CN117947002A - 一种突变型β-葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种突变型β‑葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用。本发明的突变型β‑葡萄糖醛酸酶，包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过以下突变和/或修饰后的氨基酸序列：A1)第559位的甘氨酸突变为含有非芳香羟基侧链的氨基酸：A2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的C末端添加通式为Xaan‑Cys‑Xaam的多肽序列，其中Xaa为任意氨基酸，n取自2～8之间的任意整数，m取自0～2之间的任意整数。本发明的突变型β‑葡萄糖醛酸酶相对于野生型β‑葡萄糖醛酸酶具有更高的酶活性和热稳定性，可广泛应用于葡萄糖醛酸类物质的检测。

Description

一种突变型β-葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种突变型β-葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用。
背景技术
葡萄糖醛酸化是哺乳动物通过UDP(uridine diphosphate)葡萄糖醛酸转移酶系统进行药物代谢的主要方式之一。人体通过葡萄糖醛酸化作用使大量物质更易溶于水，并通过这种方式使它们随后通过尿液或粪便(通过肝脏的胆汁)从体内排出。此外，肠道中的微生物，如大肠杆菌可以利用排泄出的β-葡萄糖醛酸作为碳源。β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,BGUS)可以催化多种β-葡萄糖醛酸(β-glucuronides)发生水解反应。并且，所有脊椎动物和大部分软体动物，以及某些细菌都表现出BGUS酶活性。
鉴于葡萄糖醛酸化在化合物代谢中的关键作用，目前BGUS酶已被应用于检测身体样本中的药物。例如检测人体内是否存在相关药物，可以通过BGUS酶检测身体样本中是否存在相关药物的葡萄糖醛酸苷酶的水解形式来判断。相关技术中，BGUS酶制剂基本是从大肠杆菌、蜗牛(Helix aspersa)或帽贝(Patella vulgata)粗提得到的。虽然这些制剂在水解葡萄糖醛酸方面是有效的，但除了BGUS之外，这些制剂通常还包括其他蛋白质，一定程度上会干扰BGUS酶的活性。此外，这些酶制剂的酶活性水平使得它们通常需要至少几个小时(三个小时或更长时间)来分析样品。这意味着包括样品制备时间和分析时间在内，使用目前市面销售的BGUS制剂对药物样品的评估需要至少两天的时间。
基于此，亟需开发出具有更强活性、且稳定性优异的BGUS酶，用于提供药物检测效率。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种突变型β-葡萄糖醛酸酶，其相对于野生型β-葡萄糖醛酸酶具有更高的酶活性和热稳定性。
本发明还提出一种生物材料。
本发明还提出一种酶制剂。
本发明还提出一种突变型β-葡萄糖醛酸酶的制备方法。
本发明还提出一种突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备检测葡萄糖醛酸类产品中的应用。
本发明还提出一种突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备葡萄糖醛酸水解产品中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种突变型β-葡萄糖醛酸酶，包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过以下突变和/或修饰后的氨基酸序列：
A1)第559位的甘氨酸突变为含有非芳香羟基侧链的氨基酸：
A2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列C末端添加通式为Xaan-Cys-Xaam的多肽序列，其中Xaa为任意氨基酸，n取自2～8之间的任意整数，m取自0～2之间的任意整数。
根据本发明实施例的突变型β-葡萄糖醛酸酶，至少具有如下有益效果：
本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶相对于野生型BGUS酶具有更强的酶活性和热稳定性，其中当第559位的甘氨酸突变为含有非芳香羟基侧链的氨基酸时(如丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬酰胺等)，其酶活性相对于野生型BGUS酶提高3倍多，尤其是当突变类型为G559T时，期酶活性达到23652U/mL，远高于野生型BGUS酶活性(5667U/mL)；而当第559位的甘氨酸突变为含有非芳香羟基侧链的氨基酸的同时，在氨基酸序列C末端添加通式为Xaan-Cys-Xaam的多肽序列(如五肽GLCGR)，其酶活性达到35565U/mL，其酶活性是野生型BGUS酶活性的6.28倍。此外，当突变类型为多重突变时，其热稳定性也明显提高，其在65℃在孵育后仍能够保持一定的酶活性，且在4～55℃条件下测试酶活性不会随时间推移而发生显著损失，可见其具有优异的热稳定性。
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列信息如下：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQGILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ。
在本发明的一些实施方式中，所述含有非芳香羟基侧链的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬酰胺中的任一种。
在本发明的一些实施方式中，所述n和m独立为2。
