CN117025566A - 一种dna聚合酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA聚合酶及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。该DNA聚合酶具有A1)至A2)中的任一种：A1)、如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3任一项所示的氨基酸序列；A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签或DNA结合结构域得到的氨基酸序列。该DNA聚合酶无外切酶活性，且扩增效率高、耐盐性高，在纳米孔测序中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种DNA聚合酶及其制备方法与应用。
背景技术
基于合成测序的纳米孔测序需要性能良好的聚合酶和高分辨率的纳米孔，而聚合酶的性质决定了测序是否可行。用于纳米孔测序的聚合酶需要具有链置换活性、耐盐性和良好的标签结合能力，且不具有外切酶活性。外切酶活性的存在可能会降解低聚核苷酸的修饰的核苷酸底物；链置换活性允许聚合酶使用环状DNA模板进行结合，耐盐性和标签结合能力有助于产生较强的电化学信号，并与四个碱基进行区分。
phi29聚合酶是一种常见的DNA聚合酶，具有高持续合成、强链置换能力和高保真性等优点，但是其外切酶活性较强，耐盐性较弱，在高盐浓度下很难发生反应。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种DNA聚合酶，其无外切酶活性，且扩增效率高、耐盐性高，在纳米孔测序中具有很好的应用前景。
本发明还提供与上述DNA聚合酶相关的生物材料。
本发明还提供一种酶制剂。
本发明还提供上述DNA聚合酶的制备方法。
本发明还提供一种对模板DNA进行扩增或测序的方法。
本发明还提供上述DNA聚合酶、生物材料或酶制剂相关的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包括A1)至A2)中的任一种：
A1)、如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3任一项所示的氨基酸序列；
A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签或DNA结合结构域得到的氨基酸序列。
根据本发明实施例的DNA聚合酶，至少具有如下有益效果：
实施例的DNA聚合酶无外切酶活性，且扩增效率高、耐盐性高，在纳米孔测序中具有很好的应用前景。
根据本发明的一些实施例，所述标签包括利于DNA聚合酶的溶解、纯化和检测的标签中的至少一种。可以理解的是，本发明的DNA聚合酶可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。例如：利于DNA聚合酶溶解的标签包括但不限于nus标签或麦芽糖结合蛋白；利于DNA聚合酶纯化的标签包括但不限于strep标签、His标签、GST标签、pelB信号序列或ompA信号序列；利于DNA聚合酶检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed或青色荧光蛋白(CFP)。所述标签具体可以为strep标签。
根据本发明的一些实施例，所述DNA结合结构域包括但不限于Sso7d、DBD、HI中的至少一种。A2)中所述DNA聚合酶至少具有与A1)中所述DNA聚合酶相同的功能；包括但不限于无外切酶活性、耐盐性。
根据本发明的一些实施例，A2)中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
根据本发明的一些实施例，所述DNA聚合酶还可以具有如A1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与A1)所示的氨基酸序列功能相同或相似。其与A1)所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。例如：可以为95％。
根据本发明的第二方面实施例的与上述DNA聚合酶相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ IDNO.12任一项所示。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述DNA聚合酶的DNA。该DNA不但可包括启动所述DNA聚合酶基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。具体可以为PET-21a载体。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述DNA聚合酶的核酸分子得到的重组载体。
根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。所述重组生物不包含生殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向大肠杆菌BL21(DE3)中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
