CN117535264A - 突变型pst dna聚合酶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种突变型PST DNA聚合酶及其制备方法与应用。该突变型PST DNA聚合酶包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺。该突变型PST DNA聚合酶能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物在高盐条件下进行延伸，可广泛应用于纳米孔测序中。

Description

突变型PST DNA聚合酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种突变型PST DNA聚合酶及其制备方法与应用。
背景技术
DNA聚合酶是一类能够在DNA模板链上将脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3'-OH末端，催化核苷酸聚合成以模板互补的DNA序列的酶，常用于催化DNA的体外合成。通常DNA聚合酶可分为以下几个种类：大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶及反转录酶等。这些聚合酶的共同特点是具有催化核苷酸聚合能力和外切酶活性。
相关技术中，当基于DNA聚合酶和纳米孔的边合成边测序技术(sequence bysynthesis，SBS)使用寡核苷酸修饰的底物来进行测序时，采用常规的DNA聚合酶进行扩增，存在难以利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸、测序效果不理想的缺点。
基于此，亟需寻求一种新的DNA聚合酶，其能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸，进而提高测序效果。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种突变型PST DNA聚合酶，该聚合酶能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物在高盐条件下进行延伸。
本发明还提出了一种生物材料。
本发明还提出了一种酶制剂。
本发明还提出了一种上述突变型PST DNA聚合酶的制备方法。
本发明还提出了一种上述的突变型PST DNA聚合酶在核酸的扩增或测序中的应用。
本发明还提出了一种上述的突变型PST DNA聚合酶在制备耐盐的纳米孔测序试剂盒中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种突变型PST DNA聚合酶，包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺。
根据本发明实施例的突变型PST DNA聚合酶，至少具有如下有益效果：本发明发现对PST DNA聚合酶的底物进口区进行突变，如将如SEQ ID NO.5所示的PST DNA聚合酶编码氨基酸的第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺，能够扩大进口区以及改变进口区的电荷性质，进而调控PST DNA聚合酶对不同分子量底物的延申结合能力。
在本发明的一些实施方式中，所述突变还包括：第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺、第336位谷氨酸突变为丙氨酸、第283位谷胺酰胺突变为甘氨酸、第266位谷氨酸突变为丙氨酸中的至少一种。
优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺和第426位丝氨酸突变为丙氨酸。
优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺和第336位谷氨酸突变为丙氨酸。
优选地，所述突变包括：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺、第336位谷氨酸突变为丙氨酸、第283位谷胺酰胺突变为甘氨酸和第266位谷氨酸突变为丙氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1至4中任一种所示。
优选的，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。
根据本发明的一些实施例，在本发明的突变型PST DNA聚合酶的氨基酸序列的N端或/和C端可以连接标签或DNA结合结构域。
根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于DNA聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的DNA聚合酶可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于DNA聚合酶溶解的标签包括但不限于nus标签或麦芽糖结合蛋白；利于DNA聚合酶纯化的标签包括但不限于strep标签、His标签、GST标签、pelB信号序列或ompA信号序列；利于DNA聚合酶检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed或青色荧光蛋白(CFP)。所述标签具体可以为strep标签。
根据本发明的一些实施例，所述DNA结合结构域包括但不限于Sso7d、DBD、HI中的至少一种。A2)中所述DNA聚合酶至少具有与A1)中所述DNA聚合酶相同的功能；包括但不限于无外切酶活性、耐盐性。
本发明的第二方面，提供生物材料，所述生物材料为A1)至A4)中的任一种：
A1)、编码第一方面任一项所述的DNA聚合酶的核酸分子；
A2)、含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)、含有A1)所述核酸分子或A2)所述表达盒的重组载体；
A4)、含有A1)所述核酸分子、A2)所述表达盒或A3)所述重组载体的宿主细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6至SEQID NO.9任一项所示。
本发明的第三方面，提供了一种酶制剂，包括第一方面任一项所述的DNA聚合酶。
