CN113447585B - 基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其包括利用第一色谱柱在高温条件下进行第一检测的步骤，和利用第一色谱柱在低温条件下进行第二检测的步骤；其中，高温是指70‑80℃的温度，低温是指25‑35℃温度，第一检测和所述第二检测包括使用相同的流动相及流速、相同的检测器。通过本发明方法能够对体外辅助生用液有关成分实现有效的定量和分析，实现对产品质量有效的控制。不仅大大降低分析难度，使各企业具备检测能力，提高体外辅助生殖培养液的质量。而且解决了液相质谱联用法可能导致的较大的误差，而是实现在一次检测过程中对多种目的物质的联合检测。

Description

基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体地涉及医疗器械产品体外辅助生殖用液检测，尤其是涉及基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法。

背景技术

自从1978年首列采用体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryotransfer，IVF-ET)技术的婴儿诞生以来，该技术已经发展30余年，其主要操作过程是分别将卵子与精子取出后，置于体外使其受精，用人工方法让精子和卵子在体外进行早期胚胎发育，然后将胚胎移植到母体子宫内发育而诞生婴儿，是解决不育不孕症乃至实现优生优育的重要技术手段。

尽管科技不断发展，但辅助生殖技术仍面临一系列问题及困难。作为该技术的关键一环-卵母细胞与胚胎的体外培养，一般会同时培育10个左右的胚胎，但只会移植其中的2-3个胚胎。胚胎的质量是影响临床妊娠结局的重要因素，如何选择高质量、高发育潜能的胚胎进行移植，是辅助生殖技术能否成功关键前提。

目前，胚胎的形态学分析是最常用的评价胚胎质量的方法，其根据卵裂球数量、发育速度、碎片、多核、空泡和卵裂球均一性等形态学评估胚胎质量。形态学评估具有直观、简便的特点，便于迅速选择胚胎，但也具有一定的局限性。胚胎的形态并不能够准确反映卵子与胚胎的发育潜能，除了分裂期胚胎的形态学观测有较为公认的评估指标外，其他时期胚胎质量评定缺少国际公认的标准，同时，形态学评价具有主观性，可重复性较低。

近年来，很多研究表明，体外胚胎培养液代谢成分分析，即代谢组学研究，可以更有效的评价胚胎的质量。自1999年Nicholson等首次提出代谢组学的概念：对受病理生理刺激或基因改变的生物体系所反应的动态代谢物进行多参数定量分析，反映生物体系受外部刺激所做出的变化。胚胎代谢成分的产生，一定程度上表现了胚胎自我修复的能力。常见的代谢指标有血小板活性因子(PAF)、人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen，HLA-G)、葡萄糖、活性氧(ROS)、氨基酸等。

能量物质是胚胎体外培养中维持其新陈代谢所必不可少的成分。主要有葡萄糖、丙酮酸、乳酸等。葡萄糖通过磷酸戊糖途径产生核酸和还原型辅酶Ⅱ，核酸是DNA和RNA的前体，而DNA和RNA是胚胎发育所必需的。作为能量来源，葡萄糖在卵丘卵母细胞复合体中通过糖酵解途径代谢产生ATP，同时产生容易被卵母细胞利用的底物，例如丙酮酸和乳酸在卵母细胞中，丙酮酸和乳酸通过三羧酸循环进行代谢，并伴随氧化磷酸化，该途径是卵母细胞产生ATP的主要途径，同时，8至16阶段细胞在高浓度的葡萄糖环境下，会产生发育阻断。

体外辅助生用液目前广泛的应用于体外辅助生殖手术中，是该手术必备的医疗耗材。现阶段该产品属于第三类高风险医疗器械，对成分控制要求较高，要求在上市前医疗器械注册检测中，必须对各组分明确定量。现有常规检测方法采用液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法对各个成分进行检测。但是存在通用性差，对操作要求较高，检测效率低，需要多种设备协同检测的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人进行了深入研究，发现通过控制检测过程中的色谱条件以及待检测组分的分组，通过最简单的操作，使试验人员高效检测培养液中多种成分，进而建立一种对体外辅助生用液专属性良好、灵敏度高、系统适用性、重复性和回收率符合要求的检测方法。至少部分地基于该发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明提供一种基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其至少包括：

