CN113316636B - 酶活性提高的dna聚合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供的是一种酶活性提高的Taq DNA聚合酶及其应用。所述DNA聚合酶与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相比，具有如下突变位点中的至少一种：E315K、E507R、E507H、E524K、L552R、D578N、E742R、E742K、A743R、A743K、K53S/E507K、K56N/E507K、K56S/E507K、K56T/E507K、K56Q/E524K、L245M/E524K、L245M/L552R、E315K/S357C、K56Q/E507K、E57D/E507K、K56Q/E507R、K56T/E524K、E57D/E524K、E57D/E742R、L245M/E315K。
Description
优先权信息
无。
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种酶活性提高的DNA聚合酶及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断、测序或任何有DNA，RNA的地方。
PCR反应中需要DNA聚合酶、模板、引物、dNTP的参与，其中DNA聚合酶对PCR反应起着至关重要的作用，因此，关于DNA聚合酶改造以适用于不同应用的报道已有很多，如提高扩增速率、对抑制剂的耐受程度等。
多重PCR较常规PCR的特点是其在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，其还具有高效性、系统性以及经济简便性的特点。由于扩增多条片段，多重PCR不仅要求DNA聚合酶具有较高的活性，还需要有一定的扩增均一性，即对同一体系中不同片段的扩增均较好。
虽然目前有很多关于DNA聚合酶改造的研究，但是能否用于多重的却不明确。基于多重PCR应用的优越性的可预见的广泛的应用范围，急需找到一种能应用于多重PCR的DNA聚合酶。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种酶活性提高的DNA聚合酶，该DNA聚合酶的酶活性相较于野生型的DNA聚合酶活性，有了显著提升。该DNA聚合酶能够应用于多重PCR反应体系中。由于本发明提供的DNA聚合酶的高活性，可以适用于模板含量低、混有抑制物质或者长片段模板的PCR反应。
PCR过程对于DNA聚合酶的要求较高，DNA聚合酶的活性等性质直接影响到PCR过程的扩增效率。但是由于用于聚合反应的聚合酶通常均是以试剂盒的形式提供，所用到的DNA聚合酶的信息很少公开，而且通常价格较贵。限制了对于DNA聚合酶性能要求较高的反应体系中的应用。
多重PCR是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，具有高效性、系统性以及经济简便性的特点。由于扩增多条片段，多重PCR不仅要求DNA聚合酶具有较高的活性，还需要有一定的扩增均一性，即对同一体系中不同片段的扩增均较好。经研究发现，野生型的DNA聚合酶在多重PCR中的扩增均一性或产量较差，无法满足大部分应用需求，因此急需寻找开发出一种能够应用于多重PCR的DNA聚合酶。
本发明通过不同的多重PCR扩增体系及活性检测筛选出的DNA聚合酶能够有效的克服该问题，且自主研发生产能大大地降低成本。所筛选出的突变体可能不仅能应用于多重PCR，也能用于低模板投入量或含有抑制剂(如盐、血液)的PCR或长片段扩增。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有如下突变位点中的至少一种：E315K、E507R、E507H、E524K、L552R、D578N、E742R、E742K、A743R、A743K、K53S/E507K、K56N/E507K、K56S/E507K、K56T/E507K、K56Q/E524K、L245M/E524K、L245M/L552R、E315K/S357C、K56Q/E507K、E57D/E507K、K56Q/E507R、K56T/E524K、E57D/E524K、E57D/E742R、L245M/E315K。本发明所提供的DNA聚合酶与野生型的DNA聚合酶(SEQ ID NO:2所示氨基酸序列)相比，具有提高的聚合活性和DNA亲和力，在多重PCR反应体系中扩增效果明显改善。
根据本发明的实施例，以上所述DNA聚合酶可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶的突变体。
在本发明的一些实施例中，所述DNA聚合酶的活性与未突变的Taq DNA聚合酶活性相比，至少提高了0.5倍。
在本发明的一些实施例中，所述DNA聚合酶的活性与未突变的Taq DNA聚合酶活性相比，至少提高了1倍。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码本发明第一方面所述的DNA聚合酶。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种构建体，包含本发明第二方面所述的分离的核酸分子。
在本发明的一些实施例中，所述构建体为质粒。
在本发明的一些实施例中，所述分离的核酸分子可操作地连接启动子。
在本发明的一些实施例中，所述启动子选自下列中的一种：λ-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的构建体。用来表达目的蛋白(DNA聚合酶)的宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞。在至少一些实施例中，利用原核细胞表达DNA聚合酶，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。适用于本发明的真核细胞可以是植物细胞、动物细胞(例如果蝇细胞、CHO细胞、C.elegans细胞等)、真菌细胞(例如酿酒细胞、巴斯德毕赤酵母细胞等)。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种DNA聚合酶的生产方法，所述DNA聚合酶为本发明第一方面所述的DNA聚合酶，所述生产方法包括：培养宿主细胞，所述宿主细胞为本发明第四方面所述的宿主细胞；将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述DNA聚合酶；分离获得所述DNA聚合酶。
在本发明的一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种试剂盒，包括本发明第一方面所述的DNA聚合酶。含有DNA聚合酶的试剂盒用于PCR反应中，可以提高扩增的效率。
根据本发明的实施例，以上所述的试剂盒可以进一步附加如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包括下列中的至少一种：一种或多种核苷酸，一种或多种缓冲液，一种或多种引物，一种或多种终止剂。
在本发明的一些实施例中，所述终止剂为双脱氧核苷酸。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种扩增核酸分子的方法，所述方法包括：将至少一种核酸模板与至少一种DNA聚合酶混合，得到混合物，所述DNA聚合酶为本发明第一方面所述的DNA聚合酶；对所述混合物进行扩增处理，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或部分互补的核酸分子。
根据本发明的实施例，以上扩增核酸分子的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述至少一种核酸模板的最低含量为0.001pg/μl。通常进行DNA扩增时，所用到的模板的含量为0.2-2ng/μl。利用本申请提供的DNA聚合酶，可以显著提高聚合活性，从而能够用于低含量模板物质的扩增。例如在进行单重PCR扩增时，当核酸模板的核酸含量为1pg/μl时，进行20个循环，即可有明显的扩增条带；即便核酸模板的核酸含量为0.001pg/μl，进行20个循环，仍有较弱的条带。而当核酸模板的核酸含量为0.001pg/μl，进行30-40个循环，有明显的扩增条带。
在本发明的一些实施例中，与所述至少一种核酸模板全部或部分互补的核酸分子的长度可达10kb。由于本申请所提供的DNA聚合酶的高的聚合活性，因此可以应用于长片段核酸模板的扩增，所获得的扩增片段的长度可以达到10kb。例如可以达到2kb以上，3kb以上，5kb以上，8kb以上等等。当然应用本申请提供的DNA聚合酶也可以用于短片段核酸模板的扩增，例如用于100bp以上，200bp以上，500bp以上的核酸模板的扩增。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种扩增多个核酸分子的方法，包括：将至少两种核酸模板与至少一种DNA聚合酶混合，得到混合物，所述DNA聚合酶为本发明第一方面所述的DNA聚合酶；对所述混合物进行扩增处理，以便获得与所述至少两种核酸模板全部或部分互补的核酸分子。
