JP2016503651A - ニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcusaetherivorans)VKMAc−2610D菌株、その培養方法およびアクリルアミドを生成するための方法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼを産生するロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcusaetherivorans)VKMAc−2610D菌株、その培養方法およびアクリルアミドを生成するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含むリン酸緩衝水溶液;
炭素源;
窒素源;
必要に応じて、酵素誘導物質;
必要に応じて、コバルト塩;
マグネシウム塩;
亜鉛塩;
カルシウム塩;および
Fe(II)塩
を含む栄養培地を使用して、培養される。
ナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含むリン酸緩衝水溶液;
炭素源;
窒素源;
酵素誘導物質;
コバルト塩;
マグネシウム塩;
亜鉛塩;
カルシウム塩;および
Fe(II)塩
を含む。
ナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含むリン酸緩衝水溶液;
炭素源;
窒素源;
必要に応じて、酵素誘導物質;
必要に応じて、コバルト塩;
マグネシウム塩;
亜鉛塩;
カルシウム塩;および
Fe(II)塩
からなる。
ナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含むリン酸緩衝水溶液;
炭素源;
窒素源;
酵素誘導物質;
コバルト塩;
マグネシウム塩;
亜鉛塩;
カルシウム塩;および
Fe(II)塩
からなる。
Na2HPO4・12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
グルコース 10.0〜20.0
カルバミド 2.0〜6.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.2
CaCl2・2H2O 0.2
CoCl2・6H2O 0.01〜0.02
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.01〜0.025
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の栄養培地を含む第1の容器の接種のために使用し、そのプロセスは、28〜30℃の温度において24〜48時間、140〜160rpmの速度で回転撹拌しながら行われることにより、540nmの波長および5mmの光学層の厚さにおいて2〜16単位の範囲の懸濁液の光学濃度が達成される。次いで、得られた懸濁液は、第1の容器の容積よりも10〜100倍大きい容積を有する第2の容器の接種のために使用され、第2の容器は、g/lである以下の組成:
Na2HPO4・12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
グルコース 20.0〜60.0
カルバミド 10.0〜24.0
MgSO4・7H2O 0.8〜1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.4
カルシウム塩 0.2〜0.6
コバルト塩 0.04〜0.085
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.025〜0.05
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の新しい栄養培地を含み、それにより、0.1〜0.3という第2の容器内の光学濃度が達成され;そのプロセスは、36〜40という懸濁液の光学濃度および7.5〜7.8のpHが達成されるまで、26〜31℃の温度、1分あたり0.5〜1.0空気体積/培地体積の通気で、48〜120時間続けられ;次いで、生成されたバイオマスが、分離される。
CaHPO4・2H2O
Ca(H2PO4)2・2H2O
Ca3(PO4)2
CaCl2・2H2O
CaCO3
CaSO4
Ca(C3H5O3)2・3H2O
Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2・H2O;
のうちの1つおよびコバルト塩として以下の塩:CoCl2・6H2O、
CoSO4・7H2O
のうちの1つを含み得る。
アクリロニトリルが、その水溶液に加えられることにより、反応溶液が形成される。
a)ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株のバイオマスを水溶液に懸濁することにより、懸濁液を得る工程;
b)アクリロニトリルを、工程a)から得ることができる懸濁液に混合することにより、反応溶液を形成する工程;および
c)その反応溶液中のアクリロニトリルの作用濃度が0.5%以下で維持されるように、水和を行う工程
を含む。
Na2HPO4・12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
グルコース 10.0〜20.0
カルバミド 2.0〜6.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.2
CaCl2・2H2O 0.2
CoCl2・6H2O 0.01〜0.02
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.01〜0.025
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の栄養培地を含む第1の容器の接種のために使用され得る。
Na2HPO4・12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
