CN111757940B - 用于制备酰胺的微生物学方法 - Google Patents
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Abstract
描述了一种通过酶促水解，从相应的腈制备酰胺的微生物学方法，其中酶促水解使用来自嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌属的一菌株的腈水合酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备酰胺的方法，更特别地，涉及一种通过用来自嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)属的一菌株中的腈水合酶，进行酶水解，而从相应的腈来制备酰胺的方法。
背景技术
腈是合成酰胺和羧酸的重要前体，广泛用作药物活性成分或其合成的高级中间体。
腈从羧酸通过中间体酰胺进行的化学水解，需要在高温(100℃)下如强酸或强碱等剧烈的条件，且反应时间长。在开始时形成酰胺，但酰胺通过酸或碱处理被水解，迅速形成羧酸。鉴于要使用的条件，化学水解常常不适合用于药物活性成分或其高级中间体的制备，因为这些化合物常常具有一个或多个不对称中心和/或其它官能团。
化学水解可能也不适合用于获得酰胺，因为必须终止水解过程以防止转化为酸。
作为化学水解的替代方案，可使用酶水解。
在文献中，已知几种通过使用产生腈水合酶(也称为NHase)的细菌菌株，将腈转化为酰胺的酶促方法。
然而，这些方法通常仅适用于特定种类的腈，而不能应用于具有可能彼此非常不同的化学特性的底物上。
因此，仍然需要一种将腈转化为酰胺的酶促方法，其适用于种类广泛的腈且具有良好的收率。
发明内容
我们现在发现了一种腈水合酶能够以良好的化学选择性、区域选择性和立体选择性，将种类广泛的腈转化为相应的酰胺，该腈水合酶通过命名为“Palladio 22”的嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌株产生，该菌株于2016年04月12日按照布达佩斯条约的要求保藏在BCCM(比利时微生物保藏中心)-LMG微生物菌种保藏中心，保藏号为LMGP-29520。
在本申请人提交的、并于2017年11月23日公开的国际专利申请WO2017199200中，已经描述了命名为“Palladio 22”的嗜联苯红球菌(Rhodococcus biphenylivorans)菌株可用于生产丙烯酰胺。
因此，本发明的目的是一种用于制备下式I的酰胺的微生物学方法：
R(R’)(R”)C-CONH2 (I)，
该方法包括下式II的腈与腈水合酶反应：
R(R’)(R”)C-CN (II)，
所述腈水合酶通过命名为“Palladio 22”的嗜联苯红球菌(Rhodococcusbiphenylivorans)菌株产生，所述菌株保藏在BCCM-LMG微生物菌种保藏中心，保藏号为LMGP-29520，
其中，
R、R’和R”中的至少一个与氢不同；
R、R’和R”彼此相同或不同，独立地选自：氢；C1-C6烷基；C1-C6烷氧基；C1-C6烷氧羰基；C2-C6烯基；任选地包含＝O基团的C3-C6环烷基；R”’CO-；具有3至6个原子的杂环，其中至少一个原子是N或O；芳基磺酰基；C1-C6烷基磺酰基；芳基；芳氨基羰基；和，C1-C6烷氨基羰基；
R”’是C1-C6烷基、芳基、氨基、肼基；
当与氢不同时，R、R’、R”和R”’各自任选地被选自卤素、腈基、氨基、C1-C6烷氨基、羟基、C1-C6烷氧基、芳基中的一个或多个取代基取代；
条件是，所述式I的化合物不是丙烯酰胺。
在本上下文中，腈向酰胺的转化反应将用本领域中更常用的术语“水解”来表示，尽管这种转化反应称为“水合作用”更正确。通过赋予它们相同的含义，这两个术语在本文中可互换使用。
术语“C1-C6烷基”如本领域技术人员通常所理解的那样使用，是指具有碳骨架或主碳链的化学实体，其中碳骨架或主碳链包含1至6个碳原子(包括该范围内的所有单个整数，以及整数1和6)。
各C1-C6烷基可以是直链或支链的。
术语“支链”如本领域技术人员通常所理解的那样使用，是指具有骨架或主链的化学实体，其中骨架或主链分成一个以上的连续链。骨架或主链分成一个以上方向的部分可以是线性、环状或其任何组合。支链烷基的非限制性实例是叔丁基、异丁基和异丙基。
术语“直链”如本领域技术人员通常所理解的那样使用，是指具有骨架或主链的化学实体，其中骨架或主链不分成一个以上的连续链。直链烷基的非限制性实例是甲基、乙基、正丙基和正丁基。
术语“C3-C6环烷基”如本领域技术人员通常所理解的那样使用，是指一化合物或化学实体，其中化学实体的碳骨架或主链的至少一部分结合形成连接在一起的原子环。这些原子不需要全部彼此直接连接，而是需要与至少两个其它原子直接连接。C3-C6环烷基的非限制性实例包括环丙烷、环丁烷、环戊烷和环己烷。
类似地，术语“C3-C6杂烷基”应理解为是指一化合物或化学实体，其中含至少一个杂原子的化学实体的骨架或主原子链的至少一部分结合形成连接在一起的原子环。这些原子不需要全部彼此直接连接，而是需要与至少两个其它原子直接连接。
术语“芳基”和“杂芳基”如本领域技术人员通常所理解的那样使用，是指一化合物或化学实体，其中化学实体的骨架或主原子链的至少一部分结合形成芳香环。
如本文所用，C1-C6烷基包括，例如且不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、正己基、异己基、1,2-二甲基丙基、2-乙基丙基、1-甲基-2-乙基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1,2-三乙基丙基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,3-二甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、仲己基、叔己基。
