CN104946672A - 一种顶头孢霉噻唑合成酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种顶头孢霉噻唑合成酶及其基因和应用。该基因是一种分离的核酸，其是(1)由序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的核酸；(2)编码如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质，一种分离的蛋白质，由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成。本发明还公开了一种包含如上所述核酸的重组表达载体，一种包含如上所述重组表达载体的重组表达转化体，上述重组表达载体以及重组表达转化体在制备头孢霉素C中的应用以及一种产头孢霉素C菌株的培养方法。本发明公开的顶头孢霉噻唑合成酶基因及其编码的蛋白质能够有效地调节头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

Description

一种顶头孢霉噻唑合成酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种顶头孢霉噻唑合成酶及其基因和应用。

背景技术

头孢菌素C是工业上生产头孢类抗生素的重要中间体，具有巨大的经济及应用价值。因此对其产生菌顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的研究一直备受重视，其菌种的选育工作显得尤为重要。直接开展对顶头孢霉的比较蛋白质组学研究，在整体代谢网络中寻找影响头孢菌素C（CPC）合成的关键酶类，并将该基因作为基因工程操作的靶点，验证该基因及其产物在顶头孢霉合成头孢菌素C中的作用，为进一步提高或降低这些关键酶在顶头孢霉中的表达和发挥生物活性，从而更大幅度的提高菌株性能，获得高产工业菌株奠定良好的科学基础。由于顶头孢霉的基因组序列也没有发表，因此为了研究其表达的上调表达或下调表达与CPC产量之间的调控机制，首先需要克隆与CPC合成调控相关的几个基因，以进行下一步体内功能研究以及代谢途径的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前顶头孢霉中决定头孢菌素C合成的关键酶类蛋白的基因序列尚未公布的技术问题，提供一种顶头孢霉噻唑合成酶的基因及其应用。

本实验室通过比较蛋白质组学得到了在CPC产生菌顶头孢霉的高低产菌株中表达量有显著差异的蛋白质点，鉴定后确定了其中5个蛋白为我们的研究目标，其中之一为噻唑合成酶，在高低产菌株中有显著差异的噻唑合成酶，在高产菌中的表达量比低产菌高2.1倍。噻唑合成酶参与了硫胺素（TPP）生物合成中噻唑模块的合成。硫胺素（Thiamine，VB1）广泛存在于细菌、古生菌、真菌及植物中，是生物体内一个重要的辅因子，参与生物化学反应中碳碳键的形成，在生物体的氨基酸代谢和碳水化合物代谢过程中发挥着重要的作用。在细菌中，硫胺素的生物合成涉及到化学和分子学机制，包括许多基因的联合作用。噻唑合成模块包括六个基因，分别为（thiF,thiS,thiG,thiH,thiO,iscS,nifS和dxs），其中噻唑合成酶（ThiG）是一个重要途径，催化噻唑环的最终合成。酵母菌中，噻唑合成模块中只有一个基因THI4得到了鉴定，THI4是一个保守蛋白，与植物和古生菌中的同源，在Arabidopsis thaliana中命名为THI1。最初THI1被认为具有修复由于DNA损伤造成菌株突变缺陷的功能，然而在酵母中进一步实验证明它能互补硫胺素营养缺陷型。使用相同的模型，在Arabidopsis thalian中证明了在DNA损伤的条件下，THI1的互补菌株没有改变细胞的生存能力，而是维持了线粒体DNA的稳定性。因此，THI1和THI4具有噻唑合成酶和耐DNA损伤的双重作用。不仅如此，噻唑合成酶基因被破坏还影响了球白僵菌的产孢量和生长形态，而CPC的产量与顶头孢霉的产孢量直接相关。因此我们从中选择顶头孢霉噻唑合成酶进行研究。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种分离的核酸，所述核酸是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码顶头孢霉噻唑合成酶的核酸，通过基因克隆技术获得编码顶头孢霉噻唑合成酶的核酸，或者通过人工全序列合成的方法得到编码顶头孢霉噻唑合成酶的核酸。噻唑合成酶的基因组全长序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

