CN106520651A - 一种利用酶法转化生产l‑正缬氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

通过大肠杆菌和钝齿棒杆菌之间的穿梭质粒pXMJ19，将来源于Trigonopsis variabilis的D‑氨基酸氧化酶成功在C.glutamicum ATCC13032中表达。通过构建重组质粒pET‑28a(+)‑leudh和pET‑28a(+)‑fdh，将来源于Bacillus cereus和Candida boidinii的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶成功在E.coli BL21中表达。以上述三株工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以混合型DL‑正缬氨酸作为底物，同时确定了最佳的反应温度为30℃和pH为7.5。在最佳的转化条件下进行酶法动力学拆分生产L‑正缬氨酸。25h后转化液中的L‑正缬氨酸的含量为80.09g/L，L‑正缬氨酸产率为98.3％。本发明方法生产L‑正缬氨酸具有效率高，绿色环保，产品纯度高等优点。

Description

一种利用酶法转化生产L-正缬氨酸的方法
背景技术
手性是自然界的本质属性之一，构成生命有机体的分子都属于不对称的手性分子。在制药行业中，把具有药理活性作用的对映纯化合物称作手性药物。不同构型的药物作用于生物体时，其所发挥的作用截然不同，在药物活性，代谢过程及毒性等方面也存在着显著差异，20世纪60年代中期在欧洲爆发的“反应停事件”已经充分表明研究单一对映体形式的药物是非常必要的。
L-正缬氨酸(L-norvaline)是一种非蛋白质支链氨基酸，作为许多药物合成的前体物质，其在制药行业具有非常广泛的应用。培哚普利，作为一种治疗高血压和心力衰竭的有效药物，就是通过以L-正缬氨酸为重要中间体而合成。当前主要通过化学方法合成L-正缬氨酸。化学方法存在较多缺陷，例如工艺路线复杂，收率低，产品手性纯度低等缺点。随着生物技术的快速发展，生物转化方法正广泛应用于医药和食品等相关领域。由于酶本身作为一种手性催化剂，且酶法转化具有选择性大，区域选择性和对映异构选择性高，反应条件温和，环境污染小等优点，因此，利用酶法转化合成L-正缬氨酸具有非常广泛的应用前景。
D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO,E.C.1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸，氨和过氧化氢(H2O2)。该酶可应用于D氨基酸的定性定量分析，生物传感器，L氨基酸和α-酮酸的生产，目前DAAO主要应用于两部酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。由于7-ACA是合成头孢菌素的重要原料，且头孢菌素市场需求量大，因此DAAO越来越受人们关注。亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LeuDH,E.C.1.4.1.9)是一种NAD+依赖型的氧化还原酶，其能可逆催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，该酶在芽孢杆菌中有较高表达水平，主要参与体内L-氨基酸的代谢。Sanwal和Zink于1961年首次在芽孢杆菌Bacilluscereus中发现该酶并将其纯化出来；Hermier等人研究发现该酶在芽孢杆菌的芽孢形成过程中发挥重要作用。LeuDH还可用于支链脂肪酸及其酮酸类似物的测定。近年来，不同来源的LeuDH基因工程菌已经被成功构建，实现了LeuDH的高密度表达和规模化制备，然而，LeuDH的大规模应用需要添加NADH作为辅酶，NADH价格昂贵，不适合工业上大规模使用，因此，构建高效的NADH再生系统是解决LeuDH规模化应用的关键。NAD+依赖型的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH,E.C.1.2.1.2)属于D-2羟基酸脱氢酶类，可以将甲酸氧化为CO2的同时将NAD+还原为NADH,因此该酶被广泛应用于NADH再生，且该酶的适宜pH值范围广，产物CO2可直接从反应体系中分离出去，有利于后续目的产物分离，因此FDH已成为辅酶再生领域中的研究热点之一。基于DAAO，LeuDH和FDH的不同催化功能，本发明成功构建了利用粗酶液将D-正缬氨酸转化为L-正缬氨酸的方法，首先利用DAAO将D-正缬氨酸氧化成2-氧代戊酸，然后通过LeuDH将2-氧代戊酸转化成L-正缬氨酸，同时将NADH氧化为NAD+,最后利用FDH将NAD+重新转化成NADH,实现NADH的再生，另外，D-正缬氨酸被DAAO氧化的过程中会产生过氧化氢(H2O2),通过外源添加过氧化氢酶来除去生成的H2O2。
本发明通过表达载体pXMJ19实现了将来源于Trigonopsis variabilis的DAAO基因daao成功在谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032中进行高效表达；通过表达载体pET-28a(+)实现了将分别来源于Bacillus cereus的LeuDH基因leudh和来源于Candida boidinii的FDH基因fdh成功在大肠杆菌Escherichia coli BL21中进行高效表达，并利用这三株基因工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以混合型DL-正缬氨酸(纯度>99％，D型和L型比例为1:1)为底物，实现L-正缬氨酸的高效生产。
发明内容
本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自Trigonopsisvariabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，构建重组表达载体pXMJ19-daao，并通过电转化方法将其转化至C.glutamicum ATCC13032中，成功构建了基因工程菌株C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-daao；又成功克隆了分别来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶基因leudh和来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶基因fdh，构建重组表达载体pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，并通过化学转化方法将其转化至E.coli BL21中，成功构建基因工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。酶活力测定结果发现DAAO，LeuDH和FDH的酶活分别为0.30U/mL，8.13U/mL和0.22U/mL。基于获得的基因工程菌，通过细胞破碎获得每株工程菌的粗酶液，用于转化D-正缬氨酸生产L-正缬氨酸进行了初步研究，在25h内，L-正缬氨酸的产量为54.09g/L，摩尔转化率达到96.3％。