C2-C6烯基的非限制性实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-1-基、1-丁烯-2-基、1-丁烯-3-基、2-丁烯-1-基、2-丁烯-2-基。
C3-C6环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
芳基的非限制性实例包括苯基(Ph)和奈基。
如本文所用，杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、吡咯啉基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啉基、吡唑烷基、咪唑烷基、吗啉基、四氢吡喃基、吖丁啶基、氧杂环丁基、邻苯二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺。
杂芳基的非限制性实例包括吡咯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法客体适用于制备式I的酰胺，其中，R、R’、R”和R”’中的至少一个是或者包含，对在酸、碱或中性催化和环境下的水解或溶剂分解敏感的官能团，该官能团选自额外的腈基、酯基、酰胺基(amido)、卤代烷基、铵盐。
本发明的方法客体的高选择性有利地允许仅进行腈基的转化，而不改变在式II的起始化合物中存在的其它官能团。
特别地，不对官能团进行修饰，如果它们经历由酸或碱催化的化学水解，那么实际上不可能完全保存，或不产生副产物和/或杂质。
这一特征是本发明的方法客体所特有的，并且它代表了其更有利和创新的特性。
在下表中，提供了可用于本发明微生物学方法客体的腈的一些具体实例，没有任何限制性目的。表中所有的腈都是已知化合物，并且它们中的大部分用作制备药物活性成分(API)过程中的中间体。
表
在本发明的微生物学方法客体中，所述酶可以纯化的形式使用，或作为细菌生物质的组分使用。任选地，所述酶也可以根据常规技术以固定的形式使用，例如固定在固体型基底上。
优选地，所述酶以生物质的形式作为糊剂使用，在105℃下具有20至45％，优选25至40％的干燥残留物。
所述酶也可以以干燥/冻干生物质的形式使用，在105℃下具有90至100％，优选95至99％的干燥残留物。
酶的用量可以根据生物催化剂的活性而发生变化。对于作为25％的糊剂的生物催化剂，用量可以在2g至8g的范围内变化，优选在3g至6g的范围内变化，以获得1Kg 100％的ADM。而对于冻干的生物质，使用约0.5g至2g，优选0.75g至1.5g的用量，来获得相同的量。
本发明的方法客体在水性溶液中进行，优选在有机助溶剂的存在下进行。
助溶剂的功能主要是增强腈和/或酰胺的溶解。因此，助溶剂的种类及其用量将取决于待水解的腈和待获得的酰胺的特性，并且它们可以基于本领域技术人员的知识来改变。
例示性地，助溶剂将选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲基-四氢呋喃、1,4-二噁烷、甲苯、甲基叔丁基醚。
甲醇和甲苯是特别优选的。
助溶剂的用量通常在2％和20％v/v之间，优选在5％和15％之间，仍然更优选约为10％。
同样，其它方法条件的选择，例如温度和pH，也在本领域技术人员的知识范围内。
通常，进行本发明的方法客体的优选pH范围是6.0至9.0。更优选的pH范围是6.5至7.5。
所需的pH值通过在反应混合物中使用合适的缓冲液来获得。磷酸盐缓冲液的使用是特别优选的。
甚至优选且有利地是在室温下工作，反应温度也可随水解底物的不同而改变，以促进转化率。通常，温度可以在10至45℃的范围内，优选在15至30℃的范围内。
具体实施方式
本发明的方法客体允许获得各种腈，包括具有复杂结构的腈，例如多取代的化合物、二腈、手性化合物的良好转化率，本发明的方法客体的非常高的灵活性将从以下实施例的结果中更明显地显现出来，然而，这些实施例对本发明的范围没有限制性目的。
实施例
反应在磷酸缓冲液(10mM，pH＝7.4)中进行，使用10％的助溶剂来增加腈的溶解度。
通用步骤：将底物(终浓度50mM)加入到1mL的MeOH中，得到酶(NHase 4mg)在缓冲液(9mL)中的悬浮液。为了确保溶解，如果需要，可以进行超声或加热。通过不同的分析方法，适时跟进(1mL样品)反应。每一样品均用MeOH淬灭，过滤并分析。
实施例1
2-氯乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶(Erlenmeyer)中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-氯乙腈(38mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并在真空下蒸发。1.5小时后，观察到向2-氯乙酰胺的全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：4.05-4.83(s，2H)，与市售的2-氯乙酰胺样品相当。
实施例2
2,2-二乙氧基乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法悬浮液混合，并将2,2-二乙氧基乙腈(65mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并在真空下蒸发。1.5小时后，观察到向2,2-二乙氧基乙酰胺的全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：1.44(t，6H，3JHH＝6.0Hz)，3.61-3.70(m，4H)，4.81(s，1H)，与市售的2,2-二乙氧基乙酰胺样品相当。