本发明的第四方面，提供了一种DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将含第一方面任一项所述的DNA聚合酶的编码基因的表达载体导入宿主细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的第五方面，提供了第一方面任一项所述的DNA聚合酶在核酸的扩增或测序中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述扩增包括环介导扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引物扩增(CPA)中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序的反应试剂包括反应缓冲液、核苷酸底物、BSA、KCl中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序中所使用的核苷酸底物包括非天然核苷酸底物。
在本发明的一些实施方式中，所述扩增或测序中所使用的核苷酸底物包括聚合物标记的核苷酸D8G和/或A30A。
本发明的第六方面，提供了第一方面任一项所述的DNA聚合酶在制备耐盐的纳米孔测序试剂盒中的应用。
纳米孔测序时增加电解槽中盐溶液的浓度，有利于提高测试过程中的信噪比以及检测结果的准确性，提升测序质量。然而传统的DNA聚合酶的耐盐性较差，所以如果增加电解槽的盐溶液的浓度，则DNA聚合酶的活性降低，不利于提高测序速度，而本发明的突变型PST DNA聚合酶不仅具有较好的耐盐性，而且能够利用不同分子量的寡核苷酸修饰底物进行延伸，可广泛应用于纳米孔测序中。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米孔测序试剂盒包括具有纳米孔的测序组件和含有所述DNA聚合酶的检测试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米孔测序试剂盒的反应体系包括50nM～500nM的核酸模板、100nM～500nM的所述DNA聚合酶、20mM～50mM的Tris-HCl、2mM～20mM的Mg2+、10mM～40mM的(NH4)2SO4、4mM～20mM的DTT、0.2mM～0.5mM的dNTPs、以及0mM～500mM的NaCl或0mM～500mM的KCl。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明DNA聚合酶PB-①、DNA聚合酶PB-②和DNA聚合酶PB-④的SDS-PAGE电泳图。
图2为本发明DNA聚合酶PB-③和DNA聚合酶PB-④的SDS-PAGE电泳图。
图3为本发明实施例突变型PST DNA聚合酶与聚合物标记的核苷酸D8G结合能力检测结果。
图4为本发明实施例突变型PST DNA聚合酶与聚合物标记的核苷酸A30A结合能力检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，词语“优选地”、“更优选地”等是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。
术语“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物。例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
另除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
本发明的主要构思
在PST DNA聚合酶的基础上，通过对其底物进口区的关键性位点进行突变构建了4种DNA聚合酶，命名为DNA聚合酶PB-①、DNA聚合酶PB-②、DNA聚合酶PB-③和DNA聚合酶PB-④。其中DNA聚合酶PB-①的突变位点是D404N、A408Q和D430G；DNA聚合酶PB-②的突变位点是D404N、A408Q、S426A和D430N；DNA聚合酶PB-③的突变位点是L334S、E335Q、E336A、D404N、A408Q、S426A和D430N；DNA聚合酶PB-④的突变位点是L334S、E335Q、E336A、D404N、A408Q、S426A、D430N、Q283G和E266A。
具体地，DNA聚合酶PB-①的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(从N端到C端)：
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSNMRRQAKAVNFGIVYGISAYGLSQNLGITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.1)。
DNA聚合酶PB-②的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(从N端到C端)：
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSNMRRQAKAVNFGIVYGISAYGLAQNLNITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.2)。
DNA聚合酶PB-③的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(从N端到C端)：
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRSQAGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSNMRRQAKAVNFGIVYGISAYGLAQNLNITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.3)。
DNA聚合酶PB-④的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(从N端到C端)：
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLAKLASEHEIIEQILLYRGLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRSQAGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSNMRRQAKAVNFGIVYGISAYGLAQNLNITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.4)。
PST DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(从N端到C端)：
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISAYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.5)。
