CN108359655A - 一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因 - Google Patents

一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL‑mut及其编码基因。本发明所述的脂肪酶突变体TDL‑mut的突变位点为：突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C，进而获得一种热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL‑mut。该突变体TDL‑mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL‑mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL‑mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

Description

一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，通过理性设计得到了热稳定性提高的1，3位置特异性脂肪酶突变体TDL-mut。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。由于脂肪酶这种特殊的酶学特性使其广泛的应用于食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。
随着不同工业领域的发展，对脂肪酶的要求也越来越高，如油脂加工和饲料工业领域许多工艺环节涉及到高温环境，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发热稳定性脂肪酶具有重要意义。本实验室前期克隆、表达了1，3位置特异性脂肪酶TDL，该酶具有很强的水解活性并且作用底物广泛，但是TDL在高温环境下容易变性失活，不利于其产业化应用。本发明通过理性设计获得了热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，为脂肪酶TDL的产业化应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是通过对1，3位置特异性脂肪酶TDL进行分子改造，使改造后的脂肪酶具有更好的热稳定性，符合工业化应用的要求。
本发明的目的是提供热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其基因。
一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
原始脂肪酶TDL的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。与脂肪酶TDL相比，突变体TDL-mut包含的突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。突变体TDL-mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。
上述所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其最适反应pH均为8.0，最适反应温度为65℃。
一种获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其包括如下步骤：
1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：将已公布的脂肪酶TDL基因(Genebank：AF123252)，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl；
2)理性定点突变：以pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果纯化回收PCR产物；使用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。
如上所述的获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法中，所述步骤1)中PCR扩增引物为5’端(5'–agtcgaattcTCTCCAGTCAGACGTGAGGTT-3')和3’端(5'-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3')。
本发明还请求保护一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。
本发明还请求保护一种包含权利要求1所述的突变体TDL-mut基因的重组载体。
本发明还请求保护一种包含权利要求3所述的突变体TDL-mut基因的重组菌株。
本发明突变体TDL-mut在80℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。因此，本发明的获得的脂肪酶突变体TDL-mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。
附图说明
图1原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH。
图2原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性。
图3原始脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，Zeocin购自Invitrogen公司。
2、酶与试剂盒
Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25ug/mL Zeocin。
酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)
酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。
实施例1脂肪酶TDL基因合成及克隆
将已公布的脂肪酶TDL基因(Genebank：AF123252)，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成。根据合成的基因分别在5’端(5'–agtcgaattcTCTCCAGTCAGACGTGAGGTT-3')和3’端(5'-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3')设计PCR引物，以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl。
实施例2理性定点突变
以上述pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增。琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。
实施例3筛选热稳定性提高的突变菌株
将实施例2中的酵母重组转化子用牙签逐个挑至含有50mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，30℃，220rpm培养24h左右，离心去上清。再分别加入BMMY培养基稀释菌体至OD600值为1.0。30℃，220rpm培养24h后，取样离心取上清，进行脂肪酶酶活及耐热性测定。脂肪酶酶活检测参照中华人民共和国国家标准《GB/T 23535-2009》进行测定。脂肪酶耐热检测方法如下：将稀释好的脂肪酶酶液加入10mL玻璃试管中，将装有酶液的玻璃试管在80℃条件下，水浴处理5min，参照国标《GB/T 23535-2009》测定剩余脂肪酶的酶活，以没有做热处理的脂肪酶，作为对照，进行剩余酶活计算。剩余酶活率以热处理样品酶活除以对照样品酶活，再乘以100％表示。
实施例4原始脂肪酶TDL及脂肪酶单点突变体的热稳定性分析
原始脂肪酶TDL及单点突变体的耐热性结果如表1所示，由表1可知脂肪酶TDL单点突变体在80℃水浴处理5min条件下的剩余酶活率的范围为19％-26％，相比原始脂肪酶酶的耐热性(18％)，具有一定程度的提高。
表1 原始脂肪酶TDL和单点突变体热稳定性分析
编号 剩余酶活(％)
原始脂肪酶TDL 18
F12C 20
R42S 19
G43E 25
S44N 24
I45V 23
I98L 22
N99A 20
L100A 22
K103T 24
G104E 26
T231N 25
K237C 23
实施例5组合突变
将实施例4获得的单点突变体进行叠加组合，最终得到突变体TDL-mut，TDL-mut包括的突变位点有：F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。TDL-mut的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。脂肪酶突变体TDL-mut在80℃水浴处理5min条件下的剩余酶活率为70％，而脂肪酶TDL在80℃水浴5min后的酶活保留率仅为18％。相对于脂肪酶TDL，突变体TDL-mut耐热性的提高幅度为288％。
实施例6脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH
参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH。由图1可知，TDL和突变体TDL-mut的最适反应pH均为8.0，在pH6-9范围内相对酶活均大于70％。
实施例7脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性
将脂肪酶TDL和突变体TDL-mut分别在pH4-10条件下室温处理4小时，然后参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的剩余酶活，结果如图2所示。由图2可知脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的pH稳定性基本一样，在pH5-9范围内很稳定，室温处理4小时后，剩余酶活均大于80％。
实施例8脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度
参照国标法，测定脂肪酶TDL和突变体TDL-mut的最适反应温度，结果如图3所示。由图3可知，原始脂肪酶TDL的最适反应温度为60℃，而突变体TDL-mut的最适反应温度为65℃。
序列表
<110> 刘丹妮
<120> 一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut及其编码基因
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 825
<212> DNA
<213> Thermomyces dupontii
<400> 1
tctccagtca gacgtgaggt ttctcaggac ttgttcgacc agtttaattt gttcgctcag 60
tactctgctg ctgcctactg tgccaagaat aacgatgccc cagctggtgc taacgttacc 120
