JP2021502821A - アミド調製のための微生物プロセス - Google Patents

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Abstract

対応するニトリルからの、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）種の菌株から生成されるニトリルヒドラターゼ酵素を用いた、酵素的加水分解によるアミド調製のための微生物プロセスが記載される。

Description

本発明は、アミド調製のためのプロセス、および、より具体的には、対応するニトリルからの、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）種の菌株から生成されるニトリルヒドラターゼ酵素を用いた、酵素的加水分解によるアミド調製のためのプロセスに関する。
ニトリルは、アミドおよびカルボン酸の合成にとって重要な前駆体であり、製薬の有効成分として、またはそれら成分の合成のための高度な中間体として、広範にわたって使用される。
カルボン酸からのニトリルの化学的加水分解は、中間体のアミドを通じて進行するが、例えば高温（１００℃）および長い反応時間での強塩基または強酸など、厳しい条件を必要とする。最初のころはアミドが形成されるものの、アミドはまた酸処理または塩基性処理によって加水分解されると、カルボン酸が素早く形成される。使用される条件という観点では、化学的加水分解は、製薬の有効成分またはその高度な中間体の調製にとって、これらの化合物が多くの場合１個以上の不斉中心および／またはその他の官能基を有するため、好適ではないことが多い。
化学的加水分解はまた、加水分解工程を停止して酸への変化を防ぐ必要があるため、アミドを得ることに好適であるとは言えない。
化学的加水分解に代わるものとして、酵素的加水分解を使用することができる。
ニトリルヒドラターゼ酵素（ＮＨａｓｅとも称される）を生成する菌株を使用することによって、ニトリルをアミドに変化させる、いくつかの酵素プロセスが文献にて知られている。
しかし、これらのプロセスは、一般的に特定部類のニトリルにのみ適用され、互いに大きく異なり得る化学的特性を有する基質には適用することができない。
したがって、多種多様なニトリルに適用可能で、好収率を有する、ニトリルをアミドに変化させるための酵素法のニーズが依然としてある。
本発明者らは、こうして、「Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２」と命名され、ブダペスト条約の要件に従ってＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＢＣＣＭ（ベルギーの微生物保存機関）−ＬＭＧのコレクション（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に２０１６年１２月４日に寄託された、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２９５２０の、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株により生成されるニトリルヒドラターゼ酵素が、良好な化学選択性、位置選択性および立体選択性を有し、多種多様なニトリルを、対応するアミドに変化させることができると見出した。
「Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２」と命名されたロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株は、現在の出願人から出願され、２０１７年１１月２３日に公開された国際公開公報ＷＯ２０１７１９９２００号明細書において、アクリルアミドの生成に有用であるとすでに記載されている。
したがって、本発明の目的は、式：
Ｒ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｃ−ＣＯＮＨ２ （Ｉ）
を有するアミドの調製のための微生物プロセスであって、式：
Ｒ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｃ−ＣＮ （ＩＩ）
を有するニトリルの反応を含み、
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＢＣＣＭ−ＬＭＧのコレクションに寄託され、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２９５２０を有し、「Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２」と命名された、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株により生成されたニトリルヒドラターゼ酵素を用いる微生物プロセスであり、
式中、
Ｒ、Ｒ’およびＲ’’の中の少なくとも１個は水素とは異なり、
Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、互いに同一または異なり、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、所望により＝Ｏ基を含有しているＣ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｒ’’’ＣＯ−、少なくとも１個の原子がＮまたはＯである３〜６個の原子を有する複素環、アリールスルホニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、アリール基、アリールアミノカルボニル基およびＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル基から選択され、
Ｒ’’’は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、アミノ、ヒドラジノであり、
各Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、水素と異なる場合、ハロゲン基、ニトリル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基から選択される１個以上の置換基に置換されていてもよく、
ただし、式Ｉの化合物はアクリルアミドではない。
現在の文脈において、ニトリルのアミドへの変換反応は、このような変換反応を「水和」と称することがより正確である場合であっても、当該技術分野において、より一般的に使用される「加水分解」という用語によって示される。これら２つの用語は、同じ意味を与えることから、本明細書において区別なく使用される。
「Ｃ１−Ｃ６アルキル」という用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されるように使用され、１〜６個の数（その範囲ならびに整数１および６の中のすべての単一の整数を含む）の炭素原子を含む炭素骨格または炭素主鎖を有する化学種を指す。