根据本发明的第三方面实施例的一种酶制剂，包括本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶。
根据本发明的一些实施例，所述酶制剂还包括反应缓冲液、BSA、dNTP中的至少一种。可以理解的是，所述反应缓冲液不影响所述DNA聚合酶的活性。
根据本发明的第四方面实施例的本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。具体地，所述生物细胞可以为大肠杆菌；进一步可以具体为大肠杆菌BL21(DE3)。
根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。
根据本发明的第五方面实施例的一种对模板DNA进行扩增或测序的方法，包括以下步骤：
采用本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶对模板DNA进行扩增或测序。
根据本发明的一些实施例，具体可以包括以下步骤：
将所述DNA聚合酶与模板DNA、引物反应试剂混合反应。
根据本发明的一些实施例，所述反应试剂包括反应缓冲液、dNTP、BSA、KCl中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述混合反应的体系具体可以为：
根据本发明的第六方面实施例的C1)至C3)任一项在D1)至D4)中任一项的应用，C1)、本发明第一方面实施例中所述的DNA聚合酶；
C2)、本发明第二方面实施例中所述的生物材料；
C3)、本发明第三方面实施例中所述的酶制剂；
D1)、核酸扩增；
D2)、制备核酸扩增相关产品；
D3)、测序；
D4)、制备测序相关产品。
根据本发明的一些实施例，所述核酸扩增包括链置换反应、聚合酶链式反应、等温扩增反应。所述等温扩增反应选自环介导扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和交叉引物扩增(CPA)。
根据本发明的一些实施例，所述测序具体可以为纳米孔测序。
根据本发明的第七方面实施例的一种核酸扩增或测序相关产品，包括上述DNA聚合酶或上述酶制剂。
根据本发明的一些实施例，所述产品包括试剂盒。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是本发明检测例1中的各DNA聚合酶的SDS-PAGE蛋白电泳结果；
图2为本发明检测例2中的各DNA聚合酶的外切酶活性检测结果；
图3是本发明检测例3中的各DNA聚合酶在不同盐浓度下的聚合酶活性检测结果；
图4是本发明检测例3中的各DNA聚合酶在300mM盐浓度下的聚合酶活性检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
术语“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
以PBI-D422A聚合酶为基础，突变了关键性位点，减少PBI-D422A聚合酶的外切酶活性，分别命名为DXE DNA聚合酶和RRRY DNA聚合酶。Bst聚合酶没有3’→5’外切酶活性，将PBI-D422A聚合酶的聚合酶区域与Bst聚合酶的外切酶区域进行融合，得到融合型聚合酶(PST DNA聚合酶)。为了进一步提高其耐盐性和聚合酶合成的持续性，在PST DNA聚合酶的尾端融合了DBD(DNA-binding domain)结构域、sso7d(DNA-binding protein 7d)结构域和HI(helix–hairpin–helix(HhH)2 domains H-I)结构域，分别命名为PST-DBD DNA聚合酶、PST-sso7d DNA聚合酶和PST-HIDNA聚合酶。
以下氨基酸序列均是从N端到C端的顺序；核苷酸序列均是从5’端到3’端的顺序。
DXE DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSNGHKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISAYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.1)。
RRRY DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
MEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISAYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRARALPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.2)。
PST DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
MEVAFEIVEEIDSTILADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISAYGLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTKLE(SEQ ID NO.3)。
PST-DBD DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，加粗标记部分为DBD结构域。
PST-sso7d DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
其中，加粗标记部分为sso7d结构域。
PST-HI DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
其中，加粗标记部分为HI结构域。
DXE DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
ATGGAGGTAGCTTTTGAAATTGTTGAAGAAATAGACTCCACCATTCTGGACAAAGTTATGTCCGTTCACCTGGAGATGTATGATGGCCAGTACCATACCAGCGAGTTGCTGGGTATCGCCCTGTCCAATGGTCATAAGGGTTACTTCGCGCCAGCAGATATCGCCTTTCAGAGCAAAGATTTTTGCTCCTGGCTGGAGAACGCCACGAACAAGAAGTATCTAGCGGACAGCAAAGCCACCCAGGCGGTTAGCCGTAAACATAATGTCAACGTGCACGGCGTTGAATTTGACCTGCTGCTCGCTGCGTATATCGTCAATCCGGCGATCAGCAGCGAGGACGTAGCTGCGATCGCGAAGGAGTTCGGTTACTTTAACCTGTTGACCAACGATAGCGTGTACGGCAAGGGTGCAAAAAAGACCGCGCCGGAGATTGAGAAAATCGCGGAACATGCAGTCCGCAAGGCTCGTGCGATTTGGGATCTTAAGGAGAAACTGGAGGTTAAATTGGAAGAAAACGAGCAATATGCGCTGTACAAAGAGATTGAGCTGCCGCTGGCGTCGATCCTGGGCACGATGGAGAGCGACGGCGTGTTGGTCGATAAACAAATCCTGGTGGAGATGGGTCATGAACTCAATATTAAGCTTCGTGCGATCGAGCAGGACATCTATGCCCTGGCGGGTGAAACCTTCAATATTAACTCTCCGAAACAGCTGGGCGTCATCTTGTTCGAGAAGATCGGTTTGACCCCGATCAAAAAAACGAAGACCGGTTACTCCACTGCCGCGGACGTTCTGGAAAAGTTGGCGAGCGAGCACGAAATTATTGAACAGATTTTATTGTACCGCCAGCTGGGTAAACTGAACTCGACGTACATCGAGGGTCTGTTGAAGGAAATCCATGAGGACGACGGCAAAATCCACACCCGTTATCAGCAGGCGCTGACCTCCACTGGCCGCTTAAGCTCTATCAACCCGAATCTGCAAAATATTCCGGTTAGGTTAGAAGAAGGCCGCAAGATCAGAAAAGCTTTCGTGCCAAGCCAACCGGGTTGGGTTATGTTTGCCGCGGATTATTCCCAGATTGAGCTTCGTGTGCTGGCGCACATGTCGGAGGACGAAAATCTGGTGGAGGCGTTCAACAACGACCTGGACATCCACACTAAAACCGCTATGGATGTTTTTCACGTGGAACAAGAAGCAGTTACGTCTGACATGCGTCGTGCTGCTAAGGCAGTGAACTTTGGCATCGTTTACGGTATCAGCGCGTACGGTTTGTCGCAAAACCTGGATATCACCCGTAAGGAAGCTGCGACCTTCATTGAGAACTATCTGAACTCTTTCCCGGGTGTTAAAGGCTACATGGACGACATCGTCCAGGATGCAAAACAAACCGGCTATGTTACAACCATTCTAAATCGTAGACGTTACCTGCCGGAAATTACCTCTAGCAATTTCAATCTGCGTAGCTTTGCAGAGCGCACCGCAATGAACACGCCGATTCAAGGTAGCGCAGCGGATATCATCAAGAAGGCCATGATTGATATGGCAGAGCGCTTGATTTCAGAAAACATGCAGACCAAGATGCTGCTGCAAGTGCACGATGAACTGATTTTCGAAGCTCCGCCCGAGGAAATTGCCATGCTGGAGAAAATAGTGCCGGAAGTTATGGAAAACGCAATTAAACTGATCGTGCCTCTCAAGGTGGACTACGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAGCTCGAG(SEQ ID NO.7)。
