CN118028263A - 一种dna聚合酶及其制备方法与应用、表达基因、表达载体及重组细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA聚合酶及其制备方法与应用、表达基因、表达载体及重组细胞，所述DNA聚合酶包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2中任一项所示的蛋白片段。本发明提供的DNA聚合酶CPS2和MAG719，具有良好的耐盐性，可以适用于较高盐浓度下的扩增，且扩增效率高，还具有较强的链置换属性以及持续性；不仅如此，所述DNA聚合酶的N端为3’‑5’外切酶结构域，外切酶活性使得该DNA聚合酶能够识别错配碱基和校正功能，从而具有较高的保真性。上述耐盐且高保真的DNA聚合酶在等温扩增以及测序领域具有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种DNA聚合酶及其制备方法与应用、表达基因、表达载体及重组细胞。
背景技术
等温扩增技术是一种在恒定温度下进行核酸扩增的分子生物学方法，与传统的PCR技术相比，不需要热循环仪器，具有操作简便、反应速度快、灵敏度高、特异性强等优点，适用于多种领域。
相关技术中，等温扩增使用具有链置换活性的DNA聚合酶来分离双链DNA。具备链置换属性的等温扩增酶，具有成本低、无需扩增设备、减少污染概率以及对反应抑制剂的敏感性较低、可用于即时检验(POCT)等特征。然而，目前的等温扩增酶耐盐性较差，当反应体系中盐浓度超过一定范围后，其活性会急剧下降，甚至完全丧失；且保真性尚不能完全达到要求。
因此，解决目前常见的等温扩增酶不能完全满足使用要求的问题，开发新型的具有一定耐盐性、保真性高的等温扩增酶具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种DNA聚合酶及其制备方法与应用、表达基因、表达载体及重组细胞，旨在解决目前缺乏具有一定耐盐性且保真性高的等温扩增酶的问题。
本发明的第一方面，提供了一种DNA聚合酶，包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQID No.2中任一项所示的蛋白片段。
SEQ ID No.1：
MDKHTQYVKAHSFIHSEYKKAQFNDIECLIFDTESCTNYENDNTGARVYGWGLGVTRNKNMIYGQNLDQFWDVCINIFNDWYYNNKNTIKITKTKKGYPVRKYIKFPIAVHNLGWDVEFLKYSLVQNGFNYDKGLLKTVFSKGAPYQTVTEIEEPKTFHIVQNNNIVYGCNVYMDVFHEIENKDGSITEIGLCLDFFDSYKIITCAESQFHNYVHDVDPMFYKMNEEYDYDKWRSTEHIQNTLELRYQYNDIYMLREVIEQFYIDGLCGGELPLTGMRTASSIAFNVLKKMTFGEEKTEEEYIKYFELDKKTKFEFLRKRIETESYTGGYTHANHKAVGKTITKLGCSLDINSSYPSQMAYKVFPYGKPIRKTWGRKPKTEKNEVYLIEVGFDFVKPKHEEYALDIFKIGAVNSKALAPITGAVSG QEYFCTNIKDEKAIPVFKELKDTKLTTNYNVVLTSVEYEFWIKHFDFGVFTKDEYECFELDNLNFTGLKIGSILYYKSEKGKFKPYVDHFTKMKVENKKLGNKPLTNQAKLFLNGAYGKFGTKQNKEEKDLIMDKNGLLTFTGSVTEYEGKEFYRPYASFVTAYGRLQLWNAIIYAVGVENFLYCDTDSIYCNREVNSLIEDMNAIGETIDKTILGKWDVEHIFDKFKVLGQKKYMYHDCKENYIDLKCCGLPADARKIIINEGFEEFYLGKNVEGKKQRKKVVGGCLLLDTLFTIKRIMF
SEQ ID No.2：
MDLNERLKNIKNNGIMNFISKDKIKATSEKDVLNFAFDIEACAINNKSEMLTYSIALMSCNNDSDLCYWYNNVSKFNDMLLNLNCKQINLFAHNCLYDVKPFLLDFVKRYGNKQRQEDYFLKKQWNEFEKIYEVLNFQSSDKENKELKPFEYRLLMKNGVFYKLTIATEFGLINFYDTFKLAPFSLKKCCSDFLGLKLGKDGLDYDKERTLDDDLTEQEMTYIYEDVYGLSYLVKLLKINGIDLNGQKIKYDKLTNSGQALANYKLTLLEDYLNKQNAFENENLYDMVDTKLMKTNFHKLKNKGNVTEIKSNIVFEALFPKQSYFQDAWQRHSYYGGLSTVEYDNVKKFSKRKNKHGIVLDVNSLYPFVMTSRLLPYGEAQYRDTAYKNMNEKYKEVYPLYIQDITIYDLKVKKNKMSFLQVKDNKHFSGRECLKNNIKDGKKLTLHLRLTNVLLDLLFECYDVKAYKLGGHMAFRGSYNLFKNYIDFWSKIKQENEGALRAFAKLMQNGLYGKFGMAGVTELTNFQNVDDVFTIEHTHENVVSDTIYLPMATFITSWAKQYLVKAINNNYERFMYCDTDSLHLFGTIEQVKGVEIGKKIYGLWDNEMCFEDFKYIGSKRYAEKNTKTHKWEIKCCGLTDEIMKKLDDINVFDVCEYSAKELAKMEYFTKEGSIYYYKDKECTQKIKGLIKSKKSKIIKGGTIIQEQPYMISLNNYFER
