JP2019516359A - アクリルアミドの製造のためのバイオテクノロジー手法および関連新規菌株 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株でＰａｌｌａｄｉｏ ２２と命名され、ＢＣＣＭ−ＬＭＧ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録番号ＬＭＧ Ｐ−２９５２０で登録された菌株に関する。本発明はまた、前記菌株のバイオマスを用いたアクリロニトリルの水和によるクリルアミドの製造方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ロドコッカス属ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ種に属する菌株に関し、この菌株は、ニトリルヒドラターゼ酵素を発生させる能力を有する。
本発明はまた、この菌株の培養、アクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造のためのこの菌株バイオマスの使用および対応するアクリルアミド製造方法にも関する。
アクリルアミドは、アクリレートの合成における中間体化学化合物であり、種々のポリマーの製造用のモノマーとして、および給水または排水の凝固剤または凝集剤としての処理によく使用される。分子生物学では、ゲルの形で、アクリルアミドは、クロマトグラフおよび電気泳動技術におけるタンパク質の分析および分離の手段として使用される。
重合は、水溶液中で実施され、ポリマーは、水への高溶解度および一般有機溶媒への不溶性を特徴とする。
現在でも、アクリルアミドは、いくつかのプラントでは、触媒としての還元銅の存在下で、アクリロニトリルの硫酸による化学的水和により製造されている。
しかし、化学的水和反応は、金属触媒の調製の複雑さ、形成されたアクリルアミドの回収と精製の困難さ、副産物の形成、変換の低収率および厳格な反応条件を含む多くの問題がある。
さらに、アクリルアミドの製造の現在の工業的プロセスは、多くの別々の処理ステップを含み、原材料の最終コストが高価になる。
したがって、この化合物は、記載した全ての有害事象を克服し、同時に低い製造コストを維持する代替供給源から得られるべきであることが強く感じられている。
微生物などの生体触媒を用いて化学反応を実行するための酵素触媒作用は、文献に十分に記載されている。
１９７０年代には、いくつかの微生物の、ニトリルを対応するアミドに変換する能力が文献に記載されている。
この変換は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリジウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビウム（Ｐｈｉｚｏｂｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードノカルジア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス（Ｐｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）およびコモモナス（Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ）属などの異なる分類群に属する種々の微生物により合成される、生体触媒のニトリルヒドラターゼ酵素により触媒される。
特許文献、欧州特許出願公開第２７４９６３７（Ａ１）号明細書（米国特許出願公開２０１４／０１８７８１８号明細書）が知られており、この特許文献は、菌株ロドコッカス・アエセリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ）ＶＫＭ Ａｃ−２６１０Ｄについて記載しており、この菌株は、アクリロニトリルのアクリルアミドへの変換に必要なニトリルヒドラターゼ酵素を生成する。
欠点は、菌株ロドコッカス・アエセリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｔｈｅｒｉｖｏｒａｎｓ）ＶＫＭ Ａｃ２６１０Ｄのニトリルヒドラターゼ酵素によるアクリルアミド製造能力は４９％以下であるという点にある。
特許文献、米国特許第５８２７６９９号明細書は、新規菌株ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｍ３３ ＶＫＭ Ａｃ−１５１５Ｄを開示している。この菌株は、脂肪族および芳香族化合物を対応するアミドに水和することができる高ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
この菌株は、培地中に酵素誘導物質の存在を何ら必要せず、培地中には、塩、炭素源（グルコース、ピルビン酸塩または酢酸塩）および窒素源（アンモニウム、尿素または硝酸塩）のみが存在する。
不都合にも、この菌株は構成的ニトリルヒドラターゼ活性を有し、培地中に誘導物質の非存在下でも増殖するにも関わらず、溶液中で生産されるアクリルアミドの最大量は、４６％（重量／体積）以下である。
現在既知で、アクリルアミドの生産に用いられているほとんどの菌株は、生産できるアクリルアミドの最大濃度が通常４０％（重量／重量）以下であり、したがって、それらの使用は限られている。
加えて、不都合にも、増殖に必要な微生物の培地の成分、例えば、ビタミン、酵母エキスおよびペプトンは、極めて高価である。