如本领域技术人员所知：编码SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个核酸的同系物。本发明中核酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。利用本发明所述PCR引物进行PCR扩增程序，即得编码所述顶头孢霉噻唑合成酶的核酸分子。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种分离的蛋白质，其是由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明所述分离的蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。具有序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的蛋白质命名为顶头孢霉噻唑合成酶。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本发明所述的编码顶头孢霉噻唑合成酶的基因核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。本发明所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选地为质粒pMD19-T。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

本发明所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的环氧水解酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：如上所述的核酸或如上所述的重组表达载体在制备头孢霉素C中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是：如上所述的蛋白质或如上所述的重组表达转化体在制备头孢霉素C中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之七是：一种产头孢霉素C菌株的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得，将转化所得宿主微生物在25℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。

本发明所述的宿主微生物为本领域常规使用的微生物，较佳的为C13菌株，所述C13菌株是菌株顶头孢霉菌ATCC11550，其拉丁文学名是Acremonium chrysogenum，该菌株通过市售可得。其中所述培养温度为本领域常规的培养温度，更佳地为30℃～37℃。所述震荡培养的震荡速度更佳地为200～300rpm，优选地为230rpm，培养时间更佳地为72～96小时，优选地为72小时。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明公开的顶头孢霉噻唑合成酶基因能够有效地调节顶头孢霉菌的头孢菌素C的合成速率和产量。利用本发明的顶头孢霉噻唑合成酶基因及其编码的蛋白质能够有效提高顶头孢霉菌的头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为噻唑合成酶基因PCR产物电泳图。其中泳道1为PCR产物，泳道2为DL2000marker。

图2为噻唑合成酶的上游序列PCR扩增产物电泳图。其中泳道1为52℃所得PCR产物，泳道2为55℃所得PCR产物，泳道3为DL2000marker。

图3为噻唑合成酶的下游序列PCR扩增电泳图。其中泳道1为PCR产物，泳道2为DL2000marker。

图4为噻唑合成酶下游片段的PCR扩增产物电泳图。其中泳道1为30℃所得PCR产物，泳道2为35℃所得PCR产物，泳道3为40℃所得PCR产物，泳道4为DL2000marker，泳道5为λ/HindIII酶切产物，泳道6为45℃所得PCR产物，泳道7为50℃所得PCR产物，泳道8为55℃所得PCR产物。

图5为噻唑合成酶cDNA和基因组的PCR扩增产物电泳图。泳道1是以cDNA为模板所得PCR产物，泳道2是以基因组为模板所得PCR产物，泳道3为λ/HindIII酶切产物。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。室温是指反应场所的温度，通常为在25℃～35℃。

实施例1

1.菌种和质粒

发酵产生CPC培养提取DNA和RNA CPC产生菌C13（CPC产生菌C13的菌株名称为：顶头孢霉菌ATCC11550，其拉丁文学名是：Acremoniumchrysogenum，该菌株购买自美国菌种保藏中心ATCC）。

克隆用宿主大肠杆菌DH5α（大肠杆菌DH5α购买自天根公司），克隆用载体pMD19-T购自大连TaKaRa公司。

2.主要实验方法

2.1顶头孢霉基因组DNA的提取

（1）从斜面上刮下少量孢子加入适量的液氮进行研磨；

（2）研磨后用1ml抽提液溶解，抽提液配方为（pH7.5Tris-Cl0.2mol/L，NaCl0.5mol/L，EDTA0.01mol/L，SDS1%）；

（3）加入等体积的酚氯仿，旋涡振荡3min，10000r/min，5min；

（4）取上清加入等体积氯仿，10000r/min，5min；

（5）去上清加入等体积异丙醇，室温放置20min，12000r/min，10min，白色沉淀即为基因组DNA。

2.2顶头孢霉总RNA的提取

试验开始前塑料制品使用0.1%的DEPC水浸泡过夜后，高温高压灭菌30min，玻璃和金属物品250℃烘烤3小时，所有的器材和表面都要用0.1%的DEPC水浸泡和处理，试验操作过程中严格避免皮肤与器具直接接触。

