CN113774039A - 重组型dna聚合酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。本发明还公开了基于所述重组型DNA聚合酶的核酸分子、表达载体、宿主细胞、制备方法、核酸的扩增方法和试剂盒。

Description

重组型DNA聚合酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组型DNA聚合酶及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术被广泛地应用于DNA分子扩增技术中，其中DNA聚合酶作为PCR中的关键组分对DNA的复制起着至关重要的作用。
重组型高保真DNA聚合酶是一种校对DNA聚合酶，具有续进增强域和通用引物退火特性，在保持优良的保真性的同时，扩增量和延伸性也有显著提升。该聚合酶适用于准确性高的应用(如克隆、测序、定点突变)，可具有5′→3′DNA聚合酶活性、3′→5′外切酶活性。
目前，国内外关于高保真DNA聚合酶的研究及应用还在不断地推进，大量的专家学者探索了聚合酶的自身连接方式乃至整体结构域，深入分析了DNA聚合酶活性域、外切酶校对活性域和续进增强域的组成，并在此基础上引入新的延伸因子等。然而，通常的高保真DNA聚合酶碱基延伸速度与扩增片段的长度低于普通的Taq DNA聚合酶，尤其是对于难扩增的模板片段，扩增效率较低。
发明内容
基于此，有必要针对高保真酶对难扩增片段的扩增效率差的问题，提供一种重组型DNA聚合酶及其应用。
重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
在其中一个实施例中，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
重组型DNA聚合酶核酸分子，其含有编码所述的重组型DNA聚合酶的核苷酸序列。
表达载体，包括所述的重组型DNA聚合酶核酸分子。
宿主细胞，包括所述的表达载体。
在其中一个实施例中，所述宿主细胞是微生物细胞。
一种试剂盒，其含有所述的重组型DNA聚合酶。
所述的重组型DNA聚合酶的制备方法，在所述重组型DNA聚合酶表达的条件下培养所述的宿主细胞。
核酸的扩增方法，在适合模板扩增的条件下，采用所述的重组型DNA聚合酶进行PCR扩增。
本发明对Pfu DNA聚合酶-Sso7d蛋白形成的重组型DNA聚合酶进行研究，得到多种重组型DNA聚合酶，发现Sso7d蛋白直接连接到Pfu DNA聚合酶的C端，或者通过特定的蛋白连接肽连接在C端能够明显提高聚合酶对于扩增困难序列的扩增活性，对于PCR扩增的便利应用提供基础。
附图说明
图1为本发明实施例1-2的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例1的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例1的蛋白亲和层析的第4泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例2的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例2的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
图2为本发明实施例3-4的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例3的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例3的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例4的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例4的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
图3为本发明实施例5-6的蛋白纯化结果图，其中A1、A2分别为实施例5的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例5的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例6的蛋白亲和层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例6的蛋白亲和层析的第2泳道对应的蛋白进行的阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
图4为本发明实施例7-10的蛋白亲和层析图，其中A、B、C、D分别为实施例7-10的蛋白亲和层析图，E为对应的电泳图；
图5为本发明实施例7-10的蛋白阳离子交换柱层析图，各蛋白阳离子交换柱层析均取自图4的第2泳道对应的蛋白，其中A1、A2分别为实施例7的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，A3、A4分别为取实施例8的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B1、B2分别为实施例9的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图，B3、B4分别为取实施例10的蛋白阳离子交换柱层析图及其对应的电泳图；
图6为本发明实施例1-10的蛋白浓度测定结果图；
图7为本发明以棉花为模板的实施例1-10的扩增结果图；
图8为本发明以花生为模板的实施例1-10的扩增结果图；
图9为本发明以水稻为模板的实施例1-10的扩增结果图；
图10为本发明以小麦为模板的实施例1-10的扩增结果图；
图11为本发明以玉米为模板的实施例1-10的扩增结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于描述可以包含部分或全长蛋白质的蛋白质分子。
如本领域已知的，“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“寡肽”是其α碳通过肽键进行连接的氨基酸(通常为L-氨基酸)的链，所述肽键通过一个氨基酸的α碳的羧基和另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应而形成。通常，构成蛋白质的氨基酸按顺序进行编号，从氨基末端残基开始，并以朝向蛋白质的羧基末端残基的方向增加。术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中互换使用并且指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸为非天然氨基酸、合成氨基酸或氨基酸模拟物的氨基酸聚合物。
“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其呈单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”可与基因、核苷酸、多核苷酸、cDNA、DNA及mRNA互换使用。除非特别限制，该术语包括含有具有与天然核酸类似结合性质的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非特别限制，具体核苷酸序列还包括其保守修饰变体(例如，含有简并密码子取代的那些)及互补序列以及具体描述的序列。