实施例3
4-氨基甲酰哌啶-1-羧酸叔丁酯
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将4-氰基哌啶-1-羧酸叔丁酯(105mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。7小时后，观察到向4-氨基甲酰哌啶-1-羧酸叔丁酯的40％的转化。
MS(ES+)：m/z：173.0[M-55]。MS(ES-)：m/z：227.0[M-1]。
HPLC色谱图与4-氨基甲酰哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成样品相当。RRT3＝1，RRT3a＝0.87。
实施例4
2-(苯磺酰基)乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-(苯磺酰基)乙腈(91mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。
MS(ES+)：m/z：200.1[M+1]，217.1[M+18]。RRT4a＝0.36。
实施例5
3-氨基-3-氧代丙酸甲酯
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-氰基乙酸甲酯(91mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS和1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。未注入的剩余样品在真空下蒸发，并通过1H-NMR分析。1.5小时后观察到全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：3.77(s，2H)，3.98(s，3H)。
MS(ES+)：m/z：118.1[M+1]。
实施例6
3-(苯氨基)丙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将3-(苯氨基)丙腈(73mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。2.5小时后观察到全部转化。
MS(ES+)：m/z：165.1[M+1]。RRT8＝1，RRT8a＝0.51。
实施例7
3,3-二甲氧基丙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将3,3-二甲氧基丙腈(58mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行GC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合并过滤。将水(2mL)加入到样品中，并用EtOAc(4mL)萃取样品。有机相经Na2SO4干燥，过滤并直接注入GC-MS。7小时后观察到几乎全部转化。
MS(ES+)：m/z：156.1[M+23]。RRT9＝1，RRT9a＝1.22。
实施例8
2-(2-氨基苯基)乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-(2-氨基苯基)乙腈(66mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。2.5小时后观察到全部转化。
MS(ES+)：m/z：151.1[M+1]。RRT10＝1，RRT10a＝0.48。
实施例9
2-氨基-2-氧代乙酰肼
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-氰基乙酰肼(50mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤，在真空下蒸发，并通过1H-NMR进行分析。1.5小时后观察到全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：3.48-3.58(m，2H)。
实施例10
2-(2-氰基苯基)乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-(氰甲基)苄腈(71mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS和1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。未注入的剩余样品在真空下蒸发，并通过1H-NMR进行分析。1.5小时后观察到全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：3.81(s，2H)，7.49(t，2H，3JHH＝7.6Hz)，7.70(d，2H，3JHH＝7.6Hz)。
MS(ES+)：m/z：161.1[M+1]。
实施例11
2-(异丙基磺酰基)乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-(异丙基磺酰基)乙腈(74mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行HPLC-MS和1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。未注入的剩余样品在真空下蒸发，并通过1H-NMR分析。1.5小时后观察到全部转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：1.35(s，3H)，1.38(s，1H)，3.52-3.61(m，1H)，4.60(s，2H，与CD3OD的水重叠)。
