CN107796883A - 快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法 - Google Patents

快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法 Download PDF

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徐浩
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Abstract

本发明涉及一种快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，包括标准溶液的配制、分析样品的配制和精密度试验等步骤，样品注入LC‑MS/MS，用外标法测定组织或者线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量，解决了同时监控ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine的难题，避免了对5种成分多次检测的时间和试剂耗费，并可进一步作为其它生物体中ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine含量测定的方法。

Description

快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量 的方法
技术领域
本发明涉及能量代谢物质含量检测的方法，适用于各种动物肌肉组织及线虫的能量代谢物质的含量检测。以LC-MS/MS(液质联用)检测ATP、ADP、AMP、CP、creatine五种能量代谢小分子的含量。
背景技术
机体各种能源物质在体内氧化时所释放的能量，不足50％的能量可以用于做功的“自由能”。这部分自由能的载体是三磷酸腺苷(ATP)，能量贮存于ATP的高能磷酸键中。除ATP外，体内还有另一种含有高能磷酸键的贮能化合物，即磷酸肌酸(CP)。磷酸肌酸(CP)能在肌酸激酶的催化下，将其磷酸基转移到ADP分子中。当一些ATP用于肌肉收缩，就会产生ADP。这时，通过肌酸激酶的作用，磷酸肌酸很快供给ADP以磷酸基，从而恢复正常的ATP高水平。在活动后的恢复期中，积累的肌酸又可被ATP磷酸化，重新生成磷酸肌酸。因此，CP常被看作是ATP的贮存库。肌酸(creatine)，是一种氨基酸衍生物，它可以快速提供能量。在脊椎动物中，creatine与ATP由肌酸激酶催化，可逆地生成CP。如图1所示，ATP、ADP、AMP、CP、creatine五种能量代谢小分子在组织内相互转化。
线虫能量代谢的水平可以通过腺嘌呤核苷酸含量的变化反映。测定ATP及其代谢产物的含量变化可以判定线虫的生长状态，对研究线粒体能量代谢功能有着重要的意义。
目前，尚无同时检测某一组织或者线虫中此五种能量代谢小分子含量的检测方法。
发明内容
为填补现有技术中尚无同时检测某一组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种能量代谢小分子的方法之空白，根据本发明的实施例，希望提出一种检验效率高、定量准确的检测方法，以满足同时快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的含量。
根据实施例，本发明提供的一种快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其创新点在于，包括如下工艺步骤：
(1)标准溶液的配制
分别精密称取2mg ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准品,分别用1mL超纯水溶解，避光-80℃保存；取各标准品溶液50μL混匀，用甲醇/水(1：1，体积比)依次稀释20、40、80、100、160、200、640倍后绘制标准曲线；取组织或者线虫，液氮状态下研碎混匀或者加高氯酸溶液匀浆，加入不同浓度的ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准溶液混匀，分别配制成自10.0到50000.0不同梯度浓度的混合标准组织液体样品；前述所有操作均在4℃以下进行；标准曲线与线性范围采用外标法定量；
(2)分析样品的配制
组织用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后，迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中液氮状态下研碎混匀或者用匀浆器打碎,加入10倍量的4℃预冷的甲醇，漩涡混匀2min；再4℃低温离心离心，14000转/分钟，15min，取上清液；上清液用4℃预冷的甲醇/水(1:1，体积比)稀释10倍，高速离心14000转/分钟，再次取得的上清液，即为供试品溶液，-80℃储存待测；
收集线虫，用浓度为0.1mol/L的高氯酸溶液在冰浴下充分匀浆，取全部匀浆液于4℃、14000r/min离心10min，取出上清液重复离心一次，并用0.22μm微孔滤膜过滤后,-80℃储存待测；
(3)精密度试验
精密吸取5种化合物混合标准品溶液，加入组织或者线虫中配制低(20.0ng/mL)、中(100.0ng/mL)、高(1000.0ng/mL)质量浓度的样品，注入LC-MS/MS，用外标法测定组织或者线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量；
所述LC-MS/MS的液相条件为：thermo C18色谱柱；流动相A：乙腈:1mM醋酸铵水溶液(pH＝10)＝100：1，流动相B：1mM醋酸铵水溶液(pH＝10)；流速：0.3mL/min；进样盘温度：4℃；柱温：35℃；进样量：10ul；流动相梯度如表1所示；
所述LC-MS/MS的质谱条件为：采用选择离子监测模式扫描，以负离子模式进行检测，利用ESI电喷雾离子源，负离子喷雾电压为2500V，雾化温度100℃，离子传输毛细管温度为350℃，以氩气作为Q2碰撞气为，压力为1.5mTorr，扫描宽度选择0.002m/z，扫描时间选择0.100s。
表1.梯度洗脱条件
相对于现有技术，本发明建立的快速检测组织或线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的方法，具有操作简便，灵敏度高、精密度好，重复性高的特点，解决了同时监控ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的难题，避免了对5种成分多次检测的时间和试剂耗费，可进一步做为各种组织以及线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量测定的方法。
附图说明
图1是ATP、ADP、AMP、CP、creatine五种能量代谢小分子在组织内相互转化示意图。
图2是ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种标准品的混合物的色谱质谱图。
图3是SD大鼠肌肉组织中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种化合物的色谱质谱图。
图4是秀丽隐杆线虫中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种化合物的色谱质谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