（1）将斜面上刮下的孢子用玻璃珠或匀浆器打碎后接种于种子培养基中，28℃、230r/min培养72h；

（2）以10%的接种量转接至发酵培养基，28℃、230r/min，培养3d，4d，5d，12000r/min离心(Beckman Avanti J-25，JA-17转子)10min收获菌体，生理盐水洗涤2次；

（3）离心收集的菌体置于研钵中，用液氮研磨，趁液氮还没有全部挥发，将菌体转移到加有1ml Trizol的Eppendorf管中，用1ml的枪头反复抽吸至少100次；

（4）加入100μl氯仿/异戊醇(24∶1)，剧烈振荡混匀30s；

（5）12000r/min离心(Eppendorf5415R台式离心机，下同)5min，吸取上清至另一离心管中；

（6）重复(4)、(5)两步，直到两相界面处基本没有蛋白；

（7）吸取上清液至另一Eppendorf管中，加入150μl无水乙醇，混匀；

（8）将溶液吸到置于2ml收集管的UNIQ-10柱（购买自生工生物工程（上海）有限公司）中，室温放置2min，8000r/min离心1min；

（9）取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450μl Solution RPE（Solution RPE购买自生工生物工程（上海）有限公司），10000r/min离心30s；

(10)重复步骤（9）一次；

(11)弃去收集管中废液，将柱子放回收集管中，离心15s；

(12)将柱子放入一干净的Eppendorf管中，向膜中央加入50μl65℃预热的DEPC H₂O，静置2min；

(13)10000r/min离心1min，收集管中的RNA溶液，置-70℃保存。

2.3逆转录体系和方法

逆转录的反应体系如表1所示。逆转录反应步骤如下：

（1）按照表1组分配制RT反应液（反应液在冰上配制）；

（2）逆转录反应条件如下：

37℃  15min（逆转录反应）；

85℃  5sec（逆转录酶的失活反应）。

配制反应液时，Random6mers和Oligo-p(dT)18Primer（如序列表中SEQID NO：3所示）同时使用，可以有效的将全长mRNA逆转录为cDNA。另外，反应体系可以按要求相应放大，10μl的反应体系可最大使用500ng的总RNA。

表1逆转录反应体系的组成

组分名称	体积(μl)
		总RNA(1μg)	×μl
Oligo-p(dT)18Primer（50μM）	0.5μl
		5×PrimeScriptTM缓冲液	2.0μl
随机六聚体(100μM)	0.5μl
		PrimeScriptTM反转录酶混合液	0.5μl
反转录酶（10U/μl）	2.0μl
		RNase Free dH2O	补到10μl

2.4大肠杆菌的生长、维持和保藏

大肠杆菌接种于LB液体培养基，37℃，230r/min振荡培养过夜；带质粒的菌株在培养时，培养基中加入相应的抗生素以保证质粒的存在。将培养好的新鲜平板置于4℃可短期保存菌种；长期保藏一般采取甘油冷冻保存法，即将大肠杆菌新鲜菌液加入等体积40%无菌甘油，混匀后置于-20℃或-70℃保藏。

2.5CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞

(1)用新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保存菌液接种2ml LB的液体培养基，于37℃振荡培养过夜；

(2)以1%的接种量接种装有20ml LB的液体培养基的250ml摇瓶，于37℃振荡培养1.5h左右，控制OD600在0.3-0.5；

(3)将菌液移入50ml的无菌塑料离心管，在冰浴中放置10min；

(4)4℃，8000r/min离心(Hitachi R15A转子，下同)5min，沉淀菌体，倾去培养液，并将离心管倒置以使培养液尽量流尽；

(5)将菌体沉淀悬浮于10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，冰浴30min；

(6)4℃，8000r/min离心5min回收菌体，倾去上层溶液并将离心管倒置以使残留溶液尽量流尽；

(7)将菌体悬浮于800μl用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，置于4℃，48h内使用；

