CN104560909A - 一种催化dna合成效率提高的dna聚合酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种催化DNA合成效率提高的DNA聚合酶，属于生物工程技术领域。本发明先将Dbh第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Sso7d，构建出核苷酸掺入效率提高的Dbh，即Sdbh M76I、Sdbh A221S、Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS和Sdbh L250V这四个正向突变体，同时也提供了一种通过突变酶非保守位点增强酶持续合成能力的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种催化DNA合成效率提高的DNA聚合酶，更具体地涉及一种经修饰后对DNA亲和力提高的DNA聚合酶，属于酶工程领域。
背景技术
Y-家族DNA聚合酶Dbh是一类跨损伤合成聚合酶(TLS)，它能够代替复制性DNA聚合酶跨越模板损伤处使得DNA合成继续，从而帮助细胞抵抗DNA损害。但为了防止出现更多突变，跨越损伤后Dbh会被立即切除，正常的复制性聚合酶会恢复对DNA合成的控制，这就说明Dbh与DNA的结合是短暂的。Dbh的结构是典型的右手结构，分为拇指(thumb)、手掌(palm)、手指(finger)、小手指(little-finger)四个结构域，相比其它DNA聚合酶，Dbh的手指域很小，导致与新生碱基对的大沟几乎没有接触，另外它的拇指域短而粗，使得Dbh与DNA及掺入核苷具有较少的作用，总的来说，Dbh对其DNA底物施加的约束很少。它的结构特点和功能要求决定了Dbh有着较低的持续合成能力。
持续性合成能力的本质是在多轮催化中保留酶对聚合底物的亲和性，因此，提高聚合酶对底物的亲和力才是提高持续合成能力的本质途径。研究发现，Dbh保守残基中单个活性位点突变(Y12A)导致其识别核糖核苷酸能力丧失和核苷酸掺入率的降低；Dbh中LF域的非保守残基R336与DNA的结合和跨过损伤后磷酸二酯键的形成密切相关。
本发明以融合有Sso7d的Dbh即Sdbh为基础，构建突变体获得DNA持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，是先将Dbh第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Sso7d得到。所得突变体分别命名为Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS、Sdbh L250V、SdbhA221S、Sdbh M76I。
所述第241-245的氨基酸KSKIP、第250位的L、第221位的A、第76位的M均为非保守位点。
编码Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Dbh的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码Sso7d的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，编码N端通过柔性linker连接了蛋白Sso7d后的Dbh，即Sdbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，先在N端通过柔性linker连接蛋白Sso7d，得到Sdbh，然后再对Sdbh的成熟酶部分的相应位点进行突变。
在本发明的一种实施方式中，突变体N端不融合Sso7d，同样能够提高持续合成能力。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，是通过定点突变获得突变体，再在突变体的N端以柔性linker融合Sso7d。
本发明筛选获得的突变体Sdbh M76I、Sdbh A221S、Sdbh L250V、SdbhKSKIP(241-245)RVRKS的持续合成能力提高，这些改造后的Dbh以及携带该酶的试剂盒将对基因工程的操作产生重要积极作用。
附图说明
图1Sdbh突变体酶的持续合成能力
图2Sdbh及突变体的DNA聚合酶活性
图3Sdbh及突变体酶的持续合成能力
具体实施方式
实施例1突变位点的确定
通过同源序列比对，确定了Dbh序列中的非保守位点以及这些位点的突变方向及频率。结果如表1所示，确定了T37F、I62V、M76I、A221S、Y249I、L250V、K337R和KSKIP(241-245)RVRKS这八个突变方向，利用计算机模拟这八个突变体Dbh与DNA的结合及结合自由能计算。结果如表2所示，理论上结合自由能降低意味着Dbh与底物的结合更为稳定，也就说明酶与底物的亲和力更大，从而酶的持续合成能力提高，从表2分析可知，除了K337R和Y249I外其余突变都能增强持续合成能力。
表1.非保守氨基酸的突变残基种类及频率
表2.Dbh及其突变体与DNA复合物的结合自由能
实施例2Sdbh突变酶构建及持续合成能力比较
通过定点突变分别构建8个突变体Dbh T37F、Dbh I62V、Dbh M76I、DbhA221S、DbhKSKIP(241-245)RVRKS、Dbh Y249I、Dbh L250V、Dbh K337R，再在各突变体的N端通过柔性linker连接蛋白Sso7d，得到8个相应Sdbh突变体：Sdbh T37F、Sdbh I62V、Sdbh M76I、Sdbh A221S、Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS、Sdbh Y249I、Sdbh L250V、Sdbh K337R。编码Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Dbh的出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码N端通过柔性linker连接蛋白了Sso7d后的Dbh，即Sdbh的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码Sso7d的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
通过持续合成能力实验来评价Sdbh及其八个突变体的持续合成能力。恒定浓度(30nM)的退火好的荧光标记引物/模板添加到反应缓冲液(10mM HEPES NaOH(pH7.4)，50mMNaCl，10mM MgCl2，200mM dNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的Triton X-100)。添加不同浓度的DNA聚合酶(从5到1000nM)在37℃启动DNA的合成。孵育5min后，加入10μL右旋糖苷终止反应，反应产物在100℃变性5分钟，简短置冰。反应混合物在10％尿素TBE PAGE分离(Bio-Rad)再由Typhoon9400扫描仪可视化。