各Ｃ１−Ｃ６アルキルは、直鎖または分枝鎖であることができる。
「分枝鎖」という用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されるように使用され、２個以上の連続する鎖に分裂する骨格または主鎖を有する化学種を指す。２個以上の方向に分かれる骨格または主鎖の部分は、直鎖、環状またはこれらの任意の組合せであり得る。分枝アルキルの非限定的な例は、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルおよびイソプロピルである。
「直鎖」という用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されるように使用され、２個以上の連続する鎖に分裂しない骨格または主鎖を有する化学種を指す。直鎖アルキルの非限定的な例は、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびｎ−ブチルである。
「Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル」という用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されるように使用され、その炭素骨格または主鎖の少なくとも一部が結合して、共に連結した原子の環を形成する化合物または化学種を指す。原子はすべてが直接的に互いに結合する必要はないが、むしろ、少なくとも他の２個の原子と直接的に結合する必要がある。Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタンおよびシクロヘキサンが挙げられる。
類似して、「Ｃ３−Ｃ６ヘテロアルキル」という用語は、少なくとも１個のへテロ原子を含む、化学種の骨格または主原子鎖の少なくとも一部が結合して、共に連結した原子の環を形成する化合物または化学種を指すように理解される。原子はすべてが直接的に互いに結合する必要はないが、むしろ、少なくとも他の２個の原子と直接的に結合する必要がある。
「アリール」および「ヘテロアリール」という用語は、当該技術分野の当業者に一般的に理解されるように使用され、その骨格または主原子鎖の少なくとも一部が結合して芳香環を形成する化合物または化学種を指す。
本明細書で使用する場合、Ｃ１−Ｃ６アルキルとしては、例えば、また限定されることなく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｓｅｃ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｉ−ヘキシル、１，２−ジメチルプロピル、２−エチルプロピル、１−メチル−２−エチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，１，２−トリエチルプロピル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｔ−ヘキシルが挙げられる。
Ｃ２−Ｃ６アルケニルの非限定的な例としては、ビニル、アリール、イソプロペニル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン−１−イル、１−ブテン−２−イル、１−ブテン−３−イル、２−ブテン−１−イル、２−ブテン−２−イルが挙げられる。
Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
アリールの非限定的な例としては、フェニル（Ｐｈ）およびナフチルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、複素環基の非限定的な例としては、ピロリジニル、ピロリニル（ｐｙｒｒｏｌｉｎｙｌ）、ピペリジニル、ピペラジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、テトラヒドロピラニル、アゼチジニル、オキセタニル、フタルイミドおよびスクシンイミドが挙げられる。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピロリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリルが挙げられる。
好ましい実施形態では、本発明の対象であるプロセスは、式Ｉのアミドの調製に適用され、式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’の中の少なくとも１個は、酸、塩基性もしくは中性の触媒、および追加のニトリル基、エステル基、アミド基、ハロアルキル基、アンモニウム塩から選択される環境の下で、加水分解または加溶媒分解に反応性の高い官能基であるか、またはそのような官能基を含有する。
本発明の対象であるプロセスの高い選択性は、有利にも、出発物質である式ＩＩの化合物に存在するその他の官能基を変化させることなく、ニトリル基のみの変換の実施を可能とする。
特に、酸または塩基によって触媒される化学的加水分解を受ける場合には、完全に保存すること、または副生成物および／もしくは不純物を生成することなく保存することが実際的には不可能である官能基に、変性が発生しない。
この特性は、本発明の対象であるプロセスに特有であり、より有利で革新的な特徴を表す。
以下の表には、本発明の対象である微生物プロセスで使用可能なニトリルの具体例がいくつか提供されるが、これはいかなる限定も目的としない。表のすべてのニトリルは既知の化合物であり、それらのほとんどは製薬の有効成分（ＡＰＩ）の調製プロセスにおいて、中間体として使用される。
本発明の対象である微生物プロセスにおいて、精製された形態で、または細菌バイオマスの構成成分として、酵素を使用することができる。所望により、酵素は、従来技術に従って、例えば、固体タイプの培地上に固定化した形態で使用することもできる。
酵素は、１０５℃で、２０〜４５％、好ましくは２５〜４０％の範囲の乾燥残留物を有する、ペースト状のバイオマスの形態で使用されるのが好ましい。
酵素はまた、１０５℃で、９０〜１００％、好ましくは９５〜９９％の乾燥残留物を有する、乾燥／凍結乾燥されたバイオマスの形態で使用することもできる。
酵素の量は、生体触媒の活性によって変動し得る。２５％のペーストとしての生体触媒の場合、１００％、１ＫｇのＡＤＭを得るために、酵素量は２ｇ〜８ｇ、好ましくは３〜６ｇの範囲である。その代わりに凍結乾燥されたバイオマスの場合は、同じ量を得るために、約０．５〜２ｇ、好ましくは０．７５ｇ〜１．５ｇの酵素を使用する。
本発明の対象であるプロセスは、水溶液中で、好ましくは有機共溶媒の存在下で実施される。
共溶媒の機能は、主にニトリルおよび／またはアミドの溶解度を高めることである。したがって、共溶媒の種類および量は、加水分解されるニトリルの特性および得られるアミドの特性に依存し、それら共溶媒の種類および量は、当該技術分野の当業者の知見に基づき変動し得る。