(8)感受态细胞也可经液氮速冻后置-70℃冰箱保存，用前于37℃水浴融化。

2.6大肠杆菌质粒的分离

(1)将在甘油冷冻管中保存的菌液或在平板上生长过夜的单菌落接种于含有100μg/ml Amp的LB液体培养基试管中，37℃振荡培养过夜。

(2)吸取1.5ml菌液于Eppendorf离心管，离心（台式离心机，16,100g×1min），弃去上清液，真空吸干残余液体。

(3)将沉淀重新悬浮于100μl Solution I，于旋涡混和器上振荡使菌体分散，置于冰浴中10min。

(4)加入200μl新鲜配制的Solution II，盖紧盖子后，颠倒管子数次使Solution II与菌体充分接触，以便细胞裂解，在冰浴中保持3～5min。

(5)加入150μl预冷的Solution III，剧烈摇动管子使之充分混和，置于冰浴中保持3～5min。

(6)离心（台式离心机，16,100g×10min），将上清液移至另一离心管，加入0.6倍体积异丙醇，室温放置15min。

(7)离心（台式离心机，16,100g×10min）弃去上清，沉淀用70%冰冷乙醇洗涤后置于真空干燥器中干燥。

最后加入20μl TE溶液溶解沉淀，质粒溶液在4℃或-20℃保存。

2.7大肠杆菌质粒转化

(1)将适量质粒或DNA连接产物(体积≤10μl，DNA≤50ng)用冷却的无菌吸头加入含有100μl感受态细胞、预先冰浴的Eppendorf离心管中，用手指轻叩离心管底部，小心混匀，在冰浴中保持30min；

(2)将离心管置42℃恒温水浴中热激90s，随后迅速将离心管置冰浴2min；

(3)加入800μl LB液体培养基，颠倒混匀，37℃温和振荡1h；

(4)将转化的菌液涂布于含有适量抗生素的LB平板表面，打开平板上盖，置超净台上将液体吹干；

(5)倒置平板，于37℃培养过夜(14-16h)。

2.8从电泳凝胶中回收DNA片段

(1)将电泳后的琼脂糖凝胶置于长波紫外灯下，切出含目的DNA片段的凝胶(尽量切去不含DNA的凝胶)，装入一个预先称重的Eppendorf管中，称出凝胶的重量；

(2)加入三倍凝胶重量的6mol/L NaI(一般每0.1g凝胶加300μl)，于50℃水浴保温5min，期间振荡离心管1-2次，使凝胶完全融解；

(3)将Glass Milk（Glass milk购买自sigma公司）用旋涡混和器剧烈振荡悬浮均匀，吸取5μl加入步骤2的离心管，并于旋涡混和器上混匀，置于冰浴5-10min，每隔1-2min振荡离心管混匀；

(4)最大转速离心(Eppendorf5415R台式离心机，下同)5s，沉淀GlassMilk，小心吸去上清液；

(5)加入200μl于-20℃冷冻的New Wash缓冲液，于旋涡振荡器上悬浮Glass Milk，最大转速离心5s，弃上清。重复三次，最后一次洗涤后尽量吸干管底残余的New Wash缓冲液，打开管口置室温片刻以使乙醇挥发干净；

(6)加入5-10μl无菌蒸馏水，振荡使Glass Milk悬浮，放置50℃水浴保温5min，使DNA解吸附。最大转速离心1min，将洗脱液移入一个新离心管。重复三次，合并洗脱液；