根据本发明实施例的DNA聚合酶，至少具有以下有益效果：本发明提供的DNA聚合酶具有良好的耐盐性，可以适用于较高盐浓度下的扩增，且扩增效率高，还具有较强的链置换属性以及持续性；不仅如此，所述DNA聚合酶的N端为3’-5’外切酶结构域，外切酶活性使得该DNA聚合酶能够识别错配碱基和校正功能，从而具有较高的保真性。上述耐盐且高保真的DNA聚合酶在等温扩增以及测序领域具有较大的应用价值。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的核心序列为SEQ ID No.1～2所示的氨基酸序列，还可以包括其他的蛋白片段、修饰或者标签等。本领域技术人员根据实际需要，基于上述核心序列做出的调整，均在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白片段的氨基酸序列的中间连接了标签或DNA结合结构域；和/或，所述蛋白片段的氨基酸序列的N端连接了标签或DNA结合结构域；和/或所述蛋白片段的氨基酸序列的C端连接了标签或DNA结合结构域。
在本发明的一些实施方式中，所述标签包括利于DNA聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的DNA聚合酶可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA结合结构域包括但不限于Spy-catvher、Sso7d、DBD、HI。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。所述DNA聚合酶为CPS2 DNA聚合酶，来自于Clostridium phage(梭状芽孢杆菌噬菌体)CPS2，通过基因合成获得，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中下划线部分为聚合酶氨基酸核心序列，N端依次为his-tag、Spy-catcher和连接肽SGGS，Spy-catcher标签能够特异性的与Spy-tag标签形成稳定的共价键，从而使得聚合酶能够与其他蛋白形成二元复合物。
SEQ ID No.3：
MHHHHHHSGGSVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHISGGSDKHTQYVKAHSFIHSEYKKAQFNDIECLIFDTESCTNYENDNTGARVYGWGLGVTRNKNMIYGQNLDQFWDVCINIFNDWYYNNKNTIKITKTKK GYPVRKYIKFPIAVHNLGWDVEFLKYSLVQNGFNYDKGLLKTVFSKGAPYQTVTEIEEPKTFHIVQNNNIVYGCNVY MDVFHEIENKDGSITEIGLCLDFFDSYKIITCAESQFHNYVHDVDPMFYKMNEEYDYDKWRSTEHIQNTLELRYQYN DIYMLREVIEQFYIDGLCGGELPLTGMRTASSIAFNVLKKMTFGEEKTEEEYIKYFELDKKTKFEFLRKRIETESYT GGYTHANHKAVGKTITKLGCSLDINSSYPSQMAYKVFPYGKPIRKTWGRKPKTEKNEVYLIEVGFDFVKPKHEEYAL DIFKIGAVNSKALAPITGAVSGQEYFCTNIKDEKAIPVFKELKDTKLTTNYNVVLTSVEYEFWIKHFDFGVFTKDEY ECFELDNLNFTGLKIGSILYYKSEKGKFKPYVDHFTKMKVENKKLGNKPLTNQAKLFLNGAYGKFGTKQNKEEKDLI MDKNGLLTFTGSVTEYEGKEFYRPYASFVTAYGRLQLWNAIIYAVGVENFLYCDTDSIYCNREVNSLIEDMNAIGET IDKTILGKWDVEHIFDKFKVLGQKKYMYHDCKENYIDLKCCGLPADARKIIINEGFEEFYLGKNVEGKKQRKKVVGG CLLLDTLFTIKRIMF
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。所述DNA聚合酶为MAG719 DNA聚合酶，来自于人类宏基因组Caudoviricetes sp.中，通过基因合成获得，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其中下划线部分为聚合酶氨基酸核心序列，N端依次为为his-tag、Spy-catcher和连接肽GSG。
SEQ ID No.4：
MHHHHHHSGGSVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGSGDLNERLKNIKNNGIMNFIS KDKIKATSEKDVLNFAFDIEACAINNKSEMLTYSIALMSCNNDSDLCYWYNNVSKFNDMLLNLNCKQINLFAHNCLY DVKPFLLDFVKRYGNKQRQEDYFLKKQWNEFEKIYEVLNFQSSDKENKELKPFEYRLLMKNGVFYKLTIATEFGLIN FYDTFKLAPFSLKKCCSDFLGLKLGKDGLDYDKERTLDDDLTEQEMTYIYEDVYGLSYLVKLLKINGIDLNGQKIKY DKLTNSGQALANYKLTLLEDYLNKQNAFENENLYDMVDTKLMKTNFHKLKNKGNVTEIKSNIVFEALFPKQSYFQDA WQRHSYYGGLSTVEYDNVKKFSKRKNKHGIVLDVNSLYPFVMTSRLLPYGEAQYRDTAYKNMNEKYKEVYPLYIQDI TIYDLKVKKNKMSFLQVKDNKHFSGRECLKNNIKDGKKLTLHLRLTNVLLDLLFECYDVKAYKLGGHMAFRGSYNLF KNYIDFWSKIKQENEGALRAFAKLMQNGLYGKFGMAGVTELTNFQNVDDVFTIEHTHENVVSDTIYLPMATFITSWA KQYLVKAINNNYERFMYCDTDSLHLFGTIEQVKGVEIGKKIYGLWDNEMCFEDFKYIGSKRYAEKNTKTHKWEIKCC GLTDEIMKKLDDINVFDVCEYSAKELAKMEYFTKEGSIYYYKDKECTQKIKGLIKSKKSKIIKGGTIIQEQPYMISL NNYFER
在本发明的一些实施方式中，CPS2和MAG719 DNA聚合酶的N端为3’-5’外切酶结构域。蛋白结构预测以及同源序列分析，显示CPS2和MAG719 DNA聚合酶N端为3’-5’外切酶结构域，3’-5’外切酶活性使得DNA聚合酶能够识别错配碱基和校正功能，从而具有较高的保真性。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶还可以包括具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列功能相同或相似。其与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。例如：可以为95％。
本发明的第二方面，提供了一种DNA聚合酶的表达基因，包括编码上述的DNA聚合酶的核苷酸片段。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的表达基因包括编码氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2中任一项所示的蛋白片段的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的表达基因还包括编码插入所述蛋白片段的氨基酸序列的中间和/或N端和/或C端的标签或DNA结合结构域的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的表达基因包括编码氨基酸序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4中任一项所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述的表达基因。
在本发明的一些实施方式中，所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述表达载体可以是在质粒载体的多克隆位点插入上述核苷酸序列得到的重组质粒。具体的，质粒载体可以是诸如pET28a、PET-21a载体等本领域所知的质粒载体。
本发明的第四方面，提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括上所述的表达基因或上述的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞可以是将上述表达载体导入大肠杆菌得到的重组细胞。具体的，可以导入大肠杆菌DH5α或者大肠杆菌BL21(DE3)。在其他的一些实施方式中，还可以将上述表达载体导入其他的原核细胞或真核细胞得到的重组细胞，所述重组细胞不包含生殖材料。
本发明的第五方面，提供了一种DNA聚合酶的制备方法，包括步骤：将编码上述的DNA聚合酶的表达基因导入生物细胞中，使所述表达基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方式中，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述原核细胞包括细菌或藻。具体地，所述生物细胞可以为大肠杆菌，更具体为大肠杆菌DH5α或者大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