示唆的には、共溶媒は、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、メチル−テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、トルエン、ｔ．ＢｕＯＭｅの中から選択されるだろう。
メタノールおよびトルエンが特に好ましい。
共溶媒の量は、通常、２ｖ／ｖ％〜２０ｖ／ｖ％、好ましくは５ｖ／ｖ％〜１５ｖ／ｖ％、さらにより好ましくは約１０ｖ／ｖ％である。
また、温度およびｐＨなどのその他のプロセス条件の選択は、当該技術分野の当業者の知見の範囲内である。
一般に、本発明の対象であるプロセスが実施される好ましいｐＨ範囲は、６．０〜９．０である。より好ましくはｐＨ範囲は６．５〜７．５である。
所望のｐＨ値は、反応混合物中で好適な緩衝液を使用することにより得られる。リン酸緩衝液の使用が特に好ましい。
室温で反応を行うことがさらに好ましくかつ有利ではあるが、変換率を促進するためには、反応温度はまた、加水分解する基質によって変動し得る。一般に、温度は１０〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃の範囲であり得る。
以下の実施例の結果から、多置換（ｐｌｕｒｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）化合物、ジニトリル、キラル化合物などの複雑な構造を有するニトリルを含む、多種多様なニトリルの良好な変換率を得ることを可能にする本発明の対象であるプロセスの極めて高い柔軟性が、さらに明らかになるだろうが、これらの実施例は本発明の範囲を限定することを目的としない。
リン酸緩衝液中（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）にて、ニトリルの溶解度を高める１０％の共溶媒を使用して、反応を実施した。
基本手順：基質（最終濃度５０ｍＭ）を１ｍＬのＭｅＯＨに添加し、緩衝液（９ｍＬ）中の酵素（ＮＨａｓｅ ４ｍｇ）の懸濁液に添加した。確実に溶解させるために、必要に応じて音波処理または過熱を適用した。反応後、適時、異なる分析を行った（１ｍＬ試料）。各試料をＭｅＯＨでクエンチし、ろ過して、分析した。
［実施例１］
２−クロロアセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−クロロアセトニトリル（３８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下にて蒸発させた。１．５時間後に、２−クロロアセトアミドへの合計変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：４．０５−４．８３（ｓ、２Ｈ）であり、商業的に利用可能な試料２−クロロアセトアミドに相当する。
［実施例２］
２，２−ジエトキシアセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２，２−ジエトキシアセトニトリル（６５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下にて蒸発させた。１．５時間後に、２，２−ジエトキシアセトアミドへの合計変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：１．４４（ｔ、６Ｈ、３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ）、３．６１−３．７０（ｍ、４Ｈ）、４．８１（ｓ、１Ｈ）であり、商業的に利用可能な試料２，２−ジエトキシアセトアミドに相当する。
［実施例３］
ｔｅｒｔ−ブチル４−カルバモイルピペリジン−１−カルボキシレート
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、ｔｅｒｔ−ブチル４−シアノピペリジン−１−カルボキシレート（１０５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。７時間後に、ｔｅｒｔ−ブチル４−カルバモイルピペリジン−１−カルボキシレートへの４０％の変換率を観察した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１７３．０［Ｍ−５５］。ＭＳ（ＥＳ−）：ｍ／ｚ：２２７．０［Ｍ−１］。
ＨＰＬＣクロマトグラムは、ｔｅｒｔ−ブチル４−カルバモイルピペリジン−１−カルボキシレートの合成試料に相当した。ＲＲＴ３＝１、ＲＲＴ３ａ＝０．８７。
［実施例４］
２−（フェニルスルホニル）アセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−（フェニルスルホニル）アセトニトリル（９１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：２００．１［Ｍ＋１］、２１７．１［Ｍ＋１８］。ＲＲＴ４ａ＝０．３６。
［実施例５］
メチル３−アミノ−３−オキソプロパノエート
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、メチル２−シアノアセテート（９１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。注入しなかった残りの試料は、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に合計変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：３．７７（ｓ、２Ｈ）、３．９８（ｓ、３Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１１８．１［Ｍ＋１］。
［実施例６］
３−（フェニルアミノ）プロパンアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、３−（フェニルアミノ）プロパンニトリル（７３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。２．５時間後に合計変換率を観察した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１６５．１［Ｍ＋１］。ＲＲＴ８＝１、ＲＲＴ８ａ＝０．５１。
［実施例７］
３，３−ジメトキシプロパンアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、３，３−ジメトキシプロパンニトリル（５８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＧＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過した。試料に水（２ｍＬ）を添加し、試料をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、ＧＣ−ＭＳに直接注入した。７時間後に、ほぼ完全な変換が観察された。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１５６．１［Ｍ＋２３］。ＲＲＴ９＝１、ＲＲＴ９ａ＝１．２２。