本发明采取的技术方案：
酶液转化D-正缬氨酸生产L-正缬氨酸，是通过构建C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh三株基因工程菌，并通过细胞破碎获得三个酶的粗酶液，以混合型DL-正缬氨酸为底物，构建转化化法生产L-正缬氨酸的最佳转化体系，实现高效生产L-正缬氨酸的方法。
1.D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶引物设计
根据NCBI中Trigonopsis variabilis全基因组核酸序列中daao基因序列，设计daao基因的PCR引物P1和P2。
F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)
R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)
根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中leudh基因序列，设计leudh基因的PCR引物P3和P4。
F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)
R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)
根据NCBI中Candida boidinii全基因组核酸序列中fdh基因序列，设计fdh基因的PCR引物P5和P6。
F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)
R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)
2.重组表达载体pXMJ19-daao，pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的构建
参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收daao，leudh和fdh的PCR产物，胶回收产物分别按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，第一种重组质粒经Kpn Ⅰ/EcoR I酶切释放出大小为2.7kb和1107bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-daao；第二种重组质粒经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切释放出大小为2.7kb和(1098)bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-leudh；第三种重组质粒经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切释放出大小为2.7kb和(1095)bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-fdh。
提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-daao和pXMJ19，质粒pMD18-T-daao和pXMJ19经Kpn Ⅰ/EcoR I双酶切，胶回收纯化，16℃过夜连接，将连接物热击转化E.coliJM109感受态细胞，用氯霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经KpnⅠ/EcoR I双酶切后释放出大小为6.6kb和1107bp的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-daao。
提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和载体pET-28a(+)，质粒和载体经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切，胶回收纯化，16℃过夜连接，将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒pET-28a(+)-leudh经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后释放出大小为6.6kb和1098bp的基因片段，重组质粒pET-28a(+)-fdh经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后释放出大小为6.6kb和1095bp的基因片段，证明重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh构建成功。
3.基因工程菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的构建及验证
将经验证构建成功的重组质粒pMA5-daao通过电击转化法转化至菌株C.glutamicum ATCC13032中；挑取在具有氯霉素抗性平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证；将重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh通过化学转化法转化至E.coli BL21中，挑取在具有卡那霉素抗性平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。
4.重组菌株酶活力测定