(1)利用第一色谱柱在高温条件下进行第一检测的步骤，和

(2)利用第一色谱柱在低温条件下进行第二检测的步骤；

其中，所述高温是指70-80℃的温度，所述低温是指25-35℃温度，所述第一检测和所述第二检测包括使用相同的流动相及流速、相同的检测器。

根据本发明所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，优选地，所述体外辅助生殖用液包含第一组分和第二组分，其中所述第一组分包含葡萄糖；和所述第二组分包含选自由丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、海藻糖、乙二醇和丙二醇组成的组中的至少一种。

根据本发明所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，优选地，在进行步骤(1)结束后通过降低至所述低温即可进行步骤(2)。

根据本发明所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，优选地，所述色谱柱为RezexROA-Organic Acid H+(8％)，300×7.8mm色谱柱。

根据本发明所述的方法，优选地，所述第二组分进一步包含蔗糖。

根据本发明所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，优选地，进一步包括步骤(3)：利用第二色谱柱在低温下进行第三检测的步骤。

根据本发明所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，优选地，所述第三检测使用AsahipakNH2P-50 4E分析柱，和乙腈水作为流动相，利用电喷雾检测器进行检测。

经过本发明方法能够对体外辅助生用液有关成分实现有效的定量和分析，实现对产品质量有效的控制。不仅大大降低分析难度，使各企业具备检测能力，提高体外辅助生殖培养液的质量。而且解决了液相质谱联用法可能导致的糖类物质稀释而导致的较大的误差，而是实现在一次检测过程中对多种目的物质的联合检测。

附图说明

图1为标准品色谱图，其中图中A为柠檬酸钠，B为丙酮酸钠，C为乳酸钠，D为吗啉丙磺酸钠。

图2为标准品色谱图，其中图中E为海藻糖，F为葡萄糖，G为乙二醇，H为丙二醇，I为DMSO。

图3为标准品色谱图，其中图中A为蔗糖，B为丙三醇，C为乙二醇，D为二甲基亚砜。

图4为葡萄糖标准品色谱图。

图5为供试品溶液测试结果，其中图中A为柠檬酸钠，B为丙酮酸钠，C为乳酸，D为海藻糖，E为葡萄糖，F为乙二醇，G为二甲基亚砜。

图6为根据实施例2的色谱图，其中，图中A为海藻糖，B为乙二醇，C为二甲基亚砜。

图7为根据实施例3的色谱图，其中，图中A为丙酮酸钠，B为乳酸，C为吗啉丙磺酸钠。

图8为根据实施例3的色谱图，其中，图中A为蔗糖，B为丙三醇。

图9为根据实施例3的色谱图，其中，图中A为葡萄糖，B为蔗糖。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明提供一种基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其至少包括利用第一色谱柱在高温条件下进行第一检测的步骤，和利用第一色谱柱在低温条件下进行第二检测的步骤；

其中，所述高温是指70-80℃的温度，所述低温是指25-35℃温度，所述第一检测和所述第二检测包括使用相同的流动相及流速、相同的检测器。

考虑到体外辅助生殖用液不同组分之间的影响、选择不同的色谱柱、色谱条件对待检测体外辅助生殖用液的相关物质都有影响，并进一步影响检测的专属性、灵敏度以及系统适应性要求。下面详细说明各个影响因素。

[体外辅助生殖用液及其组分]

本发明的待检测体外辅助生殖用液为含有特定组分的药用级产品，其实例包括市售的产品、自行制备得到的辅助生殖用液。优选地，其包含下述组分：葡萄糖、蔗糖、丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、海藻糖、乙二醇和丙二醇。

组分的分组对于本发明是重要的，原因在于，一方面，使用多种设备或者多种检测方法联用导致的复杂步骤对于实现体外辅助生殖用液生物有效检测存在难度。另一方面，尤其是在体外辅助生殖用液含有蔗糖和葡萄糖组分的情况下，例如同时含有高浓度的蔗糖和低浓度的葡萄糖时，葡萄糖的测定会被蔗糖干扰，无法实现准确测量。因此，本发明的这样的分组以及色谱条件的相互配合能够有效解决上述问题。同时本发明的分组适于色谱条件而存在，这将在后续进行阐述。

