CN116103263A - 突变型pwt聚合酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了突变型PWT聚合酶及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。该突变型PWT聚合酶具有A1)至A2)中的任一种：A1)、如SEQ ID NO.1的第407至986位氨基酸所示的氨基酸序列；A2)、在A1)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列。其可以在室温条件下进行明显的等温扩增并且能够耐受较高的盐浓度，它有望成为滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及突变型PWT聚合酶及其制备方法与应用。
背景技术
DNA聚合酶负责基因组的复制和维持，该作用对于准确地一代一代地传递遗传信息至关重要。链置换是指在DNA合成期间，聚合酶置换而不是降解所遇到的下游DNA的能力。在链置换复制期间，一次仅复制一条DNA链。链置换合成释放单链DNA，然后将其复制为双链DNA。常用的能够在常温条件下进行等温扩增聚合酶主要是phi29聚合酶，但由于其具有外切酶活性，因此，限制了其在纳米孔测序上的应用。PWT聚合酶是一种来源于嗜冷杆菌BL-248-WT-3的DNA聚合酶，可用于测序，但其不具有明显的链置换能力，仅在低温下具有较高的活性，无法在室温条件下进行有效地等温扩增，也无法耐受高盐。因此，需要不断改进PWT聚合酶的性质。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种突变型PWT聚合酶，可以在室温条件下进行明显的等温扩增并且能够耐受较高的盐浓度，它有望成为滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。
本发明还提供与上述突变型PWT聚合酶相关的生物材料。
本发明还提供一种酶制剂。
本发明还提供上述突变型PWT聚合酶的制备方法。
本发明还提供一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法。
本发明还提供上述突变型PWT聚合酶、生物材料或酶制剂相关的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种突变型PWT聚合酶，所述突变型PWT聚合酶具有A1)至A2)中的任一种：
A1)、如SEQ ID NO.1的第407至986位氨基酸所示的氨基酸序列；
A2)、在A1)或A2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列。
根据本发明实施例的突变型PWT聚合酶，至少具有如下有益效果：
实施例的突变型PWT聚合酶可以在室温条件下进行等温扩增，并且能够耐受较高的盐浓度，有望成为滚环扩增和多重置换扩增的理想工具，在纳米孔测序等方面具有很好的应用前景。
根据本发明的一些实施例，所述突变型PWT聚合酶还可以具有如A1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与A1)所示的氨基酸序列功能相同或相似。
根据本发明的一些实施例，所述多个为2～100个。
根据本发明的一些实施例，所述突变型PWT聚合酶具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施例，A2)所示氨基酸序列与SEQ ID NO.1具有至少90％同一性的氨基酸序列。优选为95％。
根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于突变型PWT聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的突变型PWT聚合酶可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于突变型PWT聚合酶溶解的标签可以为nus标签、麦芽糖结合蛋白或N-利用物质A蛋白；利于突变型PWT聚合酶纯化的标签可以为strep标签、His标签、GST标签、pelB信号序列、ompA信号序列、肠毒素B-亚基信号序列、碱性磷酸酶信号序列或FLAG八肽；利于突变型PWT聚合酶检测的标签可以为辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。
根据本发明的一些实施例，所述标签具体可以为麦芽糖结合蛋白和/或strep标签。
根据本发明的一些实施例，所述标签与所述突变型PWT聚合酶之间还包括连接子。
根据本发明的第二方面实施例的与本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2第1219至2958位核苷酸所示。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子的核苷酸序列还可以如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述突变型PWT聚合酶的DNA。该DNA不但可包括启动所述突变型PWT聚合酶基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。具体可以为PET-21a载体。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述突变型PWT聚合酶的核酸分子得到的重组载体。
根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组生物不包含生殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向大肠杆菌BL21(DE3)中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
根据本发明的第三方面实施例的一种酶制剂，包括本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶。
根据本发明的一些实施例，所述酶制剂可用于体外DNA合成、DNA扩增或DNA测序。
根据本发明的一些实施例，所述酶制剂还包括核苷三磷酸、反应缓冲液中的至少一种。可以理解的是，所述反应缓冲液不影响所述突变型PWT聚合酶的活性。
根据本发明的第四方面实施例的本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶的制备方法，包括：
将本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述突变型PWT聚合酶。
根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。
根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
根据本发明的第五方面实施例的一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，包括：
将本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶与模板DNA、反应试剂混合。
根据本发明的一些实施例，所述反应试剂包括反应缓冲液、引物、核苷三磷酸。还可以包括BSA和盐。
根据本发明的一些实施例，所述反应试剂的盐浓度为0～300mM。
根据本发明的一些实施例，混合后的反应温度为25℃～40℃。
根据本发明的第六方面实施例的C1)至C3)任一项在D1)至D4)中任一项的应用，
C1)、本发明第一方面实施例中所述的突变型PWT聚合酶；
C2)、本发明第二方面实施例中所述的生物材料；
C3)、本发明第三方面实施例中所述的酶制剂；
D1)、核酸扩增；
D2)、制备核酸扩增相关产品；
D3)、测序；
D4)、制备测序相关产品。
根据本发明的一些实施例，所述核酸扩增包括链置换反应、聚合酶链式反应、等温扩增反应。所述等温扩增反应选自环介导扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引物扩增(CPA)。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是本发明的融合型聚合酶和野生型PWT聚合酶的SDS-PAGE蛋白电泳结果；其中，泳道1～5分别为160ng、320ng、480ng、640ng、800ng的牛血清白蛋白(BSA，蛋白大小为66kDa)，泳道6为融合型聚合酶，泳道7为野生型PWT聚合酶；