RRRY DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
ATGGAGGTAGCTTTTGAAATTGTTGAAGAAATAGACTCCACCATTCTGGACAAAGTTATGTCCGTTCACCTGGAGATGTATGATGGCCAGTACCATACCAGCGAGTTGCTGGGTATCGCCCTGTCCGATGGTGAAAAGGGTTACTTCGCGCCAGCAGATATCGCCTTTCAGAGCAAAGATTTTTGCTCCTGGCTGGAGAACGCCACGAACAAGAAGTATCTAGCGGACAGCAAAGCCACCCAGGCGGTTAGCCGTAAACATAATGTCAACGTGCACGGCGTTGAATTTGACCTGCTGCTCGCTGCGTATATCGTCAATCCGGCGATCAGCAGCGAGGACGTAGCTGCGATCGCGAAGGAGTTCGGTTACTTTAACCTGTTGACCAACGATAGCGTGTACGGCAAGGGTGCAAAAAAGACCGCGCCGGAGATTGAGAAAATCGCGGAACATGCAGTCCGCAAGGCTCGTGCGATTTGGGATCTTAAGGAGAAACTGGAGGTTAAATTGGAAGAAAACGAGCAATATGCGCTGTACAAAGAGATTGAGCTGCCGCTGGCGTCGATCCTGGGCACGATGGAGAGCGACGGCGTGTTGGTCGATAAACAAATCCTGGTGGAGATGGGTCATGAACTCAATATTAAGCTTCGTGCGATCGAGCAGGACATCTATGCCCTGGCGGGTGAAACCTTCAATATTAACTCTCCGAAACAGCTGGGCGTCATCTTGTTCGAGAAGATCGGTTTGACCCCGATCAAAAAAACGAAGACCGGTTACTCCACTGCCGCGGACGTTCTGGAAAAGTTGGCGAGCGAGCACGAAATTATTGAACAGATTTTATTGTACCGCCAGCTGGGTAAACTGAACTCGACGTACATCGAGGGTCTGTTGAAGGAAATCCATGAGGACGACGGCAAAATCCACACCCGTTATCAGCAGGCGCTGACCTCCACTGGCCGCTTAAGCTCTATCAACCCGAATCTGCAAAATATTCCGGTTAGGTTAGAAGAAGGCCGCAAGATCAGAAAAGCTTTCGTGCCAAGCCAACCGGGTTGGGTTATGTTTGCCGCGGATTATTCCCAGATTGAGCTTCGTGTGCTGGCGCACATGTCGGAGGACGAAAATCTGGTGGAGGCGTTCAACAACGACCTGGACATCCACACTAAAACCGCTATGGATGTTTTTCACGTGGAACAAGAAGCAGTTACGTCTGACATGCGTCGTGCTGCTAAGGCAGTGAACTTTGGCATCGTTTACGGTATCAGCGCGTACGGTTTGTCGCAAAACCTGGATATCACCCGTAAGGAAGCTGCGACCTTCATTGAGAACTATCTGAACTCTTTCCCGGGTGTTAAAGGCTACATGGACGACATCGTCCAGGATGCAAAACAAACCGGCTATGTTACAACCATTCTAAATCGTGCACGTGCACTGCCGGAAATTACCTCTAGCAATTTCAATCTGCGTAGCTTTGCAGAGCGCACCGCAATGAACACGCCGATTCAAGGTAGCGCAGCGGATATCATCAAGAAGGCCATGATTGATATGGCAGAGCGCTTGATTTCAGAAAACATGCAGACCAAGATGCTGCTGCAAGTGCACGATGAACTGATTTTCGAAGCTCCGCCCGAGGAAATTGCCATGCTGGAGAAAATAGTGCCGGAAGTTATGGAAAACGCAATTAAACTGATCGTGCCTCTCAAGGTGGACTACGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAGCTCGAG(SEQ ID NO.8)。
PST DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCGATATGCGCCGCGCGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.9)。
PST-DBD DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