本发明以下实施例中：
组织以SD大鼠的肌肉组织为例；线虫以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为例。
仪器与试药：液相ULTIMATE 3000(Thermo Fisher Scientific，美国)，质谱TSQQUANTUM ACCESS MAX Mass Spectrometer(Thermo scientific,美国)。FA1004N电子天平(上海精科仪器有限公司),甲醇、乙腈为HPLC级。ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准品均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)的液相条件为：thermo C18色谱柱；流动相A：乙腈:1mM醋酸铵水溶液(pH＝10)＝100：1，流动相B：1mM醋酸铵水溶液(pH＝10)；流速：0.3mL/min；进样盘温度：4℃；柱温：35℃；进样量：10ul。流动相梯度见表1。
LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱联用)的质谱条件为：采用选择离子监测模式(SRM)扫描。以负离子模式进行检测，利用ESI电喷雾离子源，负离子喷雾电压为2500V，雾化温度100℃，离子传输毛细管温度为350℃，以氩气作为Q2碰撞气为，压力为1.5mTorr，扫描宽度选择0.002m/z，扫描时间选择0.100s。ATP、ADP、AMP、CP和creatine的母离子/子离子的选择及出峰时间见表2。
表2.五种小分子检测的母离子及子离子
(1)标准溶液的配制
分别精密称取2mg的ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准品,分别用1mL超纯水溶解，避光-80℃保存。取各标准品液50μL混匀，用甲醇/水(1：1)依次稀释20、40、80、100、160、200、640倍后制备标准曲线。取SD大鼠肌肉组织或者秀丽隐杆线虫，液氮状态下研碎混匀或者加高氯酸溶液匀浆，加入不同浓度的ATP、ADP、AMP、CP、creatine标准溶液混匀，分别配成自10.0到50000.0不同梯度浓度的混合标准组织液体样品。所有操作均在4℃以下进行。标准曲线与线性范围采用外标法定量。以ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine五种小分子的峰面积(Y)与其理论浓度(X)重系数作加权线性回归，得标准曲线方程见表3-4结果显示，本方法线性良好。
表3.标准曲线及线性范围(SD大鼠肌肉组织)
表4.标准曲线及线性范围(秀丽隐杆线虫)
(2)分析样品的配制
SD大鼠肌肉组织，用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中液氮状态下研碎混匀或者用匀浆器打碎,加入10倍量的4℃预冷的甲醇，漩涡混匀2min。再4℃低温离心离心，14000转/分钟，15min，取上清液。上清液用4℃预冷的甲醇/水(1:1)稀释10倍，高速离心，14000转/分钟，再取上清液，即供试品溶液，-80℃储存待测。
收集秀丽隐杆线虫，在显微镜下计数后，用高氯酸溶液(0.1mol/L)在严格冰浴下充分匀浆，取全部匀浆液于4℃、14000r/min离心10min，取出上清液重复离心一次，并用0.22μm微孔滤膜过滤后,-80℃储存待测。
(3)精密度试验
ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种标准品的混合物的色谱质谱图如图2所示。
精密吸取5种化合物混合标准品溶液，加入SD大鼠肌肉组织或者秀丽隐杆线虫中配制低(20.0ng/mL)、中(100.0ng/mL)、高(1000.0ng/mL)质量浓度的样品，注入LC-MS/MS，按LC-MS/MS的液相条件和质谱条件，用外标法测定SD大鼠肌肉组织或者秀丽隐杆线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量。
测定结果显示，SD大鼠肌肉组织中的ATP日内精密度的RSD分别为0.49％，1.51％,5.31％；ADP的RSD分别为0.67％,1.59％，3.22％；AMP的RSD分别为0.72％,1.50％,5.58％；CP的RSD分别为1.05％,1.57％,1.93％。Creatine的RSD分别为0.78％,1.53％,5.48％。ATP日间精密度的RSD分别为6.17％,3.66％,1.25％；ADP的RSD分别为7.28％,1.93％,1.87％；AMP的RSD分别为4.45％,3.51％,1.56％；CP的RSD分别为5.37％,4.42％,2.95％；Creatine的RSD分别为4.49％,3.52％,1.55％。SD大鼠肌肉组织中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种化合物的色谱质谱图如图3所示。
测定结果显示，秀丽隐杆线虫中的ATP日内精密度的RSD分别为0.35％，0.89％,6.74％；ADP的RSD分别为1.32％,2.36％，4.68％；AMP的RSD分别为1.43％,2.35％,6.78％；CP的RSD分别为2.34％,5.63％,2.65％。Creatine的RSD分别为5.12％,2.34％,6.34％。ATP日间精密度的RSD分别为2.31％,2.31％,2.34％；ADP的RSD分别为4.68％,5.12％,2.01％；AMP的RSD分别为5.11％,2.66％,4.12％；CP的RSD分别为6.12％,5.32％,6.21％；Creatine的RSD分别为5.77％,6.22％,4.98％。秀丽隐杆线虫中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五种化合物的色谱质谱图如图4所示。
(4)样品稳定性
精密吸取5种混合标准品溶液，加入SD大鼠肌肉组织或者秀丽隐杆线虫中，样品于4℃分别放置0,1,2,4,24h时，注入LC-MS/MS，按LC-MS/MS的液相条件和质谱条件测定。
测定结果显示,SD大鼠肌肉中的ATP、ADP、AMP、CP和creatine含量的RSD分别为2.68％,2.29％,2.52％,2.38％，3.38％；秀丽隐杆线虫中的ATP、ADP、AMP、CP和creatine含量的RSD分别为3.45％,3.11％,5.66％,4.35％，2.36％。测定结果表明样品在24h内基本稳定。
(5)回收率
精密吸取5种混合标准品溶液，加入SD大鼠肌肉或者秀丽隐杆线虫中，涡旋混匀，注入LC-MS/MS，按LC-MS/MS的液相条件和质谱条件测定，根据测定结果计算出SD大鼠肌肉中的ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine的回收率分别为(104.90±7.233)％，(101.60±10.192)％,(101.55±6.678)％,(113.54±5.115)％和(101.84±4.235)％。
根据测定结果计算出秀丽隐杆线虫中的ATP、ADP、AMP、CP、以及creatine的回收率分别为(98.90±8.356)％，(100.03±14.125)％,(95.26±6.872)％,(109.25±4.521)％和(95.561±6.324)％。

