JP2015535003A - プレガバリンの調製方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、（ａ）任意に適切な溶媒中、弱酸の塩および弱塩基、または弱塩基の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを反応させて、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを得るステップ、（ｂ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを適切なシアン化物源と反応させて、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得るステップ、（ｃ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、適切なシアン化物源の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを反応させることにより、単一ステップで、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得てもよいステップ、（ｄ）適切なｐＨおよび温度において、水中、または有機共溶媒を含んでもよい水中、遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素（Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２）により、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩に変換するステップ、（ｅ）適切な溶媒またはそれらの溶媒の混合物中、塩基の存在下、式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩をアルコール（Ｒ３ＯＨ）および酸性触媒、またはハロゲン化アルキル（Ｒ３Ｘ）と処理することにより、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートへと変換するステップ、（ｆ）水もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、酵素によるエナンチオ選択的な加水分解により、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートから、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび式（Ｘ）の（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩を得るステップ、（ｇ）有機溶媒またはその混合物中、塩基の存在下、式（Ｘ）の不要な（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸もしくはその塩、または実質的に豊富な式（Ｘ）のその（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸塩をラセミ化することにより、式（ＶＩＩ）の化合物を得てもよいステップ、（ｈ）適切なアルカリ金属塩基またはアルカリ土類金属塩基を用いるエステル基の加水分解、その後の適切な水素化触媒の存在下、水もしくは他の有機溶媒、またはそれらの混合物から選択される溶媒中、ワンポットで行ってもよい水素化により、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートを式（Ｉ）のプレガバリンに変換するステップ、を含む、式（Ｉ）の化合物の改善された調製方法を提供する。【化１】

Description

本発明は、プレガバリン（１）を高い収率、高い化学純度および高いキラル純度で製造するための、商業的に実現可能な環境に優しい方法に関する。
化学的には構造式（１）を有する３−（Ｓ）−（アミノメチル−５−メチルヘキサン酸として知られているプレガバリンにより、てんかん、神経障害性疼痛、不安症、および社会恐怖症を含む、いくつかの中枢神経系障害が治療されることが知られている。
（Ｓ）−プレガバリンは、ＧＡＤ（Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ）を用量依存的に活性化すること、および脳の主要な抑制性神経伝達物質の１つである、ＧＡＢＡ（ガンマ−アミノ酪酸）の産生を促進することが見いだされている。抗発作活性の発見は、米国特許第５，５６３，１７５号において、初めて開示された。
プレガバリンは、様々な方法で調製されてきた。一般的な手法の一つには、典型的にはＲおよびＳ異性体の５０：５０混合物であるラセミプレガバリンの合成、およびその後のジアステレオマー塩形成による分割が含まれる。そのような手法は、ＷＯ２００９１２２２１５、ＷＯ２００９０８７６７４、ＷＯ２００９０４４４０９、ＷＯ２００８１３８８７４、ＷＯ２００９１２５４２７、およびＷＯ２００９００１３７２などの特許公開において見いだすことができるだろう。この手法に関連する主な難しい点にはＳ−異性体の一部と共にＲ−鏡像異性体が損失することが含まれ、これを効果的に再利用できないことから、コスト上の負担がかかっている。別の手法は、戦略的に中間体の段階で分割を利用するものである。スキーム１は、ＷＯ９６３８４０５において記載されている手法を概説している。その合成には、Ｋｎｏｖａｎａｇａｌ縮合とそれに続くＭｉｃｈｅａｌ付加が含まれ、酸性加水分解により二酸が得られる。この二酸はモノアミドに変換され、このモノアミドは（Ｒ）−フェニルエチルアミンによって分割された。Ｒ−モノ酸アミドを遊離させた後、Ｈｏｆｆｍａｎｎ分解によって（Ｓ）−プレガバリンに変換された。総収率は、８ステップをかけて１２％であり、鏡像異性体過剰率（ｅｅ）は９９．８％であった。すべて市販試薬が使用され、キラル補助は回収することができる。
ＷＯ２００８１３７５１２において、スキーム２に示されている通りに記載されている別の手法は、アミド中間体の分割とその後のＨｏｆｆｍａｎｎ分解が含まれる。
さらなる修正が、OPRD, 2009, 13, 812-13において記載された。特許公開ＷＯ２００８０６２４６０およびＵＳ６０４６３５３において記載されている手法が、スキーム３に示されている。これには、マロン酸ジエチルとイソバレルアルデヒドの縮合とその後のシアノ化が含まれる。生成物は、シアノエステルに選択的に加水分解され、加水分解するとシアノ酸が得られた。このシアノ酸を水素化すると、ラセミプレガバリンとなった。最後に、（Ｓ）−マンデル酸（ｍａｎｄａｌｉｃ ａｃｉｄ）を使用することにより分割され、６ステップで、総収率１５．５％およびｅｅ＞９９．５％となった。
一般的に使用されている別の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）は、３−イソブチルグルタル酸無水物（ＩＢＧ）であることが分かった。米国特許公開第２００９０１４３６１５号および欧州特許公開ＥＰ２０６７７６８は、スキーム４に示されているプレガバリンの合成を記載しており、このスキームには、ヒドラジンによる開環と、その後のＣｕｒｔｉｕｓ転位によるウレタン酸への変換が含まれる。この中間体は、（Ｓ）−ＰＥＡを使用して分割された。キラル補助の放出とその後の加水分解により、プレガバリンが、４ステップの総収率１２％、９９．８％ｅｅで得られた。この方法もやはり、効率よく再利用することができない、不要なＲ−異性体の損失を受ける。
ＩＢＧの不斉開環、およびその後の光学的に純粋なプレガバリンへの化学的変換が、別の手法を構成する。特許公開ＷＯ２００８１１８４２７は、３−イソブチル−グルタル酸無水物から始める、スキーム５において示されている（Ｓ）−プレガバリンの合成を記載しており、このスキームには、良好な収率およびｅｅ純度での、（Ｓ）−ＰＥＡによる立体選択的な開環が含まれる。これは、混合無水物手法により、アミドに変換されるものであった。このアミドにＨｏｆｆｍａｎ分解を施し、その後に２種の異なる手法でＰＥＡアミドを加水分解すると、それぞれ５９．５％および３８．８％、純度＞９９．５％でプレガバリンが形成した。
同様の方法で、米国特許公開ＵＳ２００７０２９３６９４には、１モル当量のキニジンの存在下、高収率の、メタノールによるＩＢＧの立体選択的開環が記載されたが、ｅｅは満足するものではない。後のステップには、アミド化とその後のＨｏｆｆｍａｎｎ分解が含まれる。キニジン（高価）をモル当量使用すること、およびｅｅが低いことにより、この方法は魅力あるものにはならない。
スキーム５において記載されているものと類似のさらに別の手法では、スキーム７において記載されている通り、特許公開ＷＯ２００７０３５７８９により、（Ｒ）−ＰＥＡによる３−イソブチル−グルタル酸無水物（ＩＢＧ）の立体選択的開環が記載された。このキラル補助は、低温でアルカリ金属アミドを使用してアミドにより置きかえられ、続いて、Ｈｏｆｆｍａｎｎ分解により、３ステップの総収率３２．９％で、（Ｓ）−プレガバリンが得られた。
特許公開ＷＯ２００９０８１２０８において報告されている合成が、スキーム８に示されている。ケトンがβ−ケトエステル誘導体に変換され、このケトエステル誘導体は、２種の異なる方法により、（Ｓ）−β−ヒドロキシ中間体に変換された。この第１の方法は、マウリ・イースト（ｍａｕｒｉ ｙｅａｓｔ）を触媒とするケトン還元により、収率５０％および９９％ｅｅが得られるが、第２の方法には、［（Ｓ）−Ｒｕ（ＢＩＮＡＰ）Ｃｌ2］2．ＮＥｔ3（０．０００４６当量＝０．４４％ｗ／ｗ）を用いる収率６６％および＞９９％ｅｅの水素化が含まれる。別の重要なステップは、Ｂｒ2−ＰＰｈ3を使用する、アルコールの立体反転しているブロモへの変換であり、このステップにも、クロマトグラフィーが含まれる。ブロモ化合物は、ニトロメタンおよび１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を使用して、再度、（Ｓ）−立体配置に完全に立体反転される。エステルの加水分解およびニトロの水素化により、６ステップが関与する合成が、総収率１３％、ｅｅ＞９９％で完了する。
別の酵素による経路が、プレガバリンの合成に関するスキーム９において示されており、特許公開ＵＳ２０１００２０４５０３に記載された。これには、重要なステップとして、リパーゼによる速度論的分割が関与する。イソバレルアルデヒドとシアノ酢酸エチルの縮合、その後のシアノ化により、ラセミジシアノ化合物が得られた。ニトリラーゼ（Ｎｉｔｉｌａｓｅ）酵素を使用して、（Ｓ）−シアノ酸および不要なジニトリルが得られ、このジニトリルは、再利用するため、トルエン中、ＤＢＵを用いてラセミ化された。（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルアミン塩シアノ酸の水素化により、４ステップの総収率７．７％で、約１００％ｅｅを有する（Ｓ）−プレガバリン（Ｐｒｇａｂａｌｉｎ）が得られた。最終段階において収率が非常に低いことにより、この方法は、商業的な実現可能性に乏しい。
かなり一層効率的な酵素による経路が、スキーム１０に示されており、特許公開ＵＳ２００５０２８３０２おいて記載された。この方法では、シアノ二酸ジエチルエステルを酵素により加水分解して、（Ｓ）−シアノエステル一酸カリウム塩にし、不要な異性体をラセミ化させた。一方は、この塩を還元してラクタム酸にし、次いで加水分解による脱カルボキシル化により、総収率３４％および３ステップで、ｅｅ＞９９．５％のプレガバリンとした。あるいは（Ｓ）−シアノエステル一酸カリウム塩をシアノ一酸カリウム塩に変換し、これを水素化して、３ステップの総収率３０％で、９９．７５％ｅｅを有するプレガバリンにした。この方法は、合理性のある良好な方法に見えるが、空間対時間収率を見ると、コスト効率は高くはない。
最後に、プレガバリンの不斉合成は、より長いシークエンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を必要とするか、または低いｅｅを有するプレガバリンが得られることから、ほとんどの場合、学問的に関心の持たれるプレガバリンの不斉合成に関する報告がいくつか存在する。スキーム１１において示されている、J.Org Chem., 2003, 68, 5731-34において報告されているスキームは、Ｂａｙｌｌｉｓ−Ｈｉｌｌｍａｎ縮合、およびその後のクロロギ酸エステルによるカーボネート形成を記載した。このカーボネートに、ＣＯ挿入が施された。共役ニトリルを加水分解し、ｔｅｒｔ−ブチルアミン（ｂｕｔｙａｍｉｎｅ）塩に変換し、この塩を［（Ｒ，Ｒ）−（Ｍｅ−ＤｕＰＨＯＳ）Ｒｈ（ＣＯＤ）］．ＢＦ4を用いて立体選択的にシアノ酸に水素化し、次いでＮｉによりＣＮを水素化すると、６ステップの総収率４１．５％で９９．８％ｅｅを有するプレガバリンが得られた。
スキーム１２において示されているOrg. Lett., 2007, 9, 5307-09に記載されている合成には、キラル触媒を用いる、ニトロメタンのαβ−不飽和アルデヒドへの不斉Ｍｉｃｈｅａｌ付加が含まれる。この触媒は、Ｄ−プロリンから調製する必要があり、５ステップが必要である。ステップ数はたった３ステップであるが、ｅｅは、低い方である。追加の分割を必要とする。したがって、この手法は、商業的に実現可能なものとなり得ない。
したがって、こうして上記の従来技術すべてにおいて言及した欠点に基づくと、容易にスケールアップしやすい、式（Ｉ）の化合物の調製方法を開発することが今すぐ必要である。したがって、本発明者らは、生体触媒として遺伝子修飾したニトリラーゼ（ｎｉｔｒａｌａｓｅ）酵素を使用することによる、実質的にコスト効率が高く、環境に優しい方法で、より高い収率、より高い化学純度およびキラル純度を有する、式（Ｉ）の化合物の調製方法を簡単にして、従来技術の方法に関連する課題を回避する研究に重点的に取り組んだ。
本発明の主な目的は、簡単で、経済的で、使用者に優しく、かつ商業的に実現可能な、式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供することである。
本発明の別の目的は、商業的規模で実施すること、ならびに試薬および有機溶媒の過剰使用を避けることが容易と思われる、式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供することであり、これにより、本発明を環境に優しいものにもする。
本発明のさらに別の目的は、より高い収率で、より高い化学純度およびキラル純度を有する式（Ｉ）の化合物の調製方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、式（Ｉ）の化合物の調製方法であって、反応中に形成する副生成物が再使用可能であり、これにより再利用することができる方法を提供することであり、これにより、本方法が工業的により好適なものとなる。
したがって、本発明は、
（ａ）任意に適切な溶媒中、弱酸の塩および弱塩基、または弱塩基の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを反応させて、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを得るステップ、
（ｂ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを適切なシアン化物源と反応させて、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得るステップ、
（ｃ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、適切なシアン化物源の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを、単一ステップで反応させることにより、任意に式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得てもよいステップ、
（ｄ）適切なｐＨおよび温度において、水中、または任意に有機共溶媒を含んでもよい水中、遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素（Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２）により、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩に変換するステップ、
（ｅ）適切な溶媒またはそれらの溶媒の混合物中、塩基の存在下、式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩をアルコール（Ｒ3ＯＨ）および酸性触媒、またはハロゲン化アルキル（Ｒ3Ｘ）と処理することにより、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートへと変換するステップ、
（ｆ）水もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、酵素によるエナンチオ選択的な加水分解により、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートから、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび式（Ｘ）の（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩を得るステップ、
（ｇ）有機溶媒またはその混合物中、塩基の存在下、式（Ｘ）の不要な（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸もしくはその塩、または実質的に豊富な式（Ｘ）のその（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸塩をラセミ化することにより、任意に式（ＶＩＩ）の化合物を得てもよいステップ、
（ｈ）適切なアルカリ金属塩基またはアルカリ土類金属塩基を用いるエステル基の加水分解、その後の適切な水素化触媒の存在下、水もしくは他の有機溶媒、またはそれらの混合物から選択される溶媒中、任意にワンポットで行ってもよい水素化により、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートを式（Ｉ）のプレガバリンに変換するステップ、
を含む、式（Ｉ）の化合物の調製の改善方法を提供する。
上記の方法は、以下の一般的な合成スキーム（１３）に例示されている。
次に、本発明をこれ以降に、より完全に説明する。実際に、本発明は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書において説明されている実施形態に制限されるものと解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満足するよう、提供される。本明細書および添付されている特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の指示対象を含む。語「ラセミ体」または「ラセミ混合物」とは、Ｒ鏡像異性体とＳ鏡像異性体個々の５０：５０混合物を意味する。用語「実質的に純粋なＳ鏡像異性体」とは、Ｓ鏡像異性体＞＞Ｒ鏡像異性体となる存在を示しており、優先的には、Ｓ：Ｒの比は、８５：１５〜１００：０の範囲にあるとすることができ、より好ましくはＳ：Ｒの比は、９５：５〜１００：０とすることができ、最も好ましくは、Ｓ：Ｒの比は、９９：１〜１００：０とすることができる。用語「Ｒが豊富な鏡像異性体」とは、Ｒ鏡像異性体＞＞Ｓ鏡像異性体となる存在を示しており、優先的には、Ｒ：Ｓの比は７０：３０〜１００：０の範囲にあるとすることができる。
本目的によれば、本発明は、酵素による選択的な立体特異的な合成手法による、式（Ｉ）の化合物の調製方法の改善を実現する。
したがって、本発明の一実施形態では、ステップ（ａ）において使用される前記有機弱酸は、好ましくは、安息香酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、酢酸などからなる群から選択される。ステップ（ａ）において使用される前記弱塩基は、好ましくは、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチル（ｄｉｉｓｉｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌ）アミン、ピリジン、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンなどからなる群、より好ましくはジイソプロピルエチルアミン、ピペリジンからなる群から選択される。ステップ（ａ）における前記塩は、好ましくは、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、安息香酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、酢酸アルキルアンモニウムなどからなる群、より好ましくは酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムからなる群から選択される。