“载体(vector)”指可以用于将第二种核酸分子运送到细胞内的核酸分子。在一个实施方案中，载体允许插入到该载体中的DNA序列复制。载体可以包含启动子以增强核酸分子在至少某些宿主细胞中的表达。载体可以自主复制(染色体外的)或者可以整合到宿主细胞染色体中。在一个实施方案中，载体可以包括能够产生蛋白质的表达载体，所述蛋白质来源于插入到载体中的至少部分核酸序列。
如本文使用，术语“蛋白连接肽”是指将两个结构域以多肽链的线性氨基酸序列来连接的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。具体而言，蛋白连接肽可用于将Sso7d蛋白连接至Pfu DNA聚合酶蛋白。
本发明实施例提供一种重组型DNA聚合酶，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白。所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接。所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。
各蛋白连接肽序列：
SEQ ID NO:1：(EAAAK)5；
SEQ ID NO:2：(GGGGS)5；
SEQ ID NO:3：GGGSGS；
SEQ ID NO:4：GGGSGGSG；
SEQ ID NO:5：GGGTV；
SEQ ID NO:6：SS(GGGGS)3GM；
SEQ ID NO:7：(GGGGS)3；
SEQ ID NO:8：GTH；
SEQ ID NO:9：GSGGVD。
在一些实施方式中，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
在一些实施方式中，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
重组型DNA聚合酶，可通过标准合成方法、重组DNA技术或制备肽及重组蛋白的其他方法来制备。
本发明实施例还提供重组型DNA聚合酶核酸分子，其含有编码上述任一实施例的重组型DNA聚合酶的核苷酸序列。其可经密码子优化获得。
编码重组型DNA聚合酶的核酸分子可以通过直接产生所需DNA的方法例如传统的体外的化学合成方法或者PCR扩增和体外酶连结合的方法来制备。
本发明实施例还提供一种表达载体，包括所述的重组型DNA聚合酶核酸分子。
为了表达本发明的重组型DNA聚合酶，核酸分子被克隆到一个载体重组形成表达该重组型DNA聚合酶的表达载体。表达载体的选择是依据表达蛋白所选宿主细胞的性质而定。适合的这种表达载体可商购。当一种适合的表达载体是原核表达载体，例如λ噬菌体或细菌质粒时，优选在原核宿主中进行表达，更优选微生物宿主，特别是大肠杆菌。特殊原核表达载体的例子是pET载体例如pET-28a等。
将编码重组型DNA聚合酶的核酸分子克隆至表达载体以得到本发明的载体，其可以通过传统的限制和连接技术实现。
本发明实施例还提供一种宿主细胞，包括所述的表达载体。
宿主细胞是可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞等，真菌细胞例如酵母细胞或曲霉菌细胞等，昆虫细胞例如S2果蝇细胞或SF9细胞，和动物细胞例如纤维源细胞，CHO细胞，COS细胞，NS0细胞，Hela细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞等。在一些实施方式中，用于表达本发明重组型DNA聚合酶的宿主细胞优选是原核细胞，更优选微生物细胞，包括细菌细胞，例如：枯草芽孢杆菌，假单孢菌属，链球菌属或特别是大肠杆菌的细胞，例如BL21等。
本发明实施例还提供一种所述的重组型DNA聚合酶的制备方法，在所述重组型DNA聚合酶表达的条件下培养所述的宿主细胞。
转化宿主细胞可以用适合于细胞的传统技术来进行。例如，大肠杆菌细胞的转化步骤包括，例如用Ca2+预处理细胞以便允许DNA吸收，以及与表达载体一同孵育。随后的转化细胞选择可这样实现：通过将细胞转移到一种能将转化细胞从原代细胞中分离出来的选择性生长培养基中，或通过对由孵育细胞得到的小量制备DNA样品的限制性分析。
转化过的宿主细胞可以通过本领域公知方法在包含以下成份的液体培养基中培养：一种可同化的碳源，例如糖如葡萄糖或乳糖；一种氮源，例如氨基酸、肽、蛋白，或其降解产物例如蛋白胨、铵盐等；以及一种无机盐，例如钠、钾、镁或钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐。培养基还可含有，例如促进生长的物质，如微量元素，例如铁、锌、锰等。
培养可用本领域公知的各种方法进行。选择培养条件，例如温度、培养基pH和发酵时间，以得到本发明聚合酶的最大表达水平。例如，大肠杆菌菌株最好在约20℃-40℃、优选约37℃，pH值为4-8、优选约7的条件下有氧条件下由深层液体培养法进行培养，培养中进行搅拌或振荡，培养约4-30小时，最好到本发明聚合酶的产量达到最高时为止。
表达出的重组型DNA聚合酶能通过常规方法从宿主细胞中或细胞培养物上清液中抽提出来，所述方法例如包括裂解细胞，然后进行亲和层析、离子交换层析等这样的层析法进行分离纯化，然后制备电泳例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或等电聚焦进行分析验证，等等。
本发明实施例还提供一种试剂盒，其含有所述的重组型DNA聚合酶。该试剂盒可用于DNA扩增，例如用于PCR反应。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有扩增缓冲液、dNTP及水中的至少一种。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有引物及探针中的一种或多种。
本发明实施例还提供一种核酸的扩增方法，在适合模板扩增的条件下，采用上述实施例的重组型DNA聚合酶进行PCR扩增。
其中，不同的重组型DNA聚合酶在不同的物种的PCR扩增中的扩增效果表现不同。
若所述模板来自棉花，则所述重组型DNA聚合酶的所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种的蛋白连接肽连接。
若所述模板来自花生，则所述重组型DNA聚合酶的所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种的蛋白连接肽连接。
若所述模板来自水稻，怎所述重组型DNA聚合酶的所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种的蛋白连接肽连接。
若所述模板来自小麦，则所述重组型DNA聚合酶的所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种的蛋白连接肽连接。
若所述模板来自玉米，则所述重组型DNA聚合酶的所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间通过如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种的蛋白连接肽连接。
