CN108103038A - 一种高效合成l-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用 - Google Patents

一种高效合成l-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效合成L‑苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。本发明首先实现了来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达，并通过定点突变得到还原特性显著提高的突变体N71S，并将该突变酶与甲酸脱氢酶突变体在大肠杆菌中共表达，形成胞内原位辅因子NADH循环体系，通过启动子和RBS序列优化控制甲酸脱氢酶突变体的表达量，成功构建了重组大肠杆菌单细胞工厂，并利用单细胞工厂进行全细胞转化制备L‑苯苷氨酸，该方法转化过程简单快捷，成本低廉，没有副产物，利于分离纯化，在5L发酵罐中转化4h，L‑苯甘氨酸产量可达105.7g/l，转化率为93.3％，L‑苯苷氨酸的时空产率为26.3g/L·h，为L‑苯苷氨酸的工业化生产提供了一种实际有效的策略。

Description

一种高效合成L-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用
技术领域
本发明涉及一种高效合成L-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
苯甘氨酸及其衍生物是一种重要的医药中间体，可用于合成氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢克罗、阿莫西林、苯咪唑青霉素等内酰胺类抗生素。邻氯苯甘氨酸则是合成抗血小板抑制剂氯批格雷的重要中间体。此外苯甘氨酸还是合成多肽类激素和多种手性农药的重要中间体，随着我国医药化工行业的飞速发展，相信对苯甘氨酸及其衍生物的需求量还将会不断增加，具有广阔的应用市场。
L-苯甘氨酸的合成方法主要包括化学合成法、化学酶法及生物转化法三种。其中化学合成法除了目前工业上最常用的氰化钠法之外，近些年文献报道的还有苯乙酸法、乙醛酸法、氯仿法和相转移催化法等。化学合成虽然工艺成熟，操作简单，但往往反应条件苛刻且易生成副产物，有时需要利用对环境有害的大量有机溶剂，例如常用的氰化钠法，由于使用剧毒物质氰化钠，带来严重的环境污染问题，而苯乙酸法生产工艺操作步骤比较复杂繁琐，需要严格的反应条件，溶剂回收套用也是比较大的问题，相比之下，生物转化法具有特异性较强，光学纯度高，条件温和，对环境友好等优点，近年来受到极大的关注。并且随着基因工程技术的发展，构建重组微生物合成非天然氨基酸代谢途径已经可以完成。目前已知的利用生物转化法合成苯甘氨酸的酶主要有海因酶和苯甘氨酸转氨酶及氨基酸脱氢酶等。
在之前的研究中，2010年，W.Kroutil构建了一个由扁桃酸消旋酶、扁桃酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶组成的多酶级联反应，可以将外消旋的扁桃酸转化成光学纯的L-苯苷氨酸，无需添加额外的辅酶，在5g/L的水平上可以实现94％的转化率，产物ee值>97％。2014年，徐建和等利用扁桃酸消旋酶，新型的扁桃酸脱氢酶和新型的亮氨酸脱氢酶构建了同样的级联反应，在1L规模水平，经过12h的转化反应，30.4g外消旋的扁桃酸转化得到光学纯的L-苯苷氨酸，转化率达到96.4％，ee值>99％。虽然该多酶级联转化法生产L-苯甘氨酸相比之前的报道产量有所提高，但是进一步提高底物浓度转化率就会明显下降，很难实现大规模工业化生产。同时，利用该转化体系去进行L-苯苷氨酸的生产需要对产酶的三种重组菌进行细胞破碎，工艺繁琐成本高昂，同时在转化的过程中因酶的失活而影响了转化的稳定性，另外需要添加外源的辅因子，进一步增加了L-苯苷氨酸的生产成本。因此，有必要寻找一种高效稳定但成本低廉的制备L-苯甘氨酸的方法。
发明内容
为了建立一种更加高效稳定廉价的合成L-苯苷氨酸的方法，本发明提供了一种构建用于以苯乙酮酸为底物高效转化生产L-苯甘氨酸的重组大肠杆菌单细胞工厂的方法，并提供了利用该单细胞工厂进行全细胞转化高效制备L-苯苷氨酸的方法。
本发明首先通过表达载体pET-28a成功实现了来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)在大肠杆菌E.coli BL21中的高效表达，并对该重组酶进行纯化测定酶学性质，找出该酶催化特性的不足，为了提高该酶的催化特性，通过定点突变的方法，得到还原特性显著提高的突变体N71S，并通过表达载体pET-28a将该突变酶与已经报道的酶活和热稳定性提高的甲酸脱氢酶(FDH)突变体(申请号201610978442.2)在大肠杆菌E.coli BL21中共表达，形成胞内原位辅因子NADH循环体系，并通过启动子和RBS序列优化控制甲酸脱氢酶突变体的表达量，使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平，成功构建了不同的重组大肠杆菌单细胞工厂，并利用这些单细胞工厂进行全细胞转化高效制备L-苯苷氨酸，为L-苯苷氨酸的工业化生产提供了一种实际有效的策略。
本发明的第一个目的是提供一种还原特性显著提高的LeuDH突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的氨基酸的基础上，将71位天冬酰胺突变成丝氨酸所得。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第71位的天冬酰胺的密码子突变成编码丝氨酸的密码子所得。
本发明的第三个目的是提供一种高效合成L-苯甘氨酸的重组菌单细胞工厂，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联LeuDH突变体基因及提供辅因子NADH循环的FDH突变体所得；其中，通过启动子和RBS优化控制提供辅因子NADH循环的突变体FDH的表达量使辅因子的生成速率处于相对较高的水平。
所述的重组菌单细胞工厂能得到较优的从苯乙酮酸到L-苯苷氨酸的转化速率和最终产量，底物抑制效应不明显，同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子，相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。
在本发明的一种实施方式中，所述控制是通过但不限于启动子和RBS序列优化，也可以是增强子、终止子或沉默子优化。
本发明的第四个目的是所述重组菌单细胞工厂的构建方法，包括：
(1)对辅因子NADH的供应速率进行了调控，主要是对启动子以及RBS序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的再生速率；
(2)将LeuDH突变体基因、启动子以及RBS优化后的提供辅因子NADH循环的FDH突变体基因按顺序连接，构建重组共表达载体，并将重组共表达载体转化宿主菌中，构建基因工程菌单细胞工厂。