ニトリルおよびアミドの酵素加水分解プロセスに関し、重要な研究が実施され、顕著な成功が達成されているが、ニトリルヒドラターゼを生成する新規な菌株の発見に対する需要は継続して大きくなっている。
これは、一部には、アミドの生物工学的製造の環境安全性および有効性に起因し、また一部には、特許菌株の高コストに起因する。したがって、この酵素を生成する新規微生物が最近単離されている。
最終的に、汚染残留物を含まず、再現できる結果を保証する純粋なアクリルアミドを製造する必要性により、研究者が、新規菌株を探索し、上記に示したものに対する代替戦略を開発する方向に導かれた。
欧州特許出願公開第２７４９６３７号（米国特許出願公開第２０１４／０１８７８１８号）明細書 米国特許第５８２７６９９号明細書
本発明の目的は、アクリルアミドの製造のための、ニトリル基のアミド基への水和反応でニトリルヒドラターゼ酵素の収率を、先行技術に記載の菌株に比べて、高めることを可能にするという技術的特徴を備えたロドコッカス属の菌株を提供することである。
さらなる目的は、多量のロドコッカス属菌株のバイオマスを得るために、改善された効果的で迅速な培養プロトコルの開発であり、ここで、バイオマスは、培養ブロス中に存在するロドコッカス属細胞の総質量を意味する。開発した方法は、培養ブロスのリットル当たり１００ｇ／Ｌを超え、１０５℃での乾燥残留物が２５ｇ／Ｌのバイオマスを得ることを可能とする。
さらに、本発明は、既知の製造方法に比べて、菌株培養の不必要なコストを大きく減らすことを目的とする、高濃度のアクリルアミドの製造方法に関する。
前述の目的は、請求項１で特徴付けられる菌株により、特に、「Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２」と命名され、ブダペスト条約の規定に従って、ベルギーの微生物保存機関のＬＭＧに２０１６年１２月４日に登録され、ＬＭＧ Ｐ−２９５２０の登録番号を有する、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）種の株により、実現される。
上記菌株は、ニトリルヒドラターゼ酵素を生成する。上記で確認した菌株は、好ましくは、乾燥状態、凍結乾燥状態またはペースト状のバイオマスの形態で、１０５℃での乾燥残留物が１８〜３０％、好ましくは、２０〜２７％である。
本発明は、化学化合物、好ましくはアミドの製造のための、前記菌株の使用に関する。本発明は、アクリルアミドの製造のための、前記菌株の使用に関する。
本発明の目的はまた、上記菌株のバイオマスを用いたアクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造方法であり、水和プロセスは、反応溶液の総重量の０．８％より少ないアクリロニトリルの濃度で行われる。
好ましくは、水和プロセス中に溶液中の遊離アクリロニトリルの濃度が、反応溶液の総量の０．８％を超えないように、アクリロニトリルは、菌株のバイオマスを含む水溶液に添加される。
好ましくは、記載される方法は、５０％〜５７．５％、好ましくは、５０〜５４％（重量／重量）のアクリルアミド製造収率を有する。好ましくは、アクリルアミドの製造は、撹拌下、１４〜２３℃の温度範囲、５．０〜８．５のｐＨで行われる。
本発明は、前記菌株のバイオマスを用いたアクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造方法に関し、バイオマスは固体基材上に固定化される。
本発明の目的はまた、菌株のバイオマスから抽出したニトリルヒドラターゼ酵素を用いたアクリロニトリルの水和後のアクリルアミドの製造方法に関し、酵素は固体基材上に固定される。
本発明は、さらに、上記菌株の培養方法に関し、菌株の増殖は、ナトリウムおよびカリウムを含むリン酸緩衝液、炭素源、窒素源、マグネシウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、鉄塩（ＩＩ）、コバルト塩および、場合により、酵母エキスを含む栄養培地への株の接種を含む。好ましくは、増殖は、１０〜３５℃、好ましくは２０〜３５℃の温度で２〜４日間、８．３〜６．３、好ましくは７．４〜６．５の増殖ｐＨ下で行われる。
好ましくは、培養方法は、さらなる固形培地中で株を増殖させるステップ、液体培地中で株を増殖させるステップ、発酵ステップ、菌株のバイオマスの凝集および分離のステップをさらに含む。
好ましくは、菌株は、１０ｍｍの厚さの細胞で５４０ｎｍの波長で測定して、９０〜２２０ ＯＤの光学密度を有するまで培養される。
好ましくは、得られた菌株は、少なくとも１５０μモルのアミド／分／ｍｇの乾燥重量細胞のニトリルヒドラターゼ活性を有する。
さらに、本発明はまた、本発明の菌株の生殖または増殖により得られたロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株に関する。
特に、本発明の菌株は、アクリロニトリル基質をアクリルアミドに水和でき、先行技術で記載の菌株より大きな最終的産出量を可能とする。
このようなアクリルアミドの高い製造は、アクリルアミドの毒性に対する菌株の有利な耐性により与えられる。
実際に、出願者は、意外にも、本発明の対象の菌株は、変換反応中に、５０％（重量／重量）を超えるアクリルアミド濃度に耐え、この濃度を実現することができることを見出した。
腐敗した草／葉状の物質が存在する土壌からサンプリングすることにより、アクリルアミドの産生菌株をイタリアの土壌から単離した。