结果如图1所示，与Sdbh相比，当酶量比P/T高的时侯(80倍P引物/T模版的酶量)，除了Sdbh Y249I外，Sdbh突变体与Sdbh合成长度几乎相同的产品，大约为400nt。当酶与P/T相同摩尔量时，Sdbh K337R和Sdbh I62V复制长度约为200nt，而Sdbh Y249I只复制了100nt，表现出相比Sdbh显着降低的持续合成能力，其余的Sdbh突变酶显示与Sdbh类似的持续合成能力。当酶量比P/T量低(酶量2.5倍的P/T)，可以反应出聚合酶单次结合的持续合成能力，Sdbh T37F和Sdbh I62V显示出每次结合平均100nt的持续合成能力，表明这两个突变没有改变Sdbh的持续合成能力，Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS、Sdbh L250V、Sdbh A221S和Sdbh M76I延伸约200nt的DNA，相比Sdbh，它们的持续合成能力增加1.5倍，Sdbh K337R和Sdbh Y249I表现为几乎没有产品延伸。
总的来说，Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS、Sdbh L250V、Sdbh A221S和Sdbh M76I的持续合成能力增加了，而Sdbh K337R和Sdbh Y249I突变的持续合成能力降低了，Sdbh T37F和Sdbh I62V突变对持续合成能力无影响。未在N端融合Sso7d的突变体Dbh T37F、Dbh I62V、Dbh M76I、DbhA221S、Dbh KSKIP(241-245)RVRKS、Dbh Y249I、Dbh L250V、Dbh K337R的持续合成能力的变化趋势与融合Sso7d的突变体类似，但融合Sso7d的突变体的持续合成能力要高于未在N端融合Sso7d的突变体。
实施例3Sdbh和Sdbh突变体的催化活性比较
12.5nM的退火好的引物/模板添加到反应缓冲液(10mM HEPES NaOH(pH7.4)，50mMNaCl，10mM MgCl2，200mM dNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的Triton X-100)。加入12.5nM的DNA聚合酶在37℃起始DNA合成。在不同时间点取1μL样品添加到99μL以1:200稀释的PicoGreen(分子探针)中，在TE缓冲液(10mMTris-Hcl pH为8.0和1mMEDTA)反应。合成的DNA的量使用H1混合多功能协同酶标仪进行定量(美国伯腾仪器)。通过比较它们与Sdbh的初始速率确定DNA聚合酶的单位活性。
结果如图2所示，与Sdbh相比，Sdbh突变体表现出聚合酶活性的增加，这表明非保守残基突变不降低聚合酶活性，而显著增加DNA合成的初始速率。例如，Sdbh M76I初始速率是Sdbh速率的3倍。Sdbh M76I、SdbhA221S、Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS和Sdbh L250V的聚合酶活性都增加，并观察到比Sdbh强的持续合成能力(100nt在同P/T量的酶)。而SdbhK337R、Sdbh I62V和SdbhY249I虽然持续合成能力却比Sdbh低，聚合酶活性却增加。这些结果表明部分Sdbh突变体酶在提高持续合成能力的同时也能增加酶的催化活性，没有以降低聚合酶的活性为代价。
实施例4Sdbh突变酶的稳态动力学分析
为了进一步明确确定酶修饰对核苷酸掺入催化速率的影响，进行DNA聚合反应的稳态动力学分析。
在缓冲液(10mM HEPES NaOH(pH7.4)，50mM NaCl，10mM MgCl2，200mM dNTPs，1mM DTT，100μg/ml BSA和0.1％的Triton X-100)中含有12.5nM的酶和为12.5-125nM预退火ssM13。每个反应的初始速率根据引物-模板浓度和下面的公式计算：
V表示初始速率，[D]表示引物和模板浓度，[E]表示酶的浓度，Kcat表示逆向速率，Km(DNA)表示达到最大酶活一半时模板-引物的浓度。
结果如表3所示Sdbh和其突变体均服从简单的Michaelis-Menten动力学。Sdbh突变体表现出比Sdbh高的催化效率，这说明Sdbh突变体酶在增强持续合成能力的同时对核苷酸的催化效率没有影响，这种非保守位点突变提高聚合酶持续合成能力的方法是可行的，所构建出的Sdbh M76I、SdbhA221S、Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS和Sdbh L250V的这四种正向突变体酶在提高持续合成能力的同时能够充分保证原有酶的酶学性质。
表3.Sdbh突变酶的稳态动力学分析
未在N端融合Sso7d的突变体Dbh T37F、Dbh I62V、Dbh M76I、Dbh A221S、DbhKSKIP(241-245)RVRKS、Dbh Y249I、Dbh L250V、Dbh K337R的催化活性和稳定性的变化趋势与融合Sso7d的突变体类似。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，是先将Dbh第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Sso7d得到；所述Dbh的出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码Sso7d的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，是先将Dbh第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第76位的M突变为I。
5.一种获得权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，其特征在于，通过定点突变获得突变体。
6.编码权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的核苷酸。
7.携带权利要求6所述核苷酸的载体或重组细胞。
8.含有权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的试剂盒。
9.权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的应用。
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| US20100279360A1 (en) * | 2002-10-23 | 2010-11-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sso7-Polymerase Conjugate Proteins |
| CN102392000A (zh) * | 2011-11-07 | 2012-03-28 | 李志茹 | 一种耐高温Pyrolobus聚合酶及其高效表达质粒和应用 |
-
2015
- 2015-01-26 CN CN201510039501.5A patent/CN104560909B/zh active Active
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