ステップ（ａ）において開示されている式（ＩＶ）の粗製化合物はそのまま使用することができ、または当業者によって十分に理解されている異なる技法による蒸留によって精製することができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｃ）の前記適切なシアン化物源は、好ましくは、シアン化リチウム、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化トリメチルシリルなどからなる群、より好ましくはシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムからなる群から選択される。本発明の別の実施形態では、ステップ（ｂ）の反応において、適切なシアン化物源は、１〜５０％過剰に使用してもよい。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ａ）における前記有機溶媒は、好ましくは、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロヘキサン、トルエン、およびそれらの混合物からなる群、より好ましくはシクロヘキサンまたはトルエンからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、前記ステップ（ａ）およびステップ（ｃ）の反応は、好ましくは周囲温度から還流温度で、より好ましくは還流温度で実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）における前記有機溶媒は、好ましくは、水、エチルアルコール、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロヘキサンなどからなる群から選択され、より好ましくは、溶媒は、メチルアルコール、もしくはエチルアルコール、もしくは水、またはそれらの混合物である。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｂ）の反応は、好ましくは、４５℃〜１２０℃の間、より好ましくは４５℃〜１１０℃の間の温度範囲で実施され、最も好ましくは、メタノールの還流温度から水の還流温度において実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｄ）における前記遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素は、Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２である。本発明では、本発明者らは、前記酵素を用いて、驚くほどの選択性、条件の改善、より高い収率、廃棄物の最小化を伴い、したがって、その結果、式（Ｉ）の化合物を調製する環境に優しい化学を推進する、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルの式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩への転換を達成しようとした。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｄ）における化合物（ＶＩ）を調製するための式（Ｖ）の化合物の投入量は、好ましくは、水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり３０〜３００ｇから、より好ましくは、水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり５０〜２００ｇから、最も好ましくは水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり６０〜１５０ｇから選択することができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｄ）において化合物（ＶＩ）を調製するための、前記遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素（Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２）の投入量は、好ましくは、化合物（Ｖ）１ｇあたり４〜２５Ｕから選択することができ、より好ましくは、化合物（Ｖ）１ｇあたり６〜２０Ｕ使用することができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｄ）における式（ＶＩ）の化合物の調製中に、溶液のｐＨは７．２±０．８の範囲、最も好ましくは７．０±０．５の範囲に維持され、適切な緩衝液により維持することができ、当分野において周知である。実現するための最も好ましい方法の１つは、リン酸もしくは酢酸緩衝液を使用するか、または酢酸、クエン酸、酒石酸、塩酸、硫酸、リン酸などから選択される適切な酸を添加することによりｐＨを維持することであり、最も好ましい酸は塩酸、ならびに／またはアンモニア、モノ、ジおよびトリアルキルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどからなる群から選択される塩基であり、最も好ましい塩基は炭酸水素ナトリウムである。
本発明の別の実施形態では、基質は、ステップ（ｄ）における前記酵素の投入前に、微細化により、または当業者により周知の分散安定剤を使用して、十分に分散させることができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｄ）の反応は、好ましくは、２５℃〜４０℃の間、より好ましくは２８℃〜３８℃の間の温度範囲、最も好ましくは３０℃〜３７℃の間の温度範囲で実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｅ）における前記アルコール（Ｒ3ＯＨ）は、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、シクロペンタノール、シクロヘキサノールなどからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｅ）における前記ハロゲン化アルキル（Ｒ3Ｘ）は、好ましくは、ヨウ化メチル、塩化エチル、臭化エチル、ヨウ化エチル、臭化ｎ−プロピル、塩化イソプロピル、臭化イソプロピルなどからなる基Ｃ1からＣ5ハロゲン化アルキルから選択される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｅ）における前記酸触媒／または試薬は、好ましくは、塩酸、硫酸、塩化チオニル、塩化トリメチルシリル、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ルイス酸、または当分野で周知の強酸性スルホン化樹脂からなる群から選択され、最も適切な触媒および／または試薬は、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、塩化トリメチルシリルなどから選択される。
本発明の別の実施形態では、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製中、これをステップ（ｅ）において蒸留することにより精製してもよい。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における前記酵素によるエナンチオ選択的な加水分解は、エステラーゼ、リポラーゼ、リパーゼなどの市販の加水分解酵素を使用することにより実施される。前記加水分解酵素は、好ましくは、カンジダ・アンタルクチカ（ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）Ａ、カンジダ・アンタルクチカＢ１、カンジダ・アンタルクチカＢＹ２、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ製のＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５、リゾムコル・メイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｅｉｈｅｉ）、サーモマイセス・ランギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｈｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・ケペシア（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐｅｃｉａ）、Ｒｅｓｉｎａｓｅ ＨＴ、Ｌｉｐｅｘ １００Ｌ、枯草菌（Ｂａｓｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、リパーゼ３．１０１、リパーゼ３．１０２、リパーゼ３．１０４、リパーゼ３．１０５、リパーゼ３．１０６、リパーゼ３．１０７、リパーゼ３．１０８、リパーゼ３．１０９、リパーゼ３．１１１、リパーゼ３．１１５、リパーゼ３．１１３、リパーゼ３．１１７、リパーゼ３．１３６、ＡＹＳ Ａｍｉｎｏ、ＡＳ Ａｍａｎｏ、ＰＳ ＡｍａｎｏＳＤ、ＡＫ Ａｍａｎｏなどからなる群から選択され、最も好ましい酵素は、カンジダ・アンタルクチカＢ１、カンジダ・アンタルクチカＢＹ２、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５である。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における好ましい酵素の投入量は、基質に比べて、＞０．１％〜＜５％ｗ／ｗの範囲にあり、より好ましくはその範囲は、基質に比べて０．５％〜４％ｗ／ｗであり、最も好ましくは、その範囲は、基質と比べて、１．０％〜３％ｗ／ｗである。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における好ましい酵素は、回収されて、ほとんど完全な酵素活性が保たれている間、数回再使用することができ、その活性が乏しい場合、酵素の再利用中、追加量の新しい酵素を添加することができ、またその追加量は、初期酵素投入量に対して５％〜５０％ｗ／ｗの範囲、より優先的には初期酵素投入量に対して５％〜２５％ｗ／ｗの範囲とすることができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における前記有機溶媒は、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、アセトン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシドなどからなる群から選択され、より好ましくは、溶媒は、水、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、またはそれらの混合物である。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における式（ＶＩＩＩ）の化合物の調製中に、酢酸、クエン酸、ホウ酸、エチレンジアミン四酢酸、塩酸、硫酸、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、またはそれらの適切な組合せ物からなる群から選択される適切な試薬を使用することにより、好ましくは溶液の初期ｐＨは７．５±０．５の範囲、最も好ましくは７．２±０．２の範囲に保持される。この適切な試薬量の選択は、反応の完了後の最終ｐＨが８．５を超えないように、選択することができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの実質的に光学的に純粋な（Ｓ）−エステル（ＶＩＩＩ）への変換では、反応の進行中の反応混合物のｐＨは、好ましくは、７〜９の範囲でゆっくりと向上させることができ、最も好ましくは、ｐＨは、最大≧７．５〜≦８．５まで向上させることができる。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｆ）における式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの実質的に光学的に純粋な（Ｓ）−エステル（ＶＩＩＩ）への変換では、酵素によるステップは、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどからなる群から選択することができる塩の存在下で行ってもよく、または適切な酸と適切な塩基の中和により、インサイチュで生成させることができる。
本発明の別の実施形態では、酵素によるステップ（ｆ）は、好ましくは、２０℃〜４５℃の間、より好ましくは２２℃〜４０℃の間の温度範囲、最も好ましくは２５℃〜３５℃の間の温度範囲で実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｇ）における前記有機溶媒は、好ましくは、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、三級ブチルアルコール、シクロヘキサノール、トルエン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアミン、ジメチルスルホキシド、スルホランなどからなる群から選択される。
本発明の一実施形態では、ステップ（ｇ）において使用される前記塩基は、好ましくは、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、Ｃ1からＣ6アルコキシドなどからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、前記酵素によるステップ（ｇ）は、好ましくは、２５℃〜２００℃の間の温度範囲で１〜６０時間、より好ましくは５０℃〜１８０℃の間の温度範囲で２〜２４時間、実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｈ）における加水分解のための塩基は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、Ｃ1からＣ5四級水酸化アンモニウムなどから選択される、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物から選択される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｈ）において、式（Ｉ）のプレガバリンの前記調製は、構造（ＶＩＩＩ）の化合物をインサイチュで加水分解するステップ、その後の接触水素化を行うステップを含み、加水分解のための塩基強度は、０．１Ｎ〜５Ｎ、より好ましくは０．３〜３Ｎ、最も好ましくは０．５Ｎ〜２Ｎから選択され得る。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｈ）における前記有機溶媒は、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、三級ブチルアルコール、シクロヘキサノール、トルエン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、またはそれらの組合せ物からなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、前記適切な水素化触媒は、好ましくは、担体を含むまたは含まないニッケル、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、ならびにそれらの異なる化学形態およびグレード、新しい触媒もしくは回収触媒、または新しい触媒と回収触媒の混合物でもよいものからなる群から選択され、最も好ましい触媒は、ニッケルおよびパラジウムである。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｈ）は、好ましくは、１０℃〜１００℃の間、より好ましくは１５℃〜６０℃の間の温度範囲、最も好ましくは２５℃〜５０℃の間の温度範囲で実施される。
本発明の別の実施形態では、ステップ（ｈ）における接触水素化は、好ましくは、０．５〜２５ｋｇ／ｃｍ2または等価な単位の範囲の水素圧、２〜１５ｋｇ／ｃｍ2または等価な単位の範囲の好ましい水素圧を用いて実施され、最も好ましい圧力範囲は、３〜１０ｋｇ／ｃｍ2である。
本発明のさらに別の実施形態では、式（Ｉ）のプレガバリンの調製は、水素化生成物を活性炭処理（ｃｈａｒｃｏａｌｉｚａｔｉｏｎ）してもよいステップ、および好ましくは６．９〜７．３のｐＨ範囲、より好ましくはｐＨ７〜７．２において等電点電気泳動によりプレガバリンを単離するステップ、および水、Ｃ1からＣ5アルコール、またはそれらの混合物から粗製物を結晶化するステップを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、式（Ｉ）のプレガバリンの調製は、等電点電気泳動によりプレガバリンを単離するステップであって、ｐＨを任意の無機酸または有機酸（塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸など）を用いて調節することができ、最も好ましい酸は、塩酸または酢酸である、ステップを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、式（Ｉ）のプレガバリンの調製は、水、Ｃ1からＣ5アルコール、またはそれらの混合物から粗製物を結晶化することによりプレガバリンを精製するステップ、および乾燥母液の再結晶により、さらなる量の純粋な式（Ｉ）のプレガバリンを回収するステップを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、式（Ｉ）のプレガバリンの調製は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、カルボキシベンジル、トリチルなどの当分野で公知のアミノ保護誘導体として、母液から式（Ｉ）のプレガバリンを代替的に回収するステップをさらに含んでおり、より好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを使用して、その後に、適切な溶媒中、酸により処理することによりｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の除去を行うことができる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、本発明の範囲を決して限定するものと解釈すべきではない。
（例１．１）２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステルの調製
機械式撹拌器、ディーン−スターク凝縮器を装備した３リットルの４つ口ＲＢＦ中に、撹拌下、室温で、シアノ酢酸メチル（３００．０ｇ）、イソバレルアルデヒド（２７３ｇ、１．０５当量）、およびシクロヘキサン（２１０ｍｌ、０．７Ｖ）を添加し、続いて滴下漏斗により、シクロヘキサン（９０ｍｌ、０．３Ｖ）中のピペリジン（２．７ｇ、０．０１当量）を添加した。発熱反応が観察された（温度は、２２℃から５８℃まで上昇する）。反応混合物を還流し、２時間でディーン−スタークから共沸により水を集めた（５５ｍｌ）。反応の終了後、蒸留装置を設置し、５０℃で真空ラインを適用することにより、ＲＭからシクロヘキサン２６０ｍｌを留去した。この反応混合物を３０℃に冷却すると、ＧＣによる純度が９５．９０％を有する所望の化合物５１５ｇｍ（理論収量の＞１００％）が得られ、この物質を次のステップにそのまま使用した。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 0.98(d, 6H), 1.92 (m, 1H), 2.45 (t, 2H), 3.88 (s, 3H), 7.68 (t, 1H).