培地およびニトリル基の対応するアミドへの水和を可能とするニトリルヒドラターゼ酵素を生成できる微生物を選択できる分析方法を用いて、その株の単離および培養を行った。
本発明の対象の菌株は、リボソームＲＮＡ １６Ｓ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）コード遺伝子の１３６５ヌクレオチドの領域をシーケンシングすることにより特定された。
得られた配列は、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）（ＴＲ９Ｔ）の株と９９．９３％の類似性を示し、同等の配列の合計長さに比べて一塩基の差異であった。
本発明の対象の菌株は、次の形態学的および生化学的特徴を有する：
−寒天培養：光沢のあるピンクがかっているオレンジ色のコロニーの、円形で凸状形態；
−移動性：なし；
−芽胞形成：なし；
−グラム染色：陽性；
−培養条件：好気生活下２０〜３５℃。
本発明の菌株は、好気性で、カタラーゼ陽性であり、増殖相に応じて、顕微鏡下で棒またはココナツの形態を有する。
ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２菌株は、優れた増殖特性を有し、アミドに対応する脂肪族および芳香族ニトリルの加水分解を触媒できる。
このような水和作用は、特に、ニトリルヒドラターゼ酵素により触媒され、好ましくは、尿素およびその誘導体などの酵素誘導物質の培地への添加により誘導される。
本発明の対象である菌株は、機能的観点から特徴付けられ、ＰＣＲ増幅およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法によるシーケンシングにより、この株がコバルト依存性ニトリルヒドラターゼ酵素のαおよびβサブユニットを有することが認められた。
この株の別の好都合な特徴は、極めて低いアミダーゼ活性を有し、したがって、生成したアクリルアミドの優れた品質を保証する。正確には、アミダーゼ活性は、生成したアクリルアミドの分解を生ずる。
好都合にも、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２の菌株は、ビタミンなどの高価な栄養素およびその他の成長因子を含まない単純な培地中で増殖する。
換言すれば、出願人は、本発明の菌株のヒドラターゼ活性は、標準的培養条件下、適切に配合された培地中で、先行技術に記載の菌株に対して改善されていることがわかった。
ケースバイケースの培地の使用により、個々の成分の組み合わせによる配合を可能とし、市販のすぐに使える培地の使用に勝る節約を可能とするのみでなく、具体的な必要性に応じ、各成分の濃度の調節を可能にする。
現在まで利用可能なものと異なり、本発明の菌株は、培地中で生成され、放出された極めて高い高濃度のアクリルアミドに耐える能力を有し、このことにより、この菌株が高濃度アクリルアミドの工業生産に好適なものになる。
特に、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２株は、５０％（重量／重量）を大きく超えるアクリルアミド濃度に対し意外な耐性を有する。
本菌株のこのような特徴および製造方法の特徴は、記載した本発明を経済的に有利に、および成功裏に工業的に適用可能なものにする。
本発明はまた、菌株のバイオマスの使用およびバイオマスそれ自体からのアクリルアミドのその後の分離に基づく、アクリルアミドの大規模製造用に開発された合成プロセスに関する。
ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２株の増殖は、第１のステップ（例えば、ペトリ皿および寒天斜面培地の試験管内での増殖）では、通常、寒天を添加した、固形栄養培地への接種により行われ、一方、その後の生長段階（例えば、フラスコおよび発酵槽）では、増殖は液体栄養培地（培養ブロス）中で行われる。
固形栄養培地は、牛エキス、ペプトン、ＮａＣｌ、酵母エキスおよび寒天からなる。液体栄養培地は、炭素源、窒素および鉱物塩を含む。
一般に、液体培地中では、同化され得る炭素源は、１種または複数の糖の単独または混合物からなる。好ましくは、炭素源は、グルコース、セロビオース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、マンノース、ショ糖、リボース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サリシン、イヌリン、クエン酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩およびこれらの組み合わせから選択される。
通常、液体培地中の糖の濃度は、得られるべきバイオマスの量に応じて、および特定の増殖ステップに応じて、２０〜８０ｇ／Ｌである。
通常、液体培地中では、窒素源３〜２５ｇ／Ｌである。窒素源は好ましくは、尿素が使用される。
好ましい実施形態では、コバルトイオンは、液体培地中で活性ニトリルヒドラターゼ酵素の合成のための誘導物質として０．０１ｇ／Ｌ〜０．０８ｇ／Ｌの濃度で使用される。
液体培地の配合では、さらに、微生物の培養に使用される一般的な栄養培地中に存在するものから選択される種々の塩を採用してもよい。
このような塩には、燐酸塩、硫酸塩、塩化物、カリウム、アンモニウム、コバルト、カルシウムおよびマグネシウムがあるが、これらに限定されない。
好ましくは、液体栄養培地は、炭素源、窒素源、鉱物塩および酵母エキスを含む。