DAAO酶活测定方法：配制0.1M底物D-正缬氨酸(0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8.0)，取磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正缬氨酸0.1mL，400U/mL的过氧化氢酶0.1mL和适量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的对二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL显色，然后检测在550nm处的吸光值。
酶活定义单位为每分钟氧化D-正缬氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。
LeuDH酶活测定方法：配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化铵溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化铵溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NADH转化成NAD+所需的酶量。
FDH酶活测定方法：配制17mg/mL的甲酸钠溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD+溶液,取1.48mL的甲酸钠溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NAD+转化成NADH所需的酶量。
5.DAAO，LeuDH和FDH粗酶液转化生产L-正缬氨酸
以重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的粗酶液为生物催化剂。以一定浓度的混合型DL-正缬氨酸为底物，在最佳转化体系下进行转化生产L-正缬氨酸。用高效液相色谱法测定转化液中D-正缬氨酸和L-正缬氨酸的含量。
氨基酸分析色谱条件：
(a)色谱柱：Chiralcel OD-3R色谱柱150*4.6*3
(b)柱温：40℃
(c)流动相：A相：量取1毫升H3PO4，加入至1000毫升水中，配成0.1％的H3PO4溶液。
B相：100％乙腈
(d)检测器：紫外检测器338nm
本发明的优点和积极效果是：
(1)本发明首次在C.glutamicum ATCC13032中克隆表达了来源于Trigonopsisvariabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，重组菌中DAAO的酶活的达到0.3U/mL。
(2)本发明基于DAAO基因在C.glutamicum ATCC13032中的高效表达，LeuDH和FDH在E.coli BL21中的高效表达，研究了酶法转化产L-正缬氨酸，并在25h内获得了80.09g/L的L-正缬氨酸，D-正缬氨酸摩尔转化率达到98.3％。本次发明采用酶法转化生产L-正缬氨酸，具有产物专一性强、转化效率高等优点。
具体实施方式
实施例1：D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶引物设计
根据NCBI中Trigonopsis variabilis全基因组核酸序列中daao基因序列，设计daao基因的PCR引物P1和P2。
F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)
R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)
根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中leudh基因序列，设计leudh基因的PCR引物P3和P4。
F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)
R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)
根据NCBI中Candida boidinii全基因组核酸序列中fdh基因序列，设计fdh基因的PCR引物P5和P6。
F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)
R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)
实施例2：D-氨基酸氧化酶基因daao的克隆
以Trigonopsis variabilis总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-T Vector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-daao，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。
实施例3：亮氨酸脱氢酶基因leudh和甲酸脱氢酶基因fdh的克隆
分别以Bacillus cereus和Candida boidinii的总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-T Vector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，分别命名为pMD18-T-leudh和pMD18-T-fdh，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。实施例3：重组质粒pXMJ19-daao的构建
提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-daao和pXMJ19，并分别用KpnⅠ/EcoRI进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pXMJ19酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pXMJ9-daao转化到感受态E.coil JM109，用LB氯霉素抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pXMJ9-daao，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的构建