本发明所取得的有益效果为：本发明所提供的突变体与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有提高的聚合活性和DNA亲和力，在多重PCR中的扩增效果明显改善。而且可以用于低模板物质的扩增以及长片段分子的扩增。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的8重人源持家基因扩增电泳图。
图2是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的8重人源持家基因扩增电泳图。
图3是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的8重人源持家基因扩增电泳图。
图4是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的5重鼠源持家基因扩增电泳图。
图5是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的5重鼠源持家基因扩增电泳图。
图6是根据本发明的一个实施例提供的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体的5重鼠源持家基因扩增电泳图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了对于本申请有更为直观的理解，下面对本申请中存在的术语进行解释和说明。本领域技术人员需要理解的是，这些解释和说明仅为了理解更为方便，不应看做是对本申请保护范围的限制。
术语“DNA聚合酶”是指表现出DNA聚合酶活性的蛋白质、多肽或者多肽片段。
术语“DNA聚合酶活性”、“聚合活性”、“DNA聚合活性”是指以DNA为模板，合成互补DNA链的能力。
术语“突变体”、“突变”或者“突变型”等，是指相比较于野生型的DNA序列或者野生型的氨基酸序列，具有一个或者多个突变。当然这种突变可以发生在核酸水平上或者氨基酸水平上。
在本文中，当表示突变位点时，依照本领域通常的表述方式，即为“突变前氨基酸缩写+位点+突变后氨基酸缩写”，例如“E315K”，其中“E”代表突变前的氨基酸，“315”为相应的突变位点，“K”代表突变后的氨基酸。其中“E”和“K”均是采用本领域通用的当个字母缩写代表氨基酸。当表述组合突变时，两个突变之间用“/”连接，例如突变位点“K53S/E507K”代表相较于野生型，在第53个氨基酸和第507个氨基酸同时发生了突变。
根据本发明的实施例，本发明提供了一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶与SEQ IDNO:2所示氨基酸序列相比，具有如下突变位点中的至少一种：E315K、E507R、E507H、E524K、L552R、D578N、E742R、E742K、A743R、A743K、K53S/E507K、K56N/E507K、K56S/E507K、K56T/E507K、K56Q/E524K、L245M/E524K、L245M/L552R、E315K/S357C、K56Q/E507K、E57D/E507K、K56Q/E507R、K56T/E524K、E57D/E524K、E57D/E742R、L245M/E315K。其中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列即为野生型的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列。本申请所提供的DNA聚合酶与野生型的DNA聚合酶的氨基酸序列相比，表现为单个位点的突变，或者两个位点的组合突变，使得DNA聚合酶的活性相较于野生型的Taq DNA聚合酶的活性，至少提高了0.5倍。在至少一种具体实施方式中，所述DNA聚合酶的活性相较于野生型的DNA聚合酶的活性至少提高了1倍。在另一种具体实施方式中，所述DNA聚合酶的活性相较于野生型的DNA聚合酶的活性至少提高了2倍。在至少一些实施中，所述DNA聚合酶相较于野生型的DNA聚合酶具有提高的扩增均一性。本文中“扩增均一性”是指同一反应体系中有多种核酸模板和多种引物时，DNA聚合酶对于每种核酸模板和相应引物的扩增能力的一致性。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E315K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E507R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E507H突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E524K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有L552R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有D578N突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E742R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E742K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有A743R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有A743K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K53S/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56N/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56S/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56T/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56Q/E524K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有L245M/E524K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有L245M/L552R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E315K/S357C突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56Q/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E57D/E507K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56Q/E507R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有K56T/E524K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E57D/E524K突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有E57D/E742R突变。
在本发明的至少一些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，所述DNA聚合酶具有L245M/E315K突变。
利用野生型Taq DNA聚合酶进行突变设计，来提高酶对DNA的亲和力，从而提高DNA聚合酶的活性。同时考虑到若DNA聚合酶的聚合活性过强，与DNA的亲和力过强，可能会带来一些其他的不佳影响，例如可能会导致扩增的均一性较差等等。因此，综合多种因素，设计了多个突变位点，并通过DNA聚合酶酶活性以及多重PCR扩增试验进行了验证。
本发明通过基因工程手段，构建了含有编码Taq DNA聚合酶突变体的序列，并且转化E.Coli进行Taq DNA聚合酶的表达和纯化。其中通过定点突变PCR的手段构建了含有编码不同Taq DNA聚合酶突变体序列的质粒。然后将构建好的的含有编码不同Taq DNA聚合酶突变体序列的质粒转入E.Coli中进行培养并诱导表达，最后通过亲和层析及离子交换层析的方法对DNA聚合酶进行纯化提取，从而得到含有不同突变的Taq DNA聚合酶。