MS(ES+)：m/z：166.1[M+1]。RRT14＝1，RRT14a＝0.54。
实施例12
(R)-5-氨基-3-羟基-5-氧代戊酸乙酯
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(79mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤，在真空下蒸发，并通过1H-NMR进行分析。7小时后观察到34％的转化。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：1.35(t，3H，3JHH＝2.3Hz)，2.41-2.77(4H，m，与起始化合物的信号重叠)，3.70(s，2H)，4.40-4.43(m，1H)。
MS(ES+)：m/z：176.1[M+1]。
实施例13
N1-苯基丙二酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(8mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2-氰基-N-苯基乙酰胺(80mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。4小时后观察到低转化(13％)。
MS(ES+)：m/z：176.9[M-1]。RRT17＝1，RRT17a＝0.61。
实施例14
1-氨基甲酰环戊烷-1-羧酸甲酯
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将1-氰基环戊烷-1-羧酸甲酯(77mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行GC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合并过滤。将水(2mL)加入到样品中，并用EtOAc(4mL)萃取样品。有机相经Na2SO4干燥，过滤并直接注入GC-MS。7小时后观察到约72％的转化。
MS(ES+)：m/z：171.9[M+1]。RRT19＝1，RRT19a＝1.11。
实施例15
6-溴-2,2-二甲基己酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将6-溴-2,2-二甲基己腈(102mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm搅拌。反应后进行GC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合并过滤。将水(2mL)加入到样品中，并用EtOAc(4mL)萃取样品。有机相经Na2SO4干燥，过滤并直接注入GC-MS。7小时后观察到约64％的转化。
MS(ES+)：m/z：223.9[M+1]。RRT20＝1，RRT20a＝1.12。
实施例16
(E)-5-氰戊-3-稀酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将(E)-己-3-稀二腈(53mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤，在真空下蒸发，并通过1H-NMR进行分析。1.5小时后观察到97％的转化。从1H-NMR图谱，可以推测出相应的二酰胺的存在百分比约为7％。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：3.00-3.19(m，2H)，3.21-3.30(m，2H)，5.55-5.50(m，1H)，5.90-6.00(m，1H)。
MS(ES+)：m/z：142.1[M+18]。
实施例17
2-((氰甲基)氨基)乙酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将2,2’-亚氨基二乙腈(48mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行1H-NMR。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤，在真空下蒸发，并通过1H-NMR进行分析。1.5小时后观察到全部转化。从1H-NMR图谱，可以推测出相应的二酰胺的存在(约30％)。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：3.336(s，2H)，3.68(s，2H)。
MS(ES+)：m/z：113.9[M+1]。
实施例19
N1-苄基丙二酰胺
将NHase在研钵中研磨，并加入到50mL锥形瓶中的磷酸钾缓冲液(10mM，pH＝7.4)(9mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将N-苄基-2-氰基乙酰胺(80mg，0.5mmol)加入到溶解在MeOH(1mL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm进行搅拌。反应后进行HPLC-MS。在1.5、2.5、4和7小时后，对样品(1mL)进行分析。样品与MeOH(2mL)混合，过滤并直接注入HPLC。4小时后观察到80％的转化。
MS(ES+)：m/z：193.1[M+1]。RRT25＝1，RRT25a＝0.65。
实施例20
2-苯乙酰胺
将NHase(4mg)加入到50mL锥形瓶中的，2-苯乙腈(59mg，0.5mmol)的磷酸钾缓冲溶液(10mM，1％MeOH，pH＝7.4)(10mL)中。反应通过回转式振荡，在25℃进行搅拌。通过HPLC-MS和1H-NMR测量样品(200μL)。反应在4小时后终止。用DCM(15mL×2)萃取反应物。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下蒸发。分离出呈白色固体的2-苯乙酰胺，收率为37％。