（例１．２）２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステルの調製
機械式撹拌器、ディーン−スターク凝縮器を装備した３リットルの４つ口ＲＢＦ中に、撹拌下、室温で、シアノ酢酸メチル（３００．０ｇ）、イソバレルアルデヒド（２７３ｇ、１．０５当量）、およびシクロヘキサン（２１０ｍｌ、０．７Ｖ）を添加し、続いて滴下漏斗により、シクロヘキサン（９０ｍｌ、０．３Ｖ）中のピペリジン（２．７ｇ、０．０１当量）を添加した。発熱反応が観察された（温度は、２２℃から５８℃まで上昇する）。この反応混合物を還流して、３．５時間でディーン−スタークから共沸により水を集めた（５５ｍｌ）。ＧＣによる純度９３．７６％を有するｄ５１０ｇｍ（理論収量の１００．８％）およびこの物質を真空下での蒸留により精製すると、所望の化合物が４１４．７８ｇ（８１．３３％；ＧＣ９７．２％による純度）および別の豊富なフラクション５３．７ｇ（１０．５３％、ＧＣ純度９０．０３％）が得られ、後者は、次のバッチ用に再利用することができる。
（例１．３）２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステルの調製
機械式撹拌器、および滴下漏斗を装備した１００ｍｌの２つ口ＲＢＦ中に、撹拌下、室温で、シアノ酢酸メチル（５．０ｇ）、イソバレルアルデヒド（４．３５ｇ、１．０当量）、およびシクロヘキサン（３．５ｍｌ、０．７Ｖ）を添加し、続いて滴下漏斗により、シクロヘキサン（１．５ｍｌ、０．３Ｖ）中のピペリジン（０．０４３ｇ、０．０１当量）を添加した。発熱反応が観察された（温度は、２２℃から５８℃まで上昇する）。この反応混合物を周囲温度で撹拌した（２５〜３０℃で３時間）。反応の終了後、この反応混合物を水により洗浄した。無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水してもよかった。溶媒を蒸留によって除去し、残さを真空下で乾燥すると、ＧＣによる純度が９３．７６％を有する所望の化合物５１０ｇｍ（理論収量の１００．８％）が得られ、この物質を真空下で蒸留することにより精製すると、８．５ｇ（＞１００％、ＧＣによる純度９１．５）得られた。
（例２．１）２−イソブチルスクシノニトリル（Ｖ）の調製
油浴上の、機械式撹拌器、温度計用ポケット、ディーン−スターク凝縮器を装備した、２リットルの４つ口ＲＢＦ中に、２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステル（２００．０ｇ、ＧＣ純度９７．２％）を入れ、次いで水（２００ｍｌ、１．０Ｖ）を添加した。得られた乳状の反応混合物に、シアン化ナトリウム（５８．６１ｇ、１．０当量）の水溶液（４００ｍｌ、２．０Ｖ）を１５分間で滴下添加した。添加中、２２から４１℃への温度上昇が観察された。添加が終了した後、この反応混合物を９２℃で３時間、加熱した。この反応混合物を３０℃に冷却した。有機層を除去し、水により洗浄した（２００ｍｌ）。化合物Ｖの重量は９６．０ｇであり、ＧＣによる純度は９６．０８％であった。水層を合わせ、９２℃で４時間、再度加熱した。水層をＭＴＢＥにより抽出した。有機層を水層から分離し、水２００ｍｌ（１．０Ｖ）により洗浄した。化合物Ｖの重量は、２０．０ｇであった（２番目の収穫物；ＧＣによる純度は９７．１４％）。水層を合わせ、ＭＴＢＥ（４００ｍｌ）により抽出した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水する。溶媒を蒸留した。化合物Ｖの重量は、１９．０ｇであった（３番目の収穫物；ＧＣによる純度は９１．５％）。化合物Ｖの粗製重量の合計は、１３５ｇ（収率８２．８７％）であった。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 2.981 (1H, m), 2.712 (2H, d), 1.875 (1H, m), 1.816 (1H, m), 1.530 (1H, m), 1.016 (3H, d), 0.981 (3H, d).
（例２．２）１リットルの丸底フラスコ中で、例１．１において得られた２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステル（１００ｇ）をＭｅＯＨ（２００ｍｌ、２Ｖ）に溶解し、シアン化ナトリウム（２９．３ｇ、１．０当量）の水溶液（１００ｍｌ、１Ｖ）を約１時間で滴下添加した。発熱が観察され、最大４２℃となった。添加の終了後、下方蒸留器（ｄｏｗｎｗａｒｄ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）を据え付け、反応物の温度が９５℃に到達するまで、反応物からメタノールを留去した。約９５℃で３時間加熱を続ける。メタノールの蒸留後、固体が沈殿し始めた。この反応混合物を３０℃に冷却した。固体物質の懸濁が観察された。水（１５０ｍｌ、１．５Ｖ）を添加してこの懸濁液を崩すと、濁りのない２つの層が得られた。有機層を水層から分離し、水（１００ｍｌ）により洗浄した。化合物Ｖの重量は、６４ｇであった（収率７８．５％、ＧＣによる純度は９４．８６％）。
（例２．３）３リットルの丸底フラスコ中で、例１．１において得られた、２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステル（５１５ｇ）をＭｅＯＨ（４２０ｍｌ）に溶解し、シアン化ナトリウム（１４７ｇ、１．０当量）の水溶液（６３０ｍｌ、２．１Ｖ）を約３０分間で滴下添加した。発熱が観察され、最大４５〜５０℃となった。添加の終了後、下方蒸留器を据え付け、反応物の温度が９５℃に到達するまで、反応物からメタノールを留去した。約９５℃で１時間加熱を続ける。メタノールの蒸留後、固体が沈殿し始めた。この反応混合物を３０℃に冷却した。固体物質の懸濁が観察された。水（５００ｍｌ、１．６Ｖ）を添加して懸濁液を崩すと、濁りのない２つの層が得られた。有機層を水層から分離し、水（３００ｍｌ）により洗浄した。化合物Ｖの重量は３８９．７ｇであった（１番目の収穫物）。水層を一緒に合わせて、ＭＴＢＥ（５００ｍｌ）により抽出した。ＭＴＢＥ層を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水してもよかった。ＭＴＢＥの蒸留後、９．０ｇ（２番目の収穫物）の化合物Ｖが得られた。化合物Ｖの粗製重量の合計は、４０１ｇである（収率９７．２４％、ＧＣによる純度は９２．１％）。この粗製物を１００〜１０４℃／２．０〜２．５ｔｏｒｒを得る蒸留によりさらに精製すると、ＧＣ純度が＞９８％の純粋な生成物が３３８ｇ（８２％）得られ、別の約８〜１０％の不純物を含むフラクションを約９０％の純度で集めた、これを、その後の蒸留のために再利用することができる。
（例２．４）２リットルの丸底フラスコ中で、例１．１において得られた、２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸メチルエステル（１００ｇ）を水（１００ｍｌ、１Ｖ）と共に撹拌し、シアン化ナトリウム（２９．４ｇ、１．０当量）の水溶液（２００ｍｌ、２Ｖ）を約１５分間で滴下添加した。発熱が観察され、最大３０℃になった。添加が終了した後、この反応混合物を８９〜９２℃で１０時間、還流する。この反応混合物を３０℃に冷却した。有機層を水層から分離し、水（１００ｍｌ）により洗浄した。化合物Ｖの重量は６８．５ｇであった（１番目の収穫物）。水層を一緒に合わせて、ＭＴＢＥ（２００ｍｌ）により抽出した。ＭＴＢＥ層を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で脱水してもよかった。ＭＴＢＥの蒸留の後、２．５ｇ（２番目の収穫物）の化合物Ｖが得られた。化合物Ｖの粗製重量の合計は、７０ｇである（収率８７．１２％、ＧＣによる純度は９６．８８％）。
（例２．５）設置した反応装置は、油浴上の、５００ｍｌの４つ口ＲＢＦ、機械式撹拌器、および温度計用ポケットからなる。シアノ酢酸メチル５０ｇ（０．５０５ｍｏｌ）およびイソバレルアルデヒド４３．４ｇ（０．５０５ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解した。シアン化ナトリウムのシアン化ナトリウム（２４．５２ｇ、０．５０５ｍｏｌ）の水溶液８０ｍｌを、撹拌下でゆっくりと添加した（発熱が観察され、最大約２５〜５４℃になった）。追加の水（２０ｍｌ）を使用して、滴下漏斗をすすいだ。反応混合物を７４〜７６℃（還流温度）で加熱し、３時間維持した。還流凝縮器を取り外した後、下方蒸留の組み立て物を取り付け、下方蒸留を開始し、反応物の温度が９５℃に到達するまで、反応物からメタノールを除去した。この反応混合物をこの温度で５．０時間、維持した。この反応混合物を室温までゆっくり冷却した。生成物の上部の油状層を分離し、水により洗浄した（５０ｍｌ×２）。この油状物の重量は、５８．０ｇであった（収率、８４．４０％、ＧＣによる純度は９８．６３％）。水層をすべてまとめ、ＭＴＢＥ（５０ｍｌ×２）により抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、真空下、４０℃で蒸発させると、２番目の収穫物が３．０ｇ得られた（収率４．３６％、ＧＣにより９６．３２％）。合わせた収率は、８８％であった。
（例２．６）設置した反応装置は、油浴上の、１０００ｍｌの４つ口ＲＢＦ、機械式撹拌器、および温度計用ポケットからなる。シアノ酢酸メチル（１００．０ｇ）およびイソバレルアルデヒド（８６．９２ｇ）を水１００ｍｌに添加した。撹拌下、上記の混合物に、シアン化ナトリウム（４９．５ｇ、１．０当量）の水溶液（２００ｍｌ）を３０分間、滴下添加した。下方蒸留の組み立て物を設置し、反応物の温度が＞９０℃に到達するまで、反応物からメタノールの留去を始めた。反応物を、さらに１２時間、９０〜９８℃の範囲の温度に維持する。この反応混合物を３０℃に冷却した。有機層を水層から分離し、水２００ｍｌにより有機層を洗浄した。化合物Ｖの重量は、１３０ｇであった（収率９４．０％、ＧＣ分析による純度９５．８１％）。
（例２．７）油浴上に、機械式撹拌器および温度計用ポケットを装備した、２Ｌの４つ口ＲＢＦ中、２５℃で、シアノ酢酸メチル（２００ｇ、１当量）およびイソバレルアルデヒド（１７３．８４ｇ、１．０当量）をＭｅＯＨ（２００ｍｌ、１．０Ｖ）に溶解した。シアン化ナトリウム（９８．９０ｇ、１．０当量）の水溶液４００ｍｌ（２．０Ｖ）を１．５時間かけて、２５℃で滴下添加した。反応物を８０℃で３時間加熱し、ＧＣによりシアノ酢酸メチルの消費を確認した。下方蒸留の組み立て物を取り付け、３時間、反応物の温度が９２℃に到達するまで、反応物からメタノールを留去した。次に、反応物が固体になる。固化を回避するため、水２００ｍｌ（１Ｖ）を添加した。この反応混合物をさらに５時間、９２〜９４℃の間に維持した。形成した有機層を水層から分離した。有機層を水２００ｍｌ（１．０Ｖ）により洗浄した。化合物Ｖの重量は、２４０ｇ（収率８７．３０％）であり、ＧＣ純度は９６．８９％であった。ＭＴＢＥ（２×２００ｍｌ）を使用して、水層を抽出した。このＭＴＢＥ層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥを蒸留すると、ＧＣ純度７５．０％を有する、生成物Ｖが５．３ｇ得られた。この粗製化合物Ｖ（２４５．３ｇ）を高真空下、蒸留により精製すると、ＧＣによる純度９９．２６％を有する、２３４．２ｇ（８５．２％）の精製化合物Ｖが得られた。
（例３．１）ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（ＶＩ）の調製
１リットルの４つ口ＲＢＦは、機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーター用プローブを装備した。室温（２５℃）で、このフラスコに粗製化合物Ｖ（５０．０ｇ）および水６６６ｍｌ（１３．３Ｖ）を添加した。固体のＮａＨＣＯ3を使用して、溶液のｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に温め、この反応混合物にニトリラーゼ酵素調製物（４．０ｍｌ、比活性２３０Ｕ／ｍｌ）を添加した。ｐＨを約７．５に保持することにより、この反応混合物を３０℃で２４時間撹拌した。２４時間後、この反応混合物を２５℃にした。反応物をＭＴＢＥ（１５０ｍｌ）により抽出し、１５０ｔｏｒｒ下、４５℃で蒸発させた後、０．５ｇの未反応出発原料が回収された。濃ＨＣｌ（約５０ｍｌ）を添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１．０にした。水層をＭＴＢＥ（２×１５０ｍｌ）により抽出した。合わせたＭＴＢＥ層は、硫酸ナトリウムで脱水してもよかった。ＭＴＢＥ層を蒸発させると、化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が５４ｇ（収率９４．７８％；ＧＣによる純度９４．４０％）得られた。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.048 (1H, m), 2.768 (1H, dd), 2.615 (1H, dd), 1.883 (1H, m), 1.674 (1H, m), 1.368 (1H, m), 0.998 (3H, d), 0.978 (3H, d).