提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和pET-28a(+)，并分别用BamHⅠ/SalⅠ进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pET-28a(+)酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh转化到感受态E.coilJM109，用LB卡那霉素抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。
实施例4：重组质粒pXMJ9-daao转化C.glutamicum ATCC13032
感受态制备：挑取C.glutamicum ATCC13032接种于一支10ml LBG(LB+0.5％葡萄糖)液体培养基，30℃摇床培养过夜，取500μL过夜培养的菌液转接入含3％甘氨酸和0.1％吐温-80的50ml液体LB培养基中，使得初始细胞OD600达到0.3于30℃，200r/min培养到细胞OD600达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷15min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体4次，最后用0.2ml 10％甘油重悬细胞，用1.5ml管分装，每管80ul直接用于电转化。
电转：1800V电转5ms，电转后加入800ul LB培养基30℃培养2-3h
重组菌获得：涂布于氯霉素抗性LBG培养基，30℃培养，挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao。
实施例5：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao D-氨基酸氧化酶活力测定
将实施例4构建的重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，与出发菌株C.glutamicum ATCC13032分别接种于10ml含氯霉素的LBG培养基中，30℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LBG培养基中，30℃培养4h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，30℃诱导12h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。
取磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正缬氨酸0.1mL，400U/mL的过氧化氢酶0.1mL和适量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的对二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL显色，然后检测在550nm处的吸光值。
酶活定义单位为每分钟氧化D-正缬氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。
结果表明重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao表达的DAAO酶活为0.3U/mL，而原始菌C.glutamicum ATCC13032并没有检测到DAAO的酶活，从而实现了在C.glutamicum ATCC13032中DAAO酶活力的从无到有。
实施例6：重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh转化E.coli BL21
E.coli BL21感受态制备：(1)从LB平板上挑取新活化的单菌落，接种于10mL的LB液体培养基中培养12h左右，再将该菌悬液以1％的接种量接种于50mL的LB液体培养基培养2-3h，直至OD600达到0.5左右。(2)将菌液置于冰水浴中15min，使菌液迅速冷却。(3)分装菌液于若干个1.5mL离心管中，8000rpm离心1min后弃去上清，用0.1M的CaCl2溶液洗细胞2-3次。(4)经过清洗的菌液用80μL CaCl2和40μL50％的甘油悬浮后，于-40℃长期保存。
转化：将10μL重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh各加入到两管E.coliBL21感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上45min，然后42℃水浴热激90s后再置于冰上5min，然后加入800μLLB液体培养基后置于37℃培养1h后，8000rpm离心1min弃去上清，将剩余菌液涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养后挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。
实施例7：E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh亮氨酸脱氢酶活力测定
将实施例4构建的重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh与出发菌株E.coliBL21/pET-28a(+)分别接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。
配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化铵溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化铵溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NADH转化成NAD+所需的酶量。
结果表明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh的酶活为8.13U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并没有检测到亮氨酸脱氢酶的酶活，从而实现了在E.coli BL21中亮氨酸脱氢酶酶活力的从无到有。
实施例8：E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh甲酸脱氢酶活力测定
将实施例4构建的重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh与出发菌株E.coli BL21/pET-28a(+)分别接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。