具体地，DNA聚合酶PB-①的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示(从5’端到3’端)：
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCAATATGCGCCGCCAGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGGCATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.6)。
DNA聚合酶PB-②的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(从5’端到3’端)：
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCAATATGCGCCGCCAGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGGCGCAGAATCTGAATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.7)。
DNA聚合酶PB-③的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示(从5’端到3’端)：
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCAGCCAGGCGGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCAATATGCGCCGCCAGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGGCGCAGAATCTGAATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.8)。
DNA聚合酶PB-④的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示(从5’端到3’端)：
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGCGAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCGGCCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCAGCCAGGCGGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCAATATGCGCCGCCAGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGGCGCAGAATCTGAATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.9)。
PST DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示(从5’端到3’端)：
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCGATATGCGCCGCGCGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.10)。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件(例如文献、书本中所述的条件)或制造商建议的条件进行。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：DNA聚合酶PB-①的制备
本实施例提供了一种DNA聚合酶PB-①的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、委托上海捷瑞生物工程有限公司将DNA聚合酶PB-①的表达基因(如SEQID NO.6所示)连接到体pET-30a+载体中，得到DNA聚合酶PB-①的表达载体。
步骤S1、将DNA聚合酶PB-①的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中，抗氨苄青霉素培养基进行培养及测序验证。
步骤S1、待确认转化成功之后，挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得DNA聚合酶PB-①。
实施例2：DNA聚合酶PB-②的制备
本实施例提供了一种DNA聚合酶PB-②的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、委托上海捷瑞生物工程有限公司将DNA聚合酶PB-②的表达基因(如SEQID NO.7所示)连接到体pET-30a+载体中，得到DNA聚合酶PB-②的表达载体。
步骤S1、将DNA聚合酶PB-②的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中，抗氨苄青霉素培养基进行培养及测序验证。
步骤S1、待确认转化成功之后，挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得DNA聚合酶PB-②。
实施例3：DNA聚合酶PB-③的制备
本实施例提供了一种DNA聚合酶PB-③的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、委托上海捷瑞生物工程有限公司将DNA聚合酶PB-①的表达基因(如SEQID NO.8所示)连接到体pET-30a+载体中，得到DNA聚合酶PB-③的表达载体。
步骤S1、将DNA聚合酶PB-③的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中，抗氨苄青霉素培养基进行培养及测序验证。
步骤S1、待确认转化成功之后，挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得DNA聚合酶PB-③。
实施例4：DNA聚合酶PB-④的制备
本实施例提供了一种DNA聚合酶PB-④的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、委托上海捷瑞生物工程有限公司将DNA聚合酶PB-④的表达基因(如SEQID NO.9所示)连接到体pET-30a+载体中，得到DNA聚合酶PB-④的表达载体。
步骤S1、将DNA聚合酶PB-④的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中，抗氨苄青霉素培养基进行培养及测序验证。