好ましい実施形態では、菌株の第１の増殖ステップは、好ましくは、牛エキス、ペプトン、ＮａＣｌ、酵母エキスおよび寒天から、好ましくはゲル化を可能とするために１．５％で、作製された培地で満たしたペトリ皿上の固形栄養培地中で行われる。培地は通常、１２１℃で１５〜２０分間オートクレーブ中で滅菌される。
固形栄養素培地は、好ましくは、全体表面上に、滅菌ループを用いて、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２株を接種される。
菌株増殖は、２０〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃の温度で２〜５日間、好ましくは３〜４日間、７．４〜６．５の増殖ｐＨ下で行われる。
肉眼的には、円または凸形状を有し、典型的なピンクがかっているオレンジ色の、目に見えるコロニーの出現により増殖進行を確認することができる。
次のステップは、好ましくは、適切に固化させて傾斜表面を持つことを特徴とする寒天斜面培地の試験管中での菌株の播種を含む。
これらの試験管は、ペトリ皿と同じ培地を含み、上述の滅菌プロセスに供される。
斜面培地の試験管中での播種は、ペトリ皿からコロニーを採取し、採取した細胞を、好ましくは、滅菌ループを用いて、傾斜表面上に播種することにより行われる。
斜面培地の試験管中での菌株の増殖は、インキュベーター中で、２０〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃の温度で、１〜４日間、好ましくは２〜３日間行われる。
コロニーの増殖の終わりに、斜面培地上で増殖したバイオマスが、好ましくはボルテックスを用いて、６．５〜７．５の中性ｐＨをもち、１０〜３５℃の滅菌生理食塩水中で、好ましくは７．０±０．２のｐＨ、および１５〜２５℃の温度で、再懸濁される。
このようにして調製された菌株懸濁液はその後、好ましくは、１０〜２０ｇ／Ｌの濃度の酵母エキスを添加した汎用液体培地か、または糖、尿素、燐酸塩、硫酸塩、塩化物、カリウム、アンモニウム、コバルト、カルシウム、マグネシウム、鉄および酵母エキスを含む合成培地かを含むガラスフラスコ中に接種される。
好ましくは、菌株懸濁液は、１０〜２０ｇ／Ｌの酵母エキス添加した汎用液体培地を含む、または次の組成（ｇ／Ｌ）の合成培地中でのフラスコの接種に使用される：
本発明の対象の菌株は、好気性で、液体培地中では、オービタルシェーカーによる２００〜３５０ｒｐｍ、好ましくは約３００ｒｐｍの撹拌下増殖する。培地の酸素添加を促進することにより、撹拌は、細菌増殖のより多くの収率を可能とし、結果的に、ニトリルヒドラターゼ酵素のより多くの製造を可能とする。
フラスコ中の細菌増殖は、２０〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃の温度、６．３〜８．３、好ましくは、≧６．５および≦７．４のｐＨ下、１０ｍｍの厚さでキュベット中で５４０ｎｍの波長で測定して、３０〜４０ ＯＤの細胞懸濁液の光学密度になるまで、行われる。
細胞が多数であり、定常期に入りつつあることを示す、好ましくは、３５〜３８ ＯＤの値で、フラスコ中の細菌増殖を停止する必要がある。
フラスコ中で菌株の増殖中に高ＯＤ値を得ることは、細胞がまだ活発な成長期にあることを可能とし、都合良く、発酵槽中での次のスケールアップステップに対し必要な時間の短縮が促進される。
得られた細菌懸濁液は、第１の発酵槽におけるその後の接種に使用される。
この発酵槽では、発酵ブロスの最終体積の１／５０の体積が接種されるのが好ましい。例えば、発酵槽が２０Ｌの使える作業体積を有する場合、４００ｍＬの細胞懸濁液が接種される。
好ましい実施形態では、２０Ｌの作業体積を有する発酵槽中での細菌増殖は、次記の特定の条件下で行われる：
−通気：発酵槽は、滅菌空気が、例えば、発酵槽の底に配置されたスパージャにより送り込まれ、最初の通気条件は、５Ｌ／分〜１０Ｌ／分の範囲である。
−圧力：発酵槽の内側は、培養ブロス中への酸素のより良好に吸収されるのに寄与するように、わずかに陽圧でなければならない。相対的内圧は、０．１〜０．３バール、好ましくは０．１５〜０．２５バールである。
−撹拌：最初は、反応器内部の撹拌はゆっくりであり、スターラーの大きさと形状および発酵槽の大きさに応じて変化して良い。一般に、小さい反応器中の最初の撹拌値は、１５０〜５００ｒｐｍである。最初の増殖条件では、撹拌のｒｐｍは、２００〜２５０ｒｐｍの範囲で、撹拌は、常に最適酸素濃度（≧５５％）を維持するような方式で変化する。
−温度：発酵時間を通して、２０〜３５℃、好ましくは２８〜３２℃で一定に維持される。
−ｐＨ：６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．４の範囲であり、それを最適値に維持するための補正は、ＮａＯＨまたはＨ３ＰＯ４を添加することにより実施される。
−ｐＯ２：ｐＯ２を評価するパラメーターは、発酵の成功にとって極めて重要であり、ｐＯ２は、５５％以上〜１００％までの値の範囲で変化してよい。本発明の菌株は好気性であるので、細菌濃度と、培養ブロス中の酸素需要との間には正比例の関係がある。
培養条件下で、好気性微生物増殖は、高レベルの発泡を生じ、この現象は細菌の増殖と濃度が増大するに伴い悪化する。実際に、発泡レベルが適切なレベルプローブおよび消泡剤で抑制されない場合には、発泡体は、増殖して発酵槽出口フィルターを閉塞させる、またはさらには発酵槽から漏れ出る可能性がある。
好ましくは、次の組成（ｇ／Ｌ）を有する培地が発酵槽で使用される。
