合成熊去氧胆酸。编码该酶的基因与目前已知的7β‑羟基甾体脱氢酶同源性低，对7‑氧代胆酸酶活高，并且在培养表达该基因的大肠杆菌过程中，不需要加入抗生素，不利用传统的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，就可以实现高效的表达。在转化过程中，底物浓度10‑60克/升，浓缩发酵液后，底物浓度达到100克/升，以＞98％的转化率实现，并且反应过程中不使用任何有机溶剂，转化方法绿色、环保。
Description
本发明涉及获得来自Clostridium sp.Marseille的新7β-编码该酶的序列、获得该酶的方法，以及在胆酸化合物的酶促转化中合成熊去氧胆酸(UDCA)的新方法。
发明背景：
活性物质熊去氧胆酸(UDCA)已经用于胆结石问题的医疗很多年。熊去氧胆酸可以用于治疗脂肪肝合并高脂血症(熊去氧胆酸联合来适可治疗脂肪肝合并高脂血症患者的效果，魏鸿，2017，30，133)，熊去氧胆酸单药治疗原发性胆汁性肝硬化肝炎。目前的合成方法多为利用胆酸为底物通过化学氧化-还原的方法获得，仅今年来生物催化的发展使得酶催化在熊去氧胆酸中有了广泛的应用(The enzymic and chemical synthesis ofursodeoxycholic and chenodeoxycholic acid from cholic acid，Sutherland，J.D.Macdonald，I.A.Forrest，T.P.Prep. Biochem.，1982，12，307-321；)。
目前生物法参与的熊去氧胆酸的合成中，主要研究重点在于如何以胆酸为底物区域选择性的氧化12α-OH以及7α-OH，酶法表现出了优异的结果(One-step synthesis of12- ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzymaticsystem，Liu，L.Braun，M. Gebhardt，G.Weuster-Botz.D.Gross，R.Schmid，R.D.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2013，97，633-639；Multi- enzymatic one-potreduction of dehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cell biocatalysts， Sun.B.Kantzow，C.Bresch，s.Castiglione，K.Weuster-Botz，D.Biotechnol.Bioeng.，2013，110，68-77)。目前的工业生产中尝试利用较为廉价易得的鹅去氧胆酸通过7-OH的区域选择性氧化及随后还原的方法制备熊去氧胆酸，但是反应中涉及到往往涉及到多酶的兼容性问题，剂辅酶再生，使得在第一步的7-OH氧化为羰基化对反应体系进行加热处理促使酶失活。(Two-step enzymatic synthesis of ursodeoxycholicacid with a new 7β-hydroxysteroid dehydrogenase from Ruminococcus torques，Zheng，M.-M.Wang，R.-F.Li，C.-X.Xu，J.-H.Process Biochem.2015，50， 598-604)反应如果一锅法进行，会包含反应中间体，由于反应中间体与底物产物的结构类似，导致如果反应产物的纯度不高，对后期获得产物纯品的收率会明显降低。
目前利用化学法实现7位羰基的底物还原时需要用到大量的有机溶剂以及金属配合物作为手性催化剂，导致在后期的分离纯化以及后处理工艺时对环境的影响较大，考虑到目前的国内对环境问题的密切关注，人民群众对环保问题的认识提高，因此能够获得建立高底物浓度高转化率的绿色催化工艺是非常必须的。
发明内容：
利用7β-胆酸羟基脱氢酶与葡萄糖脱氢酶共同作用，实现7位羰基的底物的绿色还原，副产物仅为葡萄糖酸，并且在菌体培养过程中通过选择优异的7β-胆酸羟基脱氢酶不使用抗生素培养，不利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，可以实现高效、低廉的生物催化剂制备，底物的高浓度转化。本发明包括的是利用整细胞、破菌液合成熊去氧胆酸的新方法以及后处理工艺。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种来源于Clostridium sp.Marseille的7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)，其优化后核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了制备7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)的方法。
该制备方法包括以下步骤：(1)合成一种新的7β-羟基胆酸脱氢酶基因并构建到pET21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将7β-羟基胆酸脱氢酶基因和葡萄糖脱氢酶基因构建至双表达载体pRSFDuet-1上(4)将工程菌株接种至工业培养基中，32℃培养20小时。(5)离心收集菌体，破菌留取上清液。
本发明还提供了利用7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)重组菌作为生物催化剂转化底物 7-KLCA的方法。具体地，发酵液中直接加入底物7-KLCA至终浓度为10～60g/L，辅助底物葡萄糖20-80g/L，30～35℃，转化8～12h可完成反应。
本发明的有益效果：本发明利用基因挖矿的方法在基因组数据库中获得一个新的7β-羟基胆酸脱氢酶序列，基因合成后利用大肠杆菌作为宿主，成功高效表达了该7β-羟基胆酸脱氢酶。新的7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)具有宽广的底物谱，对7-氧代胆酸有很高的活性。利用7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)重组菌作为生物催化剂，7-KLCA为底物，能以较高底物投料浓度，获得高收率的目标产物熊去氧胆酸，无副产物，产率不低于95％，转化率》 98％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)基因的合成和基因工程菌的构建