tgtagaggtt ccatctgccc agaggttgag aaggctgacg ccaccttctt gtactctttc 180
gaggactctg gagttggtga cgttaccggt ttcttggctt tggacaacac caacagattg 240
atcgtcttgt ctttccgtgg ttcccgttcc cttgagaatt ggatcggtaa cattaatttg 300
gatttgaagg gtatcgacga catctgctct ggttgcaagg gacacgatgg tttcacctcc 360
tcttggagat ccgttgccaa caccttgacc caacaggttc agaacgccgt tagagagcat 420
ccagactacc gtgtcgtctt cactggtcac tctttgggtg gtgctttggc taccgttgct 480
ggtgcctctt tgagaggtaa cggttacgac atcgacgttt tctcctacgg tgctcctcgt 540
gttggtaaca gagccttcgc tgtcttcttg accgctcaga ccggtggtac cttgtacaga 600
atcacccata ccaacgatat cgtcccacgt ttgccaccaa gagagcttgg atactcccac 660
tcttccccag agtactggat cacctccggt actttggttc cagttaccaa gaacgatatt 720
gttaaggttg agggaattga ctccaccgac ggtaacaacc agccaaatac cccagacatt 780
gctgcccact tgtggtactt cggtttgatt ggtacttgtt tgtaa 825
<210> 2
<211> 825
<212> DNA
<213> Thermomyces dupontii
<400> 2
tctccagtca gacgtgaggt ttctcaggac ttgtttgacc agtttaattt gttcgctcag 60
tactctgctg ctgcctactg tgccaagaat aacgatgccc cagctggtgc taacgttacc 120
tgtagtgaga acgtttgccc agaggttgag aaggctgacg ccaccttctt gtactctttc 180
gaggactctg gagttggtga cgttaccggt ttcttggctt tggacaacac caacagattg 240
atcgtcttgt ctttccgtgg ttcccgttcc cttgagaatt ggatcggtaa cttggctgcg 300
gatttgacag agatcgacga catctgctct ggttgcaagg gacacgatgg tttcacctcc 360
tcttggagat ccgttgccaa caccttgacc caacaggttc agaacgccgt tagagagcat 420
ccagactacc gtgtcgtctt cactggtcac tctttgggtg gtgctttggc taccgttgct 480
ggtgcctctt tgagaggtaa cggttacgac atcgacgttt tctcctacgg tgctcctcgt 540
gttggtaaca gagccttcgc tgtcttcttg accgctcaga ccggtggtac cttgtacaga 600
atcacccata ccaacgatat cgtcccacgt ttgccaccaa gagagcttgg atactcccac 660
tcttccccag agtactggat cacctccggt aatttggttc cagttacctg gaacgatatt 720
gttaaggttg agggaattga ctccaccgac ggtaacaacc agccaaatac cccagacatt 780
gctgcccact tgtggtactt cggtttgatt ggtacttgtt tgtaa 825
<210> 3
<211> 274
<212> PRT
<213> Thermomyces dupontii
<400> 3
Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn
1 5 10 15
Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp
20 25 30
Ala Pro Ala Gly Ala Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu
35 40 45
Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly
85 90 95
Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys
100 105 110
Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr
115 120 125
Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg
130 135 140
Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr
165 170 175
Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Val Phe Leu Thr Ala
180 185 190
Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val
195 200 205
Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile
225 230 235 240
Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn
245 250 255
Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr
260 265 270
Cys Leu
<210> 4
<211> 273
<212> PRT
<213> Thermomyces dupontii
<400> 4
Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Cys Asp Gln Phe Asn
1 5 10 15
Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp
20 25 30
Ala Pro Ala Gly Ala Asn Val Thr Cys Ser Glu Asn Val Cys Pro Glu
35 40 45
Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly
50 55 60
Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly
85 90 95
Asn Leu Ala Ala Asp Leu Thr Glu Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys
100 105 110
Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr
115 120 125
Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg
130 135 140
Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala
145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr
165 170 175
Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Val Phe Leu Thr Ala
180 185 190
Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val
195 200 205
Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Leu Val Pro Val Thr Cys Asn Asp Ile
225 230 235 240
Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn
245 250 255
Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr
260 265 270
Cys

Claims (9)

1.一种热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求2所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，所述的脂肪酶突变体TDL-mut包含的突变位点为F12C，R42S，G43E，S44N，I45V，I98L，N99A，L100A，K103T，G104E，T231N和K237C。
4.根据权利要求2所述的热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut，其特征在于，其最适反应pH均为8.0，最适反应温度为65℃。
5.一种获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其包括如下步骤：
1)脂肪酶TDL基因合成及克隆：将已公布的脂肪酶TDL基因，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pPICzαA上，得到重组载体pPICzαA-tdl；
2)理性定点突变：以pPICzαA-tdl为模板，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果纯化回收PCR产物；使用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体；将测序正确的突变体用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。
6.根据权利要求5所述的获得上述热稳定性高的脂肪酶突变体TDL-mut的突变方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增引物为：
5’端5'–agtcgaattcTCTCCAGTCAGACGTG AGGTT-3'；
3’端5'-ttctctagaTTACAAACAAGTACCAATCAA-3'。
7.一种包含SEQ ID NO：2核苷酸序列的TDL-mut基因。
8.一种包含权利要求1所述的突变体TDL-mut基因的重组载体。
9.一种包含权利要求3所述的突变体TDL-mut基因的重组菌株。
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