（例３．２）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、５Ｌの４つ口ＲＢＦ中に、２５℃で、化合物Ｖ（２００．０ｇ、１．０当量）および水２６６０ｍｌを入れた。固体のＮａＨＣＯ3を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３５°±２℃に温め、この反応混合物にニトリラーゼ酵素（１６．０ｍｌ、比活性２３０Ｕ／ｍｌ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３５°±２℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２３時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物ＩＩＩ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。この反応物をＭＴＢＥ（２×３００ｍｌ）により抽出し、減圧下、４５℃で濃縮すると、未反応出発原料（１．０ｇ）が回収された。濃ＨＣｌ（２００ｍｌ）を添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。ＭＴＢＥ（３×４００ｍｌ）により水層を抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度９１．０７％を有する化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が２１８．１ｇ（９５．６９％）得られた。
（例３．３）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、２５０ｍｌの４つ口ＲＢＦ中に、化合物Ｖ（１０．０ｇ、１．０当量）、水１００ｍｌ（１０Ｖ）、およびＭｅＯＨ５ｍｌ（０．５Ｖ）を３０℃で入れた。固体のＮａＨＣＯ3を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に維持し、この反応混合物にニトリラーゼ酵素（０．７６ｍｌ、比活性３００Ｕ／ｍｌ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３０℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２３時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物Ｖ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。この反応物をＭＴＢＥ（２×２５ｍｌ）により抽出し、減圧下、４５℃で濃縮すると、未反応出発原料（３．９ｇ）が回収された。濃ＨＣｌを添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。水層を、ＭＴＢＥ（２×４０ｍｌ）により抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度７７．８２％を有する化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が６．５ｇ（５７．５２％）得られた。
（例３．４）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、２５０ｍｌの４つ口ＲＢＦ中に、化合物Ｖ（１０．０ｇ、１．０当量）、水５０ｍｌ（５Ｖ）を３０℃で入れた。固体のＮａＨＣＯ3を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に維持し、この反応混合物にニトリラーゼ酵素（０．７６ｍｌ、比活性３００Ｕ／ｍｌ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３０℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２３時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物Ｖ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。反応物を、ＭＴＢＥ（２×２５ｍｌ）により抽出した。濃ＨＣｌを添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。水層を、ＭＴＢＥ（２×４０ｍｌ）により抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度７５．１２％を有する化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が３．８ｇ（３３．６２％）得られた。
（例３．５）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、５００ｍｌの４つ口ＲＢＦ中に、化合物Ｖ（２５．０ｇ、１．０当量）、水３３２．５ｍｌ（１３．３Ｖ）を３０℃で入れた。固体のＮａＨＣＯ3（１．１７ｇ）を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に維持し、この反応混合物にニトリラーゼ酵素（２．７ｍｌ、比活性３００Ｕ／ｍｌ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３０℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２３時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物Ｖ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。ＭＴＢＥ（２×２５ｍｌ）により反応物を抽出した。濃ＨＣｌを添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。ＭＴＢＥ（２×４０ｍｌ）により、水層を抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度７８．３％を有する化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が２５．６ｇ（８９．９８％）得られた。
（例３．６）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、５００ｍｌの４つ口ＲＢＦ中に、化合物Ｖ（２５．０ｇ、１．０当量）、水３３２．５ｍｌ（１３．３Ｖ）を３０℃で入れた。固体のＮａＨＣＯ3（１．１７ｇ）を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に維持し、この反応混合物にニトリラーゼ酵素（３．３７ｍｌ、比活性３００Ｕ／ｍｌ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３０℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２３時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物Ｖ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。反応物を、ＭＴＢＥ（２×２５ｍｌ）により抽出した。濃ＨＣｌを添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。ＭＴＢＥ（２×４０ｍｌ）により、水層を抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度８４．７３％を有する化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が２６．６ｇ（９３．７５％）得られた。
（例３．７）機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーターを装備した、５００ｍｌの４つ口ＲＢＦ中に、化合物Ｖ（２５．０ｇ、１．０当量）、水２５０ｍｌ（１０Ｖ）、およびＭｅＯＨ１．２５ｍｌを３５℃で入れた。固体のＮａＨＣＯ3（１．７５ｇ）を使用して、ｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３５℃に維持し、この反応混合物に粉末ニトリラーゼ酵素（１．７５ｇ、比活性３００Ｕ／ｍｌ、１６．２ｕ／ｇ）を添加した。この反応混合物を、ｐＨ７．５±０．２に維持することにより、３５℃で２４時間撹拌した（必要な場合、固体のＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することによりｐＨを調節する）。反応を２４時間後にＧＣによりモニターした（未反応化合物Ｖ≦１％）。この反応混合物を２５℃に冷却し、反応物をろ過した。ＭＴＢＥ（２×２５ｍｌ）により反応物を抽出した。ＭＴＢＥ層を蒸発させると、化合物Ｖが４．５ｇ（１８％）回収された。濃ＨＣｌを添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１〜２にした。水層を、ＭＴＢＥ（２×４０ｍｌ）により抽出した。ＭＴＢＥ層を硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４５℃でＭＴＢＥ層を蒸留すると、ＧＣによる純度９７．８２％の化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が２０．５ｇ（７１．９２％）得られた。
（例３．８）３０リットルの反応器に、９．０ｋｇの水を２５℃〜３５℃で投入した。清浄なＨＤＰＥ容器に、水１０．９９リットルおよび化合物Ｖ１．５００ｋｇ（１．０当量）を２５℃〜３５℃で投入し、３０分間、微細化した。微細化後、微細小球の形成が観察され、反応器に移送した。固体のＮａＨＣＯ3（約３０．０ｇｍ）を使用して、この混合物のｐＨを７．５±０．２に調節した。反応物の温度を３５±２℃にし、ニトリラーゼ酵素１２９．２６ｇｍ（比活性、０．２３５ｋＵ／ｍＬ）を１回で投入した。酵素の容器を水０．２Ｖによりすすぎ、反応器に投入した。固体のＮａＨＣＯ3を使用することにより、反応物のｐＨを７．５±０．２に調節した。炭酸水素ナトリウム溶液または希塩酸を添加することによりｐＨ７．５±０．２を維持することによって、この反応混合物を３５±２℃で１４．０時間、撹拌した。化合物Ｖが＜１％になるまで、反応を継続する。真空下、ブフナーろ過器を使用することにより、反応器から反応物をろ過する。ろ液を反応器に投入し、濃塩酸および（約１．５６ｋｇ）を使用することにより、ｐＨを１〜２に調節する。このろ液を、ＭＴＢＥ（３×３．０リットル）により抽出した。減圧下、４５℃および４００〜１０ｔｏｒの真空でＭＴＢＥ層を濃縮すると、９０．３％のアッセイ基準とする収率で化合物ＶＩが得られた。
（例４．１）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
磁気撹拌器上に、安全管を取り付けた還流凝縮器を有する磁針を装備した、１００ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（５ｇ）をＭｅＯＨ（５０ｍｌ、１０．０Ｖ）に溶解し、０〜５℃に冷却し、次いで、塩化チオニル（４．５９ｇ；１．２当量）を室温で滴下添加した。この得られた溶液を室温で１６時間撹拌した。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（２５ｍｌ）により希釈し、酢酸エチル（１５×３ｍｌ）により抽出した。有機層を飽和炭酸水素塩溶液（５ｍｌ×３）およびブライン（５ｍｌ）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると３．８ｇ（ＧＣによる収率６９．７％〜８５％）得られた。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 3.746 (3H), 3.082 (1H, m), 2.723 (1H, dd), 2.571 (1H, dd), 1.882 (1H, m), 1.655 (1H, m), 1.352 (1H, m), 0.974 (3H, d), 0.958 (3H, d).