基于此，本发明待检测的组分包含第一组分和第二组分。优选地，第一组分包含葡萄糖，第二组分包含选自由丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、海藻糖、乙二醇和丙二醇组成的组中的至少一种。进一步优选地，第二组分由丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、海藻糖、乙二醇和丙二醇组成。需要说明的是，组分组成相对固定，例如，组分替换、增加或减少不同程度的影响后续的检测，例如影响检测的分析时间，进一步影响其有效分离和后续的进一步分析。

[检测方法]

本发明方法中通过二级温度的第一检测和第二检测，实现在一个色谱柱下，基于相同的流动相和检测器实现检测。其中，第一检测是在高温下进行，这里的高温是指70-80℃的温度。优选71-79℃的温度，例如72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃。第二检测是在低温下进行，这里的低温是指25-35℃的温度。优选26-32℃的温度，例如27℃、28℃、29℃、30℃、31℃。

优选地，在进行第一检测步骤结束后通过降低至所述低温即可进行第二检测步骤。如何降低温度不特别限定，本领域技术人员可根据已知的方法进行。

本发明中所使用的第一色谱柱为RezexROA-Organic Acid H+(8％)，300×7.8mm色谱柱，可通过商购获得。第一检测和第二检测流动相优选为稀硫酸。流速优选为0.1-0.8ml/min，还优选为0.2-0.6ml/min，进一步优选为0.3-0.5ml/min。检测器优选使用紫外检测器(检测波长210nm)及示差折光检测器联用。

本发明的检测方法在同时含有蔗糖和葡萄糖时，进一步包括利用第二色谱柱在低温下进行第三检测的步骤。低温如上述所定义，在此不再赘述，但色谱柱需要更换，第三检测使用AsahipakNH2P-50 4E分析柱。流动相优选使用乙腈水作为流动相，还有优选75％乙腈-水。检测器优选为电喷雾检测器。流速优选为0.5-1.5ml/min，还优选为0.8-1.2ml/min，进一步优选为0.9-1.1ml/min。

需要注意的是，在本发明的步骤(1)-(2)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。再例如，包含对色谱图的处理步骤。

实施例1

本发明的以下实施例所使用的试剂均为色谱纯，其余药品均为分析纯，除非另有说明。

本实施例为基于液相色谱中体外辅助生殖用液的检测的色谱条件的准备，具体如下：

1.液相色谱条件的准备

1.1液相色谱条件1

①本检测方法需借助液相色谱仪(配备紫外检测器及示差折光检测器)进行分析。

②需准备纯化水及优级纯硫酸。

③液相色谱条件1(用于测量丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、葡萄糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇)：单独组分检测时存在各种温度，且蔗糖和葡萄糖含量相差极大。尤其在长期存放等情况下质量是否变化，生产或出厂、存放时产品的质量控制均可用本发明的方法进行分析。其中液相色谱条件1如下：

表1-液相色谱条件1

④样品制备：取样品，纯化水稀释10倍后，用0.45μm滤膜过滤样品后，待测。

⑤标准品溶液制备：取需要测试成分的标准品适量，按样品浓度配制合适的标准系列溶液，待测。

⑥系统适用性：标准曲线线性R≥99.5％，标准品重复性RSD％≤2.0，峰分离度应≥1.2,理论塔板数＞2000。

⑦标准品进样后，会在紫外检测器(如图1)和示差折光检测器(如图2)上得到不同物质的标准品色谱图.。

1.2液相色谱条件2

⑧液相色谱条件2(用于测量二甲基亚砜、蔗糖、乙二醇、丙三醇)见下表：

表2-液相色谱条件2

⑨样品制备：取样品，纯化水稀释100倍后，用0.45μm滤膜过滤样品后，待测。

⑩标准品溶液制备：取需要测试成分的标准品适量，按样品浓度配制合适的标准系列溶液，待测。

系统适用性：标准曲线线性R≥99.5％，标准品重复性RSD％≤2.0，峰分离度应≥1.2,理论塔板数＞2000。

标准品进样后，会在示差折光检测器上得到4种不同物质的标准品色谱图，如图3所示。

1.3色谱条件3

需要特别注意的是，如果样品中同时含有高浓度的蔗糖和低浓度的葡萄糖时，葡萄糖会被蔗糖干扰，无法准确测量，需要使用液相色谱条件3进行单独检测。葡萄糖及蔗糖分析方法如下表所示：