步骤S1、待确认转化成功之后，挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得DNA聚合酶PB-④。
对比例：PST DNA聚合酶的制备
本对比例提供了一种PST DNA聚合酶的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、委托上海捷瑞生物工程有限公司将PST DNA聚合酶的表达基因(如SEQ IDNO.10所示)连接到体pET-30a+载体中，得到PST DNA聚合酶的表达载体。
步骤S1、将PST DNA聚合酶的表达载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(上海吐露港生物科技有限公司，目录号CC96107)中，抗氨苄青霉素培养基进行培养及测序验证。
步骤S1、待确认转化成功之后，挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICON ULTRA15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得PST DNA聚合酶。
检测例1：SDS-PAGE蛋白电泳验证
对上述实施例1～4制得的突变型PST DNA聚合酶(分别为DNA聚合酶PB-①、DNA聚合酶PB-②、DNA聚合酶PB-③和DNA聚合酶PB-④)和对比例1的野生型PST DNA聚合酶进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，以验证蛋白大小和纯度。
结果如图1和图2所示，其中图1中的泳道1为对比例1的野生型PST DNA聚合酶，泳道2为DNA聚合酶PB-①，泳道3为DNA聚合酶PB-②，泳道4为DNA聚合酶PB-④，泳道5和6分别为320ng和480ng的牛血清白蛋白(BSA)；图2中泳道1为对比例1的野生型PST DNA聚合酶，泳道2和3为DNA聚合酶PB-③，泳道4为DNA聚合酶PB-④，泳道5、6和7分别为160ng、320ng和480ng的牛血清白蛋白(BSA)。
从图中条带位置结合测序结果初步判断，实施例1～4制得的突变型PST DNA聚合酶和对比例制得的野生型PST DNA聚合酶正确，分子大小差异均符合预期。
检测例2：突变型PST DNA聚合酶与聚合物标记的核苷酸结合能力检测
本检测例对上述实施例1～4制得的突变型PST DNA聚合酶和对比例1的野生型PSTDNA聚合酶与聚合物标记的核苷酸结合能力进行了检测，具体方法如下：
配制如表1所示的反应体系，分别加入上述实施例1～4制得的突变型PST DNA聚合酶和对比例1的野生型PST DNA聚合酶，然后在30℃条件下反应3h。
表1：反应体系
其中，反应缓冲液由50mM的Tris-HCl、10mM的MgCl2、10mM的(NH4)2SO4和4mM的DTT组成，反应缓冲液在25℃条件下的pH为7.5；引物的核苷酸序列为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO.11)；D8G为寡核苷酸修饰的非天然核苷酸，分子量为9470.9，化学结构式如下：
A30A的分子量为10758.1，化学结构式如下所示：
反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳。
结果如图3和图4所示，其中图3为以dATP、dTTP、dCTP和D8G为寡核苷酸底物的扩增结果，图4为以A30A、dTTP、dCTP和dGTP为寡核苷酸底物的扩增结果，NC组为仅含野生型PSTDNA聚合酶组。从图中可以看出本发明制备的突变型PST DNA聚合酶(DNA聚合酶PB-①、DNA聚合酶PB-②、DNA聚合酶PB-③和DNA聚合酶PB-④)均可以利用寡核苷酸修饰的非天然核苷酸进行扩增反应，其中对于寡核苷酸修饰的非天然核苷酸D8G，DNA聚合酶PB-②的聚合效果最佳，延伸的产物条带更长；对于寡核苷酸修饰的非天然核苷酸A30A，DNA聚合酶PB-④的聚合效果最佳，其延伸的产物条带更长，且有大小不均一的(呈弥散形)条带扩增。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种突变型PST DNA聚合酶，其特征在于，包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过以下突变后的氨基酸序列：第404位的天冬氨酸突变为天冬酰胺、第408位的丙氨酸突变为谷胺酰胺、第430位的天冬氨酸突变为甘氨酸或天冬酰胺。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述突变还包括：第426位丝氨酸突变为丙氨酸、第334位亮氨酸突变为丝氨酸、第335位谷氨酸突变为谷胺酰胺、第336位谷氨酸突变为丙氨酸、第283位谷胺酰胺突变为甘氨酸、第266位谷氨酸突变为丙氨酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQID NO.1至4中任一种所示。
4.生物材料，其特征在于：所述生物材料为A1)至A4)中的任一种：
A1)、编码权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶的核酸分子；
A2)、含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)、含有A1)所述核酸分子或A2)所述表达盒的重组载体；
A4)、含有A1)所述核酸分子、A2)所述表达盒或A3)所述重组载体的宿主细胞。
5.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.6至SEQ ID NO.9任一项所示。
6.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶。
7.一种权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶的编码基因的表达载体导入宿主细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
8.如权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶在核酸的扩增或测序中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述扩增或测序中所使用的核苷酸底物包括非天然核苷酸底物。
10.一种如权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶在制备耐盐的纳米孔测序试剂盒中的应用。
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