在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸序列C末端添加的多肽序列为GLCGR。
在本发明的一些实施方式中，所述突变型β-葡萄糖醛酸酶为氨基酸序列如SEQ IDNO：2至SEQ ID NO：6任一种所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶。
其中所述SEQ ID NO：2所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“S”，具体序列信息如下：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQSILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ。
所述SEQ ID NO：3所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“T”，具体序列信息如下：
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所述SEQ ID NO：4所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“H”，具体序列信息如下：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQHILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ。
所述SEQ ID NO：5所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“N”，其具体序列信息如下：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQNILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ。
所述SEQ ID NO：6所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“S”，然后在酶的C端添加五肽Gly-Leu-Cys-Gly-Arg(GLCGR)，其具体序列信息如下：
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本发明的第二方面，提供了一种生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的宿主细胞。
本发明的第三方面，提供了一种酶制剂，包括上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶。
本发明的第四方面，提供了一种上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的制备方法，包括以下步骤：
将含上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的编码基因的表达载体导入宿主细胞中，使所述编码基因得到表达，得到突变型β-葡萄糖醛酸酶。
本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶通过重组表达载体产生，不会受非BGUS蛋白干扰，因此可以制备出高纯度的酶。
本发明的第五方面，提供了一种上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备检测葡萄糖醛酸类产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述葡萄糖醛酸类产品包括阿片类葡萄糖醛酸、苯二氮卓类葡萄糖醛酸、丁丙诺啡类葡萄糖醛酸、去甲丁丙诺啡类葡萄糖醛酸、11-去甲-A9-四氢大麻酚-9-羧酸类葡萄糖醛酸、睾酮类葡萄糖醛酸、雄甾酮类葡萄糖醛酸、他喷他多类葡萄糖醛酸、环苯扎林类葡萄糖醛酸和阿米替林类葡萄糖醛酸中的任一种。
在本发明的一些实施方式中，所述阿片类葡萄糖醛酸的包括但不限于吗啡-3β-D-葡萄糖醛酸、吗啡-6β-D-葡萄糖醛酸、可待因-6β-D-葡萄糖醛酸、氢吗啡酮-3β-D-葡萄糖醛酸、羟吗啡酮-3β-D-葡萄糖醛酸及其组合。
在本发明的一些实施方式中，所述苯二氮卓类葡萄糖醛酸的包括但不限于奥氮西泮-葡萄糖醛酸、劳拉西泮-葡萄糖醛酸、替马西泮-葡萄糖醛酸、阿普唑仑、α-羟基-阿普唑仑葡萄糖醛酸、去甲西泮、7-氨基氯西泮及其组合。
本发明的第六方面，提供了一种上述第一方面任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备葡萄糖醛酸水解产品中的应用。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明突变型β-葡萄糖醛酸酶构建示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
术语“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物。例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
另除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明构思
本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶构建示意图如图1所示。本发明发现在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为有非芳香羟基的侧链的氨基酸，如丝氨酸(G559S)、苏氨酸(G559T)、组氨酸(G559 H)或天冬酰胺(G559 N)，其酶活性显著增加。其中野生型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQGILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ(SEQ ID NO:1)。