［実施例８］
２−（２−アミノフェニル）アセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−（２−アミノフェニル）アセトニトリル（６６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。２．５時間後に合計変換率を観察した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１５１．１［Ｍ＋１］。ＲＲＴ１０＝１、ＲＲＴ１０ａ＝０．４８。
［実施例９］
２−アミノ−２−オキソアセトヒドラジド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−シアノアセトヒドラジド（５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に合計変換率を観察した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：３．４８−３．５８（ｍ、２Ｈ）。
［実施例１０］
２−（２−シアノフェニル）アセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−（シアノメチル）ベンゾニトリル（７１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。注入しなかった残りの試料は、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に合計変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：３．８１（ｓ、２Ｈ）、７．４９（ｔ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝７．６Ｈｚ）、７．７０（ｄ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝７．６Ｈｚ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１６１．１［Ｍ＋１］
［実施例１１］
２−（イソプロピルスルホニル）アセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−（イソプロピルスルホニル）アセトニトリル（７４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。注入しなかった残りの試料は、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に合計変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：１．３５（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、１Ｈ）、３．５２−３．６１（ｍ、１Ｈ）、４．６０（ｓ、２Ｈ、ＣＤ３ＯＤの水とオーバーラップ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１６６．１［Ｍ＋１］。ＲＲＴ１４＝１、ＲＲＴ１４ａ＝０．５４。
［実施例１２］
エチル（Ｒ）−５−アミノ−３−ヒドロキシ−５−オキソペンタノエート
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタノアート（７９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。７時間後に３４％の変換率を観察した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：１．３５（ｔ、３Ｈ、３ＪＨＨ＝２．３Ｈｚ）、２．４１−２．７７（４Ｈ、ｍ、出発化合物の信号とオーバーラップ）、３．７０（ｓ、２Ｈ）、４．４０−４．４３（ｍ、１Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１７６．１［Ｍ＋１］。
［実施例１３］
Ｎ１−フェニルマロンアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（８ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２−シアノ−Ｎ−フェニルアセトアミド（８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。４時間後に低い変換率（１３％）が観察された。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１７６．９［Ｍ−１］。ＲＲＴ１７＝１、ＲＲＴ１７ａ＝０．６１。
［実施例１４］
メチル１−カルバモイルシクロペンタン−１−カルボキシレート
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、メチル１−シアノシクロペンタン−１−カルボキシレート（７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＧＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過した。試料に水（２ｍＬ）を添加し、試料をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、ＧＣ−ＭＳに直接注入した。７時間後に約７２％の変換率が観察された。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１７１．９［Ｍ＋１］。ＲＲＴ１９＝１、ＲＲＴ１９ａ＝１．１１。
［実施例１５］
６−ブロモ−２，２−ジメチルヘキサンアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、６−ブロモ−２，２−ジメチルヘキサンニトリル（１０２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＧＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過した。試料に水（２ｍＬ）を添加し、試料をＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、ＧＣ−ＭＳに直接注入した。７時間後に約６４％の変換率が観察された。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：２２３．９［Ｍ＋１］。ＲＲＴ２０＝１、ＲＲＴ２０ａ＝１．１２。
［実施例１６］