ATGAGGTACATAGAGCTGGCCCAACTTTATCAGAAGTTAGAAAAAACAACAATGAAGCTTATTAAAACGAGGCTTGTTGCGGACTTTCTCAAGAAGGTTCCGGAGGATCATCTCGAGTTCATCCCCTACTTAATCCTTGGCGACGTCTTCCCCGAGTGGGATGAAAGGGAGCTTGGAGTGGGTGAAAAGTTATTGATAAAGGCAGTATCTATGGCGACGGGAATAGACTCCAAGGAGATAGAAAACTCGGTAAAAGATACGGGTGATTTGGGTGAAAGCATAGCTTTAGCCGTAAAGAAGAGGAAACAAAAGAGCTTCTTCTCGCAACCCTTAACGATTAAGAGGGTCTACCAAACCCTCGTCAAAGTTGCCGAGACAACTGGTGAAGGGAGCCAGGATAAGAAGATGAAGTACCTTGCAAACCTGTTCATGGATGCTGAGCCTATTGAAGCTAAGTACATAGCGAGAACGGTGCTCGGAACGATGAGAACTGGAGTAGCCGAGGGACTGCTCAGGGATGCGATATCCCTAGCATTTAACGTCAAAGTTGAGCTCGTTGAGAGGGCTTACATGCTAACTAGCGACTTTGGATTCGTCGCAAAAATTGCCAAAACTGAGGGTAATGATGGATTAGCTAAGGTGACAATTCAGATTGGTAAGCCAATAAAGGGCTCTGGCGCCATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCGATATGCGCCGCGCGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.10)。
PST-sso7d DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
ATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCGATATGCGCCGCGCGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAGGGTACCGGCTCTATGGTAACAGTAAAGTTCAAGTATAAGGGAGAAGAAAAGGAAGTAGACATTTCAAAGATAAAGAAAGTTTGGAGAGTCGGAAAAATGATATCATTCACTTATGACGACAACGGTAAGACTGGTAGAGGCGCTGTAAGCGAAAAAGATGCACCAAAAGAATTACTACAAATGTTAGAAAAATCTGGAAAGAAAGAG(SEQ ID NO.11)。
PST-HI DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
ATGTGGAAGGAGTGGCTCGAGCGTAAGGTCGGCGAGGGGAGGGCTCGCCGGTTGATTGAGTATTTCGGCTCCGCGGGTGAAGTAGGAAAGCTGGTCGAGAACGCCGAGGTGTCGAAGCTACTGGAGGTCCCGGGTATAGGCGACGAGGCCGTCGCTAGGCTCGTACCGGGCTACAAGACCCTACGAGACGCCGGTCTCACGCCGGCCGAAGCGGAGCGCGTGCTGAAACGGTACGGCTCGGTCTCCAAAGTGCAGGAAGGAGCCACTCCGGACGAGTTACGCGAGCTCGGCCTCGGCGACGCCAAGATCGCGAGGATCCTGGGCGGCTCTGGCGCCATGGAAGTGGCGTTTGAAATTGTGGAAGAAATTGATAGCACCATCCTGGCGGATAAAGCGGCGCTGGTGGTGGAAGTGGTGGAAGAAAATTATCATGATGCGCCGATTGTGGGCATTGCGGTGGTGAATGAACATGGCCGCTTTTTCCTGCGCCCGGAAACCGCGTTGGCGGATCCACAATTTGTTGCGTGGTTGGGCGATGAAACCAAAAAGAAAAGCATGTTTGATAGCAAACGCGCGGCGGTGGCGCTGAAATGGAAAGGCATTGAACTGTGCGGCGTGAGCTTTGATCTGCTGCTGGCGGCGTATCTGCTGGATCCGGCGCAAGGTGTTGATGATGTGGCGGCGGCGGCGAAAATGAAACAGTATGAAGCGGTGCGCCCGGATGAAGCGGTGTATGGCAAAGGCGCGAAACGCGCGGTTCCGGATGAACCGGTTCTGGCGGAACATCTGGTGCGCAAAGCGGCGGCGATTTGGGAACTGGAACGCCCGTTTCTGGATGAACTGCGCCGCAATGAACAGTATGCGCTGTATAAAGAAATTGAGCTGCCGCTGGCGAGCATTCTGGGCACCATGGAAAGCGATGGCGTGCTGGTGGATAAACAGATTCTGGTGGAAATGGGCCATGAACTGAATATTAAACTGCGTGCGATTGAACAGGATATTTATGCGCTGGCGGGCGAAACCTTTAATATTAATAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATTCTGTTTGAGAAAATTGGCCTGACCCCGATTAAGAAAACCAAAACCGGCTATAGCACCGCGGCGGATGTGCTGGAAAAACTGGCGAGCGAACATGAAATTATTGAACAGATTCTGCTGTACCGCCAGCTGGGCAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAAGAAATTCATGAGGATGATGGCAAAATTCACACCCGCTATCAGCAGGCGCTGACCAGCACTGGTCGTTTAAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGGTGCGCCTGGAAGAAGGCCGCAAAATTCGCAAAGCGTTTGTGCCGAGCCAGCCGGGCTGGGTTATGTTTGCGGCGGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTGCTGGCGCACATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTGGAAGCGTTTAATAATGACCTGGATATTCACACCAAAACCGCGATGGATGTGTTTCATGTGGAACAGGAAGCCGTGACCAGCGATATGCGCCGCGCGGCGAAAGCAGTGAATTTTGGCATTGTGTATGGCATTAGCGCGTATGGCCTGAGCCAGAATCTGGATATTACCCGCAAAGAAGCGGCGACCTTTATTGAAAATTATCTGAATAGCTTCCCGGGCGTGAAAGGCTATATGGATGATATTGTGCAGGATGCGAAACAGACCGGCTATGTGACCACCATTCTGAATCGCCGCCGCTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAATTTTAATCTGCGCAGCTTTGCGGAACGCACCGCGATGAATACCCCGATTCAGGGCAGCGCGGCGGATATTATTAAAAAGGCGATGATTGATATGGCGGAGCGCCTGATTAGCGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTGCATGATGAACTGATTTTTGAAGCGCCGCCGGAAGAAATTGCGATGCTGGAAAAGATTGTGCCGGAAGTGATGGAAAATGCGATTAAACTGATTGTGCCGCTGAAAGTGGATTATGCGTTTGGCAGCAGCTGGTATGATACCAAACTCGAG(SEQ ID NO.12)。
实施例1(DNA聚合酶的表达和纯化)
将编码DXE DNA聚合酶、RRRY DNA聚合酶、PST DNA聚合酶、PST-DBD DNA聚合酶、PST-sso7d DNA聚合酶和PST-HI DNA聚合酶的核苷酸序列分别连接到基因表达载体pET-21a中后，转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD901-02)中。经抗性筛选后，取5μL菌种接于5mL LB液体培养基中，37℃摇培过夜，然后将过夜培养得到的菌液转接于500mL LB液体培养基中，37℃摇培6h，至OD600nm约为1时，加入IPTG(终浓度为0.6mM)，继续于20℃摇培24h。收集菌体，超声破碎后，取上清液，通过Ni2+柱亲和层析纯化得到各聚合酶，并使用超滤柱AMICON ULTRA 15mL 50K(Millipore公司，目录号：UFC905024)进一步浓缩各DNA聚合酶。。
检测例1
本检测例通过SDS-PAGE蛋白电泳对各DNA聚合酶的蛋白大小和纯度进行验证。
结果如图1所示。其中，泳道1为PBI-D422A DNA聚合酶，泳道2为DXE DNA聚合酶，泳道3为RRRY DNA聚合酶，泳道4为PST DNA聚合酶，泳道5为PST-DBD DNA聚合酶，泳道6为PST-HI DNA聚合酶，泳道7为PST-sso7d DNA聚合酶，泳道8、9、10分别为320ng、480ng、640ng的牛血清白蛋白(BSA)。
各DNA聚合酶的纯度均较高，且分子大小差异均符合预期。
检测例2
本检测例对各DNA聚合酶的外切酶活性进行检测。检测方法如下：
如表1所示检测体系(pH 7.5)在30℃条件下反应10min。反应结束后，取8μL反应样品与2μL的Hi-Density TBE Sample Buffer(5X)(InvitrogenTM公司，目录号：LC6678)混合，进行1％ TBE-Urea凝胶电泳检测。
表1
| 组分 | 终浓度 |
| Tris-HCl | 50mM |
| MgCl2 | 10mM |
| (NH4)2SO4 | 10mM |
| DTT | 4mM |
| 单链模板 | 10μM |
| DNA聚合酶 | 200nM |
其中，单链模板的核苷酸序列为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。