(7)再次于最大转速离心1min，去除沉淀可能带入的Glass Milk，将洗脱液移入一个新的离心管。此上清液可直接用于连接和酶切反应。

2.9生物信息学指导PCR简并引物的设计

检索GenBank数据库，搜集其中收录的真菌来源噻唑合成酶的氨基酸和对应核苷酸序列，根据具体菌种亲缘关系的远近，应用Vector NTI Advance10软件包(Invitrogen公司)的AlignX多序列比对程序分析，找出2个间隔距离在100bp以上、高度保守的氨基酸序列区（BlockS）。把两个保守域的蛋白质序列转换为简并核苷酸序列，然后根据该简并核苷酸序列设计简并引物。

2.10PCR反应体系

PCR反应体系配方如表2所示。

表2PCR反应体系的配方

配方	体积(μl)
		10×缓冲液	2
5’-引物(10μmol/L)	1
		3’-引物(10μmol/L)	1
dNTPs(2.5mmol/L each)	2
		模板DNA	1
rTaq酶	0.2

dd H2O

补到20

体系中的模板DNA需根据实际情况进行稀释。

2.11阳性重组子的筛选及鉴定

阳性重组子的菌落PCR鉴定：选取平板上长出的乳白色单菌落，挑取出，置于含100μg/ml Amp的2ml液体LB的试管中，在37℃，120r/min条件下培养过夜，之后利用相应引物进行菌液PCR。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如果与目的DNA大小一致的条带，证明质粒重组正确，是阳性重组子。

3实验结果

3.1顶头孢霉菌基因组DNA以及总RNA的提取

按照方法2.2提取顶头孢霉C13的RNA，然后逆转录为cDNA，作为PCR反应的模板。

3.2噻唑合成酶基因片段的扩增

3.2.1PCR简并引物的设计

根据噻唑合成酶登录号分别为ABN45976，ACB70465.1，XM_002146726.1，XP_001394167.1，XP_003169195.1，XP_750725.1，ABN45968.1的7个菌株进行引物的设计和参考。采用正义引物（如序列表中SEQ ID NO：4所示），和反义引物（如序列表中SEQ ID NO：5所示），其中Y＝C或T；W＝A或T；S＝C或G；K＝G或T；R＝A或G；M＝A或C；B=G或C或T；H=A或C或T；D=A或G或T；V=A或G或C。

3.2.2噻唑合成酶中间部分基因片段的扩增

考虑到内含子的问题，我们按照方法2.2得到C13菌株RNA，并通过逆转录反应得到相应的cDNA（逆转录体系如表2所示），以该cDNA为模板，采用3.2.1中设计的引物正义引物（SEQ ID NO：4），反义引物（SEQ ID NO：5）进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：（1）95℃变性5min，（2）94℃预变性30s，（3）退火时间60s，（4）72℃，3min，其中步骤（2）-（4）先在非严谨退火温度35-40℃进行2-5个循环，随后在较严谨的退火温度50℃下重复25-40个循环，（5）72℃，10min，10℃过夜。

PCR扩增得到与我们预期大小相符的噻唑合成酶基因部分片段，如图1所示，其中泳道1为PCR产物，泳道2为DL2000marker，所得条带大小约为435bp。

3.2.3PCR产物的亚克隆及测序

从凝胶电泳中回收基因片段PCR产物，将其与pMD19-T克隆载体（pMD19-T是一种常用的克隆载体，大小为2692bp，具有Amp抗性基因）在16℃下过夜连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，按照方法2.11随机挑取阳性的乳白色单菌落，通过菌液PCR方法，采用3.2.1设计的引物SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，采用3.2.2所述的PCR程序。PCR扩增结果表明该重组子正确，取200μl菌液直接送英骏公司进行测序。

3.2.4噻唑合成酶全长基因的克隆

将所得测序的结果在NCBI数据库中经过比对后发现，该噻唑合成酶在数据库里与其他菌种的噻唑合成酶基因以及氨基酸序列的同源性较高。Blastx的比对结果，与很多菌株的噻唑合成酶的同源性基本都达到了71%到86%之间。比对结果显示所得基因序列和氨基酸序列都与木霉的序列相似性较高，将克隆所得片段与木霉噻唑合成酶的蛋白序列比对，可知本发明所得序列位于约75-219的位置。