在本发明的一种实施方式中，所述LeuDH突变体基因前有质粒载体自身携带的启动子和RBS序列；所述提供辅因子NADH循环的FDH突变体基因前有针对其基因和质粒载体设计的启动子、表达强度高于或等于质粒载体本身RBS的RBS序列。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌可以是大肠杆菌，也可以是其他宿主，比如、枯草芽孢杆菌、棒杆菌或酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌为E.coli BL21。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体可以是任意一种可商业化购买的质粒载体，或者是任意一种已有报道的经改造的质粒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的FDH突变体基因前的启动子或RBS序列，也可以是针对不同表达系统进行优化得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述提供辅因子NADH循环的FDH突变体基因前的启动子为tac启动子，RBS序列为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:13中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述重组共表达载体是在质粒载体pET-28a的基础上构建得到的。
本发明的第五个目的是提供一种全细胞转化合成L-苯甘氨酸的方法，利用本发明的重组菌单细胞工厂作为全细胞催化剂。
本发明还要求保护所述的重组菌单细胞工厂应用于L-苯苷氨酸或其相关衍生物的合成。
本发明的有益效果：
本发明首次构建了重组LeuDH突变体及已经报道的酶活和热稳定性提高的FDH共表达的可实现辅因子NADH原位再生的单细胞工厂，同时利用启动子及RBS序列优化控制了提供辅因子NADH的FDH突变体的表达量，优化了辅因子NADH的再生速率，最后将其与高效的LeuDH突变体串联到质粒上并在大肠杆菌E.coli BL21中表达，构建了不同的重组菌单细胞工厂，利用该单细胞工厂实现了全细胞高效转化制备L-苯甘氨酸。利用该单细胞工厂以苯乙酮酸为底物进行全细胞转化制备L-苯苷氨酸，转化过程操作简单、重组菌培养成本低廉，且转化过程中不需要添加任何辅因子，在提高转化效率的同时降低了成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
TB培养基(g/L)：甘油4，胰蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO412.5，KH2PO42.3，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
TY培养基(g/L)：葡萄糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 3，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
TYG培养基(g/L)：甘油10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
GP培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，柠檬酸钠1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
实施例1：大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
(1)大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于10ml LB培养基中活化，之后转接于37℃振荡培养至OD6000.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min；准备灭好菌的1.5mL离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2mL，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10-20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2400μL，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min(该步骤重复2-3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl280μL，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
(2)质粒的转化：取步骤(1)制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min；将离心管放入42℃水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培养基800μL，轻轻混合，37℃摇床培养1-1.5h；菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200μL于目标抗性平板，置于37℃培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
实施例2：LeuDH突变体N71S在大肠杆菌中的表达及酶活测定
(1)突变体N71S的获得，以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)和Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因。
(2)将重组基因与pET-28a分别用EcoR I、Xho I双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化E.coli BL21感受态细胞。37℃培养1-2h，转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pET-28a-N71S，测序工作由上海生工完成。得到的含正确重组质粒pET-28a-N71S的菌株即为本发明的重组基因工程菌pET-28a-N71S/BL21。
(3)将步骤(2)构建的重组菌pET-28a-N71S/BL21与表达未突变的野生LeuDH(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的对照菌株pET28a-LeuDH/BL21分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养4h后加入0.5mM的IPTG于16℃诱导24小时。离心收集细胞并破碎，细胞破碎上清液(粗酶液)用于酶活力的测定。
(4)LeuDH还原反应酶活的测定方法：反应体系为900mM的NH4Cl-NH3·H2O缓冲液，含5mmol/L苯乙酮酸，0.3mmol/LNADH，加入适量的酶液启动反应，30℃反应1分钟，每隔30s测定340nm吸光度的值并记录数据。根据NADH的摩尔消光系数利用公式计算得出酶活。酶活定义为每分钟还原lμmol NAD+为NADH所需的酶量为一个酶活单位U。
(5)将得到的粗酶液经纯化后得到野生LeuDH和突变体N71S，分别分析纯化后的重组LeuDH和突变体N71S动力学参数，如表1，突变体N71S对底物苯乙酮酸的Km较突变前降低1.2倍，Kcat较突变前提高了1.9倍，而催化效率(kcat/Km)提高2.2倍，而对底物NADH的Km较突变前降低1.3倍，催化效率(kcat/Km)没有明显变化。说明突变体N71S对底物苯乙酮酸的亲和力和催化效率较突变前显著提高，比酶活较突变前提高了1.2倍。