进一步地，在碱基突变后的大肠杆菌BGUS酶的基础上，本发明发现在C末端添加含半胱氨酸残基的多肽序列，具体的，在酶的C端添加的序列通式如下：Xaa2～8-Cys-Xaa0～2，其中Xaa为任意氨基酸，其热稳定性显著提高。
下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶(突变型BGUS酶1)，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“S”，该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQSILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ(SEQ ID NO:2)。
本实施例还提供了一种上述突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)引物设计
使用包含野生型BGUS酶的质粒作为模板，并设计引物通过融合PCR技术和NEB Q5点突变试剂盒在BGUS酶ORF框产生突变，其设计的引物如下：
BGUS F:CTGCTGTCGGCTTTAACCTC(SEQ ID NO:8)；
BGUS R:CTAGTTATTGCTCAGCGGT(SEQ ID NO:9)；
G559S F:GACCTCGCAAAGCATATTGCG(SEQ ID NO:10)；
G559S R:CGCAATATGCTTTGCGAGGTC(SEQ ID NO:11)。
(2)PCR反应
建立了两个平行的PCR反应。其中反应1使用以下试剂如表1所示。
表1：扩增体系
反应2体系与反应1体系所使用的引物序列不同，其余试剂与剂量一致，反应2所用引物为10μM G559S正向引物、10μM BGUS反向引物。
用于DNA扩增的PCR程序如表2所示：
表2：PCR反应程序
反应结束后，采用Omega Cycle Pure试剂盒纯化上述PCR产物，得到产物片段1和产物片段2。
(3)连接
将上述两个纯化后的片段混合在一起，然后配置如表3所示的扩增体系。
表3：扩增体系
其PCR扩增体系参考表2所示。反应结束后，采用Omega Cycle Pure试剂盒纯化上述PCR产物，得到产物片段3。
将最终产物片段3克隆到pUC1细菌质粒载体中，该载体包含BstB19和HindIII酶切位点，由于之前设计的BGUS引物包含BstB19和HindIII位点。因此用BstB19和HindIII酶处理PCR产物和pUC1质粒，处理后的DNA片段和质粒使用DNA连接酶进行连接，连接后的质粒通过Omega plasmid kit试剂盒提纯后，然后进行测序验证，结果与预期一致，说明含突变型大肠杆菌BGUS酶(突变酶1)的重组载体构建成功。
(4)突变型大肠杆菌BGUS酶的获取
扩增突变型大肠杆菌BGUS酶序列，将其连接到表达载体pET-30a+上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞BL21，转化成功后挑取单克隆菌落接种至5mL LB液体培养基中37℃过夜培养；然后转接于200mL LB液体培养基中，37℃下摇培5h后，调整OD600值为1，并将菌液取出置于4℃冷却，冷却后加入终浓度为0.6mM的IPTG后置于20℃摇培过夜。
将培养液离心，收集菌体，并用超声波细胞粉碎机裂解细胞，其中超声波的功率70W，超声10s，间隔10s，共持续30min。然后用Ni柱亲和层析纯化，并使用超滤柱AMICONULTRA 15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)浓缩，即得突变型大肠杆菌BGUS酶(即突变型BGUS酶1)。
实施例2
本实施例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶(突变型BGUS酶2)，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“T”,该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQTILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ(SEQ ID NO:3)。
本实施例还提供了一种上述突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法，具体方法参考上述实施例1。其中，所使用的扩增引物序列替换为：
G559T F：GACCTCGCAAACTATATTGCG(SEQ ID NO:12)；
G559T R：CGCAATATAGTTTGCGAGGTC(SEQ ID NO:13)。
实施例3
本实施例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶(突变型BGUS酶3)，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“H”,该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQHILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ(SEQ ID NO:4)。
本实施例还提供了一种上述突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法，具体方法参考上述实施例1。所使用的扩增引物序列替换为：
G559H F：GACCTCGCAACACATATTGCG(SEQ ID NO:14)；
G559H R：CGCAATATGTGTTGCGAGGTC(SEQ ID NO:15)。
实施例4