电泳结果如图2所示。其中，泳道1为.PBI野生型聚合酶蛋白，泳道2为PBI-D422ADNA聚合酶，泳道3为RRRY DNA聚合酶，泳道4为DXE DNA聚合酶，泳道5为PST DNA聚合酶，泳道6为对照泳道(不含任何DNA聚合酶)，泳道7为PST-sso7d DNA聚合酶，泳道8为PST-HI DNA聚合酶，泳道9为PST-DBD DNA聚合酶。
可见，PBI-D422A DNA聚合酶具有很强的外切酶活性，将单链模板完全降解。而DXEDNA聚合酶、RRRY DNA聚合酶、PST DNA聚合酶、PST-DBD DNA聚合酶、PST-sso7d DNA聚合酶和PST-HI DNA聚合酶均不具有明显的外切酶活性。
检测例3
本检测例对各DNA聚合酶的DNA聚合酶活性进行检测。检测方法如下：
如表2所示检测体系在30℃下反应3小时后，取反应产物跑电泳。
表2
| 组分 | 终浓度 |
| BSA | 0.5μg/μL |
| 10×反应缓冲液 | 1× |
| 模板(M13mp18) | 5nM |
| 引物 | 5nM |
| dNTP(10mM) | 200nM |
| KCl | 0mM/150mM/200mM/300mM |
| DNA聚合酶 | 200nM |
其中，引物的核苷酸序列为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。
电泳结果如图3和4所示。图3中，1、2、3、4分别指代0mM、150mM、200mM、300mM条件下的酶活性，泳道“-”是指阴性对照，只有M13mp18模板；。图4中，泳道1为DXE DNA聚合酶，泳道2为PST DNA聚合酶，泳道3为空白对照(不含DNA聚合酶)，泳道4为PST-HI DNA聚合酶，泳道5为PST-sso7d DNA聚合酶，泳道6为PST-DBD DNA聚合酶。
DXE DNA聚合酶、PST DNA聚合酶、PST-DBD DNA聚合酶、PST-sso7d DNA聚合酶和PST-HI DNA聚合酶的耐盐性均得到明显提高，能够在高盐浓度下进行扩增，可用于测序的PCR反应体系中。
综上可知，采用DXE DNA聚合酶、RRRY DNA聚合酶、PST DNA聚合酶、PST-DBD DNA聚合酶、PST-sso7d DNA聚合酶和PST-HI DNA聚合酶进行PCR扩增时，无外切酶活性，且扩增效率高、耐盐性高，在纳米孔测序中具有很好的应用前景。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包括A1)至A2)中的任一种：
A1)、如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3任一项所示的氨基酸序列；
A2)、在A1)所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签或DNA结合结构域得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，A2)中，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6任一项所示。
3.与权利要求1或2所述的DNA聚合酶相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述的DNA聚合酶的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.8至SEQ ID NO.12任一项所示。
5.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的DNA聚合酶。
6.一种权利要求1或2所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述的DNA聚合酶的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述DNA聚合酶。
7.一种对模板DNA进行扩增或测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求1或2所述的DNA聚合酶对模板DNA进行扩增或测序。
8.C1)至C3)任一项在D1)至D4)中任一项的应用，
C1)、权利要求1或2所述的DNA聚合酶；
C2)、权利要求3或4所述的生物材料；
C3)、权利要求5所述的酶制剂；
D1)、核酸扩增；
D2)、制备核酸扩增相关产品；
D3)、测序；
D4)、制备测序相关产品。
9.一种核酸扩增或测序相关产品，其特征在于，包括权利要求1或2所述的DNA聚合酶或权利要求5所述的酶制剂。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
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| CN202310952783.2A CN117025566A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 一种dna聚合酶及其制备方法与应用 |
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