CN102854257A - 定量检测组织atp，adp，amp的方法 - Google Patents
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Abstract
发明涉及一种物质检测方法，尤其是一种定量检测组织ATP，ADP，AMP的方法。按照先后顺序，准备试剂-配置溶液-设定色谱条件-制备标准曲线-制备供试品溶液-测定标本含量。这种方法适用范围广，可供临床检验，科学研究，法医鉴定等领域中对ATP、ADP、AMP的定量测定；高效检测组织ATP、ADP、AMP的含量，具有灵敏度高，稳定性高，重复性高，精密度高，回收率高等优点；此方法在10分钟内将组织ATP，ADP和AMP分离开来，有效的减少了杂质的干扰；此方法中检测所用的试剂和药品价廉，容易制取，成本比较低，本发明检测快速，用时短，有利于批量检测，而且操作很简单。
Description
技术领域
发明涉及一种物质检测方法，尤其是一种定量检测组织ATP，ADP，AMP的方法。
背景技术
5′-三磷酸腺苷(Adenosine 5′-triphosphate，ATP)是体内能量的直接来源，对人体的生理功能有着重要的影响。ATP减少会导致能量供应不足等，使各种生理功能紊乱，甚至疾病的发生。此外，ATP是法医学研究中鉴定死亡时间的重要指标。5′-二磷酸腺苷(Adenosine 5′-diphosphate，ADP)，5′一磷酸腺苷(Adenosine 5′-monophosphate，AMP)是ATP的降解产物，对体内ATP的平衡起着重要的作用。另外，研究发现ADP，AMP增多可能会导致疲劳感增加。因此，定量检测组织中ATP、ADP、AMP的含量对临床诊疗、科学研究和法医鉴定等有着重要的意义。目前检测组织中ATP、ADP、AMP的含量较多，但是大多方法检测所需时间长，操作繁琐，结果不准确。
发明内容
发明的目的在于，提供一种适用范围广、检测速度快、精确度高、成本低的定量检测组织ATP，ADP，AMP的方法。
发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定量检测组织ATP，ADP，AMP的方法，其特征在于：第一步，配置溶液：①标准品溶液的配置：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置5个浓度梯度的标准品溶液；②磷酸盐缓冲液的配制：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液，2mol/L氢氧化钾溶液调其PH为6.5；③氢氧化钾溶液的配制：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置2mol/L氢氧化钾溶液；④高氯酸溶液的配置：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置浓度为0.4mol/L的高氯酸溶液；第二步，设定色谱条件：采用美国Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱为Hypersil ODS2，柱温25℃；流动相为100mmol/L的磷酸盐缓冲液-甲醇＝99.9∶0.1；流速1.0mL/min；紫外波长为254nm；进样量20μL；第三步，制备标准曲线：取第一步配置的5个浓度梯度的标准品溶液，分别吸取20μL进样，记录色谱峰面积为纵坐标，ATP、ADP、AMP浓度为横坐标，经回归分析得ATP、ADP、AMP的线性回归方程；第四步，制备供试品溶液：取出新鲜的动物组织标本，用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中，按溶剂体积和组织重量比为10mL/g的比例加入4℃预冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成组织匀浆液，漩涡混匀2.0min，再4℃低温离心处理15min，取上清液，用4℃预冷的2mol/L的氢氧化钾溶液将上清液的PH值调至6.5，之后再次4℃低温离心处理15min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤后制成组织提取液，即供试品溶液，-80℃储存待测；第五步，测定标本含量：取第四步得到的供试品溶液20μL进样分析，根据测得的峰面积按第三步建立的线性回归方程分别计算供试品溶液中ATP、ADP、AMP的浓度，把测得的ATP、ADP、AMP浓度分别乘以相应的供试品溶液体积，再除以制成该供试品溶液的组织重量，即得到单位重量的组织中ATP、ADP、AMP的含量。
上述方法适用范围广，可供临床检验，科学研究，法医鉴定等领域中对ATP、ADP、AMP的定量测定；高效检测组织ATP、ADP、AMP的含量，具有灵敏度高，稳定性高，重复性高，精密度高，回收率高等优点；此方法在10分钟内将组织ATP，ADP和AMP分离开来，有效的减少了杂质的干扰；此方法中检测所用的试剂和药品价廉，容易制取，成本比较低，本专利检测快速，用时短，有利于批量检测，而且操作很简单。
具体实施方式
本发明中所需要的试剂有：5’-三磷酸腺苷二钠盐、5’-二磷酸腺苷钠盐、5’一磷酸腺苷二钠盐(美国SIGMA公司)；甲醇(流动相B)为色谱纯；超纯水(实验室自制，电阻率≥16MΩ.cm)；高氯酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钾均为分析纯。