表1 LeuDH和N71S反应动力学参数分析
对得到的纯酶进行热稳定性分析，在温度为60℃条件下孵育不同时间，发现突变体N71S的半衰期为4h，相比野生型LeuDH(2h)提高了2倍，说明突变体N71S的热稳定性显著提高。
对得到的纯酶进行pH稳定性分析，在不同pH条件下孵育，发现突变体N71S在偏酸性条件下的残余酶活比野生型LeuDH高，其中pH＝6时，突变体N71S的残余酶活为89.2％而野生型LeuDH仅为45.3％。说明突变体N71S在偏酸性条件下的pH稳定性也显著提高。
通过对LeuDH的结构建模，底物结合位点分析发现，在原始酶的立体结构中，位于底物结合位点的71位天冬酰胺残基可与L42、G79、M67、G75和L76形成氢键，维持底物结合区的结构稳定性，当71位天冬酰胺残基突变为丝氨酸后，加强了71位氨基酸残基与M67的氢键作用力，同时减弱了与L42和G79的氢键作用力，在维持底物结合区的稳定的同时又增加了底物结合微区域的柔性，因此突变体N71S的底物亲和性、比酶活、热稳定性及在偏酸性条件下的pH稳定性都有明显的提高。因为在L-苯甘氨酸的转化过程中，底物和产物都会引起转化液pH的下降，而突变体N71S在酸性条件下pH稳定性的提高对于全细胞转化制备L-苯甘氨酸是非常有利的。
实施例3：提供辅因子NADH的FDH突变体A10C的启动子及RBS序列优化的重组大肠杆菌的构建
(1)选取了tac启动子，并根据pXMJ-19质粒上的tac启动子及突变体A10C的基因序列，设计含有不同强度的RBS序列(用下划线加粗表示，如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:13所示)的PCR引物r1FDH、r2FDH、r3FDH、r4FDH、r5FDH、r6FDH和r7FDH(SEQ ID NO:14～SEQ IDNO:20)，及甲酸脱氢酶基因的末端引物pFDHRBamHI(SEQ ID NO:21)。
(2)利用已有的携带FDH突变体A10C的载体pET28a-A10C为模板，分别以含有不同强度的RBS序列的引物和pFDHRBamHI组成引物对，进行PCR，得到多条含有RBS序列和甲酸脱氢酶的基因片段，将其与pXMJ-19质粒连接(核苷酸片段与质粒分别用Hind III和BamHI进行双酶切，然后连接)，得到表达FDH突变体A10C的重组质粒pXMJ-19-r1A10C、pXMJ-19-r2A10C、pXMJ-19-r3A10C、pXMJ-19-r4A10C、pXMJ-19-r5A10C、pXMJ-19-r6A10C和pXMJ-19-r7A10C、将重组质粒转化到感受态E.coli BL21，筛选正确的转化子，即得到表达含有不同强度RBS序列的FDH突变体A10C的重组菌。
(3)将(1)和(2)中所构建好的重组菌分别利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100ml的LB基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。对甲酸脱氢酶的酶活力进行测试实验，取培养好的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mLpH 7.0的50mM PB缓冲液洗涤二次，将重组大肠杆菌重悬于10mL的50mM PB缓冲液中。将悬浮好的细胞放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，破1s，停3s，300W的功率工作时间10min。取破碎液于离心机内4℃，10000r/min离心30min去除沉淀，测定上清液酶活。
(4)甲酸脱氢酶酶活测定方法：利用0.1M的pH 7.5的PB缓冲液来配制100mM的甲酸钠底物溶液。将0.96mL的底物缓冲液加入到比色皿中，再加入40μL的酶液并立即混匀。通过计算酶反应液在340nm紫外光下吸光值的变化去测定生成NADH浓度的变化，根据NADH的摩尔消光系数利用公式计算得出酶活。酶活的定义为：每分钟产生的1μmol的NADH所需的酶量为1U。
(5)结果显示重组菌pET-28a-A10C/BL21、pXMJ-19-r1A10C/BL21、pXMJ-19-r2A10C/BL21、pXMJ-19-r3A10C/BL21、pXMJ-19-r4A10C/BL21、pXMJ-19-r5A10C/BL21、pXMJ-19-r6A10C/BL21和pXMJ-19-r7A10C/BL21在LB培养基中所诱导出的酶活分别为0.34U/mL、0.12U/mL、0.15U/mL、0.14U/mL、0.27U/mL、0.56U/mL、0.37U/mL和0.41U/mL。结果说明不同强度的RBS可以有效的调控突变体A10C的表达量。
实施例4：高效合成L-苯甘氨酸的重组大肠杆菌单细胞工厂的构建
分别以pXMJ-19-r1A10C、pXMJ-19-r2A10C、pXMJ-19-r3A10C、pXMJ-19-r4A10C、pXMJ-19-r5A10C、pXMJ-19-r6A10C及pXMJ-19-r7A10C为模板、pTacFSphI(SEQ ID NO:24)和pFDHRBglII(SEQ ID NO:25)为引物，进行PCR扩增，得到携带pXMJ-19质粒载体本身的tac启动子及不同强度RBS序列的FHD突变体A10C基因片段，将所得基因片段与实施例2中构建的重组载体pET-28a-N71S同时用sphI和BglII进行双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化E.coli BL21感受态细胞。37℃培养1-2h，转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，得到的含正确重组质粒的各菌株即为本发明所构建的不同的重组大肠杆菌单细胞工厂分别为pET-28a-N71S-r1A10C/BL21、pET-28a-N71S-r2A10C/BL21、pET-28a-N71S-r3A10C/BL21、pET-28a-N71S-r4A10C/BL21、pET-28a-N71S-r5A10C/BL21、pET-28a-N71S-r6A10C/BL21和pET-28a-N71S-r7A10C/BL21。
实施例5：重组大肠杆菌单细胞工厂全细胞转化生产L-苯苷氨酸
将实施例4得到的重组大肠杆菌单细胞工厂pET-28a-N71S-r1A10C/BL21、pET-28a-N71S-r2A10C/BL21、pET-28a-N71S-r3A10C/BL21、pET-28a-N71S-r4A10C/BL21、pET-28a-N71S-r5A10C/BL21、pET-28a-N71S-r6A10C/BL21和pET-28a-N71S-r7A10C/BL21分别利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100mL的LB培养基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。进行全细胞转化实验，取培养好的不同菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mLpH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤二次，分别将重组大肠杆菌重悬于100mL的pH7.5的50mM PB缓冲液中。向该体系中投入500m M苯乙酮酸及甲酸铵，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在7.5左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