グルコース 20.0〜60.0
カルバミド 10.0〜24.0
MgSO4・7H2O 0.8〜1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.4
カルシウム塩 0.2〜0.6
コバルト塩 0.04〜0.085
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.025〜0.05
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の新しい栄養培地を含む大きなフラスコまたは発酵槽の接種のために使用され得る。
その株は、アクリルアミドおよびポリアクリルアミドの製造の廃液から単離される。
アクリルアミド 6.0g/l;
アクリロニトリル 3.3g/l;
Cu2+ 1.25mg/l
Zn2+ 1.93mg/l
Fe3+ 0.43mg/l
Sorbital C−20 微量
Na2HPO4・12H2O 0.9
KH2PO4 0.5
グルコース 20.0
カルバミド 12.0
CoCl2・6H2O 0.02
MgSO4・7H2O 1.0
酵母エキス 1.0
pH7.0〜7.4
を有する培地で1/8が満たされた40mlの容積を有する細菌学的チューブ内で増殖させた。
上記株の細胞を、肉ペプトン寒天斜面上で28℃において36時間増殖させた。得られたバイオマスを、滅菌された生理学的溶液,pH7.0〜7.4で洗浄し、前培養のために、以下の組成(g/l):
Na2HPO4・12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
グルコース 12.0
カルバミド 4.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.1
CaCl2・2H2O 0.2
CoCl2・6H2O 0.02
FeSO4・7H2O 0.025
アスコルビン酸 0.05
蒸留水 1リットルまで
pH7.0〜7.4
の液体栄養培地に播種した。
Na2HPO4・12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
グルコース 40.0
カルバミド 24.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.3
CaHPO4・2H2O 0.24
CoCl2・6H2O 0.06
FeSO4・7H2O 0.05
アスコルビン酸 0.10
蒸留水 1リットルまで
pH7.0〜7.4
を有する培養用の培地に無菌的に播種した。
培養液中の細胞懸濁液である接種材料を、28時間にわたって調製した。この目的のために、以下の組成(g/l):
Na2HPO4・12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
グルコース 12.0
カルバミド 4.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.1
CaCl2・2H2O 0.2
CoCl2・6H2O 0.02
FeSO4・7H2O 0.025
EDTA 0.05
蒸留水 1リットルまで
pH7.0〜7.4
を有する培地で1/6が満たされた300mlの容積を有するエルレンマイヤーフラスコ内において、28〜30℃の温度で回転撹拌(160rpm)しながら細胞を増殖させた。
Na2HPOP4・12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
グルコース 40.0
カルバミド 22.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.25
CaHPO4・2H2O 0.24
CoCl2・6H2O 0.05
FeSO4・7H2O 0.05
EDTA 0.10
蒸留水 1リットルまで
pH7.0〜7.4
270U/mgというニトリルヒドラターゼ活性を有する、66.2gのロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株の、水道水における細胞懸濁液を、磁気撹拌機および温度計が提供された150mlの恒温反応器内に置いた;したがって、その反応器は、30mg(乾燥重量で)の生体触媒細胞を含んだ。それらの細胞は、実施例2に記載されたようにもたらされた。その反応溶液のpHは、7.6だった。溶液中のアクリロニトリル濃度が、0.3%以下であるように、24.2gのアクリロニトリルを、合成の全期間にわたって、連続的に撹拌しながら17〜22℃の温度においてその反応器に加えた。溶液中のアクリルアミドおよびアクリロニトリルを、1時間に1回の周期性で、ガスクロマトグラフィー法によって解析した。アクリロニトリルの加水分解速度が低下したので、合成の7.0時間後に、その反応を停止した。遠心分離によって、その反応溶液から細胞を分離した。その溶液中のアクリルアミドの濃度は、49%であり、残留アクリロニトリルは、無かった。
254U/mgというニトリルヒドラターゼ酵素の活性を有する、1.4lのロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D株の、脱塩水における細胞懸濁液を、磁気撹拌機および熱除去用のジャケットが提供された、20〜22℃の温度範囲内で温度調節される3リットルの反応器に加えた;したがって、その反応器は、1g(乾燥重量で)の生体触媒細胞を含んだ。それらの細胞は、実施例2に記載されたように得られた。その反応溶液のpHは、7.4だった。最初と最新の両方のアクリロニトリル濃度が0.5%以下であるように、変換が行われるように、アクリロニトリルをその反応溶液に投入した。反応の5時間後、47%の濃度を有するアクリルアミド溶液が得られた。次いで、アクリロニトリルの加水分解速度が急激に低下したので、その反応を停止した。