表3-液相色谱条件3

样品制备：取约100mg样品于10mL容量瓶中，用50％乙腈水溶液稀释至刻线，将溶液10,000xg离心10分钟取上清液，并用50％乙腈稀释至适当浓度，用0.45μm注射器过滤器过滤。待测。

标准品溶液制备：取需要测试成分的标准品适量，按样品浓度配制合适的标准系列溶液，待测。

系统适用性：标准曲线线性R≥99.5％，标准品重复性RSD％≤2.0，峰分离度应≥1.2,理论塔板数＞2000。标准品色谱图如图4所示。

实施例2

本实施例示例性示出了基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，具体如下：

一、仪器、材料和试剂

仪器：电子甜品；高效液相色谱，配紫外检测器及示差折光检测器，RezexROA-Organic Acid H+(8％)色谱柱。

材料：玻璃化冷冻液

试剂：硫酸、纯化水、葡萄糖、乳酸、丙酮酸钠、柠檬酸、乙二醇、海藻糖和二甲基亚砜对照品。

二、检测方法及步骤

1.流动相配置：取硫酸适量，加入纯化水中，得到0.005N的稀硫酸溶液，作为流动相。

2.样品溶液配置：取样品，称重后用纯化水稀释至1/10，作为待测液。

3.工作液配置：

①葡萄糖储备液的配制：精密称取纯度为98％的对照品0.4256g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为41.71mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为417.1μg/mL，104.3μg/mL，52.14μg/mL，26.07μg/mL，2.607μg/mL的葡萄糖对照品系列溶液。

②乳酸储备液的配制：精密称取纯度为98％的对照品0.1239g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为12.14mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为1214μg/mL，242.8μg/mL，121.4μg/mL，60.71μg/mL，6.071μg/mL的乳酸对照品系列溶液。

③丙酮酸钠储备液的配制：精密称取纯度为99％对照品0.0069g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为0.6831mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为68.31μg/mL，13.66μg/mL，6.831μg/mL，3.416μg/mL，0.342μg/mL的丙酮酸钠对照品系列溶液。

④柠檬酸钠储备液的配置：精密称取纯度为100％对照品0.1379g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为13.79mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为27.58μg/mL，2.516μg/mL，2.758μg/mL，1.379μg/mL，0.689μg/mL的丙酮酸钠对照品系列溶液。

⑤海藻糖储备液的配制：精密称取纯度为99％对照品0.17111g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为16.94mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为1.694mg/mL，1.186mg/mL，0.847mg/mL，0.508mg/mL，0.085mg/mL的海藻糖对照品系列溶液。

⑥乙二醇储备液的配制：精密称取纯度为99％对照品0.16697g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为16.53mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为1.653mg/mL，1.157mg/mL，0.827mg/mL，0.496mg/mL，0.083mg/mL的乙二醇对照品系列溶液。

⑦二甲基亚砜储备液的配制：精密称取纯度为99.9％对照品0.4965g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为49.60mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为4.960mg/mL，2.480mg/mL，1.240mg/mL，0.496mg/mL，0.248mg/mL的二甲基亚砜对照品系列溶液。

4.色谱条件如下表所示。

5.样品测定

6.样品供试品，标准系列溶液依次按上述色谱条件进样检测，按外标法进行定量。其中在高温条件下的色谱图如图5所示。在低温条件下的色谱图如图6所示。线性关系

对上述标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见下表。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好。

7.重复性和回收率考察

重复性测定：取浓度与标示浓度接近的7种对照品混合溶液，重复进样6次，将6次所得化合物峰面积求相对标准偏差(即重复性)值如表所示。

回收率测定：取浓度与标示浓度接近的7种对照品混合溶液，与样品1:1混合，作为样品。分别进样分析对照样品、加标样品和样品。将所得7种化合物峰面积按如下公式计算回收率：回收率＝((对照品+样品峰面积)/加标样品峰面积)x100％，所得结果如表所示。

8.测试结果

葡萄糖：323mg/L，乳酸钠：1724mg/L，丙酮酸钠：25.3mg/L，柠檬酸钠：1.29mg/L，海藻糖：158mg/mL，乙二醇：80mg/mL，二甲基亚砜：78mg/mL，符合投药量要求。