本发明的第六方面，提供了一种酶制剂，包括上述的DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方式中，所述酶制剂还可以包括可与上述的DNA聚合酶处于同一使用条件下的其他酶，共同组成酶的组合物。
本发明的第七方面，提供了一种上述的DNA聚合酶在核酸扩增或测序中的应用。
在本发明的一些实施方式中，应用所述DNA聚合酶进行核酸扩增或测序的方法包括步骤：将所述DNA聚合酶与模板DNA、引物反应试剂混合后发生反应。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述反应试剂包括反应缓冲液、dNTP、BSA、KCl中的至少一种。
本发明的第八方面，提供了一种核酸扩增或测序产品，所述产品包括上述的DNA聚合酶或者上述的酶制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒，所述试剂盒可以是DNA扩增试剂盒或测序试剂盒。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括反应缓冲液、dNTP、引物中的至少一种。
本发明提到的核酸扩增或测序，均为本领域通用概念，本领域技术人员可根据实际需要设置扩增或测序反应的条件并选择合适的反应试剂，在此不作赘述。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测结果示意图；
图2为本发明实施例1中的DNA聚合酶进行链置换和持续性测试的电泳检测结果示意图；
图3为本发明实施例1中的DNA聚合酶进行外切酶反应的电泳检测结果示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所有的反应条件如无特殊说明均为适合条件下进行。所述百分比如无特殊说明均为质量百分比。
除非特别定义，本发明所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使其分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
若无特别说明，本发明所列的氨基酸序列均是从N端到C端的顺序；核苷酸序列均是从5’端到3’端的顺序。
实施例1
将融合型CPS2 DNA聚合酶和MAG719 DNA聚合酶的表达序列分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD601-03)中。抗性筛选后取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h后，加入IPTG至终浓度为0.6mM后继续16℃摇培过夜。用Ni柱亲和层析，纯化得到CPS2和MAG719 DNA聚合酶，并使用超滤柱AMICON ULTRA15ML 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进行浓缩，分别得到上述两种DNA聚合酶。其中，野生型CPS2和MAG719 DNA聚合酶序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。融合型CPS2 DNA聚合酶和MAG719 DNA聚合酶的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
实施例2
对得到的融合型聚合酶进行性能鉴定
1、SDS-PAGE蛋白电泳验证融合型CPS2和MAG719 DNA聚合酶的蛋白大小和纯度
将上述得到融合型DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，鉴定DNA聚合酶蛋白的大小和纯度。结果如图1所示，图中泳道8为蛋白Marker，泳道1-3分别为200ng、400ng和800ng BSA，泳道4和5分别为1μL和2μL融合型CPS2 DNA聚合酶，泳道6和泳道7分别为1μL和2μL融合型MAG719 DNA聚合酶。从图1可以看出，各电泳条带在浓缩胶中被压成一条直线，从图中条带位置，结合测序结果初步判断，聚合酶分子量大小正确，蛋白纯度较高。
2、融合型CPS2和MAG719 DNA聚合酶链置换和持续性测试
(1)制备模板引物复合物
本实施例采用单链环形DNA作为模板进行延伸：
模板和引物以2：1的摩尔比在20mM HEPES溶液里面混合，模板终浓度约1μM。模板和引物混合液经过95℃，5min加热，冷却至室温即可使用。模板序列为5’-GGCTAAAATCCTTAATTAACCCTTTTCCCTTTTGAATTCCCTCCCCACTCT-3’(SEQ ID No.5)，引物序列为5’-ATTTTAGCCAGAGTGGGGA-3’(SEQ ID No.6)。
10×reaction buffer:500mM Tris-HCl,100mM MgCl2,100mM(NH4)2SO4,40mMDTT,pH7.5。
(2)延伸反应
10×reaction buffer 2:200mM Tris-HCl,100mM(NH4)2SO4,100mM KCl,20mMMgSO4,1％X-100
pH＝8.8,25℃.