280U/mgというニトリルヒドラターゼ酵素の活性を有する、1.4リットルのロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D株の、脱塩水における細胞懸濁液を、磁気撹拌機および熱除去用のジャケットが提供された、14〜23℃の温度範囲内で温度調節される3リットルの反応器に加えた;したがって、その反応器は、1g(乾燥重量で)の生体触媒細胞を含んだ。それらの細胞は、実施例3に記載されたように得られた。その反応溶液のpHは、7.8だった。最初と最新の両方のアクリロニトリル濃度が0.1%以下であるように、変換が行われるように、アクリロニトリルをその反応溶液に投入した。その溶液中のアクリルアミドおよびアクリロニトリルを、1時間に1回の周期性で、ガスクロマトグラフィー法によって解析した。アクリロニトリルの加水分解速度が低下したので、7.0時間後に、その反応を停止した。その溶液(すなわち最終生成物)中のアクリルアミドの濃度は、49%だった。溶液中の残留アクリロニトリルは、無かった。
24リットルの容積を有する発酵槽を使用したこと以外は先の実施例に記載されたように、上記菌株のバイオマスを増殖させた。そのバイオマスを使用し、1リットルの容積を有する反応器を用いて、先の実施例に記載されたようにアクリルアミドを調製した。得られた最終生成物中のアクリルアミドの濃度は、49,5%だった。
Claims (24)
- ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株。
- ニトリルヒドラターゼの産生株である、請求項1記載の菌株。
- ロドコッカス(Rhodococcus)属に属しており、ニトリルヒドラターゼ活性を有する株のバイオマスを使用するアクリロニトリルの水和によってアクリルアミドを生成するための方法であって、該水和は、ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株のバイオマスを使用して、0.5%以下であるアクリロニトリルの作用濃度で行われる、方法。
- アクリロニトリルが、前記ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株のバイオマスの水性懸濁液に混合されることにより、反応溶液が形成され;該反応溶液中のアクリロニトリルの作用濃度が0.5%以下で維持されるように水和が行われる、請求項3記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- 前記水和の後に、最終的なアクリルアミド生成物の単離が行われる、請求項3または4に記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- 前記ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株のバイオマスが、最終生成物1トンあたりの菌株の乾燥重量で、約100〜1000gまたは200〜1000gまたは200〜800gまたは300〜600gまたは約400〜500gまたは1000g未満または500g未満または400g未満である、請求項3〜5のいずれか一項に記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- 前記最終生成物が、少なくとも40%;または少なくとも41%;または少なくとも42%;または少なくとも43%;または少なくとも44%;または40〜55%;または41〜55%;42〜55%;または43〜55%;または44〜55%;または少なくとも45%;または少なくとも46%;または少なくとも47%;または45〜55%;または45〜54%;または45〜53%;または45〜52%;または45〜51%;または45〜50%;または45〜49%;または46〜55%;または46〜54%;または46〜53%;または46〜52%;または46〜51%;または46〜50%;または46〜49%;または47〜55%;または47〜54%;または47〜53%;または47〜52%;または47〜51%;または47〜50%;または47〜49%の濃度でアクリルアミドを含む、請求項6記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- アクリロニトリルの前記水和が、10〜23℃の温度で行われる、請求項3〜7のいずれか一項に記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- アクリロニトリルの前記水和が、6.8〜8.4のpHで行われる、請求項3〜8のいずれか一項に記載のアクリルアミドを生成するための方法。
- ロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法であって、該株の細胞は、
ナトリウムイオンおよびカリウムイオンを含むリン酸緩衝水溶液;
炭素源;
窒素源;
必要に応じて、酵素誘導物質;
必要に応じて、コバルト塩;
マグネシウム塩;
亜鉛塩;
カルシウム塩;および
Fe(II)塩
を含む栄養培地を使用して培養される、方法。 - 前記菌株の細胞の増殖が定常期に入るまで、または所定の細胞収量が達成されるまで、該菌株の細胞が培養される、請求項10記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記栄養培地のpHが、6.3〜8.3または7.0〜7.4である、請求項10または11に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記方法が、26〜31℃の温度または28〜30℃の温度で行われる、請求項10〜12のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 