图2是本发明一实施例的不同盐浓度下的聚合酶活性检测结果；其中，泳道1～3分别指在0mM、150mM和300mM盐浓度条件下野生型PWT聚合酶的滚环复制的活性，泳道4～6分别指在0mM、150mM和300mM盐浓度条件下融合型聚合酶的滚环复制的活性；
图3是本发明一实施例的不同温度下的聚合酶活性检测结果；其中，泳道1为阴性对照，未添加酶，泳道2～6分别是10℃、25℃、30℃、35℃、40℃的反应产物。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
若无特殊说明，本发明中“约”表示允许误差在±2％之内。
下述实施例中，10×反应缓冲液的的配方为：500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM(NH4)2SO4(pH 7.5)。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
术语“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物。例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
术语“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程。
实施例1(突变型PWT聚合酶的表达和纯化)
将融合型聚合酶的表达序列连接到基因表达载体pET-21a中后，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中。经抗性筛选后，取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃摇培至OD＝1时，加入IPTG至IPTG终浓度为0.6mM，继续于20℃摇培24h。收集菌体，超声破碎后，取上清液，使用Strep-
XT 4F flow柱料(IBA-lifesciences，目录号：2-5010-010)对上清液进行亲和层析，纯化得到融合型聚合酶，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩融合型聚合酶。
融合型聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，仅加粗标记部分为与突变型PWT聚合酶融合表达的麦芽糖结合蛋白的氨基酸序列，斜体标记部分为连接子，加粗且下划线标记部分为纯化标签(strep标签)的氨基酸序列，仅下划线标记部分为突变型PWT聚合酶的氨基酸序列。
编码融合型聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，仅加粗标记部分为编码麦芽糖结合蛋白的核苷酸序列，斜体标记部分为连接子编码序列，加粗且下划线标记部分为编码纯化标签(strep标签)的核苷酸序列，仅下划线标记部分为编码突变型PWT聚合酶的核苷酸序列，。
对比例1(野生型PWT聚合酶的表达和纯化)
将野生型PWT聚合酶的表达序列连接到基因表达载体pET-21a中后，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中。经抗性筛选后，取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中37℃摇培过夜，然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃摇培至OD＝1时，加入IPTG至IPTG终浓度为0.6mM，继续于20℃摇培24h。收集菌体，超声破碎后，取上清液，用Ni2+柱对上清液进行亲和层析，纯化得到野生型PWT聚合酶，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩野生型PWT聚合酶。
野生型PWT聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，加粗且下划线标记部分为纯化标签(His标签)的氨基酸序列。
编码融合型聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，加粗且下划线标记部分为编码纯化标签(His标签)的核苷酸序列。
检测例1
本检测例通过SDS-PAGE蛋白电泳对实施例1的融合型聚合酶和对比例2的野生型PWT聚合酶的蛋白大小和纯度进行验证。
结果如图1所示。
融合型聚合酶的蛋白大小约为110kDa，野生型PWT聚合酶的蛋白大小与BSA相近；且纯化得到的融合型聚合酶和野生型PWT聚合酶的纯度均较高。
检测例2
本检测例对实施例1的融合型聚合酶和对比例2的野生型PWT聚合酶在不同盐浓度下的滚环复制的活性进行检测。检测方法如下：
将如表1所示的反应体系在30℃下反应3h后，取反应产物跑电泳。
表1
| 试剂 | 终浓度 |
| BSA | 0.5μg/μL |
| 10×反应缓冲液 | 1× |
| 模板(M13mp18) | 5nM |
| 引物 | 5nM |
| dNTP(10mM) | 200nM |
| KCl | 0mM/150mM/300mM |
| 实施例1的融合型聚合酶/对比例2的野生型PWT聚合酶 | 200nM |
其中，引物的核苷酸序列为5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。
电泳结果如图2所示。
融合型聚合酶在30℃下以及300 mM的高盐条件下均具有较强的链置换能力，而野生型PWT聚合酶则在30℃条件下不具有链置换能力，无法进行滚环复制。
检测例3
本检测例对实施例1的融合型聚合酶在不同温度下的滚环复制的活性进行检测。检测方法如下：
将如表1所示的反应体系(KCl浓度为0mM)在10℃，25℃，30℃，35℃，40℃下反应3h后，取反应产物跑电泳。
电泳结果如图3所示。
融合型聚合酶在10℃、25℃、30℃、35℃和40℃下均具有较强的链置换能力，能够进行滚环复制。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种突变型PWT聚合酶，其特征在于，所述突变型PWT聚合酶具有A1)至A2)中的任一种：
A1)、如SEQ ID NO.1的第407至986位氨基酸所示的氨基酸序列；
A2)、在A1)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的突变型PWT聚合酶，其特征在于，所述标签包括利于突变型PWT聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种；
优选地，所述标签包括麦芽糖结合蛋白和/或step标签；
优选地，所述突变型PWT聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.与权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.2第1219至2958位核苷酸或SEQ ID NO.2所示。
5.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶。
6.根据权利要求5所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂还包括核苷三磷酸、反应缓冲液中的至少一种。
7.一种权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述突变型PWT聚合酶。
8.一种对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶与模板DNA、反应试剂混合；
所述反应试剂包括反应缓冲液、引物、核苷三磷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应试剂的盐浓度为0～300mM。
10.C1)至C3)任一项在D1)至D4)中任一项的应用，
C1)、权利要求1或2所述的突变型PWT聚合酶；
C2)、权利要求3或4所述的生物材料；
C3)、权利要求5或6所述的酶制剂；
D1)、核酸扩增；
D2)、制备核酸扩增相关产品；
D3)、测序；
D4)、制备测序相关产品。
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