以下为具体实施例。
以下实施例所述的Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
实施例1
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion1)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、Sso7d蛋白结构域。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域直接连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
表1PCR程序
Figure BDA0003251011080000071
表2PCR成分配方
Figure BDA0003251011080000072
实施例2
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion2)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1:(EAAAK)5。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例3
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion3)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2:(GGGGS)5。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例4
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion4)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3:GGGSGS。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例5
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion5)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：4:GGGSGGSG。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例6
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion6)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5:GGGTV。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例7
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion7)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：6:SS(GGGGS)3GM。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例8
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion8)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：7:(GGGGS)3。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例9
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion9)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：8:GTH。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例10
一种重组型高保真DNA聚合酶(Phusion10)，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域，其中蛋白连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：9:GSGGVD。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的C端，由此构成一个含有两个相对独立的结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成。并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Pfu-Sso7d，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Pfu-Sso7d)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。纯化后测定蛋白酶浓度以及SDS-PAGE测定蛋白酶纯度，然后利用PCR反应测定酶活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
实施例11
一种重组型高保真DNA聚合酶，包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域。
以上重组型高保真DNA聚合酶的制备方法如下：
(1)重组表达质粒的构建及宿主菌株的转化：
Sso7d蛋白结构域通过蛋白连接肽连接到Pfu DNA聚合酶的N端，由此构成一个含有两个结构域的融合蛋白，此融合蛋白酶编码的DNA序列由人工合成，并经限制性内切酶消化，连接到表达载体pET-28a，构成重组质粒pET-28a-Sso7d-Pfu，并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。
(2)重组高保真DNA聚合酶的诱导发酵及蛋白纯化：
BL21(DE3)(pET-28a-Sso7d-Pfu)经过夜活化后，以体积比1％的接种量接入含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3～4h至OD600达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3～4h。收集菌体，进行超声破碎后，离心取上清液先过亲和镍柱，然后过阳离子交换柱来纯化蛋白。但结果发现，由于连接方式导致蛋白状态不稳定，采用实施例1～10的任意一种蛋白连接肽得到的大肠杆菌转化蛋白在镍柱纯化透析后则发生蛋白沉淀现象，无法完成阳离子交换纯化，所以利用镍柱纯化后的蛋白酶进行PCR反应测定酶活性，琼脂糖凝胶电泳显示没有PCR产物生成，所以蛋白酶没有活性，PCR程序及配方如表1和表2所示。