36〜40という懸濁液の光学濃度が達成されるまで、前記菌株の細胞が培養される、請求項10〜13のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記リン酸緩衝水溶液が、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4およびそれらの任意の混合物からなる群より選択されるリン酸塩を含む、請求項10〜14のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記炭素源が、グルコース、セロビオース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、マンノース、スクロース、トレハロース、リボース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、サリシン、イヌリン、シトレート、ピルベート、スクシネート、フマレートおよびそれらの任意の混合物からなる群より選択される、請求項10〜15のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記窒素源および前記誘導物質が、カルバミドである、請求項10〜16のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記コバルト塩が、CoCl2、CoSO4またはそれらの混合物である、請求項10〜17のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記マグネシウム塩が、MgSO4であり;かつ/または前記亜鉛塩が、ZnSO4であり;かつ/または前記カルシウム塩が、CaCl2、CaHPO4・2H2O、Ca(H2PO4)2・2H2O、Ca3(PO4)2、CaCl2・2H2O、CaCO3、CaSO4、Ca(C3H5O3)2・3H2O、Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2・H2O、それらの任意の混合物からなる群より選択され;かつ/または前記Fe(II)塩が、キレート錯体の形態のFeSO4・7H2Oである、請求項10〜18のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記株の細胞を、固形栄養培地上に播種し、24〜48時間培養し、次いで、バイオマスを洗浄し、得られた懸濁液を、該栄養培地を含む第1の容器の接種のために使用し、前記方法が、24〜48時間、撹拌しながら行われることにより、540nmの波長および5mmの光学層の厚さにおいて2〜16単位の範囲の該懸濁液の光学濃度が達成され;次いで、該得られた懸濁液を、該第1の容器の容積よりも10〜100倍大きい容積を有する第2の容器の接種のために使用し、該第2の容器は、新しい栄養培地を含み;それにより、0.1〜0.3という該第2の容器内の光学濃度が達成され、該方法は、36〜40という該懸濁液の光学濃度および7.5〜7.8のpHが達成されるまで、通気しながら48〜120時間続けられ;次いで、生成されたバイオマスが、分離される、請求項10〜19のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。
- 前記株の細胞を、肉ペプトン寒天斜面上に播種し、24〜48時間培養し、次いで、バイオマスを、7.0〜7.4のpHを有する滅菌された生理学的溶液で洗浄し、
得られた懸濁液を、g/lである以下の組成:
Na2HPO4・12H2O 6.06
KH2PO4 1.3
グルコース 10.0〜20.0
カルバミド 2.0〜6.0
MgSO4・7H2O 1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.2
CaCl2・H2O 0.2
CoCl2・6H2O 0.01〜0.02
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.01〜0.025
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の栄養培地を含む第1の容器の接種のために使用し、前記方法が、28〜30℃の温度において24〜48時間、140〜160rpmの速度で回転撹拌しながら行われることにより、540nmの波長および5mmの光学層の厚さにおいて2〜16単位の範囲の該懸濁液の光学濃度が達成され、次いで、該得られた懸濁液を、該第1の容器の容積よりも10〜100倍大きい容積を有する第2の容器の接種のために使用し、該第2の容器は、g/lである以下の組成:
Na2HPO4・12H2O 6.20
KH2PO4 1.65
グルコース 20.0〜60.0
カルバミド 10.0〜24.0
MgSO4・7H2O 0.8〜1.0
ZnSO4・7H2O 0.08〜0.4
カルシウム塩 0.2〜0.6
コバルト塩 0.04〜0.085
キレート錯体の形態のFeSO4・7H2O 0.025〜0.05
蒸留水 1lまで
pH7.0〜7.4
の新しい栄養培地を含み、それにより、0.1〜0.3という第2の容器内の光学濃度が達成され;該方法は、26〜31℃の温度、1分あたり0.5〜1.0空気体積/培地体積の通気で、36〜40という該懸濁液の光学濃度および7.5〜7.8のpHが達成されるまで、48〜120時間続けられ;次いで、生成されたバイオマスが分離される、請求項10〜20のいずれか一項に記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。 - 前記第2の容器内の栄養培地が、カルシウム塩として以下の塩:CaHPO4・2H2O
Ca(H2PO4)2・2H2O
Ca3(PO4)2
CaCl2・2H2O
CaCO3
CaSO4
Ca(C3H5O3)2・3H2O
Ca(HOCH2(CHOH)4COO)2・H2O
のうちの1つ;
およびコバルト塩として以下の塩:
CoCl2・6H2O、
CoSO4・7H2O
のうちの1つを含む、請求項21記載のロドコッカス・アエセリボランス(Rhodococcus aetherivorans)VKM Ac−2610D菌株を培養する方法。 - 請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、最終生成物。
- 請求項23記載の最終生成物から得ることができる、アクリルアミド。
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