氨基酸测定结果显示pET-28a-N71S-r1A10C/BL21、pET-28a-N71S-r2A10C/BL21、pET-28a-N71S-r3A10C/BL21、pET-28a-N71S-r4A10C/BL21、pET-28a-N71S-r5A10C/BL21、pET-28a-N71S-r6A10C/BL21和pET-28a-N71S-r7A10C/BL21全细胞转化制备L-苯苷氨酸的产量分别为33.8g/L、20.5g/L、22.2g/L、21.5g/l、58.8g/L、39.6g/L、40.5g/L。由所得结果可知，提供辅因子循环的FDH突变体A10C的rbs序列强度越高，酶的表达强度越大，辅因子NADH的再生速率越快，L-苯苷氨酸的转化效率也就越高，因此选取重组大肠杆菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21作为本发明下一步转化的单细胞工厂。
实施例6：重组菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21在不同发酵培养基培养后进行全细胞转化生产L-苯甘氨酸
将重组大肠杆菌单细胞工厂pET-28a-N71S-r5A10C/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后分别转接于100mL的LB、TB、TY、TYG及GP发酵培养基中。接种量1％，培养温度37℃，摇床转速160r/min。培养至OD600约0.6～0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，置于16℃摇床24h诱导表达。进行全细胞转化实验，取培养好的不同菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用100mLpH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤二次，分别将重组大肠杆菌重悬于100mL的pH7.5的50mM PB缓冲液中。向该体系中投入500m M苯乙酮酸及甲酸铵，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在7.5左右，转化持续2h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。
氨基酸的HPLC分析条件：在EP管中依次加入转化液样品200μL，衍生剂400μL(取10mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂缓冲液及50μL 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400μL 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱：Dimosoil C8(5μm,150mm×4.6mm)，流动相：0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器：UV Detector，检测波长：338nm，柱温：30℃，进样量：20μL，流速：1.0ml/min。
氨基酸测定结果显示重组大肠杆菌单细胞工厂pET-28a-N71S-r5A10C/BL21经LB、TB、TY、TYG及GP等发酵培养基培养后，全细胞转化制备L-苯苷氨酸的产量分别为57.9g/L、70.5g/L、69.8g/l、64.7g/L、及65.1g/L。由所得结果可知，经发酵培养基TB和TY培养后重组菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21转化产L-苯甘氨酸效果最好，因酵母提取物的成本相比于葡萄糖来说较高，因此确定最佳的发酵培养基为TY培养基。
实施例7：重组菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21经TY培养基培养后5L发酵罐全细胞转化生产L-苯甘氨酸
将重组菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21利用LB培养基活化，37℃、160r/min培养过夜后转接于2L的TY培养基中，接种量8％，培养温度37℃，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.3mM的IPTG，诱导温度降低为28℃，诱导16h后，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用pH 7.5的50mM PB缓冲液将重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.5的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入750m M苯乙酮酸及甲酸铵，于30℃，300r/min进行转化，转化过程中添加50％的氨水使转化的pH保持在7.5左右，转化持续5h，分不同时间取样，稀释并用0.22μm滤膜过滤后经HPLC分析。发现重组菌pET-28a-N71S-r5A10C/BL21用于以苯乙酮酸为底物转化生成苯甘氨酸时，转化4h时，产量达到最大，为105.7g/L，转化率为93.3％，L-苯苷氨酸的时空产率为26.3g/L·h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高效合成L-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala
20 25 30
Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp
35 40 45
Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala
50 55 60
Lys Gly Met Thr Tyr Lys Ser Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala
85 90 95
Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr
100 105 110
Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile
115 120 125
His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
165 170 175
Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys
180 185 190
His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys
195 200 205
Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu
210 215 220
Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
260 265 270
Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile
275 280 285
Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn
290 295 300
Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala
305 310 315 320
Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala
325 330 335
Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg
340 345 350
Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg
355 360 365
<210> 2
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln
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Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala
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Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
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Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
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180 185 190
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Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
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Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgacattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60
caagataaag aatctggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120
gctcttggtg gaacaagaat gtggacatat gattctgaag aagcggcgat tgaagatgca 180
ttgcgtcttg caaaagggat gacatacaaa agcgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240
gcgaaaacag taattatcgg tgatcctcgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgca 300
ctaggacgtt atatccaagg actaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360
acagtagatg atatggatat tatccatgaa gaaactgact ttgtaacagg tatctcacca 420
tcattcggtt cttctggtaa cccatctccg gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480
aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gacaatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540
caaggcgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600
ttaatcgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg ctgtagaaga attcggtgca 660
tcagcagttg aaccaaatga aatttacggt gttgaatgcg atatttacgc accatgtgca 720
ctaggcgcaa cagttaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780
tctgcaaata accaattaaa agaagatcgt catggtgaca tcattcatga aatgggtatt 840
gtatacgcac cagattatgt aattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgaatta 900
tatggataca atagagaacg tgcactaaaa cgtgttgagt ctatttatga cacgattgca 960
aaagtaatcg aaatttcaaa acgcgatggc atagcaactt atgtagcggc agatcgtcta 1020
gctgaagagc gcattgcaag cttgaagaat tctcgtagca cttacttacg caacggtcac 1080
gatattatta gccgtcgcta a 1101
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 19
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<210> 20
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccaagcttt gttaaacaag gtccaactac ggttaacaca atgaagatcg ttttagtctt 60
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<210> 21
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<210> 22
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<212> DNA
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ttaatcacca cgtctgataa agaaggcgga aacagtgtgt tggatcaaca tataccagat 180