采用相同的条件下，对实施例1～10得到的Phusion1～10的亲和层析和过阳离子交换柱得到纯化的蛋白。纯化的结果如图1-5所示。其中，蛋白亲和层析图和阳离子交换柱层析图中UV1-280nm为目标谱线。其中，Phusion1亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为1：上清；2：流穿；3：起峰；4：峰左端；5：峰右端；6、7：峰尾。Phusion1过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：起峰；3：峰左端；4：峰右端；5：峰尾。Phusion2亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：峰左端；3：峰右端；4：峰尾。Phusion2过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：峰左(透析)；3：峰右。Phusion3亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：峰左端；3：峰右端；4、5：峰尾。Phusion3过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：起峰；3：峰左端(透析)；4：峰右端；5：峰尾。Phusion4亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：峰左；3：峰右；4：峰尾。Phusion4过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；4：主峰。Phusion5亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：峰左端；3：峰右端；4：峰尾。Phusion5过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2：起峰；3：峰左(透析)；4：峰右。Phusion6亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为：流穿；2：峰左端；3：峰右端；4：峰尾。Phusion5过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为1：流穿；2、3：起峰；4：主峰(透析)；5：峰尾。Phusion7-10亲和镍柱层析电泳图中，各泳道为：1：流穿；2：纯化峰部位；3：峰尾部。Phusion7-10过阳离子交换柱层析电泳图中，各泳道为：1：起峰；2：峰左端；3：峰右端；4：峰尾。
采用相同的条件下，对实施例1～10纯化后的重组高保真DNA聚合酶进行浓度测定，分别进行稀释，最终选择得到与对照组金牌酶相同的浓度(60ng/μl)，得以在相同条件下进行后续的功能测定。结果如图6所示。其中，泳道1～6分别代表BSA浓度为2.5、2、1、0.5、0.25、0.125mg/ml；泳道7～12分别代表Phusion稀释倍数依次为0、2、4、8、16、32；泳道13代表Phusion浓度为60ng/μl；泳道14代表浓度为60ng/μl的对照金牌酶。其中的金牌酶作为本申请的对照组，该金牌酶同样包括Pfu DNA聚合酶蛋白、蛋白连接肽、Sso7d蛋白结构域。蛋白连接肽的氨基酸序列为GTGGGG。
以为棉花、花生、水稻、小麦和玉米作为测试物种。选择使用金牌酶扩增相对困难的模板和引物作为测试对象。
利用棉花为模板，分析14对引物的扩增结果，如图7所示，电泳结果表明，Phusion1、3-4、6-10的扩增条带均比金牌酶亮，特别是Phusion10最亮，说明重组高保真DNA聚合酶Phusion1、3-4、6-10的酶活均比金牌酶高，特别是Phusion10酶活最高。
利用花生为模板，分析3对引物的扩增结果，如图8所示，电泳结果表明，Phusion1-10的扩增条带均比金牌酶亮，特别是Phusion10最亮，说明重组高保真DNA聚合酶Phusion1-10的酶活均比金牌酶高，特别是Phusion10酶活最高。
利用水稻为模板，分析6对引物的扩增结果，如图9所示，电泳结果表明，Phusion1、3、6-10的扩增条带均比金牌酶亮，特别是Phusion10最亮，说明重组高保真DNA聚合酶Phusion1、3、6-10的酶活均比金牌酶高，特别是Phusion10酶活最高。
利用小麦为模板，分析5对引物的扩增结果，如图10所示，电泳结果表明，Phusion1-4、6-10的扩增条带均比金牌酶亮，特别是Phusion10最亮，说明重组高保真DNA聚合酶Phusion1-4、6-10的酶活均比金牌酶高，特别是Phusion10酶活最高。
利用玉米为模板，分析4对引物的扩增结果，如图11所示，电泳结果表明，Phusion6-7、9-10的扩增条带均比金牌酶亮，特别是Phusion10最亮，说明重组高保真DNA聚合酶Phusion6-7、9-10的酶活均比金牌酶高，特别是Phusion10酶活最高。
以上结果说明，对于不同的物种各高保真DNA聚合酶的酶活不同，可以根据扩增的模板的物种来源选择活性更高的聚合酶。Phusion9-10在上述几种物种的扩增中均表现出高的酶活，特别是Phusion10酶活最高，适用于各物种的扩增。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 北京擎科生物科技有限公司
<120> 重组型DNA聚合酶及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Gly Gly Thr Val
1 5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Met
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 8
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Gly Thr His
1
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Gly Ser Gly Gly Val Asp
1 5
<210> 10
<211> 64
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ser Ala Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp
1 5 10 15
Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys Met Ile Ser Phe
20 25 30
Thr Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala Val Ser Glu
35 40 45
Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Lys Lys
50 55 60
<210> 11
<211> 785
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Met Gly His His His His His His Gly Gly Ser Met Ile Leu Asp Val
1 5 10 15
Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile Arg Leu Phe Lys Lys