好都合にも、高細菌濃度を得るために、栄養素（単一または複数）が一度に少量注入される、流加発酵プロセスを採用し得る。
発酵槽中で制御された細菌増殖は、１０ｍｍの厚さの細胞で既知の方法に従って５４０ｎｍの波長により測定して、９０〜２２０ ＯＤ、好ましくは１４０〜１８０ ＯＤの光学密度に達すると停止される。
上記増殖プロセスによる、本発明の対象の新規菌株は、分光光度法により測定して、好ましくは１５０μモルのアミド／分／ｍｇの乾燥重量細胞の比活性を有するニトリルヒドラターゼ酵素を生成できる。活性を測定するための反応は、最大体積５〜１０ｍＬのチューブ中で、行われる。チューブは、温度制御ウオーターバス中に置かれ、攪拌される。チューブは、既知の濃度の生体触媒の水性懸濁液で満たされ、後者は、既知の量の反応基質（アクリロニトリル）と接触され、所定の時間反応させられる。反応は、酸の使用により停止され、次に、生成されたアクリルアミドの濃度が、分光光度計、ガスクロマトグラフまたはＨＰＬＣなどの既知の方法で測定される。生成されたアクリルアミドの濃度が測定されると、活性が計算される。
スケールアップステップでは、増殖プロセスは、同じ増殖特性を維持し、唯一の差異は、より大きな発酵槽、４００／１０００Ｌおよび２００００／５００００Ｌが使用されるということだけである。
発酵の終わりに、得られたバイオマスは、好ましくは１０５℃で２０〜２５％の乾燥残留物が得られるまで、好ましくは遠心分離または加圧濾過により培地から分離される。必要に応じ、細菌バイオマスは、通気および撹拌をしないで、発酵槽中、１０〜１５℃でさらに２４時間保持できる。
細菌バイオマスは、冷凍庫中、−２０℃で貯蔵でき、または凍結乾燥して室温で、３０℃を超えない温度で貯蔵することもできる。
特に、発酵プロセス後、バイオマスの分離を実施するために、発酵ブロスを少なくとも１０〜３０℃、好ましくは１５〜２０℃の温度にして凝集ステップを開始する必要がある。
バイオマスは、コロイド懸濁液中にあり、すなわち、微生物が液体培地中に細かく分散した状態であり、この場合、液体培地は使い尽くされた栄養ブロスで、長期的には微生物の品質を劣化させる可能性がある。バイオマスの分離は、最初に、好ましくは１０％のカチオン溶液が添加され、続けて好ましくは０．１％のアニオン溶液が添加された後に起こる。添加されるカチオン溶液の量は、凝集させる質量に対し、２〜８％の量であり、アニオン溶液は１〜２．５％の範囲である。好ましくは、カチオン溶液は、４〜７％の範囲であり、アニオン溶液は、１〜２％の範囲である。好ましくは、懸濁液は撹拌下で維持される。
低分子量カチオン凝集剤は、凝固剤として作用し、数分で微小凝集剤が形成される。
その後、アニオン溶液が添加される。
新しく形成された微小凝集剤は、その後の高分子量アニオン凝集剤の凝集のための基材としての役割を果たす
。
アニオン溶液の添加後で、通常１０分後、凝集剤が完全に形成され、遠心分離または加圧濾過により分離できる。
通常、分離は、直径０．４５μｍ以下の孔を有するフィルターを使用して行われる。適切と見なされる場合は、濾過したバイオマスを、初期の懸濁液質量に対し、１／５の脱塩水中に再懸濁させて、その後、濾過が繰り返される。このようにして、バイオマスがブロス培養残留物からさらに除かれる。
これをペーストとして貯蔵する場合は通常、保存剤、好ましくは硫酸塩またはアンモニウム塩と混合される。
工業的規模分離プロセスでは、二重シートパネルまたは自動排液遠心分離機が使用できる。
上記方法により得られたバイオマスは、脂肪族及び芳香族ニトリルの水和を可能とし、それにより、対応するアミド、特にアクリルアミドが得られる、高ニトリルヒドラターゼ活性を示すロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２株の細菌細胞からなる。
アクリルアミド生成反応のために、記載の培養法により得られた、１ｇ／３Ｌの乾燥したロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２の細菌細胞のバイオマスが、１０〜１７℃、好ましくは１３〜１５℃の初期温度で維持された反応器中で、約１リットルの脱塩水中で再懸濁される。溶液のいくつかの添加物は最初の水溶液に加えてもよい。
反応器中では、アクリルアミド製造プロセスは、１０〜２７℃、好ましくは１４〜２３℃の温度範囲、および５．０〜８．５、好ましくは６．８〜７．２のｐＨ下で行われる。
アクリルアミドの合成は、アクリロニトリルが、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２のバイオマスを含む水溶液に添加されたときに開始される。
アクリロニトリルの添加は、アクリルアミドへの変換反応中、溶液中のアクリルアミドの遊離濃度が反応溶液の総重量に対して、０．８％、好ましくは０．６％、好ましくは０．５％、さらに好ましくは０．４または０．３％を超えないように、連続的にまたは段階的に実施できる。
反応中、懸濁液は、５０〜２００ｒｐｍ、好ましくは１００〜１５０ｒｐｍの一定速度での撹拌下で保持される。この撹拌の範囲は、反応器の大きさおよび用いられる撹拌の種類に応じて変化してよい。
反応溶液中のアクリロニトリルおよびアクリルアミドの濃度は、反応に必要な全量のアクリロニトリルが添加されるまで、または目的の濃度のアクリルアミドが得られるまで、分光光度測定、屈折率測定およびガスクロマトグラフ測定により常時モニターされる。
プロセスは、ニトリルヒドラターゼ酵素により実施される生物変換作用がほとんどゼロになると、どんな場合でも停止される。これは、アクリルアミドの高濃度が達成された場合に起こる。