（例４．２）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
磁気撹拌器上に、磁針、および安全管を取り付けた還流凝縮器を装備した、２５０ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（９．０ｇ）をＭｅＯＨ（９０ｍｌ、１０．０Ｖ）に添加し、０〜５℃に冷却し、次いで、塩化トリメチルシリル（６．２９ｇ、１．０当量）を０〜５℃で５分間、滴下添加した。この得られた溶液を室温で４８時間撹拌した。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（５０ｍｌ）により希釈し、酢酸エチル（２０×３ｍｌ）により抽出した。有機層を飽和炭酸水素塩溶液（５ｍｌ×３）およびブライン（５ｍｌ）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると化合物ＶＩＩ（Ｒ3＝メチル）が９ｇ（収率９１．７％およびＧＣによる純度９７．２％）得られた。
（例４．３）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
磁気撹拌器上に、安全管を取り付けた還流凝縮器を有する磁針を装備した、２Ｌの１つ口ＲＢＦを設置した。２５℃で、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（１５０ｇ）、次いでＨ2ＳＯ4１２ｇ（０．１２当量）をＭｅＯＨ（７５０ｍｌ）に添加した。還流温度（６８℃）で１時間、この反応物を撹拌する。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（７５０ｍｌ）により希釈し、酢酸エチル（１５０×３ｍｌ）により抽出した。有機層を飽和炭酸水素塩溶液（１００ｍｌ×２）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると化合物ＶＩＩ（Ｒ3＝メチル）が１５５．５ｇ（収率９５％、ＧＣによる純度＞９６％）得られた。
（例４．４）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
オーバーヘッド型撹拌器および安全管を取り付けた還流凝縮器を装備した２Ｌの２つ口ＲＢＦを設置した。２５℃で、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（４４３ｇ）、次いでＨ2ＳＯ4（３５．４４ｇ、０．１２当量）をＭｅＯＨ（２２１５ｍｌ、５．０Ｖ）に溶解した。還流温度（６８℃）で１時間、反応物を撹拌する。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（２０００ｍｌ）により希釈し、酢酸エチル（３００×３ｍｌ）により抽出した。有機層を飽和炭酸水素塩溶液（１００ｍｌ×２）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると化合物Ｖ（Ｒ3＝メチル）が４５９．１ｇ（収率９５％、ＧＣによる純度＞９７．６２％）得られた。この物質を真空下で蒸留すると、化合物ＶＩＩが収率８５．５２％、ＧＣアッセイ＞９９．５％で得られた。
（例４．５）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
オーバーヘッド型撹拌器および安全管を取り付けた還流凝縮器を装備した、２Ｌの２つ口ＲＢＦを設置した。２５℃で、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（４１０ｇ）、次いでＨ2ＳＯ4（３２．８ｇ、０．１２当量）をＭｅＯＨ（２０５０ｍｌ）に溶解した。還流温度（６８℃）で１時間、反応物を撹拌する。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（２０００ｍｌ）により希釈し、トルエン（３００ｍｌ×３）により抽出した。有機層を水（３００ｍｌ）、次いで飽和炭酸水素塩溶液（１００ｍｌ×２）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると化合物Ｖ（Ｒ3＝メチル）が４２５．６ｇ（収率９５．２％、ＧＣによる純度＞９５．５９％）得られた。この物質を真空下で蒸留することによりさらに精製すると、化合物ＶＩＩが収率８６．１８％、ＧＣアッセイ＞９９．８％で得られた。
（例４．６）メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
乾燥した清浄な３０リットルの反応器に、撹拌下、２５〜３０℃で、ＭｅＯＨ（５．４３リットル）およびラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（１．８１ｋｇ）を投入した。２５〜３０℃で、シアノ酸の容器をＭｅＯＨ（１．８１リットル）によりすすぎ、反応器に移送し、次いでＨ2ＳＯ4（０．１４５ｋｇ、シアノ酸に対して８％）を移送した。還流温度（６５〜６８℃）で１時間、反応物を撹拌する。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（９．０５リットル）により希釈し、トルエン（１．８１リットル×３ｍｌ）により抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素塩溶液（１．８１リットル×２）により洗浄した。４０〜４５℃で蒸留してトルエンを除去すると、化合物ＶＩＩ（Ｒ3＝メチル）が４２５．６ｇ（収率９５．２％、ＧＣによる純度＞９５．５９％）得られた。薄膜蒸発器を使用する蒸留により、この物質をさらに精製すると、化合物ＶＩＩが、ＧＣアッセイ＞９６．１４％を有する純度に基づくと、収率７９．１８％で得られた。
（例４．７）シアノ酢酸メチルから始める、メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
油浴上に、機械式撹拌器および温度計用ポケットを装備した、１Ｌの４つ口ＲＢＦ中、２５℃で、シアノ酢酸メチル（１００ｇ、１当量）およびイソバレルアルデヒド（９５．６ｇ、１．０当量）をメタノール（１００ｍｌ、１．０Ｖ）に溶解した。２５℃で、シアン化ナトリウム（９８．９０ｇ、１．０当量）の水溶液２００ｍｌ（２．０Ｖ）を１．５時間かけて滴下添加した。反応物を８０℃で３時間加熱し、ＧＣによりシアノ酢酸メチルの消費を確認した。追加の水（１００ｍｌ）を添加した。下方蒸留の組み立て物を取り付け、３時間、反応物の温度が９２℃に到達するまで、反応物からメタノールを留去した。この反応混合物をさらに５時間、９２〜９４℃の間に維持した。形成した有機層を水層から分離した。水２００ｍｌ（１．０Ｖ）により有機層を洗浄した。化合物Ｖの重量は、１２８ｇ（収率９３．１２％）で、ＧＣ純度は９５．８２％であった。
１リットルの４つ口ＲＢＦは、機械式撹拌器、温度計用ポケット、およびｐＨメーター用プローブを装備していた。上記で得られた粗製化合物Ｖ（２５．０ｇ、純度９５．８２％）およびＤＭ水３３３ｍｌ（１３．３Ｖ）を、２５℃でフラスコに添加した。固体のＮａＨＣＯ3（約２．０ｇが必要であった）を使用して、溶液のｐＨを７．５±０．２に調節した。反応混合物を３０℃に温め、この反応混合物にニトリラーゼ酵素調製物（１．８ｍｌ、２０．５ｕ／ｇ基質、比活性２５７Ｕ／ｍｌ）を添加した。ｐＨを７．５±０．２を保持（必要に応じて、および必要な場合、固体ＮａＨＣＯ3または１Ｎ ＨＣｌを使用することにより）することによって、この反応混合物を３５℃で２４時間撹拌した。２４時間後、この反応混合物を２５℃にした。反応物をＭＴＢＥ（７５ｍｌ）により抽出し、１５０Ｔｏｒｒ下、４５℃で蒸発させた後、０．２５ｇの未反応出発原料が回収された。濃ＨＣｌ（約５０ｍｌ）を添加することにより、水層を酸性にしてｐＨ１．０にした。水層を、ＭＴＢＥ（２×７５ｍｌ）により抽出した。合わせたＭＴＢＥ層は、硫酸ナトリウムで脱水してもよかった。ＭＴＢＥ層を蒸発させると、化合物ＶＩ（Ｒ2＝Ｈ）が２４．５ｇ（収率８６％；ＧＣによる純度８０％）得られた。
磁気撹拌器上に、安全管を取り付けた還流凝縮器を有する磁針を装備した、２５０ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。２５℃で、上記で得られたラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（２４ｇ）、次いでＨ2ＳＯ4２．４ｇをＭｅＯＨ（７２ｍｌ、３．０Ｖ）中に添加した。還流温度（６４〜６５℃）で１時間、反応物を撹拌する。反応物を真空下で蒸発させた後、油状残さを水（３７５ｍｌ）により希釈し、酢酸エチル（５０ｍｌ×３）により抽出した。有機層を飽和炭酸水素塩溶液（２０ｍｌ×２）により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮すると化合物ＶＩＩ（Ｒ3＝メチル）が２４ｇ（収率９１．７％、ＧＣによる純度＞９３．４％）得られた。
ラセミ化による、Ｒに富む酸を再利用することによる、メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製


（例４．８）Ｒに富む（ＩＸ）からのメチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
油浴上に、磁針、温度計用ポケット、および還流凝縮器を装備した２５０ｍｌの１つ口ＲＢＦを組み立てた。Ｒに富む３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（５．０ｇ、１．０当量）をＤＭＳＯ（２５ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（１．０８ｇ、１．０当量）を２５℃で添加した。反応物を１００℃で１２時間加熱した。熱溶液に、ＫＯtＢｕ（２．１７ｇ、０．６当量）を添加し、１３０℃で６時間撹拌した。反応混合物を２５℃に冷却し、水（１２．５ｍｌ）を添加した。１Ｎ ＨＣｌ溶液により酸性にしてｐＨ１〜２にし、酢酸エチル（２０ｍｌ×３）によって抽出した。ＥｔＯＡｃ層を水（１５ｍｌ×３）により洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４０℃で濃縮すると、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸が３．５ｇ得られた。２５℃で、残さにＭｅＯＨ（１８ｍｌ）、次いでＨ2ＳＯ4（０．１８ｇ）を添加した。この反応混合物を１時間、還流した。反応物を真空下、約４５℃で濃縮し、水（１８ｍｌ）を添加した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍｌ×３）を使用して油状層を抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１５ｍｌ×２）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下、４０℃で濃縮すると、ＧＣによる純度が約８０％、キラルＧＣ純度データ（％）であるＳ：Ｒが５０．１６：４９．８４となる、７５％の粗製メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートが得られた。
（例４．９）Ｒに富む（ＩＸ）からのメチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
油浴上に、磁針、温度計用ポケット、および還流凝縮器を装備した、２５０ｍｌの３つ口ＲＢＦを組み立てた。Ｒに富む３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（２．０ｇ、１．０当量）をＥｔＯＨ（２０ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＥｔ（１．３２ｇ、１．５当量）を２５℃で添加した。反応物を７８℃で４時間、還流した。この反応混合物を２５℃に冷却し、水（２．０ｍｌ）を添加した。１Ｎ ＨＣｌ溶液により酸性にしてｐＨ１〜２にし、ＭＴＢＥ（７ｍｌ×３）によって抽出した。合わせたＭＴＢＥ層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４０℃で濃縮すると、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸が１．７ｇ得られた。２５℃で、残さにＭｅＯＨ（５ｍｌ）、次いでＨ2ＳＯ4（０．１３６ｇ）を添加した。この反応混合物を１時間、還流した。反応物を真空下、約４５℃で濃縮し、水（８．５ｍｌ）を添加した。ＥｔＯＡｃ（５ｍｌ×３）を使用して油状層を抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５ｍｌ×２）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下、４０℃で濃縮すると、ＧＣによる純度が約８０％、およびキラルＧＣ純度データ（％）であるＳ：Ｒが５０．７４：４９．２６である、粗製メチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートが１．６ｇ（８０．８％）得られた。
（例４．１０）Ｒに富む（ＩＸ）からのメチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
油浴上に、磁針、温度計用ポケット、および還流凝縮器を装備した、１リットルの３つ口ＲＢＦを組み立てた。Ｒに富む３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（１００．０ｇ、１．０当量）をＥｔＯＨ（５００ｍｌ）に溶解し、ＮａＨＣＯ3（５４．１２ｇ）およびＮａＯＥｔ（３２．８５ｇ、０．７５当量）を２５℃で添加した。反応物を７８℃で４．５時間、還流した。エタノールの大部分を蒸留した。反応混合物を２５℃に冷却し、水（２００ｍｌ）を添加し、ＥｔＯＨおよび水（１００ｍｌ）を留去した。１Ｎ ＨＣｌ溶液により酸性にしてｐＨ１〜２にし、ＭＴＢＥ（１５０ｍｌ×３）によって抽出した。合わせたＭＴＢＥ層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。減圧下、４０℃で濃縮すると、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸が１００ｇ得られた。２５℃で、残さにＭｅＯＨ（５００ｍｌ）、次いでＨ2ＳＯ4（８ｇ）を添加した。この反応混合物を１時間、還流した。反応物を真空下、約４５℃で濃縮し（＜５００ｔｏｒｒ、７０％のＭｅＯＨを回収した）、水（２００ｍｌ）を添加した。トルエン（１５０ｍｌ×２）を使用して油状層を抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ７〜８）により洗浄した。有機層を４０℃、減圧下（約５００ｔｏｒｒ）にすると、ＧＣによる純度約８６．３７％を有する粗製メチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートが８８．９６％の収率（２ステップ）で得られた。この粗製物質を真空下、蒸留によりさらに精製すると、ＧＣによる純度＞９６％を有する純粋な生成物が６８％で得られた。
（例４．１１）Ｒに富む（ＩＸ）からのメチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
油浴上に、機械式撹拌器、温度計用ポケット、および還流凝縮器を装備した、５リットルの３つ口ＲＢＦを組み立てた。Ｒに富む３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（５００．０ｇ、１．０当量）をＥｔＯＨ（３０００ｍｌ）に溶解し、２５℃で、ＮａＨＣＯ3（２７０．６２ｇ）およびＮａＯＥｔ（１６４．４２ｇ、０．７５当量）を添加した。反応物を７８℃で４．０時間、還流した。エタノールの大部分を蒸留した。反応混合物を２５℃に冷却し、水（１０００ｍｌ）を添加し、ＥｔＯＨおよび水（５００ｍｌ）を留去した。１Ｎ ＨＣｌ溶液により酸性にしてｐＨ１〜２にし、ＭＴＢＥ（５００ｍｌ×２）によって抽出した。合わせたＭＴＢＥ層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよかった。減圧下、４０℃で濃縮すると、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸が１００ｇ得られた。２５℃で、残さにＭｅＯＨ（２５００ｍｌ）、次いでＨ2ＳＯ4（４０ｇ）を添加した。この反応混合物を１時間、還流した。反応物を真空下、約４５℃（＜５００ｔｏｒｒ）で濃縮し、水（８００ｍｌ）を添加した。トルエン（７５０ｍｌ×２）を使用して、油状層を抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ７〜８）により洗浄した。有機層を４０℃、減圧下（約５００ｔｏｒｒ）にすると、ＧＣによる純度約８１．０２％を有する粗製メチル−３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートが４４５ｇ（２ステップで収率８１．６２％）得られた。この粗製物質を真空下、蒸留によりさらに精製すると、ＧＣによる純度＞９７．８％を有する純粋な生成物が３４２ｇ（６２．７３％）得られた。
酵素を触媒とする加水分解を、異なる酵素を２０％の投入量で、ｐＨ８のリン酸緩衝液（１ｍｌ、１０Ｖ）において、化合物Ｖ１００ｍｇを用いた探索も行い、両方の緩衝溶液すなわちｐＨ７および８において、カンジダ・アンタルクチカＢ１を用いた場合だけ、酸の形成がＧＣ上で観察された。ｐＨ７および８において検討した反応の中で、ｐＨ８よりもｐＨ７での方が、反応速度（反応速度に対する酵素活性）が速いことが見いだされた。ｐＨ８中、他の条件は同一にした場合、どの酵素も反応しなかった。


５％投入量のカンジダ・アンタルクチカＢ１により、より長い反応時間、すなわち９６時間で、Ｓ−エステル（ｅｅ９７．９８％）が収率３８％得られた。再利用性がないために、Ｎｏｖｏｃｏｒ ＡＤＬのコストは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５と比較して、非常に高いことが分かった。したがって、さらなる検討には、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５だけを考慮に入れた。化合物Ｖの酵素加水分解を、水性ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ７．０）および１，４−ジオキサン（３；１）をそれぞれ１０Ｖ、２０Ｖ、３０Ｖで、２．５％および７．５％の酵素投入量（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５）で検討し、化合物ＸのキラルＧＣ純度が、約９３から９８％に向上することが観察された。