然后按照顺序先配置溶液：①标准品溶液的配置：用4℃预冷的超纯水配置5个浓度梯度的标准品溶液(待测样本ATP、ADP、AMP的浓度在标准品溶液这5个浓度范围之内)②磷酸盐缓冲液的配制(流动相A)：用4℃预冷的超纯水配置浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液(内含12mmol/L的磷酸氢二钠和88mmol/L的磷酸二氢钠)，2mol/L氢氧化钾溶液调其PH为6.5。用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气半小时后使用。③氢氧化钾溶液的配制：用4℃预冷的超纯水配置2mol/L氢氧化钾溶液。④高氯酸溶液的配置：用4℃预冷的超纯水配置浓度为0.4mol/L的高氯酸溶液。
然后设定色谱条件：采用美国Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱为Hypersil ODS2(4.6mm×150mm，5μm)，柱温25℃；流动相为100mmol/L的磷酸盐缓冲液(内含12mmol/L的磷酸氢二钠和88mmol/L的磷酸二氢钠，PH＝6.5)-甲醇＝99.9∶0.1(体积比)；流速1.0mL/min；紫外波长为254nm；进样量20μL。
在色谱条件下进行标准曲线的制备：取上述现配置的5个浓度梯度的标准品溶液，分别吸取20μL进样。记录色谱峰面积为纵坐标，ATP、ADP、AMP浓度为横坐标，经回归分析得ATP、ADP、AMP的线性回归方程。
最后进行供试品溶液的制备：取出新鲜的动物组织标本，用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中，按溶剂体积和组织重量比为10mL/g的比例加入4℃预冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成组织匀浆液，漩涡混匀2.0min。再4℃低温离心(4000r/min)15min，取上清液，用4℃预冷的2mol/L的氢氧化钾溶液将上清液的PH值调至6.5，之后再次4℃低温离心(4000r/min)15min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤后制成组织提取液，即供试品溶液，-80℃储存待测。
进行完上述的操作流程，那么就可以进行标本含量测定：取上述供试品溶液20μL进样分析，根据测得的峰面积按上述建立的线性回归方程分别计算供试品溶液中ATP、ADP、AMP的浓度。把测得的ATP、ADP、AMP浓度分别乘以相应的供试品溶液体积，再除以制成该供试品溶液的组织重量，即得到单位重量的组织中ATP、ADP、AMP的含量。
这种检测方法，前后时间只需要10分钟左右，相对于其他的检测方法时间相当的短，10分钟内将组织ATP，ADP和AMP分离开来，有效的减少了杂质的干扰，精确度很高，其中所需要的试剂和药品价格都比较低廉，而且容易制取，降低了实验的成本，而且这种方法操作简单，所以适用性很广，可以用在各个研究领域里面进行，包括临床的检验。
Claims (1)
1.一种定量检测组织ATP，ADP，AMP的方法，其特征在于：第一步，配置溶液：①标准品溶液的配置：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置5个浓度梯度的标准品溶液；②磷酸盐缓冲液的配制：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液，2mol/L氢氧化钾溶液调其PH为6.5；③氢氧化钾溶液的配制：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置2mol/L氢氧化钾溶液；④高氯酸溶液的配置：用4℃预冷电阻率≥16MΩ.cm的超纯水配置浓度为0.4mol/L的高氯酸溶液；
第二步，设定色谱条件：采用美国Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱为Hypersil ODS2，柱温25℃；流动相为100mmol/L的磷酸盐缓冲液-甲醇＝99.9∶0.1；流速1.0mL/min；紫外波长为254nm；进样量20μL；
第三步，制备标准曲线：取第一步配置的5个浓度梯度的标准品溶液，分别吸取20μL进样，记录色谱峰面积为纵坐标，ATP、ADP、AMP浓度为横坐标，经回归分析得ATP、ADP、AMP的线性回归方程；
第四步，制备供试品溶液：取出新鲜的动物组织标本，用灵敏度为0.0001g的电子分析天平称重后迅速置于预冷的玻璃组织研磨器中，按溶剂体积和组织重量比为10mL/g的比例加入4℃预冷的0.4mol/L的高氯酸溶液，然后于冰浴中迅速研磨制成组织匀浆液，漩涡混匀2.0min，再4℃低温离心处理15min，取上清液，用4℃预冷的2mol/L的氢氧化钾溶液将上清液的PH值调至6.5，之后再次4℃低温离心处理15min，取上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤后制成组织提取液，即供试品溶液，-80℃储存待测；
第五步，测定标本含量：取第四步得到的供试品溶液20μL进样分析，根据测得的峰面积按第三步建立的线性回归方程分别计算供试品溶液中ATP、ADP、AMP的浓度，把测得的ATP、ADP、AMP浓度分别乘以相应的供试品溶液体积，再除以制成该供试品溶液的组织重量，即得到单位重量的组织中ATP、ADP、AMP的含量。
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