由此证明上述噻唑合成酶部分基因片段扩增时选择的参考菌株是具有参考价值的，所以在扩增全长序列时选用同源性最高的几个菌株（所述参考菌株的登录号分别为：ACB70465.1，XP_002146762.1，XP_001267966.1，EGX96980.1，XM_001835931.2，XM_002479008.1）做参考，在结合比对时同源性很高的几个菌如Cordyceps militaris在基因和氨基酸比对时，同源性分别为82%和79%，而Coprinopsis cinerea在基因比对时同源性达到78%。再根据筛选过的参考菌株，设计5’端和3’端引物直接扩增全长基因序列。

同时利用已克隆得到的435bp的片段结合参考菌种，把整个基因分为上游和下游，分段扩增全长序列，我们可以选取我们测得的一段序列分别作为上游、下游的正义以及反义引物，来扩增全长片段。

上述两种策略同时进行，经过PCR扩增，其中上游片段的PCR扩增反应包括以下步骤：（1）95℃5min，（2）94℃30s，（3）52℃1min，（4）72℃2min，步骤（2）-（4）重复30个循环，（5）72℃10min，10℃过夜，通过上述PCR扩增方法，得到了该基因上游的全部序列。

用正义引物（如序列表中SEQ ID NO：6所示），与扩增435bp的第一对引物的反义引物（如序列表中SEQ ID NO：5所示），通过上述上游片段的PCR扩增反应可以得到编码从1-219个氨基酸的基因序列，见图2所示，其中泳道1为52℃所得PCR产物，泳道2为55℃所得PCR产物，泳道3为DL2000marker。

分段扩增下游的部分序列所利用的引物序列为：正义引物如序列表中SEQ ID NO：7所示；反义引物如序列表中SEQ ID NO：8所示。

通过下游片段PCR扩增得到了下游的部分序列，所述下游部分片段PCR扩增反应包括以下步骤：（1）95℃，预变性5min，（2）94℃，变性30s，（3）50℃，退火1min（4）72℃，延伸2min，其中步骤（2）-（4）重复30个循环，（5）72℃，10min，10℃过夜。下游部分片段PCR扩增结果如图3所示，其中泳道1为PCR产物，泳道2为DL2000marker。

经过上述两种PCR扩增得到了大部分的噻唑合成酶基因片段，但是由于尾部接近20个氨基酸大小的一段片段各个菌株的差异较大，给引物的设计带来了极大的困难，直接用简并引物进行PCR扩增也未获成功。考虑到真核生物mRNA的尾部都有一段polyA尾巴，而我们在逆转录时采用了oligodT作为引物进行扩增，因此采用oligo dT作为反义引物，选取已测序列中一段作为正义引物，该正义引物的序列为序列表中SEQ ID NO：9所示。反义引物dT的Tm为30.6℃，正义引物的Tm为50℃，因此PCR反应的退火温度分别设置了30、35、40、45、50、55℃的温度梯度，扩增噻唑合成酶下游片段，其中所述PCR的反应体系如表2所示。

所述噻唑合成酶下游片段的PCR扩增反应包括以下步骤：（1）95℃，5min，（2）94℃，30s，（3）30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃梯度退火，1min，（4）72℃，2min，步骤（2）-（4）重复30个循环，（5）72℃，10min，10℃过夜。PCR结果见图4，其中泳道1为30℃所得PCR产物，泳道2为35℃所得PCR产物，泳道3为40℃所得PCR产物，泳道4为DL2000marker，泳道5为λ/HindIII酶切产物，泳道6为45℃所得PCR产物，泳道7为50℃所得PCR产物，泳道8为55℃所得PCR产物。