为了验证所获得的DNA聚合酶的酶活性。通过如下方法对突变体的酶活性进行了测定：使用结合有引物的M13 ssDNA为模板-引物复合体，在DNA聚合酶的作用下发生DNA链的延伸，得到延长的双链DNA产物。将荧光分子参入反应产物，通过检测双链DNA量来计算DNA聚合酶的活性。通过该方法筛选出了聚合酶活性提高的Taq DNA聚合酶突变体。
对于本申请提供的突变体，利用多重PCR的反应体系，对突变体是否能够满足多重PCR反应的要求进行了验证。利用本申请提供的突变体，分别进行人源持家基因的8重PCR扩增和鼠源持家基因的5重PCR扩增，比较突变体和野生型DNA聚合酶的聚合活性以及PCR扩增效果。经过实验验证，本申请所提供的突变体能够满足多重PCR中对于DNA聚合酶的要求。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 Taq DNA聚合酶及其突变体表达质粒的构建
具体实施步骤如下：
(1)野生型Taq DNA聚合酶表达质粒的构建
野生型的Taq DNA聚合酶的基因序列为SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。
野生型Taq DNA聚合酶的核酸序列(SEQ ID NO:1)
ATGCGTGGCATGCTGCCGCTGTTCGAGCCGAAGGGTCGTGTGCTGCTGGTTGACGGCCACCACCTGGCGTACCGTACCTTTCACGCGCTGAAGGGTCTGACCACCAGCCGTGGCGAACCGGTGCAGGCGGTTTATGGTTTCGCGAAAAGCCTGCTGAAGGCGCTGAAAGAGGACGGCGATGCGGTGATCGTGGTTTTCGATGCGAAGGCGCCGAGCTTTCGTCACGAAGCGTACGGTGGCTATAAAGCGGGTCGTGCGCCGACCCCGGAGGACTTTCCGCGTCAACTGGCGCTGATTAAAGAACTGGTTGATCTGCTGGGTCTGGCGCGTCTGGAAGTGCCGGGCTACGAAGCGGACGATGTTCTGGCGAGCCTGGCGAAGAAAGCGGAGAAGGAAGGTTACGAAGTGCGTATCCTGACCGCGGACAAAGATCTGTATCAGCTGCTGAGCGACCGTATCCACGTTCTGCACCCGGAGGGTTATCTGATTACCCCGGCGTGGCTGTGGGAAAAGTACGGCCTGCGTCCGGACCAATGGGCGGATTATCGTGCGCTGACCGGTGACGAGAGCGATAACCTGCCGGGCGTTAAAGGTATTGGCGAAAAAACCGCGCGTAAGCTGCTGGAGGAATGGGGTAGCCTGGAAGCGCTGCTGAAAAACCTGGATCGTCTGAAGCCGGCGATCCGTGAGAAAATTCTGGCGCACATGGACGATCTGAAGCTGAGCTGGGACCTGGCGAAAGTGCGTACCGACCTGCCGCTGGAAGTGGATTTCGCGAAGCGTCGTGAGCCGGATCGTGAACGTCTGCGTGCGTTCCTGGAGCGTCTGGAATTTGGTAGCCTGCTGCACGAGTTTGGCCTGCTGGAAAGCCCGAAGGCGCTGGAGGAAGCGCCGTGGCCGCCGCCAGAGGGTGCGTTCGTGGGCTTTGTTCTGAGCCGTAAAGAACCGATGTGGGCGGACCTGCTGGCGCTGGCGGCGGCGCGTGGTGGCCGTGTGCACCGTGCGCCGGAGCCGTACAAGGCGCTGCGTGACCTGAAAGAAGCGCGTGGTCTGCTGGCGAAAGATCTGAGCGTTCTGGCGCTGCGCGAAGGTCTGGGTCTGCCGCCGGGTGACGATCCGATGCTGCTGGCGTACCTGCTGGATCCGAGCAACACCACCCCGGAGGGTGTGGCGCGTCGTTATGGTGGCGAATGGACCGAGGAAGCGGGCGAGCGTGCGGCGCTGAGCGAACGTCTGTTCGCGAACCTGTGGGGTCGTCTGGAGGGCGAGGAACGTCTGCTGTGGCTGTACCGTGAGGTGGAACGTCCGCTGAGCGCGGTTCTGGCGCACATGGAAGCGACCGGTGTGCGTCTGGACGTTGCGTATCTGCGTGCGCTGAGCCTGGAAGTGGCGGAGGAAATCGCGCGTCTGGAGGCGGAAGTTTTCCGTCTGGCGGGCCACCCGTTTAACCTGAACAGCCGTGACCAGCTGGAGCGTGTTCTGTTTGATGAACTGGGTCTGCCGGCGATTGGCAAGACCGAAAAAACCGGCAAGCGTAGCACCAGCGCGGCGGTGCTGGAGGCGCTGCGTGAAGCGCACCCGATCGTTGAGAAGATTCTGCAGTACCGTGAACTGACCAAGCTGAAAAGCACCTATATCGACCCGCTGCCGGATCTGATTCACCCGCGTACCGGTCGTCTGCACACCCGTTTCAACCAAACCGCGACCGCGACCGGTCGTCTGAGCAGCAGCGACCCGAACCTGCAGAACATCCCGGTGCGTACCCCGCTGGGTCAACGTATCCGTCGTGCGTTTATTGCGGAGGAAGGCTGGCTGCTGGTTGCGCTGGATTACAGCCAGATTGAGCTGCGTGTTCTGGCGCACCTGAGCGGTGACGAAAACCTGATCCGTGTTTTCCAAGAGGGCCGTGATATTCACACCGAAACCGCGAGCTGGATGTTTGGTGTGCCGCGTGAGGCGGTTGACCCGCTGATGCGTCGTGCGGCGAAGACCATCAACTTCGGTGTGCTGTATGGCATGAGCGCGCACCGTCTGAGCCAGGAGCTGGCGATCCCGTACGAGGAAGCGCAGGCGTTTATTGAACGTTATTTCCAAAGCTTTCCGAAGGTTCGTGCGTGGATTGAGAAAACCCTGGAGGAAGGTCGTCGTCGTGGTTACGTGGAAACCCTGTTCGGTCGTCGTCGTTACGTTCCGGATCTGGAGGCGCGTGTGAAAAGCGTTCGTGAGGCGGCGGAACGTATGGCGTTCAACATGCCGGTGCAGGGTACCGCGGCGGACCTGATGAAACTGGCGATGGTTAAGCTGTTTCCGCGTCTGGAGGAAATGGGCGCGCGTATGCTGCTGCAAGTGCACGATGAGCTGGTTCTGGAAGCGCCGAAGGAGCGTGCGGAAGCGGTGGCGCGTCTGGCGAAAGAGGTGATGGAAGGTGTTTACCCGCTGGCGGTTCCGCTGGAAGTTGAGGTGGGTATCGGCGAGGACTGGCTGAGCGCGAAAGAATAA
野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
含有野生型Taq DNA聚合酶编码序列的表达质粒pET29a-Taq购自金斯瑞科技有限公司。其中，设计时在氨基酸序列的N端融合有6个His以利于后续蛋白的纯化。
(2)突变体Taq DNA聚合酶表达质粒的构建
考虑到野生型Taq DNA聚合酶的活性，对野生型Taq DNA聚合酶进行突变设计，来提高酶对DNA的亲和力，来提高DNA聚合酶的活性。同时考虑到若DNA聚合酶的聚合活性过强，与DNA的亲和力过强，可能会带来一些其他的不佳影响，例如可能会导致扩增的均一性较差等等。因此，综合多种因素，发明人设计了如下突变(具体的突变位点如下表4所示)：
Taq DNA聚合酶突变体为将野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如E507R、E742R、E524K等进行突变：具体通过设计正反向突变引物对，使用pfu DNA聚合酶进行突变延伸，所使用的引物如下表1所示：
表1构建Taq DNA聚合酶突变体表达质粒过程的PCR引物
具体的反应体系如下表2所示：
表2构建Taq DNA聚合酶突变体表达质粒过程的PCR体系
| 反应组分 | 体积(μl) |
| <![CDATA[10×pfu缓冲液(含有MgSO<sub>4</sub>)]]> | 2.5 |
| 2.5mM dNTPs | 2 |
| 10μM正向引物 | 0.7 |
| 10μM反向引物 | 0.7 |
| pfu DNA聚合酶 | 0.5 |
| 50ng/μl模板(pET29a-Taq或突变体) | 1 |