（例５．１）（Ｓ）−メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸の調製
磁気撹拌器上で、磁針（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎｅｅｄｌｅ）を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（０．５ｇ、１．０当量）、次いでカンジダ・アンタルクチカＢ１（０．１ｇ）をリン酸緩衝液（３．７５ｍｌ、ｐＨ＝７．０）および１，４−ジオキサン（０．１２５ｍｌ）に分散した。反応物を５時間撹拌した。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌ（５ｍｌ×３）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が０．１７ｇ（Ｓ−エステル４３％、化学純度９６．８３％、＞９８．６％ｅｅ）である。
（例５．２）（Ｓ）−メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸の調製
磁気撹拌器上で、磁針を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（０．５ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．０１ｇ）を水性１．９％ＮａＨＣＯ3（９．４ｍｌ、ｐＨ＝７．０）および１，４−ジオキサン（３．１３ｍｌ）に分散した。反応物を２４時間撹拌した。反応の終了時に、反応のｐＨは約８．３であることが観察された。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌ（５ｍｌ×３）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が３７．５％（Ｓ−エステル、化学純度９１．８６％、＞９８．１４％ｅｅ）である。水層から、ＧＣによる純度が７８％のＲに富む酸を、５６．７％で単離した。
（例５．３）（Ｓ）−メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸の調製
磁気撹拌器上で、磁針を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（５ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．１ｇ）を水性７％ＮａＨＣＯ3（７５ｍｌ、ｐＨ＝７．５）に分散した。反応物を１２時間撹拌した。反応中、ｐＨを７．５に維持した。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌ（５ｍｌ×３）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が３２．０％（Ｓ−エステル、化学純度８７．３０％、キラル純度９９．９１％）である。水層から、純度７８％を有するＲに富む酸を、６２．５７％で単離した。
（例５．４）（Ｓ）−メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸の調製
磁気撹拌器上で、磁針を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（５ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．０１ｇ）を水性７％ＮａＨＣＯ3（７５ｍｌ、ｐＨ＝７．０）に分散した。反応物を１２時間撹拌した。反応中、ｐＨを７．０に維持した。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌ（５ｍｌ×３）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が３９．０％（Ｓ−エステル、化学純度９１．０５％、キラル純度９９．９４％）である。水層から、ＧＣによる純度７８％およびキラル純度８０．８６％ｅｅを有するＲに富む酸を、５８．７％で単離した。
（例５．５）（Ｓ）−メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの調製
磁気撹拌器上で、磁針を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（５ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．０１ｇ）を水性７％ＮａＨＣＯ3（７５ｍｌ、ｐＨ＝８．０）に分散した。反応物を１２時間撹拌した。反応中、ｐＨを８．０に維持した。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５ｍｌ（５ｍｌ×３）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が３８．２％（Ｓ−エステル、化学純度９１．５１％、キラル純度９９．７３％）である。水層から、ＧＣによる純度７８％およびキラル純度８０．８６％ｅｅを有するＲに富む酸を５７．８％で単離した。
（例５．６）
磁気撹拌器上に、磁針を装備した２５０ｍｌの１つ口ＲＢＦ中で、メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（１０ｇ、１．０当量）を、ＮａＨＣＯ3（１０．５ｇ）を含有している７％ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ７．０）（１５０ｍｌ）に分散させて、２５℃でＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５を０．２ｇ添加した。キラルＧＣ分析によりモニターして、加水分解が＞５０％になるまで、この反応物を２６±２℃で７時間撹拌した。反応の終了時に、反応のｐＨは約８．０であることが観察された。真空を使用してブフナー漏斗によって反応物をろ過し、残留酵素を酢酸エチル（５０ｍｌ）により洗浄した。２つの層を分離した。水層を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）により抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素塩溶液６０ｍｌにより洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、減圧下で濃縮すると、ＧＣによる純度９１．７３％およびキラル純度９９．９１％（９９．８２％ｅｅ）を有する化合物ＶＩＩＩが２０ｇ（４０．１％）得られた。１Ｎ ＨＣｌ溶液により、ｐＨ１〜２になるまで水層を酸性にし、酢酸エチル（６０ｍｌ）により抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。ＥｔＯＡｃを減圧下で蒸留すると、Ｒに富むＸ（Ｒ2＝Ｈ）が５．４ｇ得られた。
（例５．７）
機械式撹拌器を装備した１０リットルのＲＢＦ中で、メチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（４５０ｇ、１．０当量）を、７％ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ７．０）（６７５０ｍｌ）に分散させて、２５℃でＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５を９．０ｇ添加した。キラルＧＣ分析によりモニターして、加水分解が＞５０％になるまで、この反応物を２６±２℃で６時間撹拌した。管理している間、ｐＨ調節は行わなかった。真空を使用してブフナー漏斗によって反応物をろ過し、残留酵素を酢酸エチル（８００ｍｌ）により洗浄した。２つの層を分離した。水層を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）により抽出した。合わせた有機層を飽和炭酸水素塩溶液により洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、減圧下で濃縮すると、ＧＣによる純度９８．７４％およびキラル純度９９．９５％の化合物ＶＩＩＩが１８０ｇ（４１．０％）得られた。水層は、１Ｎ ＨＣｌ溶液により、ｐＨ１〜２になるまで酸性にし、酢酸エチル（２×３００ｍｌ）により抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。ＥｔＯＡｃを減圧下で蒸留すると、Ｒに富むＸ（Ｒ2＝Ｈ）が２３４ｇ得られた。
（例５．９）
磁気撹拌器上で、磁針を備えた２５ｍｌの１つ口ＲＢＦを設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（１０ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．２ｇ）を水性７％ＮａＨＣＯ3（１５０ｍｌ、ｐＨ＝７．０）に分散した。反応物を１２時間撹拌した。反応中、ｐＨを維持しなかった。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍｌ（２５ｍｌ×２）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）が２．３ｇ（２３％）（％Ｓ−エステル、化学純度９６．９４％、キラル純度１００％）である。水層から、Ｒに富む酸を７２．８％で単離した。
（例５．１０）
機械式撹拌器を備えた２５ｍｌのＳＳ反応槽を設置した。ラセミメチル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエート（５ｇ、１．０当量）、次いでＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５（０．１ｇ）を水性７％ＮａＨＣＯ3（７５ｍｌ、ｐＨ＝７．０）に分散した。反応物を２５℃で６時間撹拌した。反応中、ｐＨを維持しなかった。反応物を酢酸エチルにより希釈し、吸引ろ過した。層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液３０ｍｌ（１５ｍｌ×２）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水してもよく、濃縮した。単離収率は、化合物ＶＩＩＩ（Ｒ3＝メチル）のＳ−エステル（化学純度９８．２１％、キラル純度９９．８％）が１．９９ｇ（３９．８％）である。水層から、Ｒに富む酸を５７．２％で単離した。

（例６．１）ラセミプレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、水３５０ｍｌ中で水酸化ナトリウム１４．１８ｇを溶解することにより調製した、苛性アルカリ溶液を入れた。この溶液を２０〜２５℃に冷却し、ラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸（５０ｇ）をこのオートクレーブに添加した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（１５．０ｇ、３０％ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。水素ガス５ｋｇ／ｃｍ2を加圧し、窒素ガスを除去するため、大気に２回放出した。３０℃、７００ＲＰＭ、および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2で撹拌を開始した。ＨＰＬＣにより反応の完結を確認するまで、水素化を続けた。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、水（５０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。反応物を、ＭＴＢＥ（１５０ｍｌ）により抽出した。濃ＨＣｌを６０〜６５ｍｌ用いて、水層を酸性にしてｐＨ１．０にした。反応物を０℃に冷却して、１０％ＮａＯＨ溶液（約２５ｍｌ）を添加することにより、ｐＨ７．４に調節した。ラセミプレガバリンが、白色結晶として、分離を始めた。反応物を０℃で２〜３時間、維持した。真空下、ブフナー漏斗によって固体をろ過した。湿潤ケーキを水５０ｍｌにより洗浄し、３０分間、吸引乾燥すると、湿潤ケーキが５５．０ｇ得られた。ラセミプレガバリンの湿潤ケーキを、真空下、４５℃で３〜５時間乾燥すると、３５．５ｇ（収率７１．１％、ＨＰＬＣによる純度９８．０９％）が得られた。1H-NMR (D2O, 400 MHz): 2.945 (2H, d), 2.378 (2H, m), 2.078 (1H, m), 1.566 (1H, m), 1.170 (2H, dd), 0.809 (6H, dd).
（例６．２）ラセミプレガバリン（ｐｒｇａｂａｌｉｎ）の調製
清浄な４００ｍｌのオートクレーブに、２５℃で３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル１０．０ｇ（１当量）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水４．７５ｍｌ中に２．８５ｇ、約６０％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（３．０ｇ、３０％ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。ほぼ完全に転換するまで、水素化を続けた（ＨＰＬＣにより確認）。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（２５ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約５ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール１５〜２０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られたラセミプレガバリンの乾燥重量は、５．１７ｇ（収率５５％；ＨＰＬＣによる化学純度９９．２６％）であった。
（例６．３）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル６０．０ｇ（１当量）を２５℃でメタノール（６００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水８５ｍｌ中に２７．１４ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（基質に対して１８．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。ほぼ完全に転換するまで、水素化を続けた（ＨＰＬＣにより確認）。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（８０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約３０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール６０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、４５．１６ｇ（収率８０．０％、ＨＰＬＣによる化学純度９９．２７％、ＨＰＬＣによるキラル純度９９．８１％）であった。
（例６．４）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２０．０ｇ（１当量）を２５℃でメタノール（２００ｍｌ、１０Ｖ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水２８．２８ｍｌ中に９．０５ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（基質に対して６．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を４８時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（２０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約３０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール２０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１４．０３ｇ（収率７４．６２％、ＨＰＬＣによる化学純度９９．９４％、ＨＰＬＣによるキラル純度９９．９６％）であった。
（例６．５）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、２５℃で（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル３０．０ｇ（１当量）をメタノール（１５０ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化ナトリウム溶液（水２５．６ｍｌ中に８．１９７ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（９．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（４０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１５ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール６０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１９．０ｇ（収率６７．３２％、ＨＰＬＣによる化学純度９４．３３％）であった。
（例６．６）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、２５℃で（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２０．０ｇ（１当量）をメタノール（２００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水２４ｍｌ中に７．６９ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（６．０ｇ、３０％）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。７０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（３０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７．１±０．１に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール４０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１２．７ｇ（収率６７．５１％、ＨＰＬＣによる化学純度９８．６２％）であった。