从图4可以看出，所得到的条带并不单一，根据我们从数据库中得到的已有的噻唑合成酶核苷酸序列可知，一般噻唑合成酶的大小处于950-1200bp左右，由于正义引物位于268bp处，所以我们选择大于750bp，小于1000bp的最亮的条带回收，并进行亚克隆，所述的亚克隆包括以下步骤：从图4所示的凝胶泳道2中回收大于750bp，小于1000bp的最亮的条带，将条带经胶回收后与克隆载体pMD-19连接，得到的重组载体送至测序公司测序，这段序列是从268bp到尾端的序列。这样噻唑合成酶的上下游序列都测出来了，重新设计引物进行全部cDNA序列的扩增，得到了987bp的完整的cDNA的序列。

cDNA的序列PCR扩增引物：正义引物如序列表中SEQ ID NO：10所示，反义引物如序列表中SEQ ID NO：11所示。

噻唑合成酶的cDNA全长序列的PCR扩增的反应体系为表2所示，PCR扩增程序为：（1）95℃，5min，（2）94℃，30s，（3）52℃，1min，（4）72℃，2min，其中步骤（2）-（4）重复30个循环，（5）72℃10min，10℃过夜.。PCR扩增体系中的模板是上述提取的RNA经逆转录获得的cDNA片段或者上述所得基因组DNA。所述PCR的反应体系如表2所示，所得结果如图5所示，其中泳道1是以cDNA为模板所得PCR产物，泳道2是基因组DNA为模板所得PCR产物，泳道3为λ/HindIII酶切产物。

取上述所得200μl菌液测序，将测序结果放入NCBI数据库中进行比对，比对结果显示该序列与多个菌株的噻唑合成酶的同源性均较高，基本达到75%以上。至此，我们就得到了噻唑合成酶的cDNA全长序列，登录号为KF010923，全长987bp，根据得到的全长序列，设计了一段引物：正义引物如序列表中SEQ ID NO：12所示；反义引物如序列表中SEQ ID NO：13所示，以顶头孢霉基因组DNA为模板通过PCR扩增方法得到了噻唑合成酶的基因组全长序列。其中所述PCR的扩增包括以下步骤：（1）95℃，5min，（2）94℃，30s，（3）55℃，1min，（4）72℃，2min，其中步骤（2）-（4）重复30个循环，72℃10min，10℃过夜。所述PCR的反应体系如表2所示。

所得噻唑合成酶的基因组全长序列的PCR扩增产物的长度为1044bp，其名称为AcTHi基因，所述噻唑合成酶的基因组全长序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

3.2.5噻唑合成酶基因序列的分析

我们把全基因序列上传到http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用BLAST程序进行序列同源性比较和打分。通过NCBI Blastn和Blastp核酸及蛋白质序列比对分析，核苷酸序列和蛋白序列的比对结果可以看到我们测得的序列与基因库中的噻唑合成酶的基因序列有着比较高的同源性，基本在75%以上，具体见表3。由此证明根据蛋白质组的结果对该蛋白的猜测是正确的。

表3cDNA比对同源性

把所得基因组的序列和cDNA序列用Vector NTI Advance10软件包(Invitrogen公司)的AlignX多序列比对程序分析，可知该酶在基因组序列上的899位到957位有一个58bp的内含子。

根据CPC高低产菌株蛋白质组学的结果，选定在CPC高、低产菌株中表达差异较大的蛋白，获得了其部分质谱片段，综合这些信息，我们确定了研究对象之一为噻唑合成酶，噻唑合成酶与整个生物体的物质代谢和能量代谢以及CPC前体的生成相关。要分析这些蛋白的功能并利用该蛋白，首先要进行基因克隆。但是由于顶头孢霉基因组序列未知，为了克隆该未知基因，首先需要在生物信息学技术的指导下对蛋白质/核酸数据库中海量的序列信息进行针对性的搜索比对，确定与希望克隆的目的基因在物种水平上高度同源的参考菌种，并收集这些菌株中噻唑合成酶的蛋白序列以及基因序列，通过Vector NTI Advance10软件包(Invitrogen公司)的AlignX多序列比对程序分析，找出2个间隔距离在100bp以上、高度保守的氨基酸序列区（BlockS）。根据这些序列，设计不同的引物。使用这一方法原则，我们从头孢菌素C产生菌的基因组和cDNA中分别克隆得到了噻唑合成酶的基因组序列和cDNA全长序列。