水和反応は、アクリロニトリルの添加の中止により、および／または所定のアクリルアミド濃度に到達時に、停止される。
水溶液および懸濁バイオマス中のアクリルアミドから作られた最終生成物は、３０〜５７．５％、好ましくは４５〜５７％、４８〜５６％、５０〜５４％の濃度のアクリルアミドを含む。アクリルアミドの濃度は、適切な測定器、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣ、屈折計および分光光度計により測定される。
特に、水溶液中の最大５７．５％（重量／重量）の濃度のアクリルアミド製造収率が達成できる。
ガスクロマトグラフィーを用いて、反応の最後に、アクリロニトリルの残留物混入がないことが確認され、アクリルアミドおよびバイオマスの懸濁液は適切な精製処理、例えば、濾過または遠心分離に供され、水溶液中のアクリルアミドから生体触媒が分離さる。
アクリルアミド分離プロセスは、好ましくは、自動遠心分離により行われる。
得られたアクリルアミドは通常、特定の安全性規則を遵守して、２０℃の温度で連続循環空気系を備えたステンレス鋼のタンクまたは容器中に貯蔵される。
長期間の貯蔵中、アクリルアミドは、重合現象を起こす可能性があり、このために、１５ＦＴＵ（ホルマジン濁度単位）以下でなければならないポリマーの濃度が常時モニターされる。
重合を抑制するために、アクリルアミド含有溶液は、貯蔵に移される前に、空気を吹き込むことができる。
最終溶液は透明で、懸濁液中に生体触媒の残留物を含まない。
当業者なら、本発明で記載の方法は、より大きな容量の工業的発酵槽および反応器を用いて、大規模生産に適応し得ることを理解するであろう。
本発明の変形実施形態では、アクリルアミドの合成は、アクリロニトリルの、、活性炭、珪酸塩、ゼオライト、架橋アクリルアミド、ポリマー基材などのそれ自体既知の固体基材上に固定されたＰａｌｌａｄｉｏ ２２株のバイオマスへの添加により行われる。
さらに、既知の技術に従って、前述の基材などの固体基材上に、本発明の菌株由来のニトリルヒドラターゼ酵素を固定し、上記基剤上に固定された酵素に対するアクリロニトリルの添加によりアクリルアミドを合成することも可能である。
好都合にも、このような方法は、アクリルアミドを「連続的に」製造し、それにより、反応の収率を高め、完成したアクリルアミドからの生体触媒の除去を容易にし、従って、プロセスそれ自体を実施するのに必要な時間を短くすることを可能とする。
また、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２の名称の本発明の菌株の生殖または増殖により得られるロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株は、本発明により保護されることが意図されている。これらの株は、上述のように、アミドの製造、特にアクリルアミドの製造に用いられる。さらに、上記菌株の増殖は、本発明の株のために記載された技術的特徴による培養方法を用いて得られる。これらの菌株は、培養における優れた増殖特性を有し、アミドに対応する脂肪族および芳香族ニトリルの加水分解を触媒できる。
本発明の異なる実施形態の変種では、このような菌株が、高い遺伝的変異性に起因して培養増殖中に自然に発生する自然発生的遺伝子変異を有し、これが細菌を特徴付け、細菌が異なる増殖環境に適応可能とするということも、除外されない。
これらの遺伝子変異は、Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２株の増殖／生殖由来のこのような変異を有する菌株が、上述の使用または方法で使用されるのに好適し、本発明の株とおなじ技術的特徴を有する限り、培養中の外部の化学的、物理的または生物学的作用物質、例えば、抗生物質、紫外線またはウイルスに起因する誘発突然変異であることもあり得る。
本発明およびその利点は、以下の例示的実施例から明らかになるであろう。
次の実施例は、例示的および非限定的目的のみのために、本発明を実施するのに必要な種々のステップを説明する。
ペトリ皿の調製とその上の播種
ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２株を、次の組成を有する汎用増殖培地で調製したペトリ皿上で増殖させる：１．０ｇ／Ｌ牛エキス、２．０ｇ／Ｌ酵母エキス、５．０ｇ／Ｌペプトン、５．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、これに寒天を加え、最終濃度を１．５％とする。溶液のｐＨは、必要に応じ、ＮａＯＨまたはＨ３ＰＯ４で７．０±０．１の値に補正する。
調製すると、完全な寒天の可溶化のためにブロスを沸騰させる。その後、これを１２１℃の温度で１５分間、滅菌プロセスに供する。滅菌後、滅菌層流フード下で、ブロスを無菌ペトリ皿中に注ぎ込み、ゲル化する。
滅菌ループを用いてペトリ皿に菌株を播種し、好気生活下でインキュベーター中に３０℃の温度で３日間置く。
インキュベーション後、ピンクがかっているオレンジ着色された円および凸状形状のコロニーが培地の表面上に形成される。
斜面培地の調製とその播種
このようして得たロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２のコロニーを、ペトリ皿で使用したのと同じ培地で満たした斜面培地で増殖させる。
斜面培地の試験管を１２１℃の温度で１５分間、滅菌ステップに供する。