（例６．７）Ｓ−プレガバリンの調製
機械式撹拌器、温度計用ポケット、および密栓を装備した１リットルの３つ口ＲＢＦ中で、（Ｓ）−（３）−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル６０．０ｇ（１当量）およびメタノール２２５．０ｍｌを入れ、５〜１０℃に冷却した。反応温度を１０℃未満に保持することにより、この溶液に、３２％水性水酸化カリウム溶液８４．６７ｍｌ（１．１６当量）を添加した。この反応混合物を１５〜２５℃で１．５時間、撹拌（ｓｔｉｏｒｒｅｄ）した。反応物を、ＭｅＯＨ（２２５ｍｌ）およびＲａｎｅｙ Ｎｉ１８．０ｇ（３０％ｗ／ｗ）を含有しているオートクレーブに移送した。圧力１０ｋｇ／ｃｍ2、３５０ＲＰＭ、約４０℃で、最大２２時間、水素化した。触媒をろ過した。ろ液に活性炭（１．５％ｗ／ｗ）を添加して、室温で１時間撹拌してもよかった。この混合物をセライトベッドによりろ過し、メタノール６０ｍｌにより洗浄した。次に、氷酢酸を添加することにより、ｐＨを７．１±０．１の範囲内に調節した。真空下、＜４０℃でメタノール、続いて＜４５℃および＜５００ｔｏｒｒの真空でＭｅＯＨと水との混合物を蒸留することにより除去した（収集した蒸留物の合計は、添加したＭｅＯＨと水の合計の７５〜８５％になる量である）。反応混合物を５〜１０℃で冷却し、この温度を３時間、保持した。固体をろ過し、ＩＰＡ（１２０ｍｌ）により洗浄し、室温で３時間吸引乾燥すると、ＨＰＬＣ純度が９８．３７％を有する粗製プレガバリンが５４．８ｇ（９７．０７％）得られた。粗製プレガバリンを還流している水に溶解する。３０〜４０％の溶液が得られるまで、濁りのない溶液を蒸留した。この反応混合物を約２５℃で冷却し、ろ過した。ＩＰＡ（４５ｍｌ）により洗浄し、この固体を３時間乾燥すると、純粋なプレガバリン３３．０ｇが得られた（単離収率５８．０％、ＨＰＬＣ純度９９．１４％）。
（例６．８）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２０．０ｇ（１当量）を２５℃でメタノール（２００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水２４ｍｌ中に７．６９ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（基質に対して６．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。水素ガス５ｋｇ／ｃｍ2を加圧し、窒素ガスを除去するため、大気に２回放出した。７０℃および水素ガス圧５ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（３０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール４０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１２．２ｇ（収率６４．８５％、ＨＰＬＣによる化学純度９８．６３％）であった。
（例６．９）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、２５℃で（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル３０．０ｇ（１当量）をメタノール（２２５ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水３６ｍｌ中に１１．５３ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（基質に対して９．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。水素ガス１０ｋｇ／ｃｍ2を加圧し、窒素ガスを除去するため、大気に２回放出した。３０℃および水素ガス圧５ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ水（３０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過し、吸引乾燥した。湿潤ケーキ２３．２ｇ（８２．２１％）を水（約１５０ｍｌ）中の１０％ＩＰＡに懸濁させ、９０℃で２時間加熱した。室温まで冷却し、ろ過して乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１６．３６ｇ（収率５８％；ＨＰＬＣによる化学純度９８．６３％）であった。
（例６．１０）Ｓ−プレガバリンの調製
機械式撹拌器、温度計用ポケット、および密栓を装備した１リットルの３つ口ＲＢＦ中で、（Ｓ）−（３）−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２００．０ｇ（１当量）およびメタノール７５０．０ｍｌ（３．７５Ｖ）を入れ、５〜１０℃に冷却した。反応温度を１０℃未満に保持することにより、この溶液に、３２％水性水酸化カリウム溶液２８２．０ｍｌ（１．１６当量）を添加した。この反応混合物を約２５℃で１．５時間、撹拌した。反応物を、ＭｅＯＨ（７５０ｍｌ）およびＲａｎｅｙ Ｎｉ６０．０ｇ（３０％ｗ／ｗ）を含有しているオートクレーブに移送した。圧力１０ｋｇ／ｃｍ2、３５０ＲＰＭ、約３０℃で、最大２２時間、水素化した。触媒をろ過した。ろ液に活性炭（１．５％ｗ／ｗ）を添加して、室温で１時間撹拌してもよかった。この混合物をセライトベッドによりろ過し、メタノール２００ｍｌにより洗浄した。次に、氷酢酸を添加することにより、ｐＨを７．１±０．１の範囲内に調節した。真空下、＜４０℃でメタノール、続いて＜４５℃および＜５００ｔｏｒｒの真空でＭｅＯＨと水との混合物を蒸留により除去した（収集した蒸留物の合計は、添加したＭｅＯＨと水の合計の７５〜８５％になる量である）。反応混合物を５〜１０℃に冷却し、この温度を３時間保持した。固体をろ過し、ＩＰＡ（１２０ｍｌ）により洗浄し、室温で３時間吸引乾燥すると、ＨＰＬＣ純度９４．７９％を有する粗製プレガバリンが１５５．０ｇ（８２．４４％）得られた。粗製プレガバリンを還流している水に溶解する。３０〜４０％の溶液が得られるまで、濁りのない溶液を蒸留した。この反応混合物を約２５℃で冷却し、ろ過した。ＩＰＡ（２００ｍｌ）により洗浄し、この固体を３時間乾燥すると、純粋なプレガバリン１２２．０ｇが得られた（単離収率６４．８％、ＨＰＬＣ純度９９．８５％）。
（例６．１１）Ｓ−プレガバリンの調製
機械式撹拌器、温度計用ポケット、および密栓を装備した１リットルの３つ口ＲＢＦ中で、（Ｓ）−（３）−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル６０．０ｇ（１当量）およびメタノール２２５．０ｍｌ（３．７５Ｖ）を入れ、５〜１０℃に冷却した。反応温度を１０℃未満に保持することにより、この溶液に、３２％水性水酸化カリウム溶液８４．６７ｍｌ（１．１６当量）を添加した。この反応混合物を１５〜２５℃で１．５時間、撹拌した。反応物を、ＭｅＯＨ（２２５ｍｌ）およびＲａｎｅｙ Ｎｉ１８．０ｇ（３０％ｗ／ｗ）を含有しているオートクレーブに移送した。圧力１０ｋｇ／ｃｍ2、３５０ＲＰＭ、約３０℃で、最大２２時間、水素化した。触媒をろ過した。ろ液に活性炭（１．５％ｗ／ｗ）を添加して、室温で１時間撹拌してもよかった。この混合物をセライトベッドによりろ過し、メタノール６０ｍｌにより洗浄した。次に、氷酢酸を添加することにより、ｐＨを７．１±０．１の範囲内に調節した。真空下、＜４０℃でメタノール、続いて＜４５℃および約５００ｔｏｒｒの真空でＭｅＯＨと水との混合物を蒸留により除去した（採集した蒸留物の合計は、添加したＭｅＯＨと水の合計の７５〜８５％になる量である）。反応混合物を５〜１０℃で冷却し、この温度を３時間保持した。固体をろ過し、ＭｅＯＨ（６０ｍｌ）により洗浄し、室温で３時間吸引乾燥すると、ＨＰＬＣ純度８９．９％を有する粗製プレガバリンが４５．２ｇ（８０．１％）得られた。粗製プレガバリンを還流している水に溶解する。３０〜４０％の溶液が得られるまで、濁りのない溶液を蒸留した。この反応混合物を約４０℃で冷却し、ろ過した。ＩＰＡ（４５ｍｌ）により洗浄し、この固体を３時間乾燥すると、純粋なプレガバリン３４．０ｇが得られた（単離収率６０．１７％、ＨＰＬＣ純度９９．８４％）。
（例６．１２）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２０．０ｇ（１当量）を２５℃でメタノール（２００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水２４ｍｌ中に７．６９ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（基質に対して６．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。４０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ（３０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１０ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上で固体をろ過した。湿潤ケーキを冷やしたイソプロピルアルコール４０ｍｌにより洗浄し、３０分間吸引乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１３．９ｇ（収率７３．９０％、ＨＰＬＣによる化学純度９６．７２％）であった。
（例６．１３）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、２５℃で（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２０．０ｇ（１当量）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水２４ｍｌ中に７．６９ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（６．０ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ（３０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１５ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用し、ブフナー漏斗上でこの固体をろ過し、３０分間吸引乾燥すると、粗製湿潤プレガバリンが１５．９９ｇ得られた。これを２５０ｍｌの丸底フラスコに移し、１０％水性ＭｅＯＨ（約８０ｍｌ）を添加し、４０〜５０℃で２時間、加熱した。室温まで冷却し、ろ過して乾燥した。こうして得られた（Ｓ）−プレガバリンの乾燥重量は、１３．５９ｇ（収率７２．２％、ＨＰＬＣによる化学純度９９．７１％）であった。
（例６．１４）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、２５℃で（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル２５０．０ｇ（１当量）をメタノール（１８７５ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水３００ｍｌ中に９６．１３ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（７５ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨ（１４０ｍｌ）により洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸（約１８７．５ｍｌ）の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用して、ブフナー漏斗上でこの固体をろ過し、３０分間吸引乾燥すると、粗製湿潤プレガバリンが１９２．０ｇ得られた。粗製プレガバリンを還流している水に溶解する。３０〜４０％の溶液が得られるまで、濁りのない溶液を蒸留した。この反応混合物を約２５℃で冷却し、ろ過した。ＩＰＡにより洗浄し、この固体を３時間乾燥すると、純粋なプレガバリン１５８．０ｇが得られた（単離収率６７．１６％、ＨＰＬＣ純度９９．９３％）。結晶化のＭＬＲを、１００〜１１０℃における下方蒸留により、半分の体積まで濃縮した。次に、この混合物を４０℃に冷却し、次に、直ちにろ過した。その後に、２５〜２７℃で１時間、ＩＰＡ中で撹拌してＩＰＡケーキ洗浄を行い、ろ過した。このろ過ケーキをＩＰＡにより洗浄すると、９９．８４％のＨＰＬＣ純度を有する、追加量のプレガバリンが１０．１ｇ（４．３％）得られた。
（例６．１５）Ｓ−プレガバリンの調製
清浄な１リットルのオートクレーブに、（Ｓ）−３−シアノ−５−メチルヘキサン酸メチルエステル７０．０ｇ（１当量）を２５℃でメタノール（５２５ｍｌ）に溶解した。反応物の温度を２５℃未満に維持するよう、添加速度を制御することにより、水酸化カリウム溶液（水８４ｍｌ中に２６．９１ｇ、約３２％）を添加した。２０〜２５℃で約１．５時間撹拌した。Ｒａｎｅｙ Ｎｉ（２１ｇ、３０％、ｗ／ｗ）を添加した。このオートクレーブを適切に閉じ、撹拌を開始した。窒素ガスを２回パージすることにより、オートクレーブ内部の空気を置きかえた。１０ｋｇ／ｃｍ2の水素ガスを加圧し、窒素ガスを除去するために、２回大気中に放出した。３０℃および水素ガス圧１０ｋｇ／ｃｍ2において、５００ＲＰＭで撹拌を開始した。この水素化を２２時間継続した。触媒をセライト、または他の適切な任意のベッドによりろ過し、ＭｅＯＨにより洗浄した。触媒は、再使用するために回収した。氷酢酸の使用により、ろ液をｐＨ７〜７．４に調節した。メタノールを減圧下、４０℃で回収した。反応物を０〜５℃に１時間冷却した。真空を使用して、ブフナー漏斗上でこの固体をろ過し、３０分間吸引乾燥すると、粗製湿潤プレガバリンが４６．８ｇ得られた。粗製プレガバリンを還流している水に溶解する。３０〜４０％の溶液が得られるまで、濁りのない溶液を蒸留した。この反応混合物を約２５℃で冷却し、ろ過した。ＩＰＡにより洗浄し、この固体を３時間乾燥すると、純粋なプレガバリン３７．６ｇが得られた（単離収率５７．０９％、ＨＰＬＣ純度９９．８４％）。結晶化のＭＬＲ（２００ｍＬ）を６０ｍｌまで濃縮した。この混合物に、ＮａＯＨ（５．２６ｇ）を添加し、５分間撹拌した。この懸濁液に、１，４−ジオキサン（６０ｍｌ）に溶解したジ ｔｅｒｔ ブチルジカーボネート（１３．５６ｇ）を添加し、２５〜２７℃で２時間、撹拌した。反応の完結をＴＬＣによって確認した。次に、この反応混合物を濃縮し、残さを得た。この残さに水を添加し、ＭＴＢＥ（３０ｍｌ）により抽出して、過剰のジ ｔｅｒｔ ブチルジカーボネートを除去した。クエン酸を用いて、水層のｐＨをｐＨ＝３にした。次に、この混合物を酢酸エチル（３×３０ｍｌ）により抽出した。合わせた有機層をブライン（２０ｍｌ）により洗浄して濃縮すると、Ｂｏｃ保護プレガバリンが７．２ｇ得られた。1H- NMR (DMSO, 400 MHz): δ 12.00(s, 1H), 6.83 (t, 1H), 2.94 (m, 1H), 2.80(m, 1H), 2.24-2.19(dd, 1H), 2.01-1.90(m, 2H), 1.62(m, 1H), 1.37(s, 9H), 1.28(m, 1H), 1.13(m, 1H), 0.86(t, 6H). MS m/z: 258 (M-H)
以下のリストは、本発明において使用された、略語の一部である。
Ａｑ ：水性
Ｂｏｃ ：三級ブチルオキシカルボニル
ｃｍ2 ：平方センチメートル
ＤＭ ：脱イオン化
ＤＣＭ ：ジクロロメタン
ＤＢＵ ：１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン
ＤＩＰＡ ： ジイソプロピルアミン
ＤＭＡＰ ： ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＰＡ ：ジフェニルアミン
ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ：ジメチルスルホキシド
ｅｅ ：鏡像異性体過剰率
ｅｑｖ． ：当量
ＥｔＯＡｃ ：酢酸エチル
ｇ ：グラム
ＧＣ ：ガスクロマトグラフィー
ｈ ：時間
ＨＰＬＣ ：高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ ：イソプロピルアルコール
Ｋｇ ：キログラム
ＫｏｔＢｕ ：カリウムｔ−ブトキシド
ＫＵ ：キロ単位
Ｌｉｔ ：リットル
ＭＤＣ ：ジクロロメタン
ＭｅＯＨ ：メチルアルコール
ＭＩＢＫ ：メチルイソブチルケトン
ｍｌ ：ミリリットル
ｍｍｏｌ ：ミリモル
ｍｏｌ ：モル
ＭＴＢＥ ：第三ブチルメチルエーテル
ＮＭＲ ：核磁気共鳴分光法
ＲＢＦ ：丸底フラスコ
ＲＰＭ ：毎分回転数
ＴＨＦ ：テトラヒドロフラン
ＴＬＣ ：薄層クロマトグラフィー
Ｕ ：単位
Ｖ ：体積

Claims (38)

  1. 式（Ｉ）の化合物の調製の改善方法であって、
    （ａ）任意に適切な溶媒中、弱酸の塩および弱塩基、または弱塩基の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを反応させて、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを得るステップ、
    （式中、Ｒ1＝Ｃ1からＣ4のような直鎖または分岐低級アルキルなどである）
    （ｂ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、式（ＩＶ）の２−シアノ−５−メチル−ヘキサ−２−エン酸アルキルエステルを適切なシアン化物源と反応させて、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得るステップ、
    （ｃ）水中もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、適切なシアン化物源の存在下、式（ＩＩ）のイソバレルアルデヒドと式（ＩＩＩ）のシアノ酢酸アルキルとを、単一ステップで反応させることにより、任意に式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを得てもよいステップ、
    （ｄ）適切なｐＨおよび温度において、水中、または任意に有機共溶媒を含んでもよい水中、Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２のような遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素により、式（Ｖ）の２−イソブチルスクシノニトリルを式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩に変換するステップ、