将克隆所得的基因片段，在NCBI数据库中进行了分析比对，发现与许多菌株中的噻唑合成酶的相似度都达到75%以上，证明我们所克隆得到的片段与我们之前的推测是一致的。另外将基因组序列与cDNA序列进行了比对，发现在噻唑合成酶全长基因的899-957bp处有一个内含子。

本发明通过分步克隆方法得到了全长的AcTHi基因，参考蛋白质组结果研究该基因及其编码蛋白对CPC合成的影响，为顶头孢霉的基因工程研究奠定了良好基础。

效果实施例1顶头孢霉噻唑合成基因功能研究

由于顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)在基因敲除过程中同源重组频率很低，因此本研究不采用基因敲除的手段，而采用RNA干扰技术达到基因沉默的目的，以此来研究该基因的功能。制备顶头孢霉LD-7原生质体，得到了RNA干扰的两种顶头孢霉菌株，并命名为L-1和L-4，所述顶头孢霉菌株的制备方法请参见文献：龚桂花.cefG基因沉默工程菌的构建及CmcH在大肠杆菌中的表达和纯化.上海医药工业研究院硕士学位论文【D】.上海：上海医药工业研究院，2009:18-21。

分别提取发酵培养五天的转化子L-1、L-4以及出发菌LD-7的总RNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模板进行定量PCR，以actin基因为内参基因，进行荧光定量PCR检测。结果显示，L-4号转化子的AcThi转录水平相对于出发菌下降了55%。

将2个转化子L-1、L-4以及出发菌LD-7分别进行发酵培养，从发酵结果来看，转化子L-1和L-4的CPC产量均比出发菌株LD-7的要低，分别降低了约64%和57.2%，这个结果也与以上的RT-PCR结果相对应，说明噻唑合成酶转录水平的降低直接导致了该菌株CPC产量的降低。

效果实施例2顶头孢霉噻唑合成酶的基因产物具有蛋白酶活性

在顶头孢霉中将AcTHi基因进行过表达，实验步骤详见参考文献：Liu Y,Gong G,Xie L,Yuan N,Zhu C,Zhu B,Hu Y*,Improvement of Cephalosporin Cproduction by recombinant DNA integration in Acremonium chrysogenum.Molecular Biotechnology,44:101-109,2010，所得重组菌中CPC的产量提高了10%以上，结果如表4所示：

表4顶头孢霉CPC出发菌和AcTHi表达菌的CPC产量

从表4所示结果可以看出，当顶头孢中霉噻唑合成酶的基因过表达时，所得过表达噻唑合成酶基因的突变株CPC的产量也相应有所提高。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的核酸，其特征在于，其是如下(1)或(2)的核酸：

(1)由序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的核酸；

(2)编码如序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种分离的蛋白质，其特征在于，其是由序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

3.一种包含如权利要求1所述核酸的重组表达载体。

4.一种包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。

5.如权利要求1所述的核酸或如权利要求3所述的重组表达载体在制备头孢霉素C中的应用。

6.如权利要求2所述的蛋白质或如权利要求4所述的重组表达转化体在制备头孢霉素C中的应用。

7.一种产头孢霉素C菌株的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：将权利要求3所述重组表达载体转化至宿主微生物中，制得产头孢霉素C的菌株，将所得菌株在25℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。

8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述的宿主微生物为C13菌株。

9.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述震荡培养的震荡速度为200～300rpm，培养时间为36～72小时。

10.如权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述震荡培养的震荡速度为230rpm，培养时间为72小时。