| <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 17.6 |
PCR反应条件如下表3所示：
表3构建Taq DNA聚合酶突变体表达质粒过程的PCR条件
反应结束后，加入1μl DpnI于37℃消化2h，然后取5μl消化后的产物转化E.Coli感受态细胞DH5α，观察转化结果。然后从平板上挑取单克隆进行培养后提取质粒，再通过测序比对分析得到的突变体是否正确。
所构建的突变体具体如下表4所示：
表4 Taq DNA聚合酶突变体突变位置及突变类型
| 编号 | 突变 | 编号 | 突变 |
| Taq-1 | G46D | Taq-26 | K56N/E507K |
| Taq-2 | K56Q | Taq-27 | K56Q/E507K |
| Taq-3 | E57D | Taq-28 | K56Q/E507R |
| Taq-4 | E315K | Taq-29 | K56Q/E524K |
| Taq-5 | A348V | Taq-30 | K56S/E507K |
| Taq-6 | L351V | Taq-31 | K56S/E524K |
| Taq-7 | D488H | Taq-32 | K56S/E742R |
| Taq-8 | D488R | Taq-33 | K56T/E507K |
| Taq-9 | D488K | Taq-34 | K56T/E524K |
| Taq-10 | E507K | Taq-35 | K56T/E742R |
| Taq-11 | E507R | Taq-36 | E57D/E507K |
| Taq-12 | E507H | Taq-37 | E57D/E524K |
| Taq-13 | E520K | Taq-38 | E57D/E742R |
| Taq-14 | E524K | Taq-39 | E57H/E507K |
| Taq-15 | L552R | Taq-40 | E57N/E507K |
| Taq-16 | D578N | Taq-41 | E57S/E507K |
| Taq-17 | E742R | Taq-42 | E57T/E507K |
| Taq-18 | E742K | Taq-43 | L245M/A348V |
| Taq-19 | A743R | Taq-44 | L245M/D578N |
| Taq-20 | A743K | Taq-45 | L245M/E315K |
| Taq-21 | G46D/E507K | Taq-46 | L245M/E524K |
| Taq-22 | K53H/E507K | Taq-47 | L245M/L552R |
| Taq-23 | K53Q/E507K | Taq-48 | E742H/A743H |
| Taq-24 | K53S/E507K | Taq-49 | E57Q/E507K |
| Taq-25 | K53T/E507K | Taq-50 | E315K/S357C |
表4中，编号Taq-21～Taq-50均为组合突变，即代表相应的突变体相对于野生型的TaqDNA聚合酶，有两个位点发生突变，这种组合突变利用表1中给出的应用于定点突变的引物，先进行一个突变位点的定点突变，获得突变产物，然后再对该突变产物进行定点突变，得到相较于野生型Taq DNA聚合酶，发生两个位点突变的产物。
实施例2 Taq DNA聚合酶及其突变体的诱导表达和纯化
野生型Taq DNA聚合酶及其突变体均通过pET28a的启动子启动表达，并且均在N-端融合有6个His标签，纯化时可利用His标签进行Ni柱亲和纯化。
野生型及突变体质粒转化BL21感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)，然后挑取单菌落于5ml含卡那抗性(50μg/ml)LB培养基中，37℃，200rpm/min，过夜培养。次日按1:100的比例进行稀释，分别转接于新鲜的1500ml含卡那抗性(50μg/ml)的LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD600≈0.6，然后按照终浓度为0.5mM的量加入诱导剂IPTG，37℃，200rpm/min培养4h诱导表达，最后8000rpm/min的条件离心10分钟，收集诱导后的菌液沉淀。
收集菌体沉淀后，使用Taq DNA聚合酶Ni柱亲和A液(50mM Tris，500mM NaCl，0.5％Triton X-100，5％Glycerol，10mM Imidazole，pH7.8)重悬，在冰水浴条件下进行超声破菌，超声条件为：变幅杆直径10mm，超声强度为40％，超声2s，间歇3s，超声30min。将破碎后的菌液置于75℃水浴30min，然后在转速13000rpm、4℃下离心30min，收集上清。
将上步准备好的样品进行亲和纯化，具体如下：
按照AKTA操作流程，用过滤脱气MillQ水冲洗工作泵和系统，0.5ml/min流速下接上预装柱HisTrap FF 5ml，用H2O冲洗5CV，再用5CV的Taq DNA聚合酶Ni柱亲和A液平衡柱子，然后将之前处理好的样品以5ml/min上样至层析柱。上样完毕后，继续用10CV的Taq DNA聚合酶Ni柱亲和A液冲洗柱子，然后在Taq DNA聚合酶Ni柱亲和B液(50mM Tris,500mMNaCl，0.5％Triton X-100,5％Glycerol,500mM Imidazole,pH7.8)在占比0-50％(10CV)范围内线性梯度洗脱，并收集目的蛋白。
将经亲和纯化得到的样品用Taq稀释液(50mM Tris,0.5％Triton X-100,5％Glycerol,pH7.8)进行10倍稀释。然后进行阴离子交换层析，具体步骤如下：
按照AKTA操作流程，用过滤脱气MillQ水冲洗工作泵和系统，0.5ml/min流速下接上预装柱HisTrap FF 5ml，用H2O冲洗5CV，再用5CV的Taq DNA聚合酶离子A液(20mM Tris,50mM NaCl,5％Glycerol,pH7.8)平衡柱子，然后将稀释处理好的样品以5ml/min上样至层析柱。上样完毕后，继续用10CV的Taq DNA聚合酶离子A液冲洗柱子，然后在Taq DNA聚合酶离子B液((20mM Tris,1M NaCl,5％Glycerol,pH7.8)在占比0-100％(15CV)范围内线性梯度洗脱，并收集目的蛋白。
纯化后得到的目的蛋白经过透析、储存，用于后续的测定及分析。
实施例3 Taq DNA聚合酶及其突变体的聚合活性测定及分析
对经纯化得到的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体进行聚合酶活性的测定。活性测定中使用结合有引物的M13 ssDNA为模板-引物复合体，在DNA聚合酶的作用下发生DNA链的延伸，得到延长的双链DNA产物。将荧光分子参入反应产物，通过检测双链DNA量来计算DNA聚合酶的活性。其中结合的引物序列为(SEQ ID NO:75)：5’-AGCGAACCTCCCGACTTGCGGGAGG-3’。本发明中所用的10x PCR缓冲液的配方均为：100mM Tris，500mM KCl，15mM MgCl2，25％Glycerol，0.5mg/mL BSA。
Taq DNA聚合酶活性检测的反应体系如下表5所示：
表5 Taq DNA聚合酶聚合活性检测体系
| 反应组分 | 体积(μl) |
| 10x PCR缓冲液 | 2.5 |
| 50nM M13ssDNA模板-引物复合体 | 2 |
| 10mM dNTP | 1 |
| 4ng/μl Taq DNA聚合酶及其突变体 | 1 |
| <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 补足至25μl |
将上述配好的反应体系置于PCR仪中，72℃反应5min后加入0.5μl的0.5M EDTA终止反应，然后用Qubit dsDNA HS Assay Kit检测双链DNA的量，通过计算得到突变体相对于野生型的聚合活性。
Taq DNA聚合酶及其突变体的相对聚合活性如下表6所示：
表6 Taq DNA聚合酶及其突变体的相对聚合活性
从上表6可以看出，相较于野生型Taq DNA聚合酶，多种DNA聚合酶突变体的酶活性均表现出提高，例如DNA聚合酶突变体(E315K)的聚合活性是野生型Taq DNA聚合酶的2.46倍等等。
实施例4 Taq DNA聚合酶及其突变体的多重PCR测试及分析
为了获得能够应用于多重PCR扩增的DNA聚合酶突变体，分别对经纯化得到的野生型Taq DNA聚合酶及其突变体进行8重的人源持家基因和5重的鼠源持家基因扩增测试。
(1)人源持家基因8重扩增
人源持家基因8重扩增的模板为人的基因组DNA，扩增引物及目的片段大小如下表7所示：
表7人源持家基因8重扩增引物及目的片段大小