本实施例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶(突变型BGUS酶4)，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“N”,该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQNILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQ(SEQ ID NO:5)。
本实施例还提供了一种上述突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法，具体方法参考上述实施例1。所使用的扩增引物序列替换为：
G559SN F：GACCTCGCAAAACATATTGCG(SEQ ID NO:16)；
G559N R：CGCAATATGTTTTGCGAGGTC(SEQ ID NO:17)。
实施例5
本实施例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶(多重突变型BGUS酶5)，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“S”,然后在酶的C端添加五肽Gly-Leu-Cys-Gly-Arg(GLCGR)，该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQSILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQGLCGR(SEQ ID NO:6)。
本实施例还提供了一种上述突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法，具体方法参考上述实施例1。其中，在构建突变类型为“G559S”的基础上，还在5’端添加了GLCGR的编码核苷酸序列。
对比例1
本对比例提供了一种野生型大肠杆菌BGUS酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其制备方法参考实施例1，其区别在于其没有经过突变处理。
对比例2
本对比例提供了一种野生型蜗牛BGUS酶，其购买自sigma，货号：G7017。
对比例3
本对比例提供了一种突变型大肠杆菌BGUS酶，其是在野生型大肠杆菌BGUS酶(NCBI参考序列：NC_000913.2)的基础上，将第559位碱基“G”替换为“S”,然后在酶的C端添加五肽Gly-Leu-Ser-Gly-Arg(GLSGR)，该突变型大肠杆菌BGUS酶的氨基酸序列如下所示：
MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVLRFDAVTHYGKVWVNNQEVMEHQGGYTPFEADVTPYVIAGKSVRITVCVNNELNWQTIPPGMVITDENGKKKQSYFHDFFNYAGIHRSVMLYTTPNTWVDDITVVTHVAQDCNHASVDWQVVANGDVSVELRDADQQVVATGQGTSGTLQVVNPHLWQPGEGYLYELCVTAKSQTECDIYPLRVGIRSVAVKGEQFLINHKPFYFTGFGRHEDADLRGKGFDNVLMVHDHALMDWIGANSYRTSHYPYAEEMLDWADEHGIVVIDETAAVGFNLSLGIGFEAGNKPKELYSEEAVNGETQQAHLQAIKELIARDKNHPSVVMWSIANEPDTRPQGAREYFAPLAEATRKLDPTRPITCVNVMFCDAHTDTISDLFDVLCLNRYYGWYVQSGDLETAEKVLEKELLAWQEKLHQPIIITEYGVDTLAGLHSMYTDMWSEEYQCAWLDMYHRVFDRVSAVVGEQVWNFADFATSQSILRVGGNKKGIFTRDRKPKSAAFLLQKRWTGMNFGEKPQQGGKQGLSGR(SEQ ID NO:7)。
该对比例的突变型大肠杆菌BGUS酶的制备方法参考上述实施例1。其中，在构建突变类型为“G559S”的基础上，还在5’端添加了GLSGR的编码核苷酸序列。
检测例1：酶活性的测定
本检测例对上述实施例1～5和对比例1的酶活性进行检测，具体方法如下：
首先用移液管将400μL活性缓冲液(浓度为20mM的磷酸钾缓冲液，pH＝6.8)转移到1.5mL离心管中，分别加入适量上述实施例1～5和对比例1的制得的酶溶液，稀释100倍得到稀释后的酶溶液。然后取30μL稀释的酶溶液至96孔板的每个孔中，n＝3。将30μL稀释的对照酶溶液移液到对照孔中，n＝3。将30μL酚酞葡萄糖醛酸底物溶液(1mM酚酞葡萄糖醛酸)与上述酶溶液一起混匀在移液到孔中。置于25℃下孵育30分钟，然后加入180μL甘氨酸以停止反应，并且显色，然后通过标准方法测量在540nm处的吸光度。
其中，1单位(Unit)的BGUS酶活性定义为在1小时内从酚酞-葡萄糖醛酸中释放1μg酚酞的酶量。因此，为了确定酶的活性(U/mL)，首先通过酚酞标准品在540nm处的吸光度制备标准曲线。假设标准曲线为线性图，则确定酶释放的酚酞浓度的公式如下：
酚酞含量(μg)＝[(540nm处的吸光度)-(y截距值)]/斜率。
检测结果如表4所示。
表4：酶活性检测结果
上述检测结果显示：本发明的突变型BGUS酶的活性较野生型BGUS酶提高3～6.3倍，其中多重突变型BGUS酶5的酶活性最高，达到了35565U/mL。
检测例2：水解可待因-6-葡萄糖醛酸的活性测定
本检测例测试了上述实施例1、5和对比例2制得的BGUS酶对可待因-6-葡萄糖醛酸的水解能力，其中具体方法参考上述检测例1，其区别在于将酚酞葡萄糖醛酸底物溶液替换为可待因-6-葡萄糖醛酸底物溶液。
检测结果如表5所示。
表5：水解可待因-6-葡萄糖醛酸的活性结果
突变类型 可待因回收率(％)
突变型BGUS酶1 G559S 93.5
多重突变型BGUS酶5 G559S+GLCGR 88.1
野生型BGUS酶(蜗牛) WT 12.3