    （式中、Ｒ2＝カチオン対イオン、水素、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、有機アミン塩など）
    ｅ）適切な溶媒またはそれらの溶媒の混合物中、塩基の存在下、式（ＶＩ）のラセミ３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩をアルコール（Ｒ3ＯＨ）および酸性触媒、またはハロゲン化アルキル（Ｒ3Ｘ）と処理することにより、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートへと変換するステップ、
    （式中、Ｒ3＝Ｃ1からＣ4のような直鎖もしくは分岐低級アルキル、またはＣ7からＣ10アリールもしくはアルキルアリールなどである）
    （ｆ）水もしくは有機溶媒中、またはそれらの混合物中、酵素によるエナンチオ選択的な加水分解により、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートから、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートおよび式（Ｘ）の（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸またはその塩を得るステップ、
    （式中、
    Ｒ2＝カチオン対イオン、水素、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、有機アミン塩などであり、
    Ｒ3＝Ｃ1からＣ4のような直鎖もしくは分岐低級アルキル、またはＣ7からＣ10アリールもしくはアルキルアリールなどである）
    （ｇ）有機溶媒またはその混合物中、塩基の存在下、式（Ｘ）の不要な（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸もしくはその塩、または実質的に豊富な式（Ｘ）のその（Ｒ）−３−シアノ−５−メチル−ヘキサン酸塩をラセミ化することにより、任意に式（ＶＩＩ）の化合物を得てもよいステップ、
    （ｈ）適切なアルカリ金属塩基またはアルカリ土類金属塩基を用いるエステル基の加水分解、その後の適切な水素化触媒の存在下、水もしくは他の有機溶媒、またはそれらの混合物から選択される溶媒中、任意にワンポットで行ってもよい水素化により、式（ＶＩＩＩ）の（Ｓ）−アルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートを式（Ｉ）のプレガバリンに変換するステップ、
    を含む、方法。
  2. ステップ（ａ）において使用される前記有機弱酸が、好ましくは、安息香酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、酢酸などからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ａ）において使用される前記弱塩基が、好ましくは、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンなどから、より好ましくはジイソプロピルエチルアミン、ピペリジンなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. ステップ（ａ）において使用される前記塩が、好ましくは、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、安息香酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、酢酸アルキルアンモニウムなどから、より好ましくは酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記適切なシアン化物源が、好ましくは、シアン化リチウム、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、シアン化トリメチルシリルなどから、より好ましくはシアン化ナトリウムまたはシアン化カリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  6. ステップ（ａ）における前記適切な有機溶媒が、好ましくは、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロヘキサン、トルエン、およびそれらの混合物から、より好ましくはシクロヘキサンまたはトルエンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）における前記有機溶媒が、水、エチルアルコール、メチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、シクロヘキサンなどからなる群から選択され、より好ましくは、溶媒は、メチルアルコール、もしくはエチルアルコール、もしくは水、またはそれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
  8. ステップ（ｂ）の前記反応が、好ましくは、４５℃〜１２０℃の間、より好ましくは４５℃〜１１０℃の間の温度範囲で実施され、最も好ましくは、メチルアルコールまたはエチルアルコールの還流温度から水の還流温度においてである、請求項１に記載の方法。
  9. ステップ（ａ）およびステップ（ｃ）の前記反応が、好ましくは周囲温度から還流温度で、より好ましくは還流温度で実施される、請求項１に記載の方法。
  10. ステップ（ｄ）における化合物（ＶＩ）を調製するための式（Ｖ）の化合物の投入量が、好ましくは、水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり３０〜３００ｇから、より好ましくは、水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり５０〜２００ｇから、最も好ましくは水または共溶媒と組み合わせた水１リットルあたり６０〜１５０ｇから選択することができる、請求項１に記載の方法。
  11. ステップ（ｄ）において化合物（ＶＩ）を調製するための、前記遺伝子修飾したニトリラーゼ酵素（Ｎｉｔ９Ｎ＿５６＿２）の投入量が、好ましくは、化合物（Ｖ）１ｇあたり４〜２５Ｕから、より好ましくは、化合物（Ｖ）１ｇあたり６〜２０Ｕから選択することができる、請求項１に記載の方法。
  12. ステップ（ｄ）における式（ＶＩ）の化合物の調製中に、溶液のｐＨが７．２±０．８の範囲、最も好ましくは７．０±０．５の範囲に保持され、適切な緩衝液により維持することができ、当分野において周知であり、実現するための最も好ましい方法の１つが、リン酸もしくは酢酸緩衝液を使用するか、または酢酸、クエン酸、酒石酸、塩酸、硫酸、リン酸などから選択される適切な酸を添加することによりｐＨを維持することであり、最も好ましい酸が塩酸、ならびに／またはアンモニア、モノ、ジおよびトリアルキルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどからなる群から選択される塩基であり、最も好ましい塩基が炭酸水素ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
  13. ステップ（ｄ）の前記反応が、好ましくは、２５℃〜４０℃の間、より好ましくは２８℃〜３８℃の間の温度範囲、最も好ましくは３０℃〜３７℃の間の温度範囲で実施される、請求項１に記載の方法。
  14. ステップ（ｅ）における前記アルコール（Ｒ3ＯＨ）が、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、シクロペンタノール、シクロヘキサノールなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  15. ステップ（ｅ）における前記ハロゲン化アルキル（Ｒ3Ｘ）が、好ましくは、ヨウ化メチル、塩化エチル、臭化エチル、ヨウ化エチル、臭化ｎ−プロピル、塩化イソプロピル、臭化イソプロピルなどからなる基Ｃ1からＣ5ハロゲン化アルキルから選択される、請求項１に記載の方法。
  16. ステップ（ｅ）における前記酸触媒／または試薬が、好ましくは、塩酸、硫酸、塩化チオニル、塩化トリメチルシリル、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ルイス酸、または当分野で周知の強酸性スルホン化樹脂からなる群から、より好ましくは塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、塩化トリメチルシリルなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  17. 式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチルヘキサノエートの調製中、これをステップ（ｅ）において蒸留することにより任意に精製してもよい、請求項１に記載の方法。
  18. ステップ（ｆ）における前記酵素によるエナンチオ選択的な加水分解が、カンジダ・アンタルクチカＡ、カンジダ・アンタルクチカＢ１、カンジダ・アンタルクチカＢＹ２、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５、リゾムコル・メイヘイ、サーモマイセス・ランギノサ、シュードモナス・ケペシア、Ｒｅｓｉｎａｓｅ ＨＴ、Ｌｉｐｅｘ １００Ｌ、枯草菌、リパーゼ３．１０１、リパーゼ３．１０２、リパーゼ３．１０４、リパーゼ３．１０５、リパーゼ３．１０６、リパーゼ３．１０７、リパーゼ３．１０８、リパーゼ３．１０９、リパーゼ３．１１１、リパーゼ３．１１５、リパーゼ３．１１３、リパーゼ３．１１７、リパーゼ３．１３６、ＡＹＳ Ａｍｉｎｏ、ＡＳ Ａｍａｎｏ、ＰＳ ＡｍａｎｏＳＤ、ＡＫ Ａｍａｎｏなどから、より好ましくは、カンジダ・アンタルクチカＢ１またはカンジダ・アンタルクチカＢＹ２またはＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５からなる群から選択される、エステラーゼ、リポラーゼ、およびリパーゼのような加水分解酵素を使用することにより、好ましくは実施される、請求項１に記載の方法。
  19. ステップ（ｆ）における好ましい酵素の投入量が、基質に比べて、＞０．１％〜＜５％ｗ／ｗの範囲にあり、より好ましくはその範囲が、基質に比べて０．５％〜４％ｗ／ｗであり、最も好ましくは、その範囲が、基質と比べて１．０％〜３％ｗ／ｗである、請求項１に記載の方法。
  20. ステップ（ｆ）における好ましい酵素が、回収されて、ほとんど完全な酵素活性が保たれている間、数回再使用することができ、その活性が乏しい場合、酵素の再利用中、追加量の新しい酵素を添加することができ、その追加量は、初期酵素投入量に対して５％〜５０％ｗ／ｗの範囲、より優先的には初期酵素投入量に対して５％〜２５％ｗ／ｗの範囲とすることができる、請求項１に記載の方法。
  21. ステップ（ｆ）における有機溶媒が、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、アセトン、メチルイソブチルケトン、アセトニトリル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシドなどからなる群から選択され、より好ましくは、溶媒は、水、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、またはそれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
  22. ステップ（ｆ）における式（ＶＩＩＩ）の化合物の調製中に、酢酸、クエン酸、ホウ酸、エチレンジアミン四酢酸、塩酸、硫酸、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、またはそれらの適切な組合せ物からなる群から選択される適切な試薬を使用することにより、好ましくは溶液の初期ｐＨが７．５±０．５の範囲、最も好ましくは７．２±０．２の範囲に保持される、請求項１に記載の方法。
  23. ステップ（ｆ）における、式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの実質的に光学的に純粋な（Ｓ）−エステル（ＶＩＩＩ）への変換において、反応の進行中の反応混合物のｐＨが、好ましくは、７〜９の範囲でゆっくりと向上させることができ、より好ましくは、最大≧７．５〜≦８．５まで向上させることができる、請求項１に記載の方法。
  24. ステップ（ｆ）における式（ＶＩＩ）のラセミアルキル３−シアノ−５−メチル−ヘキサノエートの実質的に光学的に純粋な（Ｓ）−エステル（ＶＩＩＩ）への変換において、酵素によるステップが、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどからなる群から選択することができる塩の存在下で任意に行ってもよく、または適切な酸と適切な塩基の中和により、インサイチュで生成させることができる、請求項１に記載の方法。
  25. 前記酵素によるステップ（ｆ）が、好ましくは、２０℃〜４５℃の間、より好ましくは２２℃〜４０℃の間の温度範囲、最も好ましくは２５℃〜３５℃の間の温度範囲で実施される、請求項１に記載の方法。
  26. ステップ（ｇ）における前記有機溶媒が、好ましくは、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、三級ブチルアルコール、シクロヘキサノール、トルエン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアミン、ジメチルスルホキシド、スルホランなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  27. ステップ（ｇ）において使用される前記塩基が、好ましくは、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、Ｃ1からＣ6アルコキシドなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  28. 前記酵素によるステップ（ｇ）が、好ましくは、２５℃〜２００℃の間の温度範囲で１〜６０時間、より好ましくは５０℃〜１８０℃の間の温度範囲で２〜２４時間、実施される、請求項１に記載の方法。
  29. ステップ（ｈ）における加水分解のための前記塩基は、好ましくは、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、Ｃ1からＣ5四級水酸化アンモニウムなどから選択される、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物から選択される、請求項１に記載の方法。
  30. ステップ（ｈ）において、式（Ｉ）のプレガバリンの前記調製が、構造（ＶＩＩＩ）の化合物をインサイチュで加水分解するステップ、その後の接触水素化を行うステップを含み、加水分解のための塩基強度が、好ましくは０．１Ｎ〜５Ｎ、より好ましくは０．３〜３Ｎ、最も好ましくは０．５Ｎ〜２Ｎから選択され得る、請求項１に記載の方法。
  31. ステップ（ｈ）における前記有機溶媒が、好ましくは、水、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、三級ブチルアルコール、シクロヘキサノール、トルエン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、またはそれらの組合せ物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  32. 前記適切な水素化触媒が、好ましくは、担体を含むまたは含まないニッケル、パラジウム、ルテニウム、ロジウム、ならびにそれらの異なる化学形態およびグレード、新しい触媒もしくは回収触媒、または新しい触媒と回収触媒の混合物でもよいものからなる群から選択され、最も好ましい触媒は、ニッケルおよびパラジウムである、請求項１に記載の方法。
  33. ステップ（ｈ）が、好ましくは、１０℃〜１００℃の間、より好ましくは１５℃〜６０℃の間の温度範囲、最も好ましくは２５℃〜５０℃の間の温度範囲で実施される、請求項１に記載の方法。
  34. ステップ（ｈ）における前記接触水素化が、好ましくは、０．５〜２５ｋｇ／ｃｍ2または等価な単位の範囲の水素圧、２〜１５ｋｇ／ｃｍ2または等価な単位の範囲の好ましい水素圧を用いて実施され、最も好ましい圧力範囲が、３〜１０ｋｇ／ｃｍ2である、請求項１に記載の方法。
  35. 式（Ｉ）のプレガバリンの前記調製が、水素化生成物を活性炭処理してもよいステップ、および好ましくは６．９〜７．３のｐＨ範囲、より好ましくはｐＨ７〜７．２において等電点電気泳動によりプレガバリンを単離するステップ、および水、Ｃ1からＣ5アルコール、またはそれらの混合物から粗製物を結晶化するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  36. 式（Ｉ）のプレガバリンの前記調製が、等電点電気泳動によりプレガバリンを単離するステップであって、ｐＨを塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸のような任意の無機酸または有機酸を用いて調節することができ、最も好ましい酸が、塩酸または酢酸である、ステップを含む、請求項１に記載の方法。
  37. 式（Ｉ）のプレガバリンの調製が、水、Ｃ1からＣ5アルコール、またはそれらの混合物から粗製物を結晶化することによりプレガバリンを精製するステップ、および乾燥母液の再結晶により、さらなる量の純粋な式（Ｉ）のプレガバリンを回収するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  38. 式（Ｉ）のプレガバリンの調製が、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、カルボキシベンジル、トリチルのような当分野で公知のアミノ保護誘導体として、母液から式（Ｉ）のプレガバリンを代替的に回収するステップをさらに含んでおり、最も好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを使用して、その後に、適切な溶媒中、酸により処理することによりｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の除去を行うことができる、請求項３６に記載の方法。
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