人源持家基因8重扩增的PCR反应体系如下表8所示：
表8人源持家基因8重扩增反应体系
| 反应组分 | 体积(μl) |
| 10×PCR Buffer | 5 |
| 10mM dNTPs | 1 |
| 5μM Primer Mix | 2 |
| 10ng/μl YH gDNA | 2 |
| 0.1mg/ml Taq | 0.5 |
| <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> | 39.5 |
人源持家基因8重扩增的PCR条件如下表9所示：
表9人源持家基因8重扩增条件
人源持家基因8重扩增完成后，加入10μl 6x DNA Loading Buffer(60mM Tris,60mM EDTA,60％Glycerol,Orange G)后充分混匀后用1.3％的琼脂糖胶进行电泳分析，挑选出能扩增出所有条带或条带较野生型多，或产量提高，或均一性提高的突变体。具体结果见附图1～图3。
图1到图3所示的结果来看，琼脂糖凝胶电泳图的扩增条带较亮或者扩增条带增多，表明相较于野生型的DNA聚合酶，突变型DNA聚合酶活性提高。同时相较于野生型的DNA聚合酶，有些突变型DNA聚合酶的扩增条带各条带之间均一性增强，表明突变型DNA聚合酶能够提高扩增的均一性。而图中有些条带出现了拖尾现象，是由于存在某些非特异性扩增的现象，和DNA聚合酶的聚合活性以及对提高扩增均一性没有影响，可以不必考虑。
(2)鼠源持家基因5重扩增
鼠源持家基因5重扩增的模板来源中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的cDNA，具体制备过程为：从CHO细胞提取的total RNA为模板，以含有polyA的序列为引物用逆转录酶SuperScript II Reverse Transcriptase进行逆转录，从而得到CHO的cDNA。
鼠源持家基因5重扩增引物及目的片段大小如下表10所示：
表10鼠源持家基因5重扩增引物及目的片段大小
鼠源持家基因5重扩增的PCR反应体系如下表11所示：
表11鼠源持家基因5重扩增反应体系
鼠源持家基因5重扩增的PCR条件如下表12所示：
表12鼠源持家基因5重扩增条件
鼠源持家基因5重扩增完成后，加入10μl 6x DNA Loading Buffer(60mM Tris,60mM EDTA,60％Glycerol,Orange G)后充分混匀后用1.3％的琼脂糖胶进行电泳分析，挑选出能扩增出所所有条带或条带较野生型多，或产量提高，或均一性提高的突变体。具体结果见附图4～图6。
图4到图6所示的结果来看，琼脂糖凝胶电泳图的扩增条带较亮或者扩增条带增多，表明相较于野生型的DNA聚合酶，突变型DNA聚合酶活性提高。同时相较于野生型的DNA聚合酶，有些突变型DNA聚合酶的扩增条带各条带之间均一性增强，表明突变型DNA聚合酶能够提高扩增的均一性。而图中有些条带出现了拖尾现象，是由于存在某些非特异性扩增的现象，和DNA聚合酶的聚合活性以及对提高扩增均一性没有影响，可以不必考虑。
综合不同突变型DNA聚合酶对于人源持家基因8重扩增的结果，对于鼠源持家基因5重扩增的结果，选择聚合酶活性以及扩增均一性提高的DNA聚合酶，同时结合上述实施例对于不同突变型DNA聚合酶相对于野生型DNA聚合酶的聚合活性测定结果，确定了突变：E315K、E507R、E507H、E524K、L552R、D578N、E742R、E742K、A743R、A743K、K53S/E507K、K56N/E507K、K56S/E507K、K56T/E507K、K56Q/E524K、L245M/E524K、L245M/L552R、E315K/S357C、K56Q/E507K、E57D/E507K、K56Q/E507R、K56T/E524K、E57D/E524K、E57D/E742R、L245M/E315K中的至少一种，可以显著提高DNA聚合酶活性，应用于多重PCR中，扩增效果明显改善。而且可以用于低模板物质的扩增以及长片段分子的扩增。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 酶活性提高的DNA聚合酶及其应用
<130> PIOC3183957PCN
<160> 101
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型TaqDNA聚合酶
<400> 1
atgcgtggca tgctgccgct gttcgagccg aagggtcgtg tgctgctggt tgacggccac 60
cacctggcgt accgtacctt tcacgcgctg aagggtctga ccaccagccg tggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tttatggttt cgcgaaaagc ctgctgaagg cgctgaaaga ggacggcgat 180
gcggtgatcg tggttttcga tgcgaaggcg ccgagctttc gtcacgaagc gtacggtggc 240
tataaagcgg gtcgtgcgcc gaccccggag gactttccgc gtcaactggc gctgattaaa 300
gaactggttg atctgctggg tctggcgcgt ctggaagtgc cgggctacga agcggacgat 360
gttctggcga gcctggcgaa gaaagcggag aaggaaggtt acgaagtgcg tatcctgacc 420
gcggacaaag atctgtatca gctgctgagc gaccgtatcc acgttctgca cccggagggt 480
tatctgatta ccccggcgtg gctgtgggaa aagtacggcc tgcgtccgga ccaatgggcg 540
gattatcgtg cgctgaccgg tgacgagagc gataacctgc cgggcgttaa aggtattggc 600
gaaaaaaccg cgcgtaagct gctggaggaa tggggtagcc tggaagcgct gctgaaaaac 660
ctggatcgtc tgaagccggc gatccgtgag aaaattctgg cgcacatgga cgatctgaag 720
ctgagctggg acctggcgaa agtgcgtacc gacctgccgc tggaagtgga tttcgcgaag 780
cgtcgtgagc cggatcgtga acgtctgcgt gcgttcctgg agcgtctgga atttggtagc 840
ctgctgcacg agtttggcct gctggaaagc ccgaaggcgc tggaggaagc gccgtggccg 900
ccgccagagg gtgcgttcgt gggctttgtt ctgagccgta aagaaccgat gtgggcggac 960
ctgctggcgc tggcggcggc gcgtggtggc cgtgtgcacc gtgcgccgga gccgtacaag 1020
gcgctgcgtg acctgaaaga agcgcgtggt ctgctggcga aagatctgag cgttctggcg 1080
ctgcgcgaag gtctgggtct gccgccgggt gacgatccga tgctgctggc gtacctgctg 1140
gatccgagca acaccacccc ggagggtgtg gcgcgtcgtt atggtggcga atggaccgag 1200
gaagcgggcg agcgtgcggc gctgagcgaa cgtctgttcg cgaacctgtg gggtcgtctg 1260
gagggcgagg aacgtctgct gtggctgtac cgtgaggtgg aacgtccgct gagcgcggtt 1320
ctggcgcaca tggaagcgac cggtgtgcgt ctggacgttg cgtatctgcg tgcgctgagc 1380
ctggaagtgg cggaggaaat cgcgcgtctg gaggcggaag ttttccgtct ggcgggccac 1440
ccgtttaacc tgaacagccg tgaccagctg gagcgtgttc tgtttgatga actgggtctg 1500
ccggcgattg gcaagaccga aaaaaccggc aagcgtagca ccagcgcggc ggtgctggag 1560
gcgctgcgtg aagcgcaccc gatcgttgag aagattctgc agtaccgtga actgaccaag 1620