上述检测结果显示：本发明的突变型BGUS酶表现出高效水解可待因-6-葡萄糖醛酸的能力，其在1小时内从可待因-6-葡萄糖醛酸底物中可以回收88％以上的可待因，而从蜗牛中提取的野生型BGUS酶(其酶活性远大于野生型BGUS酶)在1个小时内回收可待因率仅约12.3％。可见突变后的BGUS酶具有优异的可待因-6-葡萄糖醛酸水解活性。
检测例3：热稳定性
本检测例对上述实施例1、2、5和对比例1、3的β-葡萄糖醛酸酶的热稳定性进行检测，具体方法如下：
将含有缓冲液(浓度为20mM的磷酸钾缓冲液，pH＝6.8)与待检测酶的混合物在65℃下分别孵育30分钟或60分钟。在孵育前和孵育后测量酶活性，对比酶活性保存的百分比。
检测结果如表6所示。
表6：热稳定性检测结果
突变类型 孵育30min(％) 孵育60min(％)
实施例1 G559S 0.55 0
实施例2 G559T 0 0
实施例5 G559S+GLCGR 28.1 6.5
对比例1 WT 0 0
对比例3 G559S+GLSGR 0.12 0
检测结果显示当在突变型BGUS酶1的基础上进一步在C端添加五肽GLCGR后，其热稳定性显著提高，而将五肽GLCGR序列中的半胱氨酸替换为丝氨酸后，其热稳定性反而下降。
进一步地，本检测例还测试了上述多重突变型BGUS酶5分别在4℃、20℃、37℃或55℃下孵育3小时后的酶活性。检测结果如表7所示。
表7：多重突变型BGUS酶5水解活性
结果表明，在4～55℃条件下测试，多重突变型BGUS酶5的活性随时间和温度的推移为产生明显变化，说明其具有优异的热稳定性。
综上所述，本发明提供了一种突变型β-葡萄糖醛酸酶及其制备方法与应用，本发明的突变型BGUS酶(如多重突变型BGUS酶5)，较野生型BGUS酶具有更强的酶活性和热稳定性，其中使用酚酞-葡萄糖醛酸水解测定法测定酶的比活性，结果表明，对于酚酞-葡萄糖醛酸底物，本发明的突变型BGUS酶活性达到20000U/mL以上。进一步地，对可待因-6-葡萄糖醛酸的水解能力测试结果表明，本发明的突变型BGUS酶表现出可以高效水解可待因-6-葡萄糖醛酸的效果，其水解后的可待因回收率达到85％以上。
其次，热稳定性实验结果表明本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶(如多重突变型BGUS酶5)在不同温度加热处理后，均表现出热稳定性，酶活性不因温度和时间而降低，并且具有C端半胱氨酸残基修饰的突变体比缺乏C端半胱氨酸的单G559突变体(如突变型BGUS酶1)表现出更高的热稳定性。
此外，本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶可以应用于药检，测试的底物包括但不限于阿片类葡萄糖醛酸和苯二氮卓类葡萄糖醛酸底物，以及其他或替代的葡萄糖醛酸底物，如丁丙诺啡、去甲丁丙诺啡、11-去甲-A9-四氢大麻酚-9-羧酸、睾酮、雄甾酮、他喷他多、环苯扎林和阿米替林的葡萄糖醛酸。本发明的突变型β-葡萄糖醛酸酶允许在30分钟内准确分析身体样品是否存在药物，与目前市面销售的BGUS酶制剂相比可以在更短的时间内完成药物分析。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种突变型β-葡萄糖醛酸酶，其特征在于，包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过以下突变和/或修饰后的氨基酸序列：
A1)第559位的甘氨酸突变为含有非芳香羟基侧链的氨基酸：
A2)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列C末端添加通式为Xaan-Cys-Xaam的多肽序列，其中Xaa为任意氨基酸，n取自2～8之间的任意整数，m取自0～2之间的任意整数。
2.根据权利要求1所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶，其特征在于，所述含有非芳香羟基侧链的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬酰胺中的任一种。
3.根据权利要求1所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶，其特征在于，所述n和m独立为2。
4.根据权利要求1所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶，其特征在于，所述突变型β-葡萄糖醛酸酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6任一种所示的突变型β-葡萄糖醛酸酶。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的宿主细胞。
6.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶。
7.一种权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶的编码基因的表达载体导入宿主细胞中，使所述编码基因得到表达，得到突变型β-葡萄糖醛酸酶。
8.如权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备检测葡萄糖醛酸类产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖醛酸类产品包括阿片类葡萄糖醛酸、苯二氮卓类葡萄糖醛酸、丁丙诺啡类葡萄糖醛酸、去甲丁丙诺啡类葡萄糖醛酸、11-去甲-A9-四氢大麻酚-9-羧酸类葡萄糖醛酸、睾酮类葡萄糖醛酸、雄甾酮类葡萄糖醛酸、他喷他多类葡萄糖醛酸、环苯扎林类葡萄糖醛酸和阿米替林类葡萄糖醛酸中的任一种。
10.一种如权利要求1至4任一项所述的突变型β-葡萄糖醛酸酶在制备葡萄糖醛酸水解产品中的应用。
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