Claims (4)

1.一种快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，包括如下工艺步骤：
(1)标准溶液的配制
分别精密称取2mg ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准品,分别用1mL超纯水溶解，避光-80℃保存；取各标准品溶液50μL混匀，用体积比为1:1的甲醇和水依次稀释20、40、80、100、160、200、640倍后绘制标准曲线；取组织或者线虫，液氮状态下研碎混匀或者加高氯酸溶液匀浆，加入不同浓度的ATP、ADP、AMP、CP和creatine标准溶液混匀，分别配制成自10.0到50000.0不同梯度浓度的混合标准组织液体样品；前述所有操作均在4℃以下进行；标准曲线与线性范围采用外标法定量；
(2)分析样品的配制
组织用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后，迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中液氮状态下研碎混匀或者用匀浆器打碎,加入10倍量的4℃预冷的甲醇，漩涡混匀2min；再4℃低温离心离心，14000转/分钟，15min，取上清液；上清液用4℃预冷的体积比为1:1的甲醇和水稀释10倍，高速离心14000转/分钟，再次取得的上清液，即为供试品溶液，-80℃储存待测；
收集线虫，用浓度为0.1mol/L的高氯酸溶液在冰浴下充分匀浆，取全部匀浆液于4℃、14000r/min离心10min，取出上清液重复离心一次，并用0.22μm微孔滤膜过滤后,-80℃储存待测；
(3)精密度试验
精密吸取5种化合物混合标准品溶液，加入组织或者线虫中配制质量浓度分别为20.0ng/mL、100.0ng/mL和1000.0ng/mL的样品，注入LC-MS/MS，用外标法测定组织或者线虫中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量；
所述LC-MS/MS的液相条件为：thermo C18色谱柱；流动相A：乙腈:1mM醋酸铵水溶液＝100：1，流动相B：1mM醋酸铵水溶液；流速：0.3mL/min；进样盘温度：4℃；柱温：35℃；进样量：10ul；流动相梯度如表1所示，前述1mM醋酸铵水溶液的pH＝10；
所述LC-MS/MS的质谱条件为：采用选择离子监测模式扫描，以负离子模式进行检测，利用ESI电喷雾离子源，负离子喷雾电压为2500V，雾化温度100℃，离子传输毛细管温度为350℃，以氩气作为Q2碰撞气为，压力为1.5mTorr，扫描宽度选择0.002m/z，扫描时间选择0.100s。
表1.梯度洗脱条件
2.根据权利要求1所述的快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，所述组织为心脏或肌肉。
3.根据权利要求1或2所述所述的快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，进一步包括如下工艺步骤：
精密吸取5种混合标准品溶液，加入组织或者线虫中，按LC-MS/MS的液相条件和质谱条件测定，样品于4℃分别放置0,1,2,4,24h时ATP、ADP、AMP、CP和creatine的含量，以判断样品的稳定性。
4.根据权利要求1或2所述的快速检测组织或者线虫中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，进一步包括如下工艺步骤：
精密吸取5种混合标准品溶液，加入组织或者线虫中，涡旋混匀，按LC-MS/MS的液相条件和质谱条件测定，计算ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的回收率。
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