ctgaaaagca cctatatcga cccgctgccg gatctgattc acccgcgtac cggtcgtctg 1680
cacacccgtt tcaaccaaac cgcgaccgcg accggtcgtc tgagcagcag cgacccgaac 1740
ctgcagaaca tcccggtgcg taccccgctg ggtcaacgta tccgtcgtgc gtttattgcg 1800
gaggaaggct ggctgctggt tgcgctggat tacagccaga ttgagctgcg tgttctggcg 1860
cacctgagcg gtgacgaaaa cctgatccgt gttttccaag agggccgtga tattcacacc 1920
gaaaccgcga gctggatgtt tggtgtgccg cgtgaggcgg ttgacccgct gatgcgtcgt 1980
gcggcgaaga ccatcaactt cggtgtgctg tatggcatga gcgcgcaccg tctgagccag 2040
gagctggcga tcccgtacga ggaagcgcag gcgtttattg aacgttattt ccaaagcttt 2100
ccgaaggttc gtgcgtggat tgagaaaacc ctggaggaag gtcgtcgtcg tggttacgtg 2160
gaaaccctgt tcggtcgtcg tcgttacgtt ccggatctgg aggcgcgtgt gaaaagcgtt 2220
cgtgaggcgg cggaacgtat ggcgttcaac atgccggtgc agggtaccgc ggcggacctg 2280
atgaaactgg cgatggttaa gctgtttccg cgtctggagg aaatgggcgc gcgtatgctg 2340
ctgcaagtgc acgatgagct ggttctggaa gcgccgaagg agcgtgcgga agcggtggcg 2400
cgtctggcga aagaggtgat ggaaggtgtt tacccgctgg cggttccgct ggaagttgag 2460
gtgggtatcg gcgaggactg gctgagcgcg aaagaataa 2499
<210> 2
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型TaqDNA聚合酶
<400> 2
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 3
gctttgttct gagccgtaaa aaaccgatgt gggcg 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 4
cgcccacatc ggttttttac ggctcagaac aaagc 35
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 5
ggcgattggc aagaccaaaa aaaccggcaa gcg 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 6
cgcttgccgg tttttttggt cttgccaatc gcc 33
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 7
cggcgattgg caagaccaga aaaaccggca agcgta 36
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 8
tacgcttgcc ggtttttctg gtcttgccaa tcgccg 36
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 9
ggcgattggc aagacccata aaaccggcaa gcgta 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 10
tacgcttgcc ggttttatgg gtcttgccaa tcgcc 35
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 11
cggcggtgct gaaggcgctg cgt 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 12
acgcagcgcc ttcagcaccg ccg 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 13
gaggcgctgc gtaaagcgca cccga 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 14
tcgggtgcgc tttacgcagc gcctc 25
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 15
gaaggcgctg aaagatgacg gcgatgcg 28
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 16
cgcatcgccg tcatctttca gcgccttc 28
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 17
gctttgttct gagccgtaaa aaaccgatgt gggcg 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 18
cgcccacatc ggttttttac ggctcagaac aaagc 35
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 19
ggcgattggc aagaccaaaa aaaccggcaa gcg 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 20
cgcttgccgg tttttttggt cttgccaatc gcc 33
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 21
cggcgattgg caagaccaga aaaaccggca agcgta 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 22
tacgcttgcc ggtttttctg gtcttgccaa tcgccg 36
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 23
ggcgattggc aagacccata aaaccggcaa gcgta 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 24
tacgcttgcc ggttttatgg gtcttgccaa tcgcc 35
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 25
gaggcgctgc gtaaagcgca cccga 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 26
tcgggtgcgc tttacgcagc gcctc 25
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 27
gcgcgtgtga aaagcgttcg tagggcggcg gaac 34
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 28
gttccgccgc cctacgaacg cttttcacac gcgc 34
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 29
gcgtgtgaaa agcgttcgtc atgcggcgga ac 32
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 30
gttccgccgc atgacgaacg cttttcacac gc 32
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 31