实施例3

一、仪器、材料和试剂

仪器：电子天平；高效液相色谱，配紫外检测器及示差折光检测器，RezexROA-Organic Acid H+(8％)色谱柱。

材料：精子冻存液

试剂：硫酸、纯化水、蔗糖、乳酸、丙酮酸钠、吗啉丙磺酸钠、丙三醇对照品。

二、检测方法及步骤

1.流动相配置：取硫酸适量，加入纯化水中，得到0.005N的稀硫酸溶液，作为流动相。

2.样品溶液配置：取样品，称重后用纯化水稀释至1/100，作为待测液。

3.工作液配置：

①蔗糖储备液的配制：精密称取纯度为99.5％的对照品0.1017g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为10.12mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为10.12mg/mL，5.060mg/mL，2.530mg/mL，1.012mg/mL，0.506mg/mL的蔗糖对照品系列溶液。

②乳酸储备液的配制：精密称取纯度为98％的对照品0.1310g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为12.838mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为1283.8μg/mL，128.3μg/mL，64.19μg/mL，12.83μg/mL，6.419μg/mL的乳酸对照品系列溶液。

③丙酮酸钠储备液的配制：精密称取纯度为99％对照品0.00425g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为0.42075mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为42.075μg/mL，4.207μg/mL，2.104μg/mL，0.421μg/mL，0.210μg/mL的丙酮酸钠对照品系列溶液。

④吗啉丙磺酸钠储备液的配制：精密称取纯度为99％对照品0.10053g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为9.952mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为2.582mg/mL，1.936mg/mL，1.291mg/mL，0.945mg/mL，0.258mg/mL的吗啉丙磺酸钠对照品系列溶液。

⑤丙三醇储备液的配制：精密称取纯度为98％对照品1.0155g，纯化水溶解并定容至10mL，制成浓度为99.519mg/mL的储备液。取储备液配成浓度为9.952mg/mL，7.464mg/mL，4.976mg/mL，2.488mg/mL，0.498mg/mL的丙三醇对照品系列溶液。

4.色谱条件

⑥乳酸、丙酮酸钠、吗啉丙磺酸钠采用本专利中色谱条件1进行检测，获取紫外检测器的检测结果进行计算。色谱图见图7。

⑦蔗糖、丙三醇采用本专利中色谱条件2进行检测，获取示差折光检测器检测器的检测结果进行计算。色谱图见图8。

⑧葡萄糖采用本专利中色谱条件3进行检测，获取电喷雾检测器检测器的检测结果进行计算。色谱图见图9。

5.样品测定

样品供试品，标准系列溶液依次按上述色谱条件进样检测，按外标法进行定量。

6.线性关系

对上述标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见下表。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好。

7.测试结果

葡萄糖：1.2mg/mL，乳酸：4.0mg/mL，丙酮酸钠：0.06mg/mL，吗啉丙磺酸钠：1.0mg/mL，蔗糖：15.8mg/mL，丙三醇：298mg/mL，符合投药量要求。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (4)

1.一种基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其特征在于，包括：

(1)利用第一色谱柱在高温条件下进行第一检测的步骤，其中第一检测中体外辅助生殖用液包括丙酮酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、吗啉丙磺酸钠、葡萄糖、海藻糖、乙二醇和丙二醇，所述高温是指70-80℃的温度；和

(2)利用第一色谱柱在低温条件下进行第二检测的步骤，其中第二检测中体外辅助生殖用液包括二甲基亚砜、蔗糖、乙二醇和丙三醇，所述低温是指25-35℃温度；

其中，所述第一检测和所述第二检测的检测条件为：RezexROA-Organic Acid H+(8%), 300 x 7.8mm分析柱，流动相为稀硫酸，检测器为紫外检测器及示差折光检测器联用；

当所述辅助生殖用液同时含有高浓度蔗糖和低浓度葡萄糖时，所述方法进一步包括步骤(3)：利用AsahipakNH2P-50 4E分析柱、75%乙腈-水为流动相和电喷雾检测器在低温下进行第三检测的步骤，其中，检测对象为葡萄糖和蔗糖。

2.根据权利要求1所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其特征在于，在进行步骤(1)结束后通过降低至所述低温即可进行步骤(2)。

3.根据权利要求1所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其特征在于，第一检测和第二检测中流速为0.1-0.8 ml/min。

4.根据权利要求1所述的基于液相色谱评价体外辅助生殖用液质量的方法，其特征在于，第三检测中流速为0.5-1.5 ml/min。

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