（Ｅ）−５−シアノペンタ−３−エナミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、（Ｅ）−ヘキサ−３−エンジニトリル（５３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に９７％の変換率を観察した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、約７％の割合での対応するジアミドの存在を仮定することができる。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：３．００−３．１９（ｍ、２Ｈ）、３．２１−３．３０（ｍ、２Ｈ）、５．５５−５．５０（ｍ、１Ｈ）、５．９０−６．００（ｍ、１Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１４２．１［Ｍ＋１８］。
［実施例１７］
２−（（シアノメチル）アミノ）アセトアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、２，２’−アザンジイルジアセトニトリル（４８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いて、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下で蒸発させ、１Ｈ−ＮＭＲによって分析した。１．５時間後に合計変換率を観察した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、対応するジアミド（約３０％）の存在を仮定することができる。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：３．３３６（ｓ、２Ｈ）、３．６８（ｓ、２Ｈ）。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１１３．９［Ｍ＋１］。
［実施例１９］
Ｎ１−ベンジルマロンアミド
ＮＨａｓｅを乳鉢で粉砕し、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）（９ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、Ｎ−ベンジル−２−シアノアセトアミド（８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した懸濁液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＨＰＬＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を、１．５時間後、２．５時間後、４時間後および７時間後に分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、ＨＰＬＣに直接注入した。４時間後に８０％の変換率を観察した。
ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ：１９３．１［Ｍ＋１］。ＲＲＴ２５＝１、ＲＲＴ２５ａ＝０．６５。
［実施例２０］
２−フェニルアセトアミド
ＮＨａｓｅ（４ｍｇ）を、５０ｍＬ三角フラスコにおいて、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、１％ＭｅＯＨ、ｐＨ＝７．４）（１０ｍＬ）中の２−フェニルアセトニトリル（５９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃で攪拌した。試料（２００μＬ）をＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲによって測定した。反応を４時間後に停止した。反応物をＤＣＭ（１５ｍＬ×２）によって抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空下にて蒸発させた。２−フェニルアセトアミドを白色固体として、３７％の収率で単離した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００．１３ＭＨｚ）：３．７０（ｓ、２Ｈ）、５．１６（ｂｓ、１Ｈ）、５．７３（ｂｓ、１Ｈ）、７．２７−７．４３（ｍ、５Ｈ）。
［実施例２１］
３−フェニルプロパンアミド
ＮＨａｓｅ（４ｍｇ）を、５０ｍＬ三角フラスコにおいてリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、１％ＭｅＯＨ、ｐＨ＝７．４）（１０ｍＬ）中の３−フェニルプロパンニトリル（６６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃で攪拌した。試料（２００μＬ）をＨＰＬＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲによって測定した。反応を４時間後に停止した。反応物をＤＣＭ（１５ｍＬ×２）によって抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、真空下にて蒸発させた。３−フェニルプロパンアミドを白色固体として、９９％の収率で単離した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００．１３ＭＨｚ）：２．５５（ｔ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ）、３．００（ｔ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝８．２Ｈｚ）、５．１６−５．４７（ｂｓ、１Ｈ）、５．７３（ｂｓ、１Ｈ）、７．１７−７．３６（ｍ、５Ｈ）。
［実施例２２］
エチル３−アミノ−３−オキソ−２−フェニルプロパノエート
ＮＨａｓｅ（４ｍｇ）を、５０ｍＬ三角フラスコにおいて、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、１％トルエン、ｐＨ＝７．４）（１０ｍＬ）中の（±）エチル２−シアノ−２−フェニルアセテート（５９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃で攪拌した。試料（５００μＬ）をＤＣＭで抽出し、ＵＰＣ−ＭＳによって測定した。反応を異なる時間で分析した。これらの条件で１時間後に観察される変換率は３０％であり、９７％ｅｅを有するエチル３−アミノ−３−オキソ−２−フェニルプロパノエートを得た。
合成経路により得られたアミドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと比較して、構造を確認した。
［実施例２３］
２−フェニルプロパンアミド