| 1×reaction buffer2(10×) |
| 10nM模板引物复合物 |
| 300mM KCL |
| 50μM dATP/dTTP/dCTP/dGTP |
| 100nM Enzyme |
| Water |
反应条件：30℃,2h。
(3)电泳验证
取5μl上述样品与1μl的10×碱性缓冲液和2μl的碱性上样缓冲液(6×)(Coolaber公司，目录号：SL2212-5 mL)以及4μl无酶水混合。将上述样品进行0.6％碱性琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图2所示，图中泳道1为Gene Ruler High Range DNA Ladder(ThermoScientific公司，目录号：SM1353)，图中泳道2为1kb plus DNA ladder(Trans公司，目录号：BM211),泳道3为不添加酶的对照组；泳道4为CPS2 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，泳道5为MAG719 DNA聚合酶在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，泳道6为mut83 DNA聚合酶(参见：冯伟，Phi29 DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用)在300mM KCl条件下与DNA模板延伸产物的条带，泳道7-9分别为不添加模板的对照组，目的是检测DNA聚合酶纯化过程中携带的DNA污染。
在天然底物条件下所有DNA聚合酶均有～50kb的延伸条带，反映了三个DNA聚合酶突变体均具有较强的链置换属性、持续性和耐盐性，且其聚合酶活性并未受到N端融合结构域抑制。
3、外切酶实验：
蛋白结构预测以及同源序列分析，显示CPS2和MAG719 DNA聚合酶N端为3’-5’外切酶结构域。3’-5’外切酶活性使得DNA聚合酶，能够识别错配碱基和校正功能，从而具有较高的保真性。
本实施例采用单链DNA为模板，分别验证CPS2和MAG719 DNA聚合酶的外切酶活性。反应体系如下：模板序列为T40，模板终浓度约10μM。镁浓度为500nM；反应体系中还包括20mM Hepes,pH 7.5,300mM KCl,1mM Mn2+,反应条件为30℃,10min。
结果如图3所示。泳道1-4为不添加二价金属离子的对照组；泳道5-8为添加1mMMn2+的反应组；对照组中寡核苷酸片段条带呈均一条带；而反应组中，泳道6和泳道7中DNA片段总量显著减少，证实CPS2和MAG719具有较强的外切酶活性；泳道5中蛋白无外切酶活性，因此，DNA片段总量不变。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种DNA聚合酶，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2中任一项所示的蛋白片段。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述蛋白片段的氨基酸序列的中间和/或N端和/或C端连接了标签或DNA结合结构域。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQID No.3～SEQ ID No.4中任一项所示。
4.一种DNA聚合酶的表达基因，其特征在于，包括编码如权利要求1-3任一所述的DNA聚合酶的核苷酸片段。
5.一种表达载体，其特征在于，包括如权利要求4所述的表达基因。
6.一种重组细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的表达基因或如权利要求5所述的表达载体。
7.一种DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：将编码如权利要求1-3任一所述的DNA聚合酶的表达基因导入生物细胞中，使所述表达基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
8.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1-3任一所述的DNA聚合酶或者如权利要求7所述的制备方法制备得到的DNA聚合酶。
9.一种如权利要求1-3任一所述的DNA聚合酶在核酸扩增或测序中的应用。
10.一种核酸扩增或测序产品，其特征在于，包括如权利要求1-3任一所述的DNA聚合酶或者如权利要求8所述的酶制剂。
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