gccgatatta tcattacaac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagaatcgac 240
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aaagatgctg aagaaaaagt tggtgctaga agggttgaaa atattgaaga attggttgcc 660
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aaggaattat tgtctaaatt caagaaaggt gcttggttag tcaatactgc aagaggtgcc 780
atttgtgttg ccgaagatgt tgctgcagct ttagaatctg gtcaattaag aggttatggt 840
ggtgatgttt ggttcccaca accagctcca aaagatcacc catggagaga tatgagaaac 900
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actagatacg ctcaaggtac taaaaatatc ttggagtcat tctttactgg taagtttgat 1020
tacagaccac aagatatcat cttattaaac ggtgaatacg ttaccaaagc ttacggtaag 1080
cacgataaga aataa 1095
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Cys Gly Lys His Ala Ala Asp
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Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn
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Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu
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Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile
50 55 60
Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp
65 70 75 80
Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp
85 90 95
His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
100 105 110
Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val
115 120 125
Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln
130 135 140
Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr
145 150 155 160
Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly
165 170 175
Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly
195 200 205
Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile
210 215 220
Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn
225 230 235 240
Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr
245 250 255
Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro
275 280 285
Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala
290 295 300
Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr
325 330 335
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu
340 345 350
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
355 360
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
catgcatgct gacaattaat catcggct 28
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gaagatctta tttcttatcg tgtttac 27

Claims (10)

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
3.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的重组表达载体。
4.一种表达权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
5.一种高效合成L-苯甘氨酸的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的；所述重组共表达载体是在质粒载体上串联权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体基因及提供辅因子NADH循环的甲酸脱氢酶突变体所得。
6.根据权利要求5所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的表达量控制是通过但不限于启动子和RBS序列优化。
7.根据权利要求6所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体基因前的启动子为tac启动子，RBS序列为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:13中的任意一种。
8.根据权利要求5所述的重组菌单细胞工厂，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的表达量控制是通过增强子、终止子或沉默子优化。
9.一种全细胞转化法合成L-苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求5～8任一所述的重组菌单细胞工厂。
10.权利要求5～8任一所述的重组菌单细胞工厂应用于L-苯苷氨酸及其相关衍生物的合成。
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