1H-NMR(CDCl3，300.13MHz)：3.70(s，2H)，5.16(bs，1H)，5.73(bs，1H)，7.27-7.43(m，5H)。
实施例21
3-苯丙酰胺
将NHase(4mg)加入到50mL锥形瓶中的，3-苯丙腈(66mg，0.5mmol)的磷酸钾缓冲溶液(10mM，1％MeOH，pH＝7.4)(10mL)中。反应通过回转式振荡，在25℃下进行搅拌。通过HPLC-MS和1H-NMR测量样品(200μL)。反应在4h后终止。用DCM(15mL×2)萃取反应物。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下蒸发。分离出呈白色固体的3-苯丙酰胺，收率为99％。
1H-NMR(CDCl3，300.13MHz)：2.55(t，2H，3JHH＝8.2Hz)，3.00(t，2H，3JHH＝8.2Hz)，5.16-5.47(bs，1H)，5.73(bs，1H)，7.17-7.36(m，5H)。
实施例22
3-氨基-3-氧代-2-苯丙酸乙酯
将NHase(4mg)加入到50mL锥形瓶中的，(±)2-氰基-2-苯乙酸乙酯(59mg，0.5mmol)的磷酸钾缓冲溶液(10mM，1％甲苯，pH＝7.4)(10mL)中。反应通过回转式振荡，在25℃下进行搅拌。样品(500μL)用DCM萃取，并通过UPC-MS测量。在不同的时间分析反应。1小时后，在这些条件下观察到的转化为30％，且得到97％ee的3-氨基-3-氧代-2-苯丙酸乙酯。
与通过合成路线获得的酰胺的1H-NMR图谱进行比较，证实了结构。
实施例23
2-苯丙酰胺
将NHase(4mg)加入到50mL锥形瓶中的，(±)2-苯丙腈(66mg，0.5mmol)的磷酸钾缓冲溶液(10mM，1％甲苯，pH＝7.4)(10mL)中。反应通过回转式振荡，在25℃下进行搅拌。样品(500μL)用DCM萃取并通过GC-MS测量。在不同的时间分析反应。1小时后，在这些条件下观察到的转化为83％，且得到82％ee的(S)-2-苯丙酰胺。
与通过合成路线获得的酰胺的1H-NMR图谱进行比较，证实了结构。
实施例24
5-氰戊酰胺
将NHase(16mg)在研钵中研磨，并加入到在100mL锥形瓶中的脱矿质水(40mL)中。通过旋涡法混合悬浮液，并将己二腈(224μL，0.5mmol)加入到溶解在甲苯(400μL)中的悬浮液中。反应通过回转式振荡，在25℃，250rpm下进行搅拌。反应后进行GC-MS。适时分析样品(1mL)。样品与MeOH(2mL)混合，过滤，在真空下蒸发，并溶于MeOH中。分离出5-氰戊酰胺(92mg)，收率为37％。
RRT酰胺＝1.12，RRT腈＝1。
1H-NMR(CD3OD，300.13MHz)：1.59-1.84(m，4H)，2.26(t，2H，3JHH＝7.0Hz)，2.49(t，2H，3JHH＝7.0Hz)。
MS(EI)：m/z：126.1[M]。
Claims (13)
1.一种用于制备下式I的酰胺的微生物学方法，
R(R')(R”)C-CONH2(I)，
包括：下式II的腈与腈水合酶反应
R(R')(R”)C-CN(II)，
所述腈水合酶通过命名为“Palladio 22”的嗜联苯红球菌(Rhodococcusbiphenylivorans)菌株产生，所述菌株保藏在BCCM-LMG微生物菌种保藏中心，保藏号为LMGP-29520，
其中，
R、R'和R”中的至少一个与氢不同；
R、R'和R”彼此相同或不同，独立地选自：氢；C1-C6烷基；C1-C6烷氧基；C1-C6烷氧羰基；C2-C6烯基；任选地包含＝O基团的C3-C6环烷基；R”'CO-；具有3至6个原子的杂环，其中至少一个原子是N或O；芳基磺酰基；C1-C6烷基磺酰基；芳基；芳氨基羰基；和，C1-C6烷氨基羰基；
R”'是C1-C6烷基、芳基、氨基、肼基；
当与氢不同时，每个R、R'、R”和R”'任选地被选自卤素、腈基、氨基、C1-C6烷氨基、羟基、C1-C6烷氧基、芳基中的一个或多个取代基取代；
条件是所述式I的化合物不是丙烯酰胺。
2.根据权利要求1所述的用于制备式I的酰胺的微生物学方法，其中，R、R'、R”和R”'中的至少一个是或者包含：对在酸、碱或中性催化或环境下的水解或溶剂分解敏感的官能团，该官能团选自额外的腈基、酯基、酰胺基、卤代烷基、铵盐。
3.根据权利要求1或2所述的微生物学方法，所述微生物学方法在水性溶液中进行。
4.根据权利要求3所述的微生物学方法，所述微生物学方法在有机助溶剂的存在下进行。
5.根据权利要求4所述的微生物学方法，其中，所述助溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲基-四氢呋喃、1,4-二噁烷、甲苯、甲基叔丁基醚。
6.根据权利要求5所述的微生物学方法，其中，所述助溶剂选自甲醇和甲苯。
7.根据权利要求4所述的微生物学方法，其中，所述助溶剂的量在2％和20％v/v之间。
8.根据权利要求7所述的微生物学方法，其中，所述助溶剂的量在5％和15％之间。
9.根据权利要求8所述的微生物学方法，其中，所述助溶剂的量为10％。
10.根据权利要求1或2所述的微生物学方法，其中，所述反应在pH 6.0至9.0下进行。
11.根据权利要求10所述的微生物学方法，其中，所述反应在pH 6.5至7.5下进行。
12.根据权利要求1或2所述的微生物学方法，其中，所述反应在10℃至45℃的温度下进行。
13.根据权利要求12所述的微生物学方法，其中，所述反应在15℃至30℃的温度下进行。
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