1.17β-羟基胆酸脱氢酶基因的合成
利用基因挖矿的方法挖掘到来源于Clostridium sp.Marseille的可能的7β-羟基胆酸脱氢酶序列，根据蛋白序列进行密码子优化合成该基因，构建至pET21a表达载体，基因插入位点为 NdeI和XhoI。
1.2重组质粒的转化
氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。
(1)取10μL重组质粒于50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激45s，快速置于冰上1～2min。
(3)加入新鲜LB液体培养基600μL，于37℃振荡培养45～60min。
(4)取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12～16h至单菌落出现。
实施例2：共表达菌的构建
将实验室已有pRSFDuet-GDH载体用NdeI/XhoI双酶切后回收，pET-7β-HSDHCM用NdeI/XhoI双酶切后回收基因片段，片段和线性载体用T4DNA连接酶连接后转化 BL21(DE3)感受态，挑取单克隆进行验证及活性检测，得到了pRSFDuet-GDH-7β-HSDHCM 共表达菌
实施例3：单表达菌及共表达菌的诱导表达
配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(工业培养基)，32℃，200rpm培养20h。
取发酵液1mL超声破菌后，检测7β-羟基胆酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶的活力。7β-羟基胆酸脱氢酶酶活定义：每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为1个酶活单位(U)；葡萄糖脱氢酶的酶活定义：每分钟生成1μmol NADPH所需要的酶量为1个酶活单位(U)。
经酶标仪检测，发酵液的7β-羟基胆酸脱氢酶酶活达到3.7U/ml，葡萄糖脱氢酶酶活6.6U/ml
实施例4：7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)重组菌发酵液转化7-氧代胆酸的方法
按照实施例3的方法诱导表达7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)，获得发酵液3L，加入 15g/L葡萄糖，将底物溶解在pH 9.0的水溶液，滴加至发酵液中终浓度为10g/L，反应pH控制在8.0左右，薄层层析检测反应进程。12小时后检测，底物反应完全，调节反应pH至9.0，离心除去菌体，重新调节反应pH至6.0，获得大量熊去氧胆酸沉淀，过滤得粗品31g。
实施例5：7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)重组菌发酵液转化7-氧代胆酸的方法
按照实施例3的方法诱导表达7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)，获得发酵液3L，加入 45g/L葡萄糖，将底物溶解在pH 9.0的水溶液，滴加至发酵液中终浓度为25g/L，反应pH控制在8.0左右，薄层层析检测反应进程。20小时后检测，底物反应完全，调节反应pH至9.0，离心除去菌体，重新调节反应pH至6.0，获得大量熊去氧胆酸沉淀，过滤得粗品78g。
实施例6：7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)重组菌发酵液转化7-氧代胆酸的方法
按照实施例3的方法诱导表达7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)，获得发酵液3L，浓缩发酵液体积至1L，加入125g/L葡萄糖，100毫克NADP+，将底物溶解在pH 9.0的水溶液，滴加至发酵液中终浓度为90g/L，反应pH控制在8.0左右，薄层层析检测反应进程。24小时后检测，底物反应完全，调节反应pH至9.0，离心除去菌体，重新调节反应pH至6.0，获得大量熊去氧胆酸沉淀，过滤得粗品92g。
Claims (6)
1.一种编码7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)的基因，其优化后的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一种7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDHCM)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求2所述的7β-羟基胆酸脱氢酶(7β-HSDHCM)作为生物催化剂在转化底物7-氧代胆酸7-KLCA)合成熊去氧胆酸的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物催化剂为来源于Clostridiumsp.Marseille的7β-羟基胆酸脱氢酶或者是与其氨基酸序列相似度不低于85％的酶。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将7β-羟基胆酸脱氢酶异源在大肠杆菌中表达，在菌体放大培养过程中不使用抗生素，不利用传统的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，利用发酵液直接进行转化反应，不额外添加辅因子，直接转化底物浓度7-氧代胆酸(为10-60克/升；发酵液浓缩后，加入辅因子浓度为0.1-1克/升，底物浓度可以提高至100克/升，转化率＞98％。
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