滅菌プロセス後、培地の固化の結果として傾斜表面が得られるように、チューブをインキュベーター中で傾斜させて配置する。
次に、滅菌ループを用いて斜面培地に、前の増殖ステップ由来のコロニーを播種し、インキュベーター中に３０℃の温度で２日間置く。
フラスコ中の液体培地への株の播種
斜面培地での増殖により得た細菌細胞のバイオマスを、滅菌生理食塩水中にｐＨ７．２、３０℃で再懸濁する。
このバイオマス懸濁液はその後、１５ｇ／Ｌの濃度の酵母エキスを添加された汎用液体培地を含む、または次の組成（ｇ／Ｌ）を有する合成培地中でのフラスコの接種に使用される。
バイオマスは、フラスコ中に、無菌条件下で接種され、増殖は３０℃の温度および７．２のｐＨで行われる。液相中の菌株増殖は、フラスコを３００ｒｐｍで撹拌するオービタルシェーカー中で行われる。
フラスコ中のバイオマス増殖は、１０ｍｍの厚さの細胞で５４０ｎｍの波長で測定して、３５〜３８ ＯＤの光学密度で停止される。
得られた細菌懸濁液は、その後の発酵槽中のスケールアップステップでの接種に使用される。
発酵槽中の液体培地での菌株の増殖とその後のスケールアップ
次の組成（ｇ／Ｌ）を有する培地が２０Ｌの発酵槽中で調製される。
培地は、１２１℃で１５分間滅菌され、その後、細菌培養の接種の前に、３０℃まで冷却される。
接種材料の体積は、発酵槽に含まれる培地の最終体積の１／５０に等しい。
２０Ｌ発酵槽における増殖条件は、１７０〜１９０ ＯＤの光学密度が達成されるまで、５〜１０Ｌ／分の通気、１５０〜４００ｒｐｍの撹拌で、これはバイオマス濃度に応じて可変である、ｐＯ２≧５５％、３０℃の温度および６．５〜７．４のｐＨ（増殖中変動する）を含む。
細菌増殖をいつ停止するかを決定する目的で、光学密度およびニトリルヒドラターゼ活性を決定するために評価される。これらの値は、それぞれ、９０〜２２０ ＯＤおよび１５０μモルアミド／分／ｍｇの乾燥重量細胞の値であるべきである。
その後のスケールアップステップでは、増殖プロセスは、同じ特性を維持するが、４００／１０００Ｌおよび２００００／５００００Ｌの発酵槽が順に使用される。
このように得られた最終バイオマスは、遠心分離または加圧濾過により培地から分離され、冷凍庫中に−２０℃で貯蔵されるか、または凍結乾燥して３０℃以下の室温で貯蔵される。
必要に応じ、分離プロセスの前に、細菌培養が培養条件下、１０〜１５℃で、空気と撹拌のない状態で、さらに２４時間保持できる。
バイオマスの凝集と分離
ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２株の発酵のスケールアップを実施例４に記載のように実施した。
最後の発酵の終わりに、凝集プロセスの開始前に、細菌懸濁液を少なくとも１５℃の温度にする。
コロイド懸濁液中にあるバイオマスの分離を実施するために、凝集溶液が培養ブロスに加えられる。
特に、５００ｇの量を考慮して、２５ｍＬの１０％のカチオン溶液が細菌懸濁液に５０ｒｐｍの撹拌下で加えられ、数分後、微細凝集体の形成をもたらす。
その後、８ｍＬの０．１％のアニオン溶液をゆっくり加え、フレークの完全な形成まで、撹拌下に懸濁液を保持する。
反応の最後で、使い尽くされたブロスからのバイオマスの最終分離ステップは、直径≦０．４５μｍの孔を有するフィルターの使用により、実施される。
得られたバイオマスはその後、１００ｇのＨ２Ｏ中に再懸濁され、これはその後再濾過される。この操作は、培養ブロスの残留物を劇的に減らす。
得られたバイオマスは、ペーストとして、−２０℃に貯蔵されるか、または凍結乾燥され、３０℃以下の室温で貯蔵される。
アクリルアミド生成反応
アクリルアミド製造反応では、１ｇ（乾燥重量）のロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２は、合計体積３Ｌの冷却した反応器中、水溶液中に再懸濁される。
アクリルアミド製造プロセスは、１４〜２３℃の温度、７．０±０．２のｐＨ、および溶液中の遊離アクリロニトリルの濃度が０．５％を超えない条件下で、一定速度（１５０ｒｐｍ）で撹拌しながら行われる。
１２０１．２６ｇの水および生体触媒に対し、７９８．７４ｇのアクリロニトリルが、連続的にまたは段階的に、アクリロニトリルの１０７０ｇのアクリルアミド（１００％）への変換が完了するまで、添加される。
ニトリルヒドラターゼ酵素の速度が劇的に低下する場合、反応が停止される。通常、この現象は、アクリルアミドの濃度が５３％を超えると起こり得る。
生成したアクリルアミドは、自動遠心分離によりバイオマスから分離され、特殊なタンクまたは容器中に貯蔵される。
生成されたアクリルアミドの溶液の最終濃度は５３．５％であり、アクリロニトリル残留物を含まない。
アクリルアミド生成反応
アクリルアミド生成反応では、１ｇ（乾燥重量）のバイオマス、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２は、合計体積３Ｌの冷却した反応器中、水溶液中に再懸濁される。
アクリルアミド製造プロセスは、１４〜２３℃の温度、７．０±０．２のｐＨ、および溶液中の遊離アクリロニトリルの濃度が０．５〜０．８％以下である条件下で、一定速度（１５０〜２００ｒｐｍ）で撹拌しながら行われる。
１１４１．５５ｇの水および生体触媒に対し、８５８．４５ｇのアクリロニトリルが、連続的にまたは段階的に、アクリロニトリルの１１５０ｇのアクリルアミド（１００％）への変換が完了するまで、添加される。
ニトリルヒドラターゼ酵素の速度が劇的に低下する場合、反応が停止される。通常、この現象は、アクリルアミドの濃度が５３％を超えると起こり得る。この濃度に対する反応バッチは、約４〜８時間で完了する。