ＮＨａｓｅ（４ｍｇ）を、５０ｍＬ三角フラスコにおいて、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、１％トルエン、ｐＨ＝７．４）（１０ｍＬ）中の（±）２−フェニルプロパンニトリル（６６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応物を回転振とうにより、２５℃で攪拌した。試料（５００μＬ）をＤＣＭで抽出し、ＧＣ−ＭＳによって測定した。反応を異なる時間で分析した。これらの条件で１時間後に観察される変換率は８３％であり、８２％ｅｅを有する（Ｓ）−２−フェニルプロパンアミドを得た。
合成経路により得られたアミドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと比較して、構造を確認した。
［実施例２４］
５−シアノペンタンアミド
ＮＨａｓｅ（１６ｍｇ）を乳鉢で粉砕し、１００ｍＬ三角フラスコにおいて、脱塩水（４０ｍＬ）に添加した。懸濁液をボルテックスで混合し、トルエン（４００μＬ）に溶解したこの懸濁液に、アジポニトリル（２２４μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を回転攪拌により、２５℃および２５０ｒｐｍで攪拌した。反応に続いてＧＣ−ＭＳを行った。試料（１ｍＬ）を適時分析した。試料をＭｅＯＨ（２ｍＬ）と混合し、ろ過し、真空下で蒸発させ、ＭｅＯＨに溶解させた。５−シアノペンタンアミド（９２ｍｇ）を、３７％の収率で単離した。
ＲＲＴａｍｉｄｅ＝１．１２、ＲＲＴｎｉｔｒｉｌｅ＝１。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００．１３ＭＨｚ）：１．５９−１．８４（ｍ、４Ｈ）、２．２６（ｔ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ）、２．４９（ｔ、２Ｈ、３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ）。
ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ：１２６．１［Ｍ］

Claims (10)

  1. 式：Ｒ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｃ−ＣＯＮＨ２ （Ｉ）
    を有するアミドの調製のための微生物プロセスであって、
    式：Ｒ（Ｒ’）（Ｒ’’）Ｃ−ＣＮ （ＩＩ）
    を有するニトリルの反応を含み、
    Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＢＣＣＭ−ＬＭＧのコレクションに寄託され、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２９５２０を有し、「Ｐａｌｌａｄｉｏ ２２」と命名された、ロドコッカス・ビフェニリボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｐｈｅｎｙｌｉｖｏｒａｎｓ）の菌株により生成されたニトリルヒドラターゼ酵素を用いる微生物プロセスであり、
    式中、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’の中の少なくとも１個は水素とは異なり、
    Ｒ、Ｒ’およびＲ’’は、互いに同一または異なり、独立して、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、所望により＝Ｏ基を含有しているＣ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｒ’’’ＣＯ−、少なくとも１個の原子がＮまたはＯである３〜６個の原子を有する複素環、アリールスルホニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、アリール基、アリールアミノカルボニル基およびＣ１−Ｃ６アルキルアミノカルボニル基から選択され、
    Ｒ’’’は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、アミノ、ヒドラジノであり、
    各Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、水素と異なる場合、ハロゲン基、ニトリル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アリール基から選択される１個以上の置換基に置換されていてもよく、
    ただし、式Ｉの前記化合物はアクリルアミドではない、アミド調製のための微生物プロセス。
  2. Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’の中の少なくとも１個が、酸、塩基性もしくは中性の触媒または追加のニトリル基、エステル基、アミド基、ハロアルキル基、アンモニウム塩から選択される環境の下で、加水分解または加溶媒分解に反応性の高い官能基であるか、またはそのような官能基を含有する、式Ｉのアミドの調製のための、請求項１に記載の微生物プロセス。
  3. 前記酵素が、１０５℃で、２０〜４５％、好ましくは２５〜４０％の範囲の乾燥残留物を有する、ペースト状のバイオマスの形態で使用される、請求項１または２に記載の微生物プロセス。
  4. 前記酵素が、１０５℃で、９０〜１００％、好ましくは９５〜９９％の乾燥残留物を有する、乾燥／凍結乾燥されたバイオマスの形態で使用される、請求項１または２に記載の微生物プロセス。
  5. 前記バイオマスが、固体タイプの培地上に固定化される、請求項３または４に記載の微生物プロセス。
  6. 水溶液中で、好ましくは有機共溶媒の存在下で実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物プロセス。
  7. 前記共溶媒が、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、メチル−テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサエオ（ｄｉｏｘａｅｏ）、トルエン、ｔ．ＢｕＯＭｅ、好ましくはメタノールおよびトルエンから選択される、請求項６に記載の微生物プロセス。
  8. 共溶媒の量が、２ｖ／ｖ％〜２０ｖ／ｖ％、好ましくは５ｖ／ｖ％〜１５ｖ／ｖ％、さらにより好ましくは約１０ｖ／ｖ％である、請求項６に記載の微生物プロセス。
  9. 前記反応が、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくは６．５〜７．５で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物プロセス。
  10. 前記反応が、１０〜４５℃、好ましくは１５〜３０℃の温度にて実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物プロセス。
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