gcgtgtgaaa agcgttcgta aggcggcgga 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 32
tccgccgcct tacgaacgct tttcacacgc 30
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 33
cgctgccgga tcggattcac ccgcg 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 34
cgcgggtgaa tccgatccgg cagcg 25
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 35
gctgagctgg gacatggcga aagtgcg 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 36
cgcactttcg ccatgtccca gctcagc 27
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 37
gaaagaagcg cgtggtgtgc tggcgaaaga 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 38
tctttcgcca gcacaccacg cgcttctttc 30
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 39
cggtgcaggc ggtttatgat ttcgcgaaaa gcc 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 40
ggcttttcgc gaaatcataa accgcctgca ccg 33
<210> 41
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 41
aacctgaaca gccgtcacca gctggagc 28
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 42
gctccagctg gtgacggctg ttcaggtt 28
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 43
taacctgaac agccgtcgcc agctggagcg tg 32
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 44
cacgctccag ctggcgacgg ctgttcaggt ta 32
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 45
taacctgaac agccgtaagc agctggagcg tgttc 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 46
gaacacgctc cagctgctta cggctgttca ggtta 35
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 47
gtctgagcag cagcaacccg aacctgcag 29
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 48
ctgcaggttc gggttgctgc tgctcagac 29
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 49
gtgacctgaa agaagtgcgt ggtctgctgg c 31
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 50
gccagcagac cacgcacttc tttcaggtca c 31
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 51
gaaaagcgtt cgtgagaggg cggaacgtat ggcg 34
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 52
cgccatacgt tccgccctct cacgaacgct tttc 34
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 53
gaaaagcgtt cgtgagaagg cggaacgtat ggcg 34
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 54
cgccatacgt tccgccttct cacgaacgct tttc 34
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 55
gtgaaaagcg ttcgtgagca tgcggaacgt atggcgttc 39
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 56
gaacgccata cgttccgcat gctcacgaac gcttttcac 39
<210> 57
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 57
gtttcgcgaa aagcctgctg agcgcgctga aagagg 36
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 58
cctctttcag cgcgctcagc aggcttttcg cgaaac 36
<210> 59
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 59
gcgaaaagcc tgctgcaggc gctgaaagag g 31
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 60
cctctttcag cgcctgcagc aggcttttcg c 31
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 61
gcgaaaagcc tgctgtaggc gctgaaagag g 31
<210> 62
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 62
cctctttcag cgcctacagc aggcttttcg c 31
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 63
cgcgaaaagc ctgctgcatg cgctgaaaga ggacg 35
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 64
cgtcctcttt cagcgcatgc agcaggcttt tcgcg 35
<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 65
cctgctgaag gcgctgaatg aggacggcg 29
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 66
cgccgtcctc attcagcgcc ttcagcagg 29
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 67
gctgaaggcg ctgagcgagg acggcgatgc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 68
gcatcgccgt cctcgctcag cgccttcagc 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 69
gctgaaggcg ctgacggagg acggcgatgc 30
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 70
gcatcgccgt cctccgtcag cgccttcagc 30
<210> 71
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 71
tgctgaaggc gctgcaggag gacggcgatg c 31
<210> 72