配制17mg/mL的甲酸钠溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD+溶液,取1.48mL的甲酸钠溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NAD+转化成NADH所需的酶量。
结果表明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的酶活为0.22U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并没有检测到甲酸脱氢酶的酶活，从而实现了在E.coli BL21中甲酸脱氢酶酶活力的从无到有。
实施例9：利用D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过动力学拆分生产L-正缬氨酸。
将通过超声破碎所获得的D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶粗酶液按照酶活添加量为2:1:0.5的比例加入到2L底物缓冲液中(0.1M磷酸盐缓冲液)，初始DL-正缬氨酸底物浓度为5g/L，通过分批补料策略依次向反应体系中补料，30℃转化25h，结果表明，转化25后，转化液中的L-正缬氨酸的含量为80.09g/L，L-正缬氨酸产率为98.3％。
<110> 江南大学
<120>一种利用酶法转化生产L-正缬氨酸的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 1071
<212> D-氨基酸氧化酶基因
<213> Trigonopsis variabilis
<400> 1
1 ATGGCTAAAA TCGTTGTTAT TGGTGCCGGT GTAGCCGGTT TAACTACAGC TCTTCAACTT
61 CTTCGTAAAG GACATGAGGT TACAATTGTG TCCGAGTTTA CGCCCGGTGA TCTTAGTATC
121 GGATATACCT CGCCTTGGGC AGGTGCCAAC TGGCTCACAT TTTACGATGG AGGCAAGTTA
181 GCCGACTACG ATGCCGTCTC TTATCCTATC TTGCGAGAGC TGGCTCGAAG CAGCCCCGAG
241 GCTGGAATTC GACTCATCAA CCAACGCTCC CATGTTCTCA AGCGTGATCT TCCTAAACTG
301 GAAGGTGCCA TGTCGGCCAT CTGTCAACGC AACCCCTGGT TCAAAAACAC AGTCGATTCT
361 TTCGAGATTA TCGAGGACAG GTCCAGGATT GTCCACGATG ATGTGGCTTA TCTAGTCGAA
421 TTTGCTTCCG TTTGCATCCA CGCCGGAGTC TACTTGAACT GGCTGATGTC CCAATGCTTA
481 TCGCTCGGCG CCACGGTGGA TAAACGTCGA GTGAACCATA TCAAGGATGC CAATTTACTA
541 CACTCCTCAG GATCACGCCC CGACGTGATT GTCAACTGTA GTGGTCTCTT TGCCCGGTTC
601 TTGGGAGGCG TCGAGGACAA GAAGATGTAC CCTATTCGAG GACAAGTCGT CCTTGTTCGA
661 AACTCTCTTC CTTTTATGGC CTCCTTTTCC AGCACTCCTG AAAAAGAAAA TGAAGACGAA
721 GCTCTATATA TCATGACCCG ATTCGATGGT ACTTCTATCA TTGGCGGTTG TTTCCAACCC
781 AACAACTGGT CATCCGAACC CGATCCTTCT CTCACCCATC GAATCCTGTC TAGAGCCCTC
841 GACCGATTCC CGGAACTGAC CAAAGATGGC CCTCTTGACA TTGTGCGCGG ATGCGTTGGC
901 CACCGTCCTG GTAGAGAGGG CGGTCCCCGA GTAGAATTAG AGAAGATCCC CGGCGTTGGC
961 TTTGTTGTCC ATAACTATGG TGCCGCCGGT GCTGGTTACC AGTCCTCTTA CGGCATGGCT
1021 GATGAAGCTG TTTCTTACGT CGAAAGAGCT CTTACTCGTC CAAACCTTTA G

Claims (6)

1.一种具有D-氨基酸氧化酶活性的谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，将Trigonopsisvariabilis来源的D-氨基酸氧化酶基因克隆至Corynebacterium glutamicum ATCC13032中获得的。
2.一株具有亮氨酸脱氢酶活性的大肠杆菌重组菌，其特征在于，将Bacillus cereus来源的亮氨酸脱氢酶基因克隆至Escherichia coli BL21中获得的。
3.一株具有甲酸脱氢酶活性的大肠杆菌重组菌，其特征在于，将Candida boidinii来源的甲酸脱氢酶基因克隆至Escherichia coli BL21中获得的。
4.一种重组菌株的培养方法，其特征是：将权利要求2所述的重组菌接种于10mL LBG培养基中，30℃振荡培养12h后，取2ml转接于200ml LBG(LB+0.5％葡萄糖)30℃培养3-6h后，添加终浓度为0.8mM的IPTG对重组菌的精氨酸酶进行诱导表达，诱导表达后离心收集重组菌细胞；权利要求3和权利要求4所述的重组菌分别接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养12h后取2mL接种于200mL的LB中培养3-6h后，添加终浓度为0.8mM的IPTG进行28℃诱导表达，诱导表达后分别离心收集重组菌细胞；将上述三种重组菌细胞分别通过超声破碎细胞后，分别离心收集上清粗酶液。
5.一种酶转化法生产L-正缬氨酸的方法，其特征在于，将权利要求5所述的粗酶液作为生物催化剂，以混合型DL-正缬氨酸为底物酶催化合成L-正缬氨酸，催化温度优选30℃，转化pH优选7.5，优选0.1M磷酸盐为缓冲液。
6.将权利要求1-4所述的重组菌或重组菌的裂解液用于其他化合物的合成。
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