生成したアクリルアミドは、自動遠心分離によりバイオマスから分離され、特殊なタンクまたは容器中に貯蔵される。
生成されたアクリルアミドの溶液の最終濃度は５７．５％であり、アクリロニトリル残留物を含まない。

Claims (20)

  1. ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株でＰａｌｌａｄｉｏ ２２と命名され、ＢＣＣＭ−ＬＭＧ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録番号ＬＭＧ Ｐ−２９５２０で登録された菌株。
  2. ヒドラターゼニトリル酵素を生成する、請求項１に記載の菌株。
  3. 乾燥状態、凍結乾燥状態またはペースト状のバイオマスの形態で、１８〜３０％、好ましくは、２０〜２７％の乾燥残留物を有する、請求項１または２に記載の菌株。
  4. アミドの製造のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株の使用。
  5. 前記アミドがアクリルアミドであることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
  6. 前記水和プロセスが、前記反応溶液の総重量の０．８％より少ないアクリロニトリルの濃度で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株のバイオマスを用いたアクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造方法。
  7. 前記水和プロセス中に、溶液中の遊離アクリロニトリルの濃度が前記反応溶液の総重量の０．８％を超えないように、アクリロニトリルが前記菌株のバイオマスを含む水溶液に添加されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. ５０％〜５７．５％（重量／重量）のアクリルアミド製造収率を有する、請求項６または７に記載の方法。
  9. ５０％〜５４％のアクリルアミド製造収率を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記アクリルアミドの製造が、１４〜２３℃の範囲の温度および５．０〜８．５のｐＨで行われる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記バイオマスが固体基材上に固定され、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株のバイオマスを用いたアクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造方法。
  12. 前記ニトリルヒドラターゼ酵素が固体基材上に固定され、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株のバイオマスから抽出されたニトリルヒドラターゼ酵素を用いたアクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの製造方法。
  13. 前記菌株の増殖が、ナトリウムおよびカリウムを含むリン酸緩衝液、炭素源、窒素源、マグネシウム塩、亜鉛塩、カルシウム塩、鉄塩（ＩＩ）、コバルト塩および、場合により、酵母エキスを含む栄養素培地への前記株の接種を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株の培養方法。
  14. 前記増殖が、１０〜３５℃、好ましくは２０〜３５℃の温度で２〜４日間、８．３〜６．３、好ましくは７．４〜６．５の増殖ｐＨ下で行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 固形培地中で前記株を増殖させるステップ、液体培地中で前記株を増殖させるステップ、発酵ステップ、前記菌株のバイオマスの凝集および分離のステップをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記細胞が１０ｍｍの厚さの細胞で５４０ｎｍの波長の分光光度計で測定して、９０〜２２０ ＯＤの光学密度を有するまで前記菌株が培養される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記得られた菌株が、少なくとも１５０μモルのアミド／分／ｍｇの乾燥重量細胞のニトリルヒドラターゼ活性を有する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 請求項１に記載のロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）のＰａｌｌａｄｉｏ ２２の名称の前記菌株の生殖または増殖により得られるロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株。
  19. 請求項６〜１２のいずれか１項に記載のアクリルアミドの製造のための、請求項１８に記載の菌株の使用。
  20. 請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法による、請求項１８に記載の菌株の培養方法。
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