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 72
gcatcgccgt cctcctgcag cgccttcagc a 31
<210> 73
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 73
tggcgaaaga tctgtgcgtt ctggcgctg 29
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 74
cagcgccaga acgcacagat ctttcgcca 29
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 75
agcgaacctc ccgacttgcg ggagg 25
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 76
ggcaacgctt agactctgtg tg 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 77
ctgcccttgg cctaactaac ct 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 78
gttcctcaag aagctgcacg ag 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 79
cgttagactc tggatctggc gt 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 80
ccagccaatt catgagtcgg tg 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 81
cctgacaact cgcaagtagc ac 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 82
gctcaatggg gtacttcagg gt 22
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 83
gtggacgtta cgtaaaaggc cc 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 84
tgctctggat gtgaagatgc ca 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 85
ttccaggtaa atccagccca gg 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 86
cagccagtca gcatcatcca ac 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 87
gaaagccgga ttgcggtaac at 22
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 88
ggatagctct gcaaggggag ag 22
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 89
tcgtcgcagt agaaatacgg ct 22
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 90
agaagtcagg cacgtagctc ag 22
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 91
ggcacgttgg tgtttacgat ga 22
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 92
acggaaggaa aaggccaaga tgcac 25
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 93
attgggttca caccaggagt ccgtt 25
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 94
agcctcgtcc cgtagacaaa atggt 25
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 95
agatggtgat gggcttcccg ttgat 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 96
cggtgttgcc aaaatgtcgc tttcc 25
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 97
ggccggctca gctttaacct tgttt 25
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 98
accggagaat gggaagccga acata 25
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 99
acagggttgg gggtgagaat tgcta 25
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 100
gagcacagct tctttgcagc tcctt 25
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 101
tcctgtcagc aatgcctggg tacat 25
Claims (14)
1.一种DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶的突变体，所述DNA聚合酶与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有如下突变位点中的一种：
E524K、K56Q/E524K、L245M/E524K、K56T/E524K、E57D/E524K。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码权利要求1所述的DNA聚合酶。
3.一种构建体，其特征在于，包含权利要求2所述的分离的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于，所述构建体为质粒。
5.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于，所述分离的核酸分子可操作地连接启动子。
6.根据权利要求5所述的构建体，其特征在于，所述启动子选自下列中的一种：λ-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子或trc启动子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3~6中任一项所述的构建体。
8.权利要求1所述的DNA聚合酶的生产方法，其特征在于，包括：
培养宿主细胞，所述宿主细胞为权利要求7所述的宿主细胞；
将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述DNA聚合酶；
分离获得所述DNA聚合酶。
9.根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的DNA聚合酶。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，还包括下列中的至少一种：
一种或多种核苷酸，一种或多种缓冲液，一种或多种引物，一种或多种终止剂。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述终止剂为双脱氧核苷酸。
13.一种扩增核酸分子的方法，其特征在于，所述方法包括：
将至少一种核酸模板与至少一种DNA聚合酶混合，得到混合物，所述DNA聚合酶为权利要求1所述的DNA聚合酶；
对所述混合物进行扩增处理，以便获得与所述至少一种核酸模板全部或部分互补的核酸分子。
14.一种扩增多个核酸分子的方法，其特征在于，包括：
将至少两种核酸模板与至少一种DNA聚合酶混合，得到混合物，所述DNA聚合酶为权利要求1所述的DNA聚合酶；
对所述混合物进行扩增处理，以便获得与所述至少两种核酸模板全部或部分互补的核酸分子。
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