20 25 30
Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg Thr Phe Arg Pro Tyr
35 40 45
Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile Glu Glu Val Lys Lys
50 55 60
Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg Ile Val Asp Val Glu
65 70 75 80
Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile Thr Val Trp Lys Leu
85 90 95
Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile Arg Glu Lys Val Arg
100 105 110
Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala
115 120 125
Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Glu Glu
130 135 140
Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu Gly
145 150 155 160
Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu
165 170 175
Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile Asp Leu Pro Tyr Val
180 185 190
Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Ile
195 200 205
Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr Tyr Asn Gly Asp Ser
210 215 220
Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly Ile Lys
225 230 235 240
Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Met Gln Arg Ile Gly
245 250 255
Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr
260 265 270
His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala
275 280 285
Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Asp
290 295 300
Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala
305 310 315 320
Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu Val Gly Gln Pro Leu
340 345 350
Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu
355 360 365
Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala Pro Asn Lys Pro Ser
370 375 380
Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Thr Gly Gly Phe
385 390 395 400
Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp
405 410 415
Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Val Ser Pro
420 425 430
Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr Asp Ile Ala Pro Gln
435 440 445
Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly Phe Ile Pro Ser Leu
450 455 460
Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Thr Lys Met Lys
465 470 475 480
Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Lys
485 490 495
Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala
500 505 510
Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp
515 520 525
Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu Leu Glu Glu Lys Phe
530 535 540
Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile
545 550 555 560
Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys Ala Leu Glu Phe Val
565 570 575
Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr Glu
580 585 590
Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Arg Tyr Ala Val
595 600 605
Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val Arg
610 615 620
Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu Glu
625 630 635 640
Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val Arg Ile Val Lys
645 650 655
Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile Pro Pro Glu Lys Leu
660 665 670
Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His Glu Tyr Lys Ala Ile
675 680 685
Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala Ala Lys Gly Val Lys
690 695 700
Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val Leu Arg Gly Asp Gly
705 710 715 720
Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu Tyr Asp Pro Lys Lys
725 730 735
His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala
740 745 750
Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg
755 760 765
Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Thr Ser Trp Leu Asn Ile Lys
770 775 780
Lys
785

Claims (10)

1.重组型DNA聚合酶，其特征在于，从N端到C端依次连接Pfu DNA聚合酶蛋白和Sso7d蛋白，所述Pfu DNA聚合酶蛋白和所述Sso7d蛋白之间直接连接或者通过蛋白连接肽连接，所述蛋白连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的重组型DNA聚合酶，其特征在于，所述Sso7d蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
3.根据权利要求1或2所述的重组型DNA聚合酶，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
4.重组型DNA聚合酶核酸分子，其特征在于，其含有编码如权利要求1～3任一项所述的重组型DNA聚合酶的核苷酸序列。
5.表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的重组型DNA聚合酶核酸分子。
6.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，其是微生物细胞。
8.如权利要求1～3任一项所述的重组型DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，在所述重组型DNA聚合酶表达的条件下培养权利要求6～7任一项所述的宿主细胞。
9.核酸的扩增方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的重组型DNA聚合酶进行PCR扩增。
10.试剂盒，其含有权利要求1～3任一项所述的重组型DNA聚合酶。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011891A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Strategene California Dna binding protein-polymerase chimeras
CN103562410A (zh) * 2011-04-08 2014-02-05 伯乐实验室公司 具有降低的非特异性活性的Sso7-聚合酶缀合物
CN104560909A (zh) * 2015-01-26 2015-04-29 江南大学 一种催化dna合成效率提高的dna聚合酶
CN104693270A (zh) * 2013-12-10 2015-06-10 清华大学 一种用于融合蛋白的连接肽
CN107841493A (zh) * 2016-09-21 2018-03-27 北京擎科新业生物技术有限公司 一种快速扩增型重组Taq DNA聚合酶及相关应用
CN109679932A (zh) * 2018-12-05 2019-04-26 广州奇辉生物科技有限公司 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用
CN110331141A (zh) * 2019-07-10 2019-10-15 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种突变型SSO7d SSB及其应用
CN111518873A (zh) * 2020-05-11 2020-08-11 南京君华基因科技有限公司 一种优化的扩增目标核酸的方法及应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011891A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Strategene California Dna binding protein-polymerase chimeras
CN103562410A (zh) * 2011-04-08 2014-02-05 伯乐实验室公司 具有降低的非特异性活性的Sso7-聚合酶缀合物
CN104693270A (zh) * 2013-12-10 2015-06-10 清华大学 一种用于融合蛋白的连接肽
CN104560909A (zh) * 2015-01-26 2015-04-29 江南大学 一种催化dna合成效率提高的dna聚合酶
CN107841493A (zh) * 2016-09-21 2018-03-27 北京擎科新业生物技术有限公司 一种快速扩增型重组Taq DNA聚合酶及相关应用
CN109679932A (zh) * 2018-12-05 2019-04-26 广州奇辉生物科技有限公司 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用
CN110331141A (zh) * 2019-07-10 2019-10-15 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种突变型SSO7d SSB及其应用
CN111518873A (zh) * 2020-05-11 2020-08-11 南京君华基因科技有限公司 一种优化的扩增目标核酸的方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA ŚPIBIDA，等: "Fusion of DNA-binding domain of Pyrococcus furiosus ligase with TaqStoffel DNA polymerase as a useful tool in PCR with difficult targets.", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶
CN114015672B (zh